PT1401448E

PT1401448E - Tratamento antibacteriano de osteoartrite

Info

Publication number: PT1401448E
Application number: PT02730515T
Authority: PT
Inventors: Mohamed Raafat El-Gewely
Original assignee: Orthogenics As
Priority date: 2001-06-15
Filing date: 2002-06-17
Publication date: 2010-10-27
Also published as: EP1401448B1; US20080027013A1; ES2349030T3; DK1401448T3; GB0114672D0; CA2456685A1; US20040236074A1; US8318422B2; ATE482705T1; DE60237821D1; US8349816B2; AU2002302833B2; WO2002102384A1; EP1401448A1

Description

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO ANTIBACTERIANO DE OSTEOARTRITE" A presente invenção refere-se a osteoartrite e métodos para o seu tratamento e diagnóstico. A osteoartrite é também conhecida como "doença degenerativa das articulações" e é o tipo de artrite mais comum, afectando uma estimativa de 20,7 milhões de adultos só nos Estados Unidos da América (dados de www.nih.gov/niams/healthinfo/artrheu.htm). A osteoartrite afecta principalmente as cartilagens, o tecido que almofada as extremidades dos ossos numa articulação. A osteoartrite ocorre quando a cartilagem começa a faccionar, desgastar e enfraquecer. Em casos extremos, a cartilagem pode enfraquecer deixando uma articulação de osso-com-osso. A osteoartrite (OA) pode provocar dor na articulação, mobilidade da articulação reduzida e incapacidade. A incapacidade resulta, muito frequentemente, quando a doença afecta a coluna e as articulações que suportam o peso (joelhos e ancas).

Tipicamente, os sintomas da OA desenvolvem-se muito lentamente. Uma articulação particular pode doer ou ficar inflamada após utilização prolongada ou após um período de inactividade, e. g., a dormir. A dor, rigidez e inflamação, geralmente, irão piorar com o tempo e a gama de movimentos na 1 articulação torna-se reduzida. Um som de raspagem durante o movimento indica que a cartilagem na articulação se esgotou e os ossos estão a raspar um contra o outro. A osteoartrite é conhecida como "artrite degenerativa" e pode afectar o joelho, anca, coluna e outras estruturas; é o mais comum de todos os distúrbios das articulações em humanos. A OA é classificada como uma artrite não inflamatória e, por isso, pode ser distinguida das doenças reumáticas, como a artrite reumatóide que é classificada como uma artrite inflamatória. A artrite reumatóide é uma doença inflamatória do revestimento da articulação (sinóvio), está associada ao inchaço e inflamação de determinadas articulações, dor muscular e, eventualmente, a perda de utilização da articulação no seu todo. A inflamação tende a ser simétrica, o que ajuda no diagnóstico da artrite reumatóide. Outras doenças no grupo de doenças reumáticas incluem a gota, que afecta, mais habitualmente, o dedo grande do pé e desenvolve-se rapidamente, a artrite infecciosa que é um termo geral utilizado para descrever as várias formas de artrite provocadas por agentes infecciosos, tais como bactérias ou vírus, e artrite reactiva que se desenvolve após uma infecção que envolve o tracto urinário, intestino e outros órgãos e está, frequentemente, associada com problemas dos olhos, irritações da pele e inflamações da boca. 0 termo "artrite" é, por vezes, utilizado para se referir a todas as doenças reumáticas, contudo a palavra significa literalmente inflamação da articulação, i. e., inchaço, vermelhidão, calor e dor provocados pela lesão do tecido ou doença na articulação. 2

Os diferentes tipos de artrite compreendem apenas uma parte das doenças reumáticas que também inclui doenças descritas como "doenças do tecido conjuntivo" e doenças autoimunes, tais como fibromialgia e lúpus sistémico eritematoso. Como discutido acima, a OA já não é considerada como parte deste grupo na medida em que é uma artrite não inflamatória. A causa da OA não é conhecida, mas acredita-se que resulta de uma combinação de factores. Pensou-se que o aumento da idade, um historial familiar da doença, utilização excessiva ou abuso de uma articulação particular, lesão, ter excesso de peso e outras doenças podem todas contribuir para o desenvolvimento da OA. A causa ou causas de tipos de artrite infecciosa (bactérias e vírus) e gota (cristais de ácido úrico na articulação) são melhor entendidos pelos cientistas e pelos médicos.

Foi investigado o papel de determinadas enzimas produzidas endogenamente na degradação da cartilagem da articulação na OA e a possibilidade de utilizar fármacos que bloqueiam a acção destas enzimas. Em particular, o óxido nítrico que é produzido por uma família de enzimas, denominadas sintases do óxido nítrico, é libertado espontaneamente da cartilagem humana afectada pela OA em quantidades suficientes para provocar lesão na cartilagem. Existe uma hipótese do NO inibir a produção da matriz interferindo com importantes factores autócrinos e parácrinos e foi demonstrado que o NO inibia a produção de TGF-β. Os condrócitos articulares activados produzem grandes quantidades de NO e existe uma evidência crescente de que isto pode estar envolvido na etiopatogénese de osteoartrite. Devido à sua semi-vida curta, os efeitos biológicos de NO produzido endogenamente ocorrerão, provavelmente, localmente na cartilagem. (R. Studer, Osteoarthritis and Cartilage Vol. 7, N° 4, Julho de 1999). Um componente, também, importante da cartilagem é o colagénio de Tipo II que é degradado pela metaloproteinase endógena, gelatinase.

Diagnosticar doenças reumáticas ou OA pode ser difícil porque alguns sintomas são comuns a muitas doenças diferentes. 0 diagnóstico pode necessitar de uma consulta a um reumatologista, na medida em que, mesmo que tenha sido diagnosticada uma das doenças reumáticas, pode necessitar de um especialista para determinar qual delas.

Tipicamente, um diagnóstico necessitará de uma revisão total do historial médico do doente, incluindo história familiar, um exame físico, testes laboratoriais e raios X ou outras técnicas de imagem. 0 exame físico incluirá tipicamente a investigação de todas articulações em relação a vermelhidão, aquecimento, deformação, facilidade de movimento e suavidade. Na medida em que algumas formas de artrite, tal como lúpus, podem afectar outros órgãos, pode ser necessário um exame físico completo incluindo o coração, pulmões, abdómen, sistema nervoso, olhos, ouvidos e garganta. Podem ser necessários sangue, urina e/ou fluido sinovial para realizar um de vários testes laboratoriais icluindo: anticorpo antinuclear, contagem sanguínea completa, hematócrito, factor reumatóide e análise à urina.

0 médico pode necessitar de ver o doente mais do que uma vez para fazer o diagnóstico e a decisão final será geralmente um diagnóstico de trabalho com base em vários parâmetros diferentes que se baseia na competência e experiência relevante do médico analista. Um teste menos subjectivo para OA que fosse rápido e fácil de realizar iria melhorar fortemente o processo de diagnóstico. Como a OA é comum, seria útil identificar a OA 4 positivamente, mas igualmente se a OA pudesse ser descartada num estádio precoce, isto também seria um benefício considerável para o médico.

Até agora, no que se refere aos tratamentos presentemente disponíveis para OA, não existe um tratamento único, de sucesso disponível para todos os doentes. Um plano de tratamento típico combinará normalmente vários tipos de tratamento dependendo do estádio e gravidade do estado e das necessidades médicas e de estilo de vida do doente. Os tratamentos podem incluir descanso e relaxamento, exercício, alterações na dieta e medicação, em casos graves pode ser necessária cirurgia. É geralmente reconhecido (www.nih.gob/niams/healthinfo/ artrheu.htm) que os medicamentos disponíveis utilizados para tratar a maioria das doenças reumáticas e a OA não proporcionam uma cura, mas sim limitam os sintomas da doença. Embora a artrite infecciosa (e. g.r doença de Lyme), se diagnosticado a tempo, pode ser tratada com sucesso com antibióticos.

As medicações normalmente utilizadas para tratar OA proporcionam alívio da dor. Os analgésicos adequados incluem aspirina e outros fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAID), tais como ibuprofeno, (que tem o benefício adicional de diminuir a inflamação associada com lesão de tecido). Nos últimos anos, alterações precoces nas articulações têm sido tratadas cirurgicamente utilizando uma combinação de células de cartilagem cultivadas e cobertura perióstea no doente, numa tentativa de reparar a cartilagem danificada. Apenas um pequeno número de doentes pode ser tratado por este método dispendioso e invasivo.

Foi postulado (Amin, A. R. et ai. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA; 93, pp 14014-14019) que as tetraciclinas podiam ser utilizadas no tratamento de OA devido à sua capacidade para inibir a expressão de sintase de óxido nítrico endógeno (NOS). A possibilidade utilizando a tetraciclina doxiclina no tratamento de AO, devido à sua capacidade para inibir a actividade de colagenase, foi discutida por Yu, L. P. et ai. (1991) em J. Rheumatol; 18, pp 1450-2. Não foi ainda colocado no mercado nenhum produto com base nestes compostos. É óbvio a partir da discussão acima que os métodos existentes para o diagnóstico e tratamento de OA não são totalmente satisfatórios. Atendendo ao número de pessoas que sofrem de OA, particularmente nas populações envelhecidas do ocidente, existe uma necessidade real para um diagnóstico rápido e fiável de OA e de métodos melhorados para o seu tratamento. Na continuação de uma nova e surpreendente constatação, a presente invenção proporciona ensinamentos que se dirigem a ambos os problemas apresentados. A presente requerente estabeleceu, pela primeira vez, uma ligação entre bactérias e a osteoartrite. Nunca antes foi sugerido que as bactérias pudessem ter um papel primário na OA e a identificação deste papel abriu a possibilidade de uma variedade de novas técnicas terapêuticas e de diagnóstico no campo dos cuidados de OA. De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona, deste modo, a utilização de um agente antibacteriano na preparação de um medicamento para o tratamento de OA bacteriana primária por tratamento de uma infecção bacteriana que é responsável por OA. De outra forma, a presente invenção proporciona um agente antibacteriano para utilização no 6 tratamento de OA bacteriana primária por tratamento de uma infecção bacteriana que é responsável por OA.

Os sintomas e diagnóstico de OA são discutidos acima e embora possa ser um processo complexo, um médico com experiência adequada é normalmente capaz de diagnosticar OA com sucesso. Uma definição útil de OA para os propósitos da presente invenção é como se segue: dor em uma ou mais articulações, fraqueza gradual da cartilagem nessa articulação (tipicamente ao longo de vários anos) , sem mais sinais de alterações artríticas como as que são encontradas, por exemplo, na artrite reumatóide.

As alterações tipicas encontradas nas imagens de raios x de doentes com OA incluem um espaço estreito de articulação e esclerose subcondral. A OA é caracterizada por dor na articulação e perda de função causada geralmente por uma perda progressiva de cartilagem articular, seguida por tentativa de reparação da cartilagem articular e também remodelação e esclerose de osso subcondral. Os cistos de osso subcondral e osteófitos e a sinovite secundária no interior da articulação podem também ser encontrados. Contrariamente às doenças reumáticas, a inflamação não é um aspecto principal da doença. A OA pode ser dividida em OA primária e secundária. A OA primária é a forma mais comum e ocorre com prevalência crescente com o aumento da idade, não existindo actualmente uma cura disponível. Uma definição de OA primária é proporcionada pelo American College of Rheumatology (ACR) http://www.rheumatology.org/patients/factsheets.html como se segue: OA é um grupo heterogéneo de estados que levam a sintomas na articulação e sinais que são associados com integridade deficiente da cartilagem da articulação, adicionalmente às / alterações relacionadas no osso subjacente e margens da articulação. 0 diagnóstico envolverá tipicamente a avaliação de aspectos patológicos, radiográficos e clínicos. A OA secundária é menos comum e as causas incluem anomalias metabólicas, de desenvolvimento e genéticas da cartilagem articular. Na OA secundária é reconhecido um evento causal inequívoco ou doença. A OA secundária ocorre frequentemente nas seguintes circunstâncias: Síndroma de Stickler (Artro- oftalmopatia Hereditária progressiva), hemocromatose, doença da deposição de pirofosfato de cálcio, lesão da superfície articular, instabilidade da articulação, incongruência da articulação, desenervamento (Articulação de Charcot), displasias epifiseas, após artrite séptica (infecção), osteonecrose, osteocondrite dissecante e anos após lesão do menisco e/ou remoção do menisco.

De facto, os dados aqui apresentados, relacionados com o papel da infecção bacteriana no desenvolvimento de AO, podem levar à sua classificação como um estado secundário, resultante da infecção bacteriana inicial. A requerente é a primeira a identificar um papel primário (i. e. causal) para bactérias na OA, i. e., a infecção pode ser um evento primário ou secundário para um evento de iniciação na OA mas é, no entanto, responsável por um ou mais (tipicamente a maior parte deles) dos sintomas de OA característicos e/ou por exacerbar estes sintomas. 0 termo "responsável por" deve, deste modo, ser interpretado com esta relação em mente.

Os dados clínicos aqui apresentados, relacionados com o tratamento de doentes osteoartríticos com um antibiótico, b confirmam os dados moleculares e demonstram um papel para as bactérias na osteoartrite. A maioria dos doentes testados foram considerados como tendo melhorado dos sintomas após apenas 4 semanas de tratamento com um antibiótico.

Apesar de não desejar estar limitado pela teoria, parece provável que possa existir alguma lesão inicial na cartilagem e a infecção que causa a OA seja transmitida através do fluido sinovial ou através dos vasos sanguíneos que se desenvolveram em redor da cartilagem lesionada. Este papel activo para as bactérias no desenvolvimento de OA pode ser comparado com infecções bacterianas secundárias que podem ocorrer, e. g., pós-cirurgia e não são por si, responsáveis pelos sintomas de OA.

Por exemplo, os antibióticos foram descritos previamente num contexto profiláctico (Espehaug, B. et al. (1997) J. Bone Joint Surg. Br. Julho; 79 (4) pp 590-5) . Neste estudo o cemento contendo antibiótico e/ou antibióticos sistémicos foram administrados a doentes osteoartríticos que tinham recebido apenas substituições totais de anca, primariamente cementadas. O implante de metal durante o tratamento de fracturas ou OA significa 0 aumento do risco de infecção uma vez que as bactérias podem facilmente invadir a área em redor de um implante de metal. A utilização de antibióticos neste contexto não é, contudo, para o tratamento de uma infecção bacteriana possuindo um papel causal na própria OA. Contrariamente, de acordo com a presente invenção, os tratamentos são tipicamente não profilácticos, i. e., é tratada uma infecção estabelecida que é responsável pela OA observada. Adicionalmente, as bactérias particulares que podem causar problemas pós-operatórios, são diferentes das agora identificadas como tendo um papel causal na OA e nos seus sintomas. y A presente invenção pode também ser distinguida em publicações, tal como Amin et al. (supra) que sugerem um possível papel das tetraciclinas no tratamento de OA através da capacidade destas moléculas inibirem enzimas endógenas, incluindo NOS e colagenase. Claramente, estes documentos não estão preocupados e não descrevem a utilização de tetraciclinas no tratamento de uma infecção bacteriana, sendo a sua actividade de antibiótico acidental para as actividades de interessa. Não é sugerido nestes documentos um papel causal para as bactérias na OA. A requerente foi capaz de efectuar uma ligação entre as bactérias e OA através de uma série de experiências. Anteriormente, não tinham sido encontradas bactérias em articulações com osteoartrite primária (excepto em casos com cirurgia de troca após afrouxamento). Como discutido acima, a artrite séptica (infecciosa) é um estado diferente e as bactérias tais como Streptococcus e Staphylococcus e algumas espécies gram-negativas, são normalmente encontradas nestas articulações. Apenas uma combinação fortuita de técnicas, nomeadamente o modo da recolha da biopsia, métodos de apresentação diferencial modificados e finalmente análise de ARNr 16S alertou a requerente para a possibilidade do envolvimento de bactérias e depois foi confirmado. É postulado que a presença de bactérias pode ter estado "escondida" no passado porque as bactérias relevantes são difíceis de cultivar em testes de cultura convencionais.

Os doentes incluídos no "grupo osteoartrítico" tinham todos sido submetidos a processos de artroplastia num joelho. As biopsias foram efectuadas durante a cirurgia quando a

1U articulação estava a ser substituída, nos lados femoral e tibial. 0 diagnóstico de osteoartrite foi baseado na dor na articulação, uma típica fraqueza gradual da cartilagem durante anos, sem sinais de alterações artríticas conforme encontrado na artrite reumatóide e alterações típicas encontradas nas imagens de raios x, como um espaço estreito da articulação e esclerose subcondral. As alterações patológicas foram bastante avançadas; isto é apoiado pela necessidade dos doentes sofrerem uma artroplastia da articulação.

Um dos grupos de controlo incluído eram doentes com cartilagem normal, dos quais as amostras foram recolhidas durante a substituição do ligamento cruzado anterior. Nenhum trauma recente tinha perturbado os joelhos que iam sofrer esta operação e a peça de cartilagem estudada tinha de ser removida durante o processo de substituição, para permitir espaço suficiente para que o ligamento reparado funcione. Em nenhum destes doentes de controlo foi encontrada a sequência do gene identificador bacteriano.

No outro grupo de controlo, os doentes possuíam apenas áreas lesionadas localizadas sem lesões gerais na articulação. Foram todos operados numa tentativa de ganharem a arquitectura e funções da cartilagem normal. Esta operação incluía a utilização de condrócitos cultivados in vitro, remoção da cartilagem lesionada e a cobertura da área a ser reparada com periósteo e as células cultivadas in vitro. Em nenhum destes doentes com esta lesão limitada da cartilagem se encontrou o gene bacteriano. Estes resultados sugerem que em estádios muito precoces do desenvolvimento de OA pode existir um pequeno ou nenhum envolvimento, mas que a infecção bacteriana é responsável pelo desenvolvimento de OA totalmente instalada e pelos seus 11 sintomas desta avançados e mais sérios. É a progressão da OA totalmente instalada (estádio avançado) de uma determinada articulação que é responsável pela dor e ausência de mobilidade experimentada pela maior parte dos doentes com OA e, deste modo, os tratamentos que evitam ou abrandam esta progressão devem ser desejados.

Os sintomas caracteristicos do estádio precoce de AO, incluem dor durante actividade e um nivel reduzido de actividade. Num estádio avançado de OA, a dor pode ser observada em repouso e à noite, assim como durante a actividade. A actividade é muito reduzida e a utilização de muletas é comum. Também associada com a OA avançada estão o reduzido movimento da articulação e a rigidez na articulação.

Do ponto de vista do clinico, nos estádios precoces de OA, verifica-se a dor na linha da articulação e pode existir fluido sinovial aumentado na articulação. As radiografias indicam geralmente um estreitamento do espaço da articulação porque a cartilagem é reduzida. Contudo, os varrimentos MRI são mais úteis do que as imagens de raios x nos estádios precoces uma vez que podem identificar alterações precoces na cartilagem e osso subcondral. A artroscopia pode revelar fibrilhação, fracturas e defeitos na cartilagem. Na OA avançada, existe um aumento na dor na linha da articulação, palpação de osteófitos e normalmente aumento do fluido sinovial. As radiografias revelam um estreitamento significativo do espaço da articulação para a articulação em que aparece osso com osso sem espaço para cartilagem. Os raios X também revelam esclerose e cistos no osso subcondral, possível deformação da articulação e normalmente osteófitos em redor das margens da articulação. A artroscopia revela a ausência e degradação da cartilagem. 11 É aqui também revelada a utilização de um agente antibacteriano na preparação de um medicamento para prevenir ou reduzir o desenvolvimento de, ou progressão para, o estádio avançado de osteoartrite. Se a OA é diagnosticada num estádio muito precoce, então o tratamento profiláctico com um antibiótico pode ser apropriado.

Foi utilizada uma técnica de apresentação diferencial modificada que é descrita em detalhe na secção dos Exemplos. A apresentação diferencial é um método utilizado para identificar genes que são diferencialmente expressos numa situação em comparação com outra. 0 ARNm é transcrito de forma reversa e a partir da população de ADNc é amplificado um pequeno número de genes utilizando iniciadores de PCR seleccionados. A separação das amostras sob investigação (amplificadas com o mesmo conjunto de iniciadores), lado a lado, com representando um gene expresso nas amostras originais. Um gene/banda que se encontra numa amostra, mas não em outra, é referida como sendo diferencialmente expressa.

Neste caso, foram retiradas biopsias do joelho, em doentes de OA da parte osteoartritica da cartilagem e de outro doente durante a reparação do ligamento cruzado. Num doente com OA, foram comparadas as biopsias de ambas as áreas osteoartritica e uma área não perturbada. Havia um problema com insuficiente ARNm na amostra da cartilagem. 0 tecido cartilagineo é construído de células do condrócito, rodeadas pela matriz extracelular. 0 número total de células por grama de tecido é baixo. A matriz extracelular consiste principalmente de colagénio (tipo II, IX, XI), proteoglicanos (agrecano) e outras moléculas grandes, tal como hialuronano. A extracção de ARNm de amostras de cartilagem pequenas produz níveis quase indetectáveis de ARNm. Isto é devido ao baixo número de células numa pequena porção de tecido com poucas células por unidade de peso e ao efeito da matriz extracelular na eficiência das extracções/isolamento de ARNm. Os proteoglicanos ligam-se rapidamente ao ARN e desse modo baixam o rendimento. Por isso, a população completa de ADNc foi amplificada como um passo preliminar após transcrição reversa.

As bandas expressas diferencialmente no gel podem ser cortadas, reamplifiçadas, clonadas e depois sequenciadas. Este trabalho identificou NOS como expresso de forma mais elevada na cartilagem osteoartrítica e a análise de sequências indicou que o gene tinha uma homologia superior com uma sequência bacteriana do que com uma sequência humana. A presença de bactérias foi então confirmada através da detecção de ARNr 16S em tecidos osteoartríticos, indicativo de bactérias patogénicas no tecido da cartilagem afectado. A sequenciação e estudos comparativos posteriores do ARNr 16S permitiram a identificação da espécie bacteriana envolvida na OA, e isto irá permitir a selecção dos antibióticos mais apropriados. A espécie em questão é ou está muito proximamente relacionada com Janthinobacterium. Duganella é um exemplo de uma espécie muito proximamente relacionada com Janthinobacterium. Os dados de sequências indicam que as bactérias responsáveis estão relacionadas com subespécies de Pseudomonas. Essas bactérias são diferentes das bactérias que provocam problemas em hospitais, devido a infecção de feridas e locais de cirurgia. Podem ser uma população bacteriana heterogénea que provoca OA na(s) articulação(ões) de alguns doentes. 14

Por "agente antibacteriano" entende-se qualquer composto ou formulação que mata bactérias, previne ou inibe a proliferação de bactérias ou de outra forma enfraquece ou inactiva bactérias. Ambos os agentes bactericidas e bacteriostáticos podem ser utilizados. 0 agente pode possuir uma actividade específica para apenas uma ou um número pequeno de espécies bacterianas ou pode ser activo contra uma vasta gama de bactérias, tal como péptidos que afectam a membrana bacteriana.

Agentes antibacterianos adequados podem ser utilizados localmente ou administrados intravenosamente ou oralmente. 0 tratamento pode incluir um ou mais dos seguintes: a- Uma pequena operação de artroscopia que irá incluir fazendo passar através da articulação e injectando o antibiótico seleccionado, ou uma artrotomia com uma agulha injectando o antibiótico seleccionado. b- Novamente por artroscopia, colocar uma matriz libertadora de antibiótico nas articulações afectadas. c- Administração oral de uma combinação de antibióticos seleccionados. d- A administração intravenosa de uma combinação de antibióticos seleccionados.

Também, a prótese ou as células podem ser impregnadas ou formuladas com antibióticos antes da implantação. São conhecidos muitos agentes antibacterianos e estão a ser desenvolvidos mais o tempo todo. Agentes antibacterianos preferidos são aqueles que são eficazes no tratamento e infecções com Pseudomonas. Os antibióticos que são activos mesmo contra espécies bacterianas que têm uma tendência para formar ih biofilmes através de "detecção de quórum" são preferidos, como Pseudomonas, Janthinobacterium e Burkholderia têm uma tendência elevada para formar esses biofilmes. Assim, uma classe de antibióticos preferidos são aqueles que são dirigidos/vão contra os genes ou produtos genéticos envolvidos na "detecção de quórum" e formação de biofilme.

De facto, foi demonstrado recentemente que um componente principal em biofilmes produzidos por Pseudomonas é ADN (as bactérias que se acredita serem responsáveis pela osteoartrite são semelhantes a Pseudomonas) . Por isso, numa forma de realização preferida da presente invenção, o tratamento será uma terapia combinada em que um antibiótico é co-administrado com um agente que pode degradar o ADN, de um modo preferido, uma enzima, e. g., uma enzima de restrição ou DNase I. Ocorre um efeito sinergistico à medida que a enzima ou outro agente degrada o ADN e reduz a viscosidade do biofilme, permitindo uma penetração mais eficaz do antibiótico. Agentes anti-DNA, tal como DNase I serão, de um modo preferido, injectados na articulação afectada.

Os seguintes exemplos são específicos de agentes antibacterianos adequados: combinação de claritromicina/levofloxacina, mercaptoetilguanidina (verificou-se que inibe a resposta inflamatória de infecção por Pseudomonas devido ao óxido nítrico), ciprofloxacinlactato (eficaz contra Pseudomonas), tobramicina (foi utilizado contra Pseudomonas), ceftazidim-pentatidrato (isoladamente ou em combinação com outros antibióticos), gentamicina (é utilizado localmente em cirurgia ortopédica para o tratamento de infecções e pode ser utilizado no tratamento local da osteoartrite), ciproxina, rifampicina (em combinação com ceftazidim-pentatidrato e/ou lb gentamicina), doxiciclina (um antibiótico de largo espectro) e trimetroprim/sulfametoxazole (combinação).

Em alguns casos, por exemplo quando há preocupação em relação aos efeitos colaterais após um tratamento sistémico, o agente antibacteriano será, de um modo preferido, injectado em (ou próximo de) a articulação osteoartrítica afectada. Agentes antibacterianos nesta categoria incluem gentamicina e Ciproxina. De acordo com um regime de tratamento preferido, 2 ou mais agentes antibacterianos serão co-admidistrados, e. g., gentamicina e doxiciclina. Neste caso, um agente activo pode ser administrado oralmente e o outro injectado localmente.

Agentes da forma de realização particularmente preferida são aqueles que são eficazes contra Janthinobacterium e/ou Pseudomonas ou bactérias de tipo Pseudomonas.

Durante o trabalho que conduziu à presente invenção, a requerente demonstrou que a sintase de óxido nítrico (que pareceu ser bacteriana na sua origem) foi expressa diferencialmente em tecidos com OA. A sintase de óxido nítrico demonstrou ser inibida mesmo ao nível da transcrição por compostos de tetraciclina e, assim, esses compostos são uma classe preferida de antibióticos para utilização na invenção.

Os agentes antibacterianos para utilização, de acordo com a presente invenção, possuem um efeito suficientemente inibidor nas bactérias na articulação que estes provocam um melhoramento mensurável e significativo na osteoartrite e nos seus sintomas associados. Não é expectável que, em todos os casos, o tratamento seja totalmente bem sucedido mas o "tratamento", de acordo com a presente invenção, deve incluir melhoramento em uma 17 ou mais das seguintes áreas: dor na articulação e em redor desta, em repouso ou em movimento, inflamação em redor da articulação, movimento da articulação e degradação da cartilagem na articulação. 0 tratamento verá, de um modo preferido, um melhoramento em uma ou mais dessas áreas, mas podem incluir a prevenção ou o abrandamento no posterior declínio da cartilagem, movimento da articulação, etc. A natureza da OA significa que se o desenvolvimento da doença é parado, isto pode ser um benefício significativo para o doente. Se for pretendido introduzir tecido modificado ou novas células no local da lesão na articulação, então o local é, de um modo preferido, primeiro tratado com um agente antibacteriano de acordo com os ensinamentos da invenção.

Todos os doentes com AO, principalmente bacteriana, quer sejam recentemente diagnosticados ou num estádio mais avançado, podem ser considerados para tratamento de acordo com a presente invenção. Os sintomas em relação aos quais se observou melhoramento são discutidos acima.

Uma quantidade "farmaceuticamente eficaz" pode ser determinada em relação às várias áreas aqui discutidas, em que o tratamento pode proporcionar melhoras mensuráveis, e seleccionados em relação aos Exemplos. É também descrito um método para melhorar a mobilidade da articulação e/ou reduzir a dor e/ou inflamação de uma articulação num mamífero, cujo método compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente antibacteriano ao referido mamífero.

Um melhoramento na mobilidade da articulação pode ser avaliada pelos próprios doentes ou pelo seu médico assistente. Igualmente para a dor e inflamação. uma É também descrita uma composição farmacêutica para utilização no tratamento de AO, principalmente bacteriana, mais particularmente uma infecção bacteriana responsável por OA, compreendendo a referida composição um agente antibacteriano juntamente com, pelo menos, um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 0 ingrediente activo nessas composições, pode compreender desde 0,05% a 99% em peso da formulação, de um modo mais preferido, 0,1% a 5,0%.

Por "farmaceuticamente aceitável" entende-se que os ingredientes devem ser compatíveis com outros ingredientes da composição, assim como fisiologicamente aceitável para o receptor.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com qualquer um dos métodos convencionais conhecidos na técnica e vastamente descritos na literatura. Assim, o ingrediente activo pode ser incorporado, opcionalmente em conjunto com outras substâncias activas, com um ou mais veículos, diluentes e/ou excipientes convencionais, para produzir preparações galénicas convencionais, tais como comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, saquetas, cápsulas, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido ou num meio líquido), loções, cápsulas de gelatina moles e duras, supositórios, soluções injectáveis estéreis, pós empacotados estéreis e semelhantes. São discutidos acima outros métodos de formulação de agentes antibacterianos, e. g., por incorporação em dispositivos para implantação.

Os agentes activos são, de um modo preferido, formulados em comprimidos, contendo cada comprimido uma quantidade predeterminada de ingrediente activo. Como aqui discutido, pode ser desejável injectar determinados antibióticos na articulação afectada.

As doses adequadas irão variar de doente para doente e podem ser determinadas pelo médico de acordo com o peso, idade e sexo do doente e a gravidade do estado e também o agente antibacteriano particular seleccionado. Uma dose diária total típica de agente antibacteriano estará na região de 50-1000 mg, de um modo preferido, 100-300 mg. Esta será, de um modo preferido, administrada como uma dose única.

As melhoras nos doentes tratados de acordo com a presente invenção podem ser observados numa semana ou duas e o tratamento deve ser normalmente continuado durante 1 a 2 meses ou mais para alcançar os benefícios máximos. Como aqui observado, 4 semanas podem ser suficientes para observar melhoras significativas. A identificação de um papel para as bactérias no desenvolvimento de OA também proporciona novos métodos para o diagnóstico rigoroso de OA. Biopsias retiradas de doentes suspeitos de possuírem OA, e. g., amostras de fluido sinovial, podem ser testadas quanto à presença de bactérias patogénicas. Assim, num outro aspecto, a presente invenção proporciona um método in vitro de diagnóstico da osteoartrite num doente, suspeito de ter osteoartrite, cujo método compreende testar uma amostra de uma articulação do referido doente para a presença de bactérias (patogénicas) e em que as bactérias estão presentes, confirmando que a referida articulação é afectada por osteoartrite principalmente bacteriana.

Um método particularmente preferido, envolve a utilização de sondas de ácido nucleico ou iniciadores concebidos para detectar

2 U a espécie bacteriana de interesse, através de homologia com uma região alvo (sequência) no ácido nucleico da bactéria. Iniciadores adequados são aqui descritos nos Exemplos. De um modo preferido, o iniciador ou iniciadores têm como alvo uma região no ARNr 16S (ou o gene que o codifica) . Os iniciadores aqui designados como F21-and R21-, particularmente F21-4 e R21-4 são específicos para sequências do tipo Janthinobacterium e são especialmente preferidas. 0 par de iniciadores F21-2 e R21-4 são também particularmente adequados.

As sondas/iniciadores possuem homologia com sequências alvo, i. e., são capazes de se ligar a sequências alvo sob níveis de restringência convencionais. São aqui proporcionados métodos para obter amostras adequadas de doentes suspeitos de possuir OA em uma ou mais articulações, nos Exemplos aqui referidos. 0 método de diagnóstico aqui descrito proporciona um teste útil e fiável para confirmar que a articulação é afectada por OA bacteriana primária e pode ser utilizada por si só ou juntamente com técnicas de diagnóstico conhecidas. A amostra testada será, de um modo preferido, fluido sinovial. Se for obtido apenas pouco fluido, então pode ser injectada solução salina (possivelmente até cerca de 30 mL) antes de posterior aspiração. Estas amostras de fluido podem ser então centrifugadas para produzir uma amostra de células, e. g., por centrifugação a 13000 rpm (15000 g) durante 45 mins. As células no sedimento são, de um modo preferido, lavadas com uma solução salina estéril 2-3 vezes antes de serem congeladas, e. g. a -70 °C. 21 0 ensaio para o marcador genético bacteriano pode ser baseado na identificação de ARN (e. g., directamente para ARNr 16S) ou ADN (e. g., o gene que codifica o ARNr 16S) . Quando é analisado ARN, é necessário um passo de transcrição reversa para criar ADNc antes da PCR poder ser realizada. Métodos de análise de ARN são descritos nos Exemplos, mas o ADN das bactérias no fluido sinovial pode ser analisado em sua substituição/de igual modo. 0 ADN pode ser primeiro isolado a partir das células, e. g., utilizando o QIAGEN's DNeasy tissue kit (Cat. N° 69504) . Alternativamente, o ADN pode ser amplificado e analisado sem um passo de extracção separado. Protocolos adequados para amplificação de ADN nas células sanguíneas são descritos por Nordvâg, B. et al. em Methods in Neurosciences Vol. 26 [1995] p. 15-25 e em BioTechniques [1992] Vol. 12 N°. 4, p. 490-491 e os métodos aplicam-se igualmente a uma amostra celular do fluido sinovial.

Quando se realiza a PCR serão utilizados, de um modo preferido, três pares de iniciadores separados: A) um conjunto de iniciadores específico para as bactérias que provocam a doença, assim específico para Janthinobacteria e espécies relacionadas (de um modo preferido, concebidos para a amplificação do gene do ARNr 16S) B) um conjunto de iniciadores para amplificação de outro gene nas bactérias que provocam a doença, que não é tão altamente conservado como os genes de ARNr 16S, e. g., para parte de um dos genes de ARNr 23S; e C) um gene convencional humano, tal como β-actina que pode ser utilizada para normalização da quantidade de sinal bacteriano para ser um sinal de genes humanos derivados de células sinoviais humanas. 0 ensaio pode ser realizado rapidamente e convenientemente, utilizando apenas o conjunto de iniciadores (A) acima.

As células irão lisar, de um modo preferido, num pré-ciclo para o método de PCR para tornar o ADN acessível para emparelhamento do iniciador. Após a PCR, são utilizadas técnicas de visualização em gel convencional.

Visualizada alternativamente, a presente invenção proporciona uma unidade de detecção bacteriana para utilização no diagnóstico de osteoartrite bacteriana primária num doente suspeito de possuir osteoartrite. Como discutido acima, as unidades de detecção bacteriana adequada incluem sondas de ácido nucleico e iniciadores que podem ser, geralmente, concebidas para detectar bactérias ou um gene ou espécie particular. Em particular, as unidades que podem detectar as espécies relacionadas com Janthinobacterium que foram encontradas pela presente requerente para serem ligados a OA. Outras unidades para a detecção bacteriana incluem anticorpos. 0 "agente" pode ser simplesmente uma solução, suspensão, etc., que contém a unidade de detecção bacteriana e está, ou é capaz de estar, numa forma conveniente para realizar o método de diagnóstico numa amostra. 0 agente será tipicamente contactado com a amostra de modo a determinar se as bactérias estão ou não presentes. É também descrito um kit para o diagnóstico de OA bacteriano primário que compreende uma unidade de detecção bacteriana, de um modo preferido, um agente como definido acima. A 'unidade de detecção bacteriana' é tipicamente uma ou mais moléculas de oligonucleótidos, e. g., um par de iniciadores de ácido nucleico que detectam as bactérias alvo responsáveis pelos sintomas de OA. 0 kit pode também incluir, de um modo preferido, uma ou mais dos seguintes, polimerase de ADN (que está tão isenta de ADN contaminante quanto possível), dNTPs, tampões e um reagente para facilitar a solubilização do ARN/ADN.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona um produto contendo (a) um agente antibacteriano como aqui definido e (b) um antagonista de óxido nítrico como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial no tratamento de OA bacteriana primária, através do tratamento de uma infecção bacteriana que é responsável para OA. Um "antagonista de óxido nítrico" é qualquer unidade que serve para baixar a concentração de óxido nítrico local na área que circunda a articulação, por exemplo, um inibidor da sintase de óxido nítrico.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um produto contendo (a) um agente antibacteriano como aqui definido e (b) um agente que pode degradar ADN, este agente será, de um modo preferido, uma enzima, tal como DNasel, como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial no tratamento de OA bacteriana primária através do tratamento de uma infecção bacteriana que é responsável pela OA. A invenção será ainda descrita com referência aos seguintes Exemplos não limitativos e as Figuras em que: A Figura 1 é um esboço que apresenta plastia de recuperação durante a reconstrução do ligamento cruzado anterior. A cartilagem é removida da parede lateral do implante. 14 A Figura 2 é uma fotografia baseada na visualização óptica mostrando focalmente cartilagem danificada no côndilo femoral médio. A fotografia foi retirada durante a artroscopia. A Figura 3 é uma fotografia baseada na visualização óptica mostrando alterações osteoartriticas avançadas num joelho, novamente a fotografia foi tirada durante a artroscopia. A Figura 4 é um fluxograma da tecnologia SMART. A figura é adaptada do manual do utilizador do Kit da Clontech SMART™ PCR ADNc Synthesis. A Figura 5 é uma fotografia de gel mostrando os resultados de reamplificação de bandas expressas diferencialmente. As bandas entre 200-600 pb são isoladas e utilizadas para clonagem, sequenciação e posterior verificação. A Figura 6 é a primeira sequência isolada dos doentes através de apresentação diferencial. Foi uma análise FASTA desta sequência que primeiro conduziu o inventor à suspeita da presença de bactérias. A Figura 7 é uma fotografia de gel mostrando a detecção de sinais de ARN ribossomal 16S das culturas de controlo de E. coli. Pista 1 = ARN bacteriano de controlo, Pista 2 = 1/10 x ARN bacteriano, Pista 3 = Água. A transcrição reversa é realizada com o iniciador R1492 e a PCR com F27/R1492; 5 pL de cada reacção de PCR foram aplicados no gel. A Figura 8 é uma foto do gel mostrando o sinal 16S em biopsia de cartilagem. As pistas foram aplicadas como se segue:

Zb

Pista Amostra ID

1 8A

2 8A

3 17A

4 17A

5 20A

6 20A

7 16N

8 16N 9 Mistura principal tratada, + iniciadores mas sem molde.

Foi realizada transcrição reversa com o iniciador R1474, a PCR com os iniciadores F7/R1474 e 6 pL de cada reacção de PCR foram aplicados no gel. A Figura 9 é uma foto de gel mostrando o sinal 16S em biopsias de cartilagem. As pistas foram carregadas como se segue:

Pista Amostra ID 1 8A 2 17A 3 16N 4 Controlo de água A transcrição reversa e a PCR foram realizadas utilizando os iniciadores da Fig. 8. A Figura 10 é uma fotografia mostrando fragmentos de ADN 16S amplificados purificados antes da sequenciação. Em algumas 2b amostras, especialmente em tecidos normais, foi observado um fragmento mais pequeno (350 pb) em relação ao dos sinais 16S (1400 pb) . Estes fragmentos mais pequenos, quando sequenciados pareceram ser semelhantes aos ARNr 18S humano. 0 gel foi carregado como se segue:

Pista Amostra ID 1 17A fragmento pequeno* 2 17A fragmento grande 3 20A fragmento grande 4 17A fragmento pequeno* 5 17A fragmento grande 6 Mistura principal tratada, + iniciadores (F7 e RI474) mas sem molde. 4 pL de cada isolado de ADN foi aplicado ao gel. A Figura 11 é uma representação em diagrama mostrando a localização do iniciador em ARNr 16s de comprimento total. 0 par F7/R1474 irá amplificar o ADNc do ARNr 16s de comprimento total mas quando utilizado para sequenciação, estes iniciadores irão produzir informação de sequências para algumas centenas de pares de bases cada, que não irão abranger a sequência completa. Para obter a sequência completa do ADNc amplificado, os iniciadores F10A, F10B. F10C, R10A, R10B e R10C, são utilizados como iniciadores de sequenciação adicional. As sequências de nucleótidos são listadas na Tabela 1. Deste modo, é criada uma sequência composta utilizando informação de sequências sobreponiveis, obtidas por sequenciação com vários iniciadores em sentido directo. Pode ser realizado o mesmo processo com os iniciadores reversos para obter uma sequência reversa composta e então as sequências em sentido directo e reverso foram comparadas para produzir uma sequência composta ainda mais precisa. A Figura 12 é a sequência de ARN 16s completa obtida como uma sequência composta em sentido directo e reverso do doente número 21, região A, utilizando os iniciadores descritos na legenda da Figura 16. Esta sequência foi sempre encontrada em doentes osteoartríticos por uma pesquisa Blastn da base de dados NCBI para representar Janthinobacterium. A Figura 13 é uma representação esquemática de como podem ser utilizados iniciadores diferentes para diferenciar entre as sequências de ARNr a6s de Janthinobacterium (J) e Burkholderia (B) . Esta sequências são geralmente bastante semelhantes, mas com regiões em que existe uma percentagem elevada de desemparelhamentos entre as duas espécies. Assim, os iniciadores F25-/R25-, irão amplificar moldes com uma sequência de tipo B e os iniciadores F21-/R21 irão amplificar moldes com uma sequência de tipo J. Esta técnica ajuda a chegar à conclusão que a espécie bacteriana envolvida em OA foi a Janthinobacterium ou, muito proximamente, relacionada com esta e na identificação dos melhores iniciadores para utilização no diagnóstico de OA provocada por infecção bacteriana, F21-1 e R21-4. A Figura 14 é uma fotografia de gel mostrando a detecção dos genes de ARNr 16s do patogénio no fluido sinovial. 0 ADN foi isolado a partir do fluido sinovial a partir de um joelho artrítico utilizando o kit TRIzol da Gibco BRL/life Techologies. A sequência de ARN 16s foi amplificada utilizando iniciadores concebidos a partir da sequência de ARNr 16s encontrada na amostra 21A. 0 gel foi carregado como segue:

Pista Amostra

1 ADN 2 ADN diluição 1/10 3 Água de controlo

4 ADN 5 ADN diluição 1/10 6 Água de controlo L Marcador de ADN: BRL/Life Techologies

Iniciadores F21-1/R21-4 F21-1/R21-4 F21-1/R21-4 F21-1/R21-5 F21-1/R21-5 F21-1/R21-5 1 kb Plus DNA ladder, Gibco A Figura 15 é uma fotografia de gel mostrando uma incapacidade para detectar ARNr 16S bacteriano em amostras do doente 31, região normal (N) e numa água de controlo. As pistas foram carregadas como segue:

Amostra 1 kb+ ladder Inic. Direc. Inic. 31N-SF ADN 1/10 dil. F25-1 R25-3 31N-SF ADN 1/10 dil. F25-1 R25-4 31N-SF ADN 1/10 dil. F25-1 R25-5 31N-SF ADN 1/10 dil. F25-2 R25-3 31N-SF ADN 1/10 dil. F25-2 R25-4 31N-SF ADN 1/10 dil. F25-2 R25-5 31N-SF ADN 1/10 dil. F25-3 R25-4 31N-SF ADN 1/10 dil. F25-3 R25-5 Água Controlo F25-1 R25-3 Água Controlo F25-1 R25-4 Água Controlo F25-1 R25-5 Água Controlo F25-2 R25-3 Água Controlo F25-2 R25-4 Água Controlo F25-2 R25-5 Água Controlo F25-3 R25-4

Pista n° L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 (continuação)

Pista n° Amostra Inic. Direc. Inic. Rev. 16 Água Controlo F25-3 R25-5

Se as bactérias estivessem presentes em qualquer das amostras (mesmo espécies diferentes de Burkholderia) então deveria ter sido criado um sinal utilizando estes iniciadores em sentido directo e reverso. A Figura 16 é um gráfico mostrando os resultados de KOOS para os "sintomas" antes e após tratamento com um antibiótico. P = 0,100 A Figura 17 é um gráfico mostrando os valores de KOOS para a "actividade diária" antes e após tratamento com um antibiótico, p = 0,429. A Figura 18 é um gráfico mostrando os valores de KOOS para "Desporto e Lazer" antes e após tratamento com um antibiótico. P = 0,008. A Figura 19 é um gráfico mostrando os valores de KOOS para "Qualidade de Vida" antes e após tratamento com um antibiótico. p = 0,182 . A Figura 20 é um gráfico que apresenta os valores de KOOS para a "Dor" antes e após tratamento com um antibiótico. P = 0,386. A Figura 21 é um gráfico mostrando os valores simples de Lysholm antes e após tratamento com um antibiótico, p = 0,003.

Exemplos

Exemplo 1 - Identificação de bactérias associadas com lesão osteoartrítica

Biopsias de Cartilagem Clínicas A comissão de ética no Troms University Hospital aprovou a remoção e exame de cartilagem para este estudo. Doentes submetidos a processos de biopsia, foram informados oralmente e por escrito acerca do projecto, e assinaram um documento a dizer que os mesmos aceitaram a utilização do material para este projecto de investigação.

As três qualidades diferentes de tecidos de cartilagem, normais, com lesão focal e osteoartríticos, foram retirados de doentes do seguinte modo: 1. A cartilagem normal (N) foi retirada dos joelhos submetidos a reconstrução do ligamento cruzado anterior. Para reparar o ligamento, foram utilizados um enxerto incluindo um pedaço de osso da patela, uma parte do ligamento patelar e uma quantidade de osso da tíbia proximal. Quando se coloca o enxerto no joelho, o processo inclui a remoção de alguma cartilagem do côndilo femoral lateral do joelho (Fig 1). Isto é realizado para permitir espaço suficiente para o novo ligamento em flexão e extensão do joelho. Nenhum dos joelhos que foram utilizados para recolher cartilagem normal tinha um historial de trauma durante os últimos dois meses e não havia sinais de inflamação nesses joelhos. A cartilagem removida foi utilizada como a amostra de tecido normal. Durante a operação foi retirado em condições de esterilidade e foi imediatamente congelado por imersão em azoto liquido. As amostras foram mais tarde armazenadas a -75 °C. 2. A cartilagem lesionada focalmente (D) foi de áreas nos joelhos removidos durante a reparação com transplante de condrócitos (Fig 2), uma técnica descrita por Mats Brittberg e colaboradores em 1994 (Brittberg M., Landahl A., Nilsson A., Ohlsson C., Isaksson 0.,

Peterson L., N. Engl. J. Med. 1994, Oct 6; 331 (14): 889-95). Esta técnica inclui retirar uma biopsia do joelho que se quer reparar a partir de uma área do joelho que não suporta peso e a partir desta biopsia as células são isoladas e deixadas multiplicar in vitro durante cerca de três semanas. Quando é atingido um número de células suficiente, as células são transplantadas para o joelho após a remoção da área de cartilagem danificada. A cartilagem removida e danificada foi utilizada como uma amostra da cartilagem danificada. Também esta biopsia foi removida em condições de esterilidade. 3. A cartilagem osteoartritica (A) (Fig. 3) foi removida durante a operação de doentes com osteoartrite avançada até um grau que exclui a técnica de transplante celular. Estes joelhos sofreram cirurgia de substituição de articulação, utilizando prótese.

Durante o processo operativo, a cartilagem tem que ser removida, e foram retiradas áreas da cartilagem com as 32 alterações mais avançadas, recolhidas em condições de esterilidade.

Detalhe de outros materiais utilizados nas experiências

Iniciadores

Foram utilizados os seguintes iniciadores. Foram utilizados os iniciadores R (reversos) iniciadores R-1492 e R-1474 para a transcrição reversa. Para PCR, foram utilizados geralmente os pares F-27/R-1492 e F-7/R-1474 (F = sentido directo). A sequência dos iniciadores é indicada na Tabela 1 abaixo.

Os iniciadores foram adquiridos a Sigma-Genosys. Para a síntese de ADNc, os iniciadores foram diluídos para 2,5 pmol/pL em água. Para PCR, os iniciadores foram diluídos para 50 pmol/pL em água. São geralmente preferidos F-7/R-1474 para a identificação de ARNr 16S bacteriano (ou o gene que o codifica) na medida em que emparelham com uma sequência conservada entre várias espécies bacterianas estudadas. F21-2/R21-4 são adequados para identificação da bactéria chave que provoca a doença Janthinobacterium (ou espécies intimamente relacionadas). 33

Iniciador Sequência do iniciador F2521 5 ' - GCA AGT CGA ACG GCA GCA CGG GT - - 3' F25-1 5 ' - GGA TAG CCC GGC GAA AGC CGG AT - - 3' F25-2 5 ' - CCT TCG GGC CTC GCG CTA TAG GGT T - 3 ' F25-3 5' - TCC TTG GCC CTA ATA CGG TCG GGG G - 3' R25-3 5 ' - CCC CCG ACC GTA TTA GGG CCA AGG A - 3' R25-4 5 ' - TCC ACC TCT CAG CGG AAT TCC GA - - 3' R25-5 5' - GCA ACC CTC TGT TCC GAC CAT TGT - 3' R2521 5 ' - GAT TAG CTC CCC CTC GCG GGT TGG - 3' F21-1 5 ' - GGG ATA ACG TAG CGA AAG TTA CGC TA - 3 ' F21-2 5 ' - TCG CAA GAC CTC ATG CTC GTG GAG C - 3' F21-3 5 ' - CGG TGA GAG CTA ATA TCT CTT GCT AAT - 3' R21-3 5 ' - ATT AGC AAG AGA TAT TAG CTC TCA CCG - 3' R21-4 5 ' - CCC TGA TCT CTC AAG GAT TCC AGC C - 3' R21-5 5 ' - GCG GCG CTC TGT ATG TAC CAT TGT ATC - 3 ' F-7 5' - ATC CTG GCT CAG ATT GAA CG - 3' R-1474 5 ' - TCA CCC CAG TCA TGA ATC CT - 3' F-2 7 5 ' - AGA GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG - - 3' R-1492 5 ' - TAC GG(C/T) TAC CTT GTT ACG ACT T - 3 ' F10A 5' - GTG AGT GAA GAA GGC CTT CG - 3' F10B 5 ' - TGG GGG ATT CAT TTC CTT AF - 3' F10C 5 ' - AGC AGC CGC GGT AAT ACG - 3 r Rl OA 5 ' - ATG ACG TGT GAA GCC CTA CC - 3' Rl OB 5' - TTA ATC CAC ATC ATC CAC CG - 3' Rl OC 5 ' - AGC CCG GGG ATT TCA CAT - 3 r F27 ' 5 ' - AGA GTT TGA TC(C/A) TGG GTC AG - - 3' 1 co 5' - AGA GTT TGA TCC TGG YTC AG - 3' R-556 5 ' - CTT TAC GCC CAR TAA WTC CG - 3'

Tabela 1 34 Síntese de ADNc

As Superscript II RNase H_ Reverse Transcriptase (Cat. N° 18064-014) de GibcoBRL/Life Technologies foram utilizadas com o seu tampão e DTT. Os dNTP's (Cat. N° U1240) foram adquiridos a Promega.

Electroforese em gel de agarose e isolamento de ADN

SeaKem LE Agarose (Cat. N° 50004) de MedProbe foram utilizados para electroforese em gel. QIAEX II Gel Extraction Kit (Cat. N° 20021) de QIAGEN foram utilizados para o isolamento de ADN a partir da agarose.

Kit e condições de sequenciação

Foram utilizados Kits Thermo Sequenase Cy-5 Dye Terminator (Cat. N° 27- 2682-01) de Amersham Pharmacia Biotech para as reacções de sequenciação. Sephadex G-50 (Cat. N° 9048- 71-9) de Sigma foram utilizados para a purificação do produto de PCR para sequenciação. Também podem ser utilizados os Kits ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing.

Reagentes de PCR

Foram utilizadas HotStarTaq ADN polymerase (Cat. N° 203205) da Qiagen para amplificação por PCR de ARN 16S ribossomal.

As misturas mae de PCR foram tratadas com RQ1 RNase free DNase I (Cat. N° M610A) da Promega.

Agua tratada com DEPC, de 0,2 μΜ (Cat. a síntese de ADNc

Foi utilizada água sem RNase, sem DNase, autoclavada, filtrada através de um filtro N° 9915G) da Ambion quando se preparava o ARN, e durante a PCR. Método de Apresentação Diferencial A técnica seguinte combina a amplificação de ADNc de comprimento completo com apresentação diferencial. SMART cDNA PCR (Clontech Laboratories Inc., PR304-1) é uma técnica originalmente desenvolvida para amplificar populações/bibliotecas de ADNc completas. A primeira cadeia do ADNc é sintetizada utilizando um iniciador oligo-dT (iniciador CDS) . A transcriptase reversa (MMLV, RNase H-) adiciona um número pequeno e resíduos de citidina após completar a primeira cadeia. Um segundo iniciador (iniciador SMART II) emparelha com a "cauda" dC e a transcriptase reversa vira o molde. Os iniciadores são concebidos para produzir a mesma sequência em ambas as extremidades do ADNc e, desse modo, utilizando um iniciador que se irá ligar a ambas as extremidades (iniciador de PCR) é possível amplificar a população de ARNm total (como ADNc) exponencialmente. 36

Foi utilizado SMART cDNA PCR para amplificar o ADNc construído a partir de amostras de ARNm muito pequenas. Foi utilizado o ADNc amplificado como molde em reacções de apresentaçao diferencial.

Materiais e Métodos

Os materiais da amostra foram retirados de um doente que estava a ser operado para artrose unicompartimental neste joelho, ver Exemplo 1. As biopsias foram retiradas da parte osteoartrítica da cartilagem. Foi retirada cartilagem normal do mesmo joelho, a partir da área não perturbada. As amostras de cartilagem foram congeladas em azoto liquido num período de 5 minutos e depois armazenadas a -75 °C até ser realizada a extracção do ARN.

Extracção de ARN

As cartilagens foram homogeneizadas num pó fino com um almofariz e um pilão em azoto líquido. 0 ARN total foi isolado utilizando o reagente TRIZOL da Gibco (N° 15596) . A concentração e a qualidade do ARN foram determinadas através da medição da Abs 260/280 e correndo uma amostra em gel de agarose. Síntese de ADNc

Foram realizadas Transcrições Reversas utilizando o Kit SMART PCR cDNA Synthesis da Clontech (N° K1052-1). Foram seguidas as condições recomendadas pelo fabricante. Foram utilizados 3 pL de solução de ARN. Foi utilizada transcriptase reversa MMLV (200 U/l) (Gibco 18064-014).

Amplificação de ADNc 0 ADNc total foi amplificado utilizando o Kit SMART PCR ADNc Synthesis (N° K1052-1) da Clontech. Foram utilizadas as condições recomendadas pelo fabricante. Foram amplificados 2 pL da primeira cadeia de ADNc num volume total de 50 pL com Advantage 2 KlenTaq Polymerase de Clontech (N° 8430-1). Após 25 ciclos os produtos da PCR foram examinados num gel de agarose e as concentrações de ADN foram determinadas medindo a Abs 260/280 .

Apresentação Diferencial; utilizando dois iniciadores:

Para as reacções de Apresentação Diferencial foi utilizado o Kit Delta Differential Display (N° K1810-1) da Clontech. Foram utilizadas as condições recomendadas pelo fabricante. O ADNc amplificado foi diluído para 0,02 pg/pL. Foram utilizadas várias combinações de iniciadores (os iniciadores T e P incluídos no kit) para o rastreio para genes expressos de forma diferencial.

Foi utilizado 1 pL das diluições de ADNc como molde em cada reacção. As amostras foram marcadas com [a]-33P dATP (Amersham) e amplificadas com Advantage 2 KlenTaq Polymerase (N° 8417-1) da Clontech. Após três ciclos de baixa restringência foram realizados 25 ciclos de elevada restringência. Os produtos de PCR foram separados num gel de sequenciação (Ureia a 7 M, acrilamida a 4% (37,5:1) 0,5xTBE) com espaçadores de 0,2 mm a 500 V até o corante azul de bromofenol ter saído do gel. Os géis foram visualizados expondo-os a uma película BioMax MR durante um dia e meio.

As bandas expressas de forma diferencial foram excisadas a partir dos géis secos sobrepondo a película para marcar as bandas antes de isolar o material em gel utilizando um bisturi. Foi adicionado 10 0 pL de água a cada pedaço de gel num tubo de tipo eppendorf. Os pedaços foram então incubados a 37 °C durante a noite. Os tubos foram centrifugados a 14000 g durante 15 minutos a 4 °C. Os eluatos foram então armazenados a -20 °C.

Foram utilizados 5 pL de cada eluato como molde numa reacção de amplificação utilizando as mesmas condições que na PCR de Apresentação Diferencial (sem marcação). Os produtos de PCR foram examinados num gel de agarose. Foi visível algum arrasto e foi separado um volume maior num gel maior. As bandas de

interesse foram cortadas a partir do gel de agarose e o ADN foram isolados utilizando o Kit QIAEX II da Qiagen (N° 20021) .

Foi seguido o processo do fabricante. O ADN foi eluído em 20 pL de água. O ADN foi reamplifiçado novamente utilizando pfu Turbo polymerase (N° 600252-51) . Cada reacção de 50 pL continha 1 pL de molde, iniciador de 40 pM T e P, 100 pM dNTP, tampão lOx e 1,25 U de enzima. A PCR foi corrida com as seguintes condições: Inicialmente 94 °C durante 9 min, 43 ciclos de 94 °C durante

30 seg e 60 °C durante 1 min e uma extensão final a 60 °C durante 10 min.

Após examinar uma corrida de teste. Foram corridas reacções paralelas em gel de agarose em 2 tubos e os produtos foram misturados. O ADN foi isolado a partir da mistura de reacção de PCR utilizando o Sistema QIAEX II DNA Purification da Qiagen. Foram seguidas as recomendações do fabricante. O ADN foi eluído em 15 pL de água. Foi corrida uma amostra num gel de agarose. Após visualização não houve bandas adicionais ou arrasto visíveis.

Clonagem 0 ADNc reamplifiçado foi clonado no vector de clonagem fácil pGEM-T (N° A1360, Promega, Madison, WI, USA) . A ligação foi realizada com uma concentração de vector de 50 ng/pL. A presença de uma inserção de plasmado do tamanho esperado foi avaliada por PCR utilizando os mesmos iniciadores que na apresentação diferencial e cortando o vector com a enzima de restrição FcoRI.

Os fragmentos de PCR clonados foram sequenciados utilizando o iniciador T7. As sequências encontradas apresentaram forte homologia com sequências de genes humanos conhecidas. Estes também foram 3-4 vezes mais longos do que os EST médios.

Apresentação Diferencial utilizando um iniciador:

Foram utilizados iniciadores 10-meros (Operon Technologies, Alameda, CA, USA) para amplificar ADNc sem radioactividade. Cada reacção de 50 pL continha 1 pL de ADNc, 80 pM de um iniciador, 200 pM de cada dNTP, tampão lOx e 2,5 U de HotStarTaq polymerase (Qiagen). A PCR foi realizada com as seguintes condições: Inicialmente 95 °C durante 15 min, 40 ciclos de 94 °C durante 2 min, 38 °C durante 2 min e 68 °C durante 1 min e 25 seg, e uma extensão final a 72 °C durante 10 min. Os produtos de amplificação por PCR foram separados num gel de agarose a 1,5% (agarose 1000, Gibco) em tampão TAE com guanosina a 1 mM, e

4 U visualizados com brometo de etidio. A agarose 1000 é capaz de resolver bandas separadas por 10 pb. As bandas expressas de forma diferencial foram excisadas, isoladas e clonadas no vector pGEM-T easy sem amplificação adicional.

Resultados

Um aspecto importante da estratégia dos autores é amplificar a população total de ADNc antes da sua utilização como molde em reacções de PCR de Apresentação Diferencial utilizando o Kit Smart™ PCR da Clontech (Fig. 4). A comparação de produtos de produtos de PCR de Apresentação Diferencial de amostras de cartilagem (saudáveis e osteoartrítica) apresentou genes expressos numa amostra, mas não na outra.

Após Apresentação Diferencial o ADNc pode ser eluido a partir do material gel. O ADNc pode ser então reamplifiçado utilizando os mesmos iniciadores (RT PCR) como no processo de Apresentação Diferencial (Fig. 5) .

Recuperação do Gene da biblioteca por PCR Reversa

Após a seguenciação, foram concebidos dois iniciadores internos com 100% de sobreposição. Estes iniciadores internos foram utilizados para amplificar o gene total utilizando a biblioteca de ADNc no vector pTriplEx2 (Clontech) como molde. O ADNc foi empacotado em λ TriplEx2 gue é convertido em pTriplEx2 por transdução em E. coli BM25.8. Utilizando a biblioteca de 41 ADNc em pTriplEx2 com os iniciadores internos decididos, apenas o plasmideo com o gene de interesse é amplificado. Os iniciadores são concebidos a partir da sequência de um gene expresso de forma diferencial. Após transformação em JM109, o gene expresso de forma diferencial é sequenciado.

Identificação de ARN 16S ribossomal bacteriana em amostras de cartilagem

Extracção de ARN

Os tecidos de cartilagem congelados frescos foram homogeneizados num pó fino com um almofariz e um pilão em azoto liquido. 0 ARN total foi isolado utilizando o reagente TRIZOL de Gibco (N° 15596) . A qualidade do ARN foi determinada correndo uma amostra numa electroforese em gel de agarose. Síntese da primeira cadeia do ADNc

Foram misturados os seguintes num tubo eppendorf: 2 pL iniciador de RT (R1474, 5 pmol) 2 pL amostra de ARN 8 pL H20 (DEPC tratada, sem RNase) 0 tubo foi aquecido até 90 °C durante 5 min, depois arrefecido lentamente até à temperatura ambiente.

Foram preparadas Misturas mãe de RT-PCR: /Uma reacção 4 ^

4 pL Tampão da 1 2 pL 0,1 M DTT 1 pL 10 mM dNTP cadeia A cada reacção foram adicionados 7 pL de RT-MasterMix e o tubo foi então incubado a 42 °C durante 2 min. A cada reacção foi adicionado 1 pL de Superscript II Reverse Transcriptase. Os tubos foram então incubados a 42 °C durante 50 min. As reacções foram paradas através de aquecimento a 100 °C durante 10 min. Os tubos foram então colocados rapidamente no gelo.

Foram então adicionados 80 pL de água tratada com DEPC a cada tubo.

Amplificação por PCR

Preparação e tratamento com DNase da PCR-MasterMix 1 x rxn

5 pL tampão 10X 2 pL 2 5 mM Mg2+

1 pL de 10 mM de dNTP 37.5 pL de H20

2.5 pL de DNase I A PCR-MasterMix foi incubada a 37 °C durante 1 hora, depois fervida durante 5 minutos e colocada em gelo. Foram adicionados os seguintes reagentes. 1 rxn 50 pm/pL a cadeia mL. PTC-200 1 pL de PrimerMix (50 pm/pL de iniciador directo + de iniciador reverso. 0,25 pL de polimerase de ADN HotStarTaq.

Para cada reacção de PCR foram misturados 1 pL de 1 de ADNc com 49 pL de PCR-MasterMix num tubo de PCR de 0,2 O PCR que se segue foi separado num MJ Research Peltier Thermal Cycler. 95 °C 8 min 12X hO ΟΊ o o 40 s O o O 40 s 72 °C ~loC/ci 2 min 15X hO ΟΊ o o 40 s 58 °C 40 s 72 °C 2 min 20X hO ΟΊ o O 40 s O o LO 40 s 72 °C 2 min O O espera 44

Os produtos de PCR foram então armazenados a -20 °C.

Electroforese em Gel de Agarose

Os produtos de PCR foram separados lado a lado num gel de agarose a 0,8%. Os mini géis (6x10 cm) foram separados durante 50 min a 90 V em tampão IX TAE. Para os minigéis uma amostra tipica foi 6 pL de produto de PCR. Um marcador 1 kb Plus ADN de Gibco foi separado em paralelo para determinação do tamanho das amostras do fragmento de ADN.

Os géis foram corados em solução de EtBr (0,5 pg/mL de água) durante 20 minutos. Estes foram então descorados em água em várias lavagens de água durante 40 min.

Os géis foram visualizados num sistema BioRad Gel Documentation.

Isolamento de ADN do gel de agarose

Quatro reacções de PCR idênticas foram separadas em paralelo, para o isolamento preparativo de ADN para sequenciação. Os produtos combinados foram então separados num gel com poços largos. Foram utilizadas as mesmas condições da visualização anterior. Após coloração os géis foram colocados num transiluminador W de baixa intensidade e as bandas de interesse foram rapidamente excisadas com bisturis estéreis. Verificou-se que embebendo o gel em solução de 1 mM de guanosina (Grundemann e Schomig) antes da visualização das bandas aos UV eliminava as complicações na sequência de ADN devido aos danos 4b do ADN pelos UV uma parte de um gel típico pesava cerca de 150-200 mg. 0 ADN foi isolado a partir dos fragmentos do gel utilizando o Kit QIAGEN QIAEX II Gel Extraction (Cat. N° 20021). Foram seguidas as condições do fabricante. Os fragmentos de ADN foram eluídos em 25 pL de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,5. A qualidade do ADN isolado foi verificada aplicando uma pequena quantidade (2 pL) num Mini gel como anteriormente descrito. Um exemplo de fragmentos de ADN purificados isolados antes da sequenciação de ADN é apresentado na Figura 10.

Sequenciação de ADN

Misturas Cy-5 dNTP

Para quatro reacções de sequenciação foram preparadas quatro misturas de Cy-5 dNTP (A, C, G, T). 4 rxns (misturas MA, MC, MG, MT) 2 pL 1,1 mM de dNTP's 1 pL Cy-5 dNTP (A, C, G ou T) 7 pL H20

1 pL 0,55 mM de EDTA

Os tubos contendo Cy-5 dNTP's devem ser sempre mantidos em gelo no escuro.

Foram preparadas misturas mãe de sequenciação. 4b 1 rxn 8 pL de ADN molde 2 pL de iniciador (directo ou reverso) 3,5 pL de tampão de reacção 0,9 pL de Thermo Sequenase 12,6 pL de H20

Em quatro tubos de PCR foi adicionado o que se segue.

A: 2 pL MA

C: 2 pL MC

G: 2 pL MG

T: 2 pL MT

Para cada dos quatro tubos foram adicionados 6 pL da mistura de reacção mãe.

Foram efectuados os seguintes PCR:

30X 95 °C 30 s 57 °C 30 s 72 °C 80 s

Os produtos da reacção de sequenciação foram purificados em colunas de centrifugação de Sephadex G-50 (matriz de 96 poços). Os produtos foram então secos no escuro a 37 °C e depois ressuspensos em solução de interrupção de sequenciação (8 L) . As amostras (4 pL) foram então aplicadas num sequenciador

Amersham-Pharmacia ALF sob condições convencionais. 4 7

Resultados

Detecção de ARN 16S na cartilagem de doentes com osteoartrite

Resultados de PCR

Após termos conseguido testar o protocolo através da detecção de ARN 16S utilizando culturas bacterianas diluidas em série de Escherichia coli (Figura 7) testou-se este método em amostras clinicas de cartilagem.

As designações de pistas/tecidos são (N) para normal ou regiões não afectadas, (D) para Danificado e (A) para osteoartritico. A articulação de um doente pode ter regiões de OA obviamente avançada, regiões gue parecem guase normais e áreas que não estão em estádios avançados de OA mas em que a cartilagem é macia e num determinado grau fibrilhada, sendo esta área definida como danificada.

Os resultados são mostrados nas Figuras e Tabela 2 a seguir.

Os resultados mostram que a presença de sinais de 16S pode sempre ser associada com doentes osteoartríticos. Embora ocasionalmente o tecido isolado a partir de doentes osteoartríticos não revela sinais de ARN 16S utilizando as condições convencionais de PCR, nenhum sinal de ARN 16S foi alguma vez detectado em tecidos de doentes normais. 48 A tabela 2 abaixo dá um resumo da detecção de sequências de ARNr 16S em amostras clínicas. A = Osteoartrítico e N = normal. Foram utilizados dois tipos de controlo, controlo H2O (branco) e ARN total de E. coli como um controlo positivo. A transcrição reversa é efectuada com o iniciador R1474. A amplificação por PCR foi efectuada utilizando s iniciadores F7 e R1474. Os números na coluna "amostra" são os números dos doentes. Algumas amostras aparecem mais do que uma vez na tabela porque a amostra foi analisada mais do que um dia.

Tabela 2

Amostra Positivo Negativo 8A * 17A * 20A * 16N * E. coli controlo * h2o 8A * 17A * h2o 8A * 17A * 16N * H20 8A * 17A * 49 η20 * 2 ΙΑ * η2ο * 2 ΙΑ * η2ο * 25Α * η2ο * 25Α * η2ο * 25Α * η2ο * 25Α * η2ο * 25Α * η2ο * 25Α * 2 ΙΑ * η2ο * 2 ΙΑ * η2ο * 50 8Α 17Α 20Α 16Ν η2ο 17Α 20Α Η20 8Α 17Α 20Α 15Α Η20 8Α 15Α 17Α 20Α 16Ν Η20 8Α 15Α 16Ν Η20 51 8Α 17Α 2 ΟΑ 16Ν η2ο 8Α 15Α 17Α 2 ΟΑ 16Ν 18Ν Η20

Análise de Sequências A primeira sequência de apresentação diferencial isolada de doentes (Figura 6) levou a suspeitar da presença da bactéria. O resumo de uma análise FASTA desta sequência é apresentado a seguir e isto indica uma semelhança muito elevada com sequências de origem procariótica. (bits) Valor

Sequências que produzem alinhamentos significativos qbIAEQ00244.1IAE000244 Escherichia dbi1D90788.1ID9078B E.coli genomic dbiID9Q787,1ID90787 E.coli genomic emb1X94992.1IECNARG E.coli nitrite coli K-12 MG1655 section... 6SI O o DNA, Kohara clone #277(3... 657 0.0 DNA, Kohara clone #276(3... 657 O o extrusion gene and secon... 657 o o 52 156 2e-35 2e-12 _lâ 2e-12 _L2 2e-12 _Z2 2e-12 57 le-05 43 0.18 41 0.74 41 0.74 41 0.74 0.74 41 0.74 _li 0.74 41 0.74 41 0.74 41 0.74 _32 3.0 _22 3.0 3.0 _22 3.0 dbi I D2 60 5 7.11STYNARK Salmonella typhimurium genes for SmvA .. obIAE000220.1IAE000220 Escherichia coli K-12 MG1655 section.. dbiID90757.1ID90757 Escherichia coli genomic DNA. (27.3 - 2.. emb1X69189.1IECNARXLO E.coli narXL operon and partial narK .. embIX15996.1IECNARK E.coli narK gene and partial sequence o.. abIAF026945.1IAF026945 Homo sapiens cig64 mRNA, partial seq.. obIU32804.111)32804 Haemophilus influenzae Rd section 119 of. . obIAC009276.91AC009276 Homo sapiens chromosome 7 clone RP11.. obIAE003592.11AE003592 Drosophila melanogaster genomic scaf.. oblAF0989511IAF09B951 Homo sapiens breast câncer resistanc.. obl AF095856.11AF09585ÊÍ Homo sapiens asthmatic clone 4 mRNA, . . obIAF09585S.1IAF09585S Homo sapiens asthmatic clone 3 mRNA, .. obIAF100329.11AF100329 Dendrobium grex Madame Thong-IN ovgl.. oblAF013290.1IAF013290 Meloidogyne incógnita elongation fac.. embIX65318.2ICVPGEMEX2 Cloning vector pGEMEX-2 embIX653172ICVPGEMEX1 Cloning vector pGEMEX-1 obIL36849.11SYNSHBL Cloning vector pZEO (isolate SV1) phleo... refINM 015880.1I Homo sapiens RIG-like 14-1 (LOC51047), mRNA obIL36850.1lSYNLACZ Cloning vector pZEO (isolate SVLacZ) be... obIAE003496-11AE003496 Drosophila melanogaster genomic scaf...

As sequências compósito de várias amostras de doentes produzidas utilizando os iniciadores aqui descritos foram submetidas a análise FASTA. Os resultados destes indicam a presença no tecido de 0A de Janthinobacterium ou uma espécie bacteriana relacionada muito próxima com esta. Duas destas análises são apresentadas a seguir como exemplo.

Verificou-se por pesquisa de Blastn da base de dados do NCBI que a sequência compósita directa e reversa do tecido afectado do doente 21 (Fig. 12) representa Janthinobacterium. Esta sequência foi sempre encontrada em doentes com 0A.

Os 3 melhores alinhamentos desta sequência após uma pesquisa

Blastn de 13 de Novembro de 2000 foram: 2730 0.0 2714 0.0 2714 0.0 gil32019031gb|AF067655.1IAF067655 Uncultured Duganella clon... gi I 5738214Igb|AF174648.1IAF174648 Janthinobacterium lividum... giI2832894lemblY08846.1IJL16SRRN J.lividum 16S rRNA gene

Os alinhamentos actuais foram os seguintes: 54

»çi 133015031 gblAFOÉOfóS. II AíO 67655 Oncultored fiugantlla el<me C?HB-18 16S KKA gene, psxtiel SÊqueftCÈ· fcsntjth * 1453 SCO» * 2730 bits 11577), £x*>ect » 0.0 Kíentities = 1353/1406 (53%?

Ste&BíS “ FltíS / Fios

Owesfy: 4 4 cAtgcâàOt^ea^gcageacggagcttgetctggtggcgaçftggcgaaegggtgagfca 103 mi u ί Π I t Η Η Η η Μ i I Η Μ N 1 Η I U 9 I Π I Η Π I Μ Π S Μ Π Μ M í Sbjct; 27 catgEaagceÇisaeggcsgeacfígagct.tgçtctggtggegagtggcgiiacgggtgagta ®$

Qosry: 104 *fc*t*tegga*egtAeectag*gcggggg«t8acgtôgcgaaigttecsetaatiecgea 163 ΠΠί{1ίΗίΜΙ!Π)ΜίΙΙ!Η!Ιί!Μ!ΙΙΙί!ΐΠΠΙΗ(ίΗΗί)!!ΗΠ Stojçcí 87 atatatcfgeacgtácsj^tegâgtgggçgòtaacçtagsgaaegttacçctaeteecgcè 146

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π j n m n m π m 11! η n m h i m π m! i! í m m π m m η H

Sbjce: -H^fftasgateteaggstça-a.agtgggggfifccgea.B.giMrctcafcgctegtgçagGgisGcigaçat ííé

Otsery; 224 ctgattegctagttggtaggg&a&aageetaecaaggcaccgateagtagctggtctgag 203 ! Μ I Π ! Π t f ΪΊ I Μ Π Π Π Μ I S I Π l Η í: Π I Π Π 1 i! U H í t U i I Π M ! S ] Sbâctt .207 etgattegCtagttggtâgggtaa.aagcctaecaaggcaccgfltcagtaget.ggtGtgeg 266

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Sbjct: 1407 taaccgtaaggagggcgctt 1426 >giI5738214|gbIAF174648.1|AF174648 Janthinobacterium lividum 16S ribosomal RNA partial sequence

Length = 1486

Score = 2714 bits (1369), Expect « 0.0 Identities = 1391/1400 (99%)

Strand = Plus / Plus

Query: 4 4 catgcaagtcgaacggcagcacggagcttgctctggtggcgagtggcgaacgggtgagta 103 IIIIIIIIII I I I IIII I I I I I II I III I I I I I I IIIIIIIIIIIIIII I I I I I I I I I I I Sbjct: 27 catgcaagtfcgaacggcagcacggagcttgctctggtggcgagtggcgaacgggtgagta 86

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Uma sequência compósito (705 nucleótidos) do tecido afectado do doente 17 foi analisada da mesma forma, utilizando o iniciador directo F7 e os quatro melhores alinhamentos a partir de uma base de dados contendo 671 573 sequências foi: ablAF174 64 8.11AF174 64 8 Janthinobacterium lividum 16S riboso... 1315 0.0 ablAF067655.11AF067655 Uncultured Duqanella clone CTHB-18 1... 1315 0.0 db-i 1AB021388.11AB021388 Pseudomonas mephitica DNA for 16S r.. . 3?15 0.0 emblY08846.ll JL16SRRN J.lividum 16S rRNA aene 133-5 0.0 0 alinhamento actual para a primeira sequência apresentado a seguir: na lista é 64

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Isolamento de ARN e ADN a partir do fluido sinovial (SF)

As amostras discutidas previamente eram de biopsias mas num avanço significativo, foi agora também demonstrado que pode ser efectuado um diagnóstico a partir de uma amostra de fluido sinovial que pode ser obtido sem cirurgia num procedimento muito menos invasivo e traumático. A seguir é descrito um protocolo adequado.

Após recolha de SF do doente, o SF foi armazenado a 4°C., e após não mais do que 20 minutos foi centrifugado a 13000 rpm (aprox. 12500 g) durante 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o precipitado foi armazenado a -72 °C até ao isolamento de ARN/DNA. Foi adicionado 1 mL de solução de TRIzol ao precipitado. O precipitado foi dissolvido por agitação em vórtice e depois incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos. Foi adicionado 0,2 mL de clorofórmio à solução e foi então misturado por agitação em vórtice e depois incubado à temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução foi então centrifugada a 13000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. A fase aquosa, superior foi removida e o ARN foi isolado como descrito anteriormente. Foram adicionados 0,3 mL de etanol à fase de fenol-clorofórmio e a solução foi depois misturado por agitação em vórtice. A solução foi então incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi então centrifugada a 2000 rpm (aprox. 4500) durante 5 minutos a 4 °C. 0 sobrenadante foi removido e o precipitado foi lavado três vezes em 0,5 mL de 0,1 M de Na Citrato com 10% de etanol. Após cada lavagem foi centrifugado a 2000 rpm (aprox. 4500 g) durante 5 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi rejeitado. Após a última lavagem, o precipitado foi seco ao ar durante 30 minutos à temperatura ambiente. O precipitado foi ressuspenso em 80 pL de 8 mM de NaOH.

Exemplo 2 - Tratamento com Antibiótico de doentes com osteoartrite - Aspectos Clínicos

Neste estudo, foi utilizado um antibiótico eficaz contra uma vasta gama de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas.

Introdução:

Trinta doentes foram diagnosticados e tratados durante um mês com o antibiótico conhecido internacionalmente genericamente como Doxiciclina. Este foi adquirido como Vibramicina a Pfizer. As amostras de fluido sinovial foram retiradas antes e após tratamento. Métodos:

Identificaram-se 30 doentes que tinham sinais clínicos e radiológicos de Osteoartrite. Estes doentes foram informados e assinaram um papel de acordo com as instruções do comité de ética (Northern Norway Health Region 5). b 8

Utilizou-se o KOOS (Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score) [Roos et ai: Development of a self-administered outcome measure. Journal of Orthopaedic and Sports Physical Therapy 78 (2): 88-96, 1998] e a classificação de Lysholm [Ref. Tegner e

Lysholm: Rating systems in the Evaluation of Knee Ligament

Injuries. Clinicai Orthopaedics an Related Research Número 198 Setembro 1985: 43-49.] Durante a primeira visita retirou-se uma amostra do fluido sinovial. A técnica convencional, portal lateral superior, utilizando uma seringa de 10 mL. Se foi muito pouco liquido e não se aspirou fluido sinovial de uma vez, injectou-se 5-10 mL de soro fisiológico e aspirou-se de novo. As amostras foram imediatamente colocadas numa caixa de gelo e levadas para o laboratório. A todos os doentes foi dado Vibramicina a 100 mg por dia, durante 4 semanas. Dos doentes onde se encontrou a bactéria, retiraram-se novas amostras de fluido sinovial utilizando a mesma técnica.

Resultados Clínicos:

Observaram-se melhoras. É importante notar que neste sistema de classificação valores elevados significam que os doentes estão melhor. Valores baixos, mais sintomas, e. g., dor

Todos os valores melhoraram neste estudo. Uma melhora particularmente significativa é considerada quando os valores de p são: ^0,05. by KOOS: Estes parâmetros foram analisados.

Sintomas

Actividade do dia a dia

Desporto

Qualidade do dia a dia

Dor

Lysholm: 0-100. 100 é a melhor classificação possível e 0 é a pior.

Os resultados destes testes são apresentados em gráfico nas Figs. 16 a 21. A tabela 3 a seguir um resumo da resposta ao tratamento de antibiótico com tetraciclina durante quatro semanas conforme determinado por questões directas aos doentes de como se sentiam.

Amostra/Doente Estado após 4 semanas de tratamento 2 melhor 3 inalterado 4 inalterado 5 inalterado 6 melhor 7 melhor 8 inalterado 9 melhor 70 (coontinuaçao)

Amostra/Doente Estado após 4 semanas de tratamento 10 melhor 11 inalterado 12 inalterado 13 melhor 14 melhor 15 inalterado 16 melhor 17 inalterado 18 inalterado 19 inalterado 20 inalterado 21 inalterado 22 inalterado 23 inalterado 24 inalterado 25 inalterado 26 melhor 34 melhor

Conclusão

Estes resultados apoiam a hipótese de que a osteoartrite pode ser tratada com antibióticos. Vibramicina melhora todas as classificações clínicas para o doente.

Lisboa, 20 de Outubro de 2010 71

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agente antibacteriano na preparação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite bacteriana primária através do tratamento de uma infecção bacteriana que é responsável pela osteoartrite.
2. Utilização como reivindicada na reivindicação 1, em que o referido agente antibacteriano é eficaz contra Janthinobacterium.
3. Uilização como reivindicada em qualquer reivindicação anterior em que o referido agente antibacteriano é seleccionado do grupo compreendendo: claritromicina, levofloxacina, mercaptoetilguanidina, ciprofloxacinlactato, tobramicina, ceftazidimpentatidrato, gentamicina, ciproxina, rifampicina, doxiciclina, trimetroprim e sulfametoxazole.
4. Utilização como reivindicada em qualquer reivindicação anterior, em que o referido medicamento compreende dois ou mais agentes antibacterianos.
5. Utilização como reivindicada em qualquer reivindicação anterior, em que o tratamento compreende ainda a administração de um segundo medicamento contendo um outro agente antibacteriano ou um agente que pode degradar ADN.
6. Utilização como reivindicada na reivindicação 7, em que o referido segundo medicamento contém gentamicina, ciproxina ou DNase I. i
7. Utilização como reivindicada na reivindicação 6, em que o referido medicamento está na forma adequada para injecção.
8. Agente antibacteriano para utilização no tratamento de osteoartrite bacteriana primária, através do tratamento de uma infecção bacteriana que é responsável pela osteoartrite.
9. Produto contendo (a) um agente antibacteriano e (b) um antagonista do óxido nítrico como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial no tratamento de osteoartrite bacteriana primária através do tratamento de uma infecção bacteriana que é responsável pela osteoartrite.
10. Produto contendo (a) um agente antibacteriano e (b) um agente que pode degradar ADN como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial no tratamento de osteoartrite bacteriana primária através do tratamento de uma infecção bacteriana que é responsável pela osteoartrite.
11. Método de diagnóstico de osteoartrite in vitro num doente suspeito de ter osteoartrite, método esse que compreende o teste de uma amostra de uma articulação do referido doente quanto à presença de bactérias e, quando estão presentes bactérias, confirmar que a referida articulação está afectada por osteoartrite bacteriana primária.
12. Método como reivindicado na reivindicação 11, em que as bactérias são detectadas através da ligação de um ou mais oligonucleótidos ao ácido nucleico da referida bactéria. 2
13. Método como reivindicado na reivindicação 11 ou 12, em que a referida amostra é colocada em contacto com um par de iniciadores capazes de se ligarem a sequências alvo do ácido nucleico da referida bactéria.
14. Método como reivindicado na reivindicação 13, em que os referidos iniciadores são capazes de se ligarem a regiões no ARNr 16S das bactérias ou ao gene que o codifica.
15. Método como reivindicado na reivindicação 11, em que as bactérias são detectadas utilizando anticorpos.
16. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, em que a referida amostra é uma amostra de fluido sinovial.
17. Unidade de detecção de bactérias para utilização no diagnóstico de osteoartrite bacteriana primária num doente suspeito de ter osteoartrite.
18. Unidade de detecção de bactérias de acordo com a reivindicação 17, em que a referida unidade de detecção é um oligonucleótido.
19. Unidade de detecção de bactérias de acordo com a reivindicação 18, em que o referido oligonucleótido é um iniciador capaz de se ligar a sequências alvo no ácido nucleico da referida bactéria.
20. Unidade de detecção de bactérias de acordo com a reivindicação 19, em que o referido iniciador é capaz de se 3 ligar a regiões no ARNr 16S das bactérias ou do gene que o codifica. a um
21. Unidade de detecção de bactérias de acordo com reivindicação 17, em que a referida unidade de detecção é anticorpo. Lisboa, 20 de Outubro de 2010 4