PT1363509E - Composições contendo creatina e creatinina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES CONTENDO CREATINA E CREATININA"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a composições para consumo humano que compreendem creatina e creatinina e a um método para fornecer composições estáveis que contêm creatina.

Antecedentes da Invenção

Nos últimos anos houve um considerável interesse entre os atletas em creatina, que ocorre abundantemente no músculo do esqueleto. A creatina tem um papel importante na regulação e homeostase do metabolismo energético do músculo do esqueleto e é, agora, geralmente aceite que a manutenção de fosfo-creatina disponível seja importante para a continuação da produção de força muscular. A creatina também pode estar envolvida noutros processos relacionados com a síntese de proteína e hipertrofia de fibras musculares durante o treino. Embora a síntese de creatina ocorra no fígado, rins e pâncreas, soube-se, durante algum tempo, que a ingestão oral de creatina acrescentará ao corpo inteiro uma pool de creatina, e foi demonstrado que a ingestão de 20 a 30 g de creatina mono-hidratada (Cr.fbO), 2 ΡΕ1363509 por dia, durante vários dias, pode conduzir a um aumento superior a 20% do conteúdo de creatina total do músculo de esqueleto humano. Assim, o documento WO 94/02127 revela a administração de creatina mono-hidratada em quantidades de, pelo menos, 15 g (ou 0,2-0,4 g/kg de peso corporal) por dia, durante pelo menos 2 dias, para aumentar a força muscular.

Na realidade, constatou-se que após vários dias de suplementação (20 g por dia) com creatina mono-hidratada de forma a atingir uma elevação inicial da reserva de tecidos, depois disso, leva não mais que 2 a 3 g, por dia, para manter a concentração recentemente elevada. A suplementação com qualquer fonte de creatina biodisponível (i.e. suplementação de creatina) numa dose apropriada pode fornecer melhorias aos atletas envolvidos em eventos explosivos, os quais incluem todos os eventos que duram de alguns segundos a alguns minutos (tais como correr, nadar, levantar pesos, etc.). O desempenho da resistência em eventos que duram mais do que cerca de 30 minutos apresenta-se menos afectado pela suplementação de creatina excepto onde ela envolve curtos períodos de esforço energético acrescido, particularmente quando se esgotam as reservas locais de carbo-hidrato nos músculos. A creatina é um componente alimentar normal e não é um fármaco e sua utilização não é contrária aos regulamentos oficiais. É possível que os maiores benefícios de suplementação de creatina sejam experimentados pelos mais velhos, vegetarianos ou aqueles que não comem nenhuma carne ou 3 ΡΕ1363509 peixe, uma vez que estas pessoas tendem a ter baixos conteúdos de creatina no músculo. A Aloé Vera (Aloe barbadensis) é um membro da família Liliaceae e é uma planta suculenta do tipo cactos que cresce em climas amenos livres de congelação. Os índios mexicanos da América Central utilizaram Aloé Vera durante séculos como um remédio para queimaduras, para prevenir bolhas, úlceras pépticas e duodenais e todos os tipos de desordens do estômago e intestinos, infecções de rim, úlceras gástricas e locais como também para promover a longevidade. Hoje a Aloé Vera está ficando muito popular e seus benefícios são reconhecidos cientificamente. A principal utilização de Aloé Vera no passado foi prevenir a inflamação, particularmente da pele, especialmente depois de queimaduras, mas há muitas outras utilizações. Experiências e estudos de pesquisa apresentaram que depois de usar sumo de Aloé Vera, é melhorada a produção das enzimas digestivas e a população bacteriana dos intestinos. Deste modo houve um crescente interesse no extracto de Aloé Vera como um medicamento a ser tomado oralmente à medida que as pessoas se tornam mais familiarizadas com suas propriedades medicinais.

Entre os vários métodos de apresentação, há uma utilização crescente de extracto de Aloé Vera em refrigerantes que são aromatizados de fruta e estes são bastante saborosos. A inclusão de creatina num refrigerante 4 ΡΕ1363509 seria altamente desejável porque a bebida de extracto de Aloé Vera seria muito mais benéfica para a saúde que uma vulgar bebida de fruta sem suplementos.

0 sumo de Aloé Vera é ácido (geralmente pH próximo de 3). É bem conhecido que a molécula de creatina é instável em soluções aquosas a pH ácido ou neutro, e é convertida no composto relacionado creatinina. Isto é altamente significativo uma vez que a creatinina não tem nenhum efeito que aumente o desempenho do músculo e é excretado do corpo humano como um produto de excreção na urina. Devido ao precedente, o documento EP 0 669 083 ensina que bebidas aquosas para consumo humano compreendendo creatina devem ser debilmente alcalinas para limitar a conversão de creatina em creatinina, e esta tornou-se a opinião geralmente aceite.

Além disso, a creatina e seus derivados foram utilizados no passado mas apenas para a preparação de produtos com um sabor a carne ou segurelha. Por exemplo, Tonsbeek (EUA 3,615,600) revela e está relacionado com condimento artificial, descrevendo misturas que dão um sabor a carne às comidas. De igual modo Rooji (EUA 4,464,409) está relacionado com sabor a carne. Yamazaki (JP-A-59035663) prepara um sabor a carne aquecendo uma mistura que compreende creatina a pH 5,0-7,0 a uma temperatura de 80-130°C durante 30-120 minutos. Sob estas condições a maioria da creatina é convertida em creatinina. 5 ΡΕ1363509

Os inventores acreditam que não ocorreria aos peritos na técnica adicionar creatinina (até agora utilizado como um agente de condimento a carne ou segurelha) para composições que pretendiam ter um sabor (especialmente um sabor a fruta) diferente da carne ou segurelha. 0 perito na técnica poderia ter esperado a adição de creatinina para resultar numa combinação sem sabor a fruta ou carne, enquanto que na realidade os inventores determinaram que a combinação resultante não concede um sabor a carne indesejável. 0 documento WO 97/45026 revela uma composição acidica para consumo humano que compreende creatina e seus derivados, a composição que é fornecida como um pó seco ou na forma liquida ou semi-liquida. As composições reveladas aqui são estáveis a temperaturas refrigeradas (4°C) para períodos prolongados mas estável a temperatura ambiente durante períodos relativamente curtos (e.g. até, mas não excedendo, 7 dias). O documento WO 00/74500 revela composições que compreendem creatina e seus derivados suspensos em gel de Aloé Vera, cujas composições eram estáveis (no que respeita à conversão de creatina em creatinina) à temperatura ambiente durante 2 semanas ou mais, dependendo da concentração inicial de creatina na composição.

Os documentos WO 97/45026 e WO 00/74500 salientam o desejo de prevenir a conversão de creatina em creatinina, 6 ΡΕ1363509 e nenhum documento sugere a adição deliberada de creatinina a uma composição contendo creatina pretendida para consumo humano.

Seria uma grande vantagem apresentar uma composição para consumo humano, no qual a creatina era aqui substancialmente estável, até mesmo a pH acidico e a temperaturas ambientes.

Sumário da Invenção A presente invenção está relacionada com a provisão de composições para consumo humano que compreendem creatina e seus derivados, especialmente as composições apresentadas em médio aquoso, mais especialmente as composições (tal como bebidas) nas quais a creatina é fornecida em solução aquosa. 0 termo "creatina" como utilizado aqui pretende envolver todos os derivados biodisponiveis da creatina, tal como creatina mono-hidratada, fosfocreatina, e outros sais de creatina. A creatina mono-hidratada é particularmente preferida. Consequentemente o termo "creatina" deveria ser amplamente interpretado onde o contexto permite.

Como explicado acima, é bem conhecido que a molécula de creatina é instável em solução aquosa, especialmente a pH ácido (i.e. debaixo de pH 7) , sendo convertido em creatinina (Edgar & Shiver, 1925, J. Am. 7 ΡΕ1363509

Chem. Soc., 47, pág. 1179-1188; Cannan & Shore 1928 Biochem. J. 2_2, pág., 920-929). Isto apresenta um problema tentando fornecer bebidas noutras composições contendo creatina em quantidades fisiologicamente úteis, especialmente como bebidas são normalmente formuladas para ter um pH abaixo de 7.

Edgar & Shiver conduziram algumas investigações no equilíbrio que existe entre creatina e creatinina em solução aquosa e, em particular, o efeito na posição de equilíbrio pela utilização de tampões de pH diferente. Infelizmente, por várias razões, o trabalho de Edgar & Shiver não oferece nenhuma orientação prática útil ao perito na técnica para formular bebidas e outras composições nutricionais. Em primeiro lugar, a publicação por Edgar & Shiver é muito antiga e de interesse puramente académico, seria improvável para ser consultado por um perito na técnica de formular bebidas, e não tem uma ligação directa na formulação de bebidas. Em segundo lugar, e significativamente, Edgar & Shiver administraram as suas experiências utilizando soluções extremamente diluídas de creatina/creatinina (0,001 M, equivalente a 0,0149 g crea-tina/100 mL, creatina mono-hidratada que tem num peso molecular de 149) : ainda estes sejam apropriados para considerações puramente analíticas não têm nenhuma relevância para sistemas que compreendem elevadas concentrações (mais de 0,15 g creatina mono-hidratada ou equivalente 100 mL) de creatina e pretendem que forneça quantidades fisiologi-camente úteis de creatina numa bebida. Em terceiro lugar, ΡΕ1363509

Edgar & Shiver negligenciaram considerar a mudança em pH que acontece na conversão de creatina em creatinina e vice-versa - tal variação é provavelmente desprezível utilizando as misturas creatina/creatinina muito diluídas empregues por Edgar & Shiver, mas teria um impacto significativo a concentrações elevadas, tal como são desejáveis numa bebida, como descobriram os presentes inventores. Comentários geralmente semelhantes aplicados à publicação igualmente antiga por Cannan & Shore. A solução óbvia para a instabilidade de creatina seria simplesmente aumentar a concentração inicial de creatina na composição, de modo que a quantidade fisio-logicamente útil de creatina esteja presente na composição durante um período de tempo mais longo. Porém esta abordagem nada faz para prevenir ou inibir a conversão de creatina em creatinina. Além disso, a extensa conversão de creatina em creatinina é provavelmente para aumentar o pH da composição, como a reacção envolve a remoção de um ião de hidrogénio. Isto pode mudar o paladar e pode ser indesejável ao consumidor. Além disso, a creatina não é particularmente solúvel em água (especialmente a baixas temperaturas, e.g. 3-5°C à qual normalmente as bebidas são armazenadas), assim há uma concentração inicial máxima finita de creatina que não pode ser excedida. Além disso, a inclusão de excesso de creatina é indesejável, como a presença de creatina não dissolvida em formulações de bebida não é atractiva aos consumidores. Começando com uma solução de creatina resultariam numa bebida com menos que a 9 ΡΕ1363509 quantidade máxima de creatina em solução uma vez que alguma da creatina seria convertida em creatinina. Os inventores forneceram uma aproximação alternativa explicada a seguir.

Num primeiro aspecto a invenção fornece uma composição líquida aquosa para consumo humano que compreende creatina dissolvida e uma quantidade de creatinina suficiente para obter a creatina dissolvida substancialmente estável tal que pelo menos 75% de creatina na composição imediatamente após a formulação permanece imutável durante o armazenamento a temperaturas variando de 2 a 50°C durante um período de pelo menos 30 dias, a composição tendo um pH entre 2,5 e 8,5, em que a quantidade de creatina está presente ab initio, i.e. na formação da composição final. 0 conteúdo de creatinina da composição está presente ab initio, {i.e. na formação da composição final), em lugar de surgir durante o armazenamento da composição como resultado da conversão de creatina em creatinina. Ficará claro dos ensinamentos a seguir, pelo menos em algumas formas de realização, que a produção da composição (i.e. processando antes de formação das composições finais) pode envolver a conversão deliberada de creatina em creatinina. A estabilidade da creatina ab initio é comercialmente desejável, porque permite a exacta caracterização do conteúdo de creatina da composição (que pode, por exemplo, ser indicado na embalagem e no género) e permite aos consumidores calcular a dose exacta de creatina consumida. 10 ΡΕ1363509

Preferencialmente, a composição pode compreender extracto de Aloé Vera (tal como a possível de obter em Aloe Commodities Int. Inc. Farmers Branch, TX75234).

Os presentes inventores determinaram previamente que a conversão de creatina em creatinina em soluções aquosas pode ser marcadamente inibida pela própria creatinina, tal que uma mistura de creatina e creatinina pode rapidamente alcançar o equilíbrio e a creatina tornar-se substancialmente estável. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria particular, acreditam os inventores que a explicação para esta observação é que a conversão de creatina em creatinina é uma reacção reversível. Os inventores determinaram agora que, fornecendo creatina dissolvida em solução junto com uma quantidade apropriada de creatinina a conversão de creatina em creatinina (até mesmo numa composição ácida) pode ser largamente inibida ou até mesmo substancialmente prevenido mesmo a temperatura ambiente (i.e., 2-39°C) ou acima durante longos períodos (30 a 95 dias ou mais). Assim, em algumas formas de realização a composição como um todo pode convenientemente ser seleccionada para ser ácida (i.e. tenha um pH abaixo de 7,0) sem significativamente afectar adversamente a estabilidade da quantidade de creatina da composição. Em particular a composição desejável tem um pH entre 3,0 e 7,0 e mais preferencialmente entre 4,5 e 6,5. Tipicamente a composição tem um pH na gama de 4,5 a 5,5 o qual, para o paladar humano, tem um gosto refrescantemente aguçado sem ser muito ácido. 11 ΡΕ1363509

As composições de acordo com a invenção são substancialmente estáveis de forma que a creatina pode estar presente até mesmo em formulações ácidas, ao contrário do ensinado na técnica, em quantidades fisiologicamente úteis, seguidas de armazenamento durante prolongados periodos à temperatura ambiente. Uma quantidade fisiologicamente eficaz de creatina é uma quantidade suficiente para causar um aumento mensurável no conteúdo de creatina dos tecidos de um sujeito a seguir ao consumo repetido da composição, relativo ao nivel da linha de base inicial. Os métodos de medição do conteúdo da creatina dos tecidos de um sujeito são conhecidos (e.g. Harris, Hultman & Nordesjo (1974) Glicogénio, intermediários glicolíticos e fosfato de elevada energia em amostras de biopsia de músculos quadríceps femorais do homem em repouso. Os métodos e variância dos valores. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 33, 109-120; Dunnett, Harris & Orme (1991) cromatografia líquida de elevado desempenho de par iónico de fase reversa de fosfocreatina, creatina e creatinina em músculo de equino. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 51, 137-141). O termo "substancialmente estável" é aqui definido referindo a uma composição de creatina/creatinina na qual pelo menos 75% da creatina na composição imediatamente depois da formulação do produto final está inalterada, e consequentemente não se converteu em creatinina, durante o armazenamento numa gama de temperatura de 2 a 50°C durante um período de pelo menos 30 dias 12 ΡΕ1363509 de armazenamento. A estabilidade da creatina depende do pH; o último diminui com a temperatura crescente. (O "produto final" é uma composição produzida após todos os passos de processamento e produção estarem completos.)

Os inventores determinaram que um aumento de 20°C na temperatura pode diminuir o pH até 0,3 unidades. A gama de temperatura à qual a composição será sujeitada (e.g. num frigorifico ou num armazém) está tipicamente entre 2 a 50°C. A composição será suficientemente estável tal que 75% dos restos de creatina acima da gama de temperatura de 2 a 50 °C a seguir ao período de pelo menos 30 dias, mais preferencialmente 60 dias, e preferencialmente pelo menos 120 dias, durante o armazenamento. De modo a especificar a estabilidade é necessário especificar o pH (que deve ser medido à temperatura à qual a solução será armazenada) ao qual a estabilidade é requerida. O pH é alterado por aquecimento ou arrefecimento de uma solução tamponada e na gama de temperaturas à qual uma solução pode ser armazenada a razão de equilíbrio creatina:creatinina pode variar largamente. Porém, se a composição é estável a 50°C então o seu conteúdo de creatina não diminuirá em armazenamento a mais baixa temperatura.

Como mencionado acima, a razão mole:mole de creatinina a creatina para alcançar a estabilidade de creatina, é determinado para depender do pH da solução e gamas de 1:2 para pH 7 a 3,8:1 para pH 4,25. É preferido que a razão mole:mole de creatinina a creatina não seja 13 ΡΕ1363509 mais que 10:1. Mais preferido é uma razão de não mais que 5:1. Mais preferido é uma razão de creatinina a creatina que não é muito elevada (desde que a creatinina seja um ingrediente inactivo) e o pH mais preferido seja 5 a 7 onde a razão mole:mole de creatinina para creatina varia de aproximadamente 1,2:1 a 1:2.

Com a finalidade da invenção, a creatinina pode ser acrescentada à creatina como uma substância pura ou a creatinina pode ser produzida in situ por aquecimento da creatina em solução, preferencialmente a baixo pH e.g. pH 2 a 3. É muito conveniente para a solução ser aquecida e mantida durante pelo menos 30 minutos a 90°C ou mais porque estas são as condições frequentemente utilizadas para a esterilização de um liquido para venda comercial. (Alternativamente, uma "dose de aquecimento" de esterilização equivalente pode ser fornecida aquecendo a temperaturas mais elevadas durante períodos de tempo mais curtos ou vice versa.) Noutras formas de realização, a creatinina pode ser preparada por aquecimento de uma solução de creatina durante várias horas a pH 2 a 3 e de seguida acrescentando-a a uma solução de creatina a pH mais elevado (e.g. pH 7) e ajustando a mistura final ao pH desejado (e.g. pH 5) . Se preciso for a solução pode então ser re-esterilizada sob as condições supracitadas. Neste método de preparação, pode haver pouca ou nenhuma conversão adicional de creatina para creatinina e a estabilidade é assegurada imediatamente depois de misturar as duas soluções. Este método tem vantagens porque a creatina não é muito solúvel em água 14 ΡΕ1363509 quando arrefecida num frigorífico, enquanto que a creatinina é muito mais solúvel. Produzindo uma solução estável de creatina por este método isto é possível de formular uma bebida que contém uma quantidade relativamente maior de creatina estável do que poderia ser alcançado caso contrário. Assim por isto significa, é possível produzir uma bebida adequada para refrigeração que contenha até 1,2 g de creatina/100 mL (ou 1,4 g de creatina mono-hidratada) ou uma bebida adequada para armazenamento a temperaturas ambientes de 18 a 25°C que contenha até 1,5 g de creatina/100 mL (ou 1,7 g de mono-hidrato/100 mL de creatina).

Uma vantagem adicional da invenção é que capacita a provisão de uma composição que compreende a concentração máxima de creatina dissolvida disponível (sob as condições pertinentes de pH e temperatura), mas utilizando a quantidade mínima necessária de creatina, numa formulação estável, e assim não requer a utilização de creatina de excesso.

Uma forma de realização preferida da invenção é uma bebida aquosa, especialmente uma a pH ácido (i.e. abaixo de pH 7) , e em particular que tenha um pH na gama 4-6,5, especialmente 4,5-5,5, e que compreende pelo menos 0,15 g de creatina (ou creatina mono-hidratada e do género) por 100 mL. Preferencialmente a bebida compreende pelo menos 0,3 g de creatina (ou creatina mono-hidratada e do género) por 100 mL, mais preferencialmente pelo menos 0,4 g 15 ΡΕ1363509 por 100 mL, e muito preferencialmente pelo menos 0,5 g por 100 mL. A composição pode compreender uma solução de creatina e creatinina em água sem componentes adicionais (como por exemplo aromatizante) como uma solução em água e.g. água mineral ou água carbonatada que utilizam processos que são bem conhecidos desses peritos na técnica.

Preferencialmente contudo a composição pode compreender um ou mais componentes adicionais para melhorar seu paladar, estabilidade, aroma ou qualidade nutritiva. Estes componentes adicionais podem incluir electrólitos, ou podem ser seleccionados do grupo que consiste de: vitaminas, lípidos, proteínas, carbo-hidratos, polióis (como etilenoglicol, glicerol, sorbitol etc.), aminoácidos, elementos de rastreio, corantes, aromatizantes, adoçantes artificiais, substâncias naturais que melhoram o desempenho e a saúde, antioxidantes, estabilizadores, conservantes, e tampões.

Podem ser incluídas vitaminas com vantagem na composição da invenção. Estes podem ser adicionados em quantidades que variam de 20 a 100% da sua dosagem diária indicada (RDA). Os seguintes são típicos daqueles que são úteis: vitamina E, vitamina C, tiamina, riboflavina, niacina, vitamina B6, folacina, vitamina B12, biotina, e ácido de pantoténico. 16 ΡΕ1363509

Em alguns casos pode ser desejável um componente lipídico. 0 conteúdo de proteína (se algum) pode estar presente como soja ou proteínas de leite (e.g. soro ou caseína) . 0 conteúdo de carbo-hidrato (se algum) ou a composição pode estar presente como amido (particularmente amido solúvel) e/ou açúcares. Os açúcares que podem estar presentes na composição incluem glicose, frutose, sacarose, lactose e maltose.

Adoçantes artificiais que podem ser utilizados incluem Aspartame, Acesulfam K, Saccharin e Cyclamate. Quase nenhum aroma desejado pode ser adicionado, preferencialmente sabores a frutos tal como baga, limão, laranja, mamão e toranja. Contudo, a pH menos ácido (e.g. acima de 5,0) podem ser utilizados outros sabores tal como chocolate, malte, caramelo e outros sabores adequados para "bebidas lácteas". Também pode ser utilizado ácido cítrico como um acidulante e citrato e fosfato (e.g. citrato de sódio ou fosfato) como um agente tampão. Podem ser utilizados outros agentes tampão para regular a acidez da bebida. Também podem ser adicionadas outras substâncias naturais que melhoram a saúde em quantidades fisiologi-camente activas. Os seguintes são típicos daqueles que são úteis: chá de Pau D'Arco, Ginseng, chá de Suma, Ginkgo, pólen de abelha, mirra, hidroxi-metil-butirato, glutamina, di-tri-, e polipeptídeos que contêm glutamina, ribose, cafeína, e ácido lipóico.

Os conservantes podem ser fornecidos tipicamente através de benzoato de potássio e/ou sorbato de potássio. 17 ΡΕ1363509

Os corantes podem ser fornecidos, tipicamente usando um corante solúvel em água fria como beta-caroteno. Outros corantes adequados serão aparentes para esses peritos na técnica.

Pode ser incluído na composição um agente de turvação, se desejado, para melhorar a aparência da composição .

Também podem ser adicionados elementos minerais e de vestigiais em qualquer tipo ou forma que seja adequada para consumo humano. É conveniente fornecer o cálcio e potássio na forma dos seus gluconato, fosfatos ou hidro-geno-fosfatos, e magnésio como o óxido ou carbonato, crómio como picolinato de crómio, selénio como selenita de sódio ou selenato, e zinco como gluconato de zinco. Tipicamente as quantidades são: - sódio a 400 mg/litro, cálcio a 100 mg/litro, cloreto a 600 mg/litro, potássio a 200 mg/litro, magnésio a 75 mg/litro e fósforo a 50 mg/litro, crómio a 125 μg/litro, selénio a 125 μg/litro e zinco a 15 mg/litro.

Porque bebidas líquidas nas quais a creatina é completamente solúvel, a quantidade de creatina (calculada como o mono-hidrato daqui em diante) por litro ou por kg de composição preparada pode variar de 1,5 g a 24 g com um conteúdo preferido de cerca de 12 g por litro. O tamanho normal da porção está na gama 200-750 mL, fornecendo aproximadamente 2 a 7 g, preferencialmente cerca de 5 g de creatina. Durante os primeiros 4 dias de suplementação de 18 ΡΕ1363509 creatina o consumo indicado é aproximadamente de 2,0 litros por dia, dividido em 4 ou 5 partes por dia para alcançar a saturação de creatina. Isto é seguido por 1 porção de 250-750 mL por dia que contém aproximadamente 2-3 g de creatina para fornecer um nível suficiente de creatina para manter saturação. A invenção também se refere para um método de preparar a composição aquosa contendo creatina líquida definido acima. Assim, num segundo aspecto a invenção fornece um método de preparar uma composição aquosa contendo creatina líquida para consumo humano, o método compreende o passo de fornecimento, na mesma composição, creatina dissolvida e creatinina suficiente ab initio para obter a creatinina suficientemente estável tal que pelo menos 75% da creatina na composição imediatamente após a formulação permaneça imutável durante o armazenamento na gama de temperatura de 2°C a 50°C durante um período de pelo menos 30 dias. Preferencialmente o meio aquoso é água ou uma solução aquosa. O método normalmente também incluirá o passo de fornecer água ou uma solução aquosa, preferencialmente em quantidade suficiente para dissolver substancialmente toda a creatina e creatinina na composição.

Ficará claro a esses peritos na técnica que a ordem de adição dos componentes para a composição geralmente não é significativa, e será suficiente qualquer sequência de passos que fornecem o objecto da invenção. Assim, por exemplo, podem ser adicionadas a água ou um médio aquoso, creatina sólida e creatinina sólida (simulta- 19 ΡΕ1363509 neamente ou separadamente); ou podem ser acrescentados água ou um médio aquoso a creatina sólida e/ou creatinina.

Consequentemente, numa forma de realização o segundo aspecto da invenção fornece um método de preparar uma composição líquida aquosa que contém creatina para consumo humano na qual a creatina é substancialmente estável (como definido aqui), o método que compreende os passos de: fornecer uma solução de creatina; e sujeitando a solução de creatina a condições adequadas para pelo menos converter parcialmente a creatina a creatinina, formando assim creatinina ab initio para fazer a creatina na composição resultante substancialmente estável (como definido aqui). 0 método tipicamente compreenderá o passo adicional de embalar a composição em recipientes adequados e.g. garrafas de vidro ou plástico, saquetas de folha, latas de alumínio etc.

Preferencialmente o método é tal que sujeitando a solução de creatina a condições adequadas envolve o aquecimento da solução sobre da temperatura ambiente média. Num método preferido, a solução é aquecido a 90°C durante 30 minutos.

Noutra forma de realização, a invenção fornece um método de preparar uma composição líquida aquosa que contém creatina para consumo humano na qual a creatina é substancialmente estável (como definido aqui), o método que compreende os passos de: fornecer uma solução de creatina; fornecer uma solução de creatinina; e misturando as 20 ΡΕ1363509 soluções para formar uma composição resultante na qual há creatinina suficiente ab initio para obter a creatina substancialmente estável (como definido aqui).

Neste método o pH da solução de creatinina é preferencialmente mais baixo que o pH da solução de creatina. Desejavelmente o pH da solução de creatinina está na gama de 2,5 a 3,5, e o pH da solução de creatina está preferencialmente na gama de 4,0 a 6,5 com ajustamento, se necessário, do pH final ao nível desejado.

Noutra forma de realização a invenção fornece um método de preparar uma composição líquida aquosa que contém creatina para consumo humano no qual a creatina é substancialmente estável (como definido aqui), o método que compreende os passos de: fornecer creatina sólida; fornecer creatinina sólida; e misturando os dois sólidos para obter uma composição resultante que, quando dissolvida em solução aquosa, fornece uma composição na qual há creatinina suficiente para obter a creatina substancialmente estável (como definido aqui). Tipicamente este método ainda compreenderá o passo de adicionar água suficiente ou solvente aquoso para dissolver substancialmente a composição resultante. Se desejado a água ou solvente aquoso pode ser pré esterilizado por tratamento de calor e/ou filtração.

Vantajosamente, o desempenho do método do segundo aspecto resultará numa composição de acordo com o primeiro aspecto definido acima. 21 ΡΕ1363509

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As figuras 1 e 2 são os gráficos da concentração de creatina (como g por 100 mL, e como a percentagem da concentração inicial, respectivamente) em soluções de pH diferente contra o tempo (como descrito no Exemplo 2); A figura 3 é um gráfico da razão mole:mole de creatinina (Cn) para creatina (Cr) em soluções de diferente pH depois de 124 dias de incubação (como descrito no Exemplo 2);

As figuras 4 e 5 são gráficos de uma concentração de creatina (como g por 100 mL, e como a percentagem da concentração inicial, respectivamente) contra o tempo onde uma mistura de creatina e creatinina em soluções de diferente pH foi incubada até 95 dias (como descrito no

Exemplo 3); A figura 6 é um gráfico da razão mole:mole de creatinina para creatina contra pH para soluções estáveis após 6 semanas de incubação a 39°C (como descrito no Exemplo 5); A figura 7 é um gráfico da razão mole:mole de creatinina para creatina contra pH para soluções estáveis após 6 semanas de incubação a 2°C, 22°C e 39°C (como descrito no Exemplo 5); 22 ΡΕ1363509 A figura 8 é um gráfico da razão mole:mole de creatinina para creatina contra pH para soluções estáveis após 6 semanas de incubação a 22°C (como descrito no Exemplo 5), também é apresentado uma linha polinomial de 7a ordem de melhor ajustamento: Y = -Ο,ΟΟΙχ7 + 0, 077x6 - l, 693x5 + 20,594x4 - 149, 615x1 + 649,397x2 - 1560,343x + 1603,236 r = 1,000

EXEMPLOS

Exemplo 1

Este exemplo refere-se um conveniente método de análise in vitro para determinar a concentração de creatina numa solução. 1. 0 pH de cada solução era determinado com um medidor de pH. 2. As misturas foram armazenadas num gabinete escuro a temperatura ambiente (circa 22°C) num laboratório. 1

Foram recolhidas amostras de 2-3 mL de solução após períodos de tempo entre 0 e 124 dias e armazenaram congeladas a -30°C até analisado imediatamente ou dentro de um a dois dias. 23 ΡΕ1363509 4. As amostras foram descongeladas e dissolvidas em água destilada para dar uma diluição adequada e a concentração de creatina de cada uma foi determinada pelo método de Harris et al, (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 33, 1974, 109-120). Rapidamente, o ensaio foi realizado na presença de (concentração final) tampão de trietanolamina a 100 mM de pH 8,5; acetato de magnésio a 10 mM; EDTA a 1 mM; KC1 a 30 mM; fosfoenolpiruvato a 1 mM; adenosinatrifosfato a 2 mM (ATP); nicotinamida-adenina-dinucleótido/forma reduzida (NADH) 0,18 mM; cinase de creatina (CK); cinase de piruvato (PK) , e desidrogenase de lactato (LDH) . A concentração de creatina foi determinada a partir da oxidação de NADH medida fotometricamente a 340 nm.

CK: Cr + ATP —» PCr + ADP PK: ADP + PEP ATP + Piruvato LDH: Piruvato + NADH —» Lactato + NAD

Exemplo 2 O objectivo deste ensaio era determinar a estabilidade da creatina quando aquecida a 90°C a diferentes pH e as soluções permaneceram a temperatura ambiente até 124 dias. A 90°C a conversão de creatina para creatinina ocorre geralmente muito rapidamente.

Soluções em água de 2 g de creatina mono-hidratada em 100 mL de ácido cítrico a 0,1 M - tampões fosfato de potássio a 0,1 M a pH 3, 4, 5, 6 e 7 foram aquecidos a 90°C durante 30 minutos. As soluções foram - 24 - ΡΕ1363509 rapidamente arrefecidas, o pH (que tinha variado) medido novamente e depois permaneceu à temperatura ambiente como descrito no Exemplo 1. Foram retiradas alíquotas aos 7, 15, 29, 43, 57, 89 e 124 dias e armazenadas a -30°C e subsequentemente analisadas para creatina. Foi medido o pH de cada amostra. A concentração de creatinina foi estimada a partir da diferença entre o nivel de partida (2 g de creatina mono-hidratada) e o nivel de creatina medido (calculado como o mono-hidrato).

Resultados

Como apresentado nas Figuras 1 e 2, houve uma conversão rápida de creatina a creatinina após os 30 minutos de aquecimento. Porém, a extensão de conversão dependeu do pH da solução, sendo progressivamente maior com o pH mais baixo. No armazenamento durante 30 dias ocorreu um decréscimo adicional na concentração de creatina. Entre os 30 e 124 dias o nivel de creatina alcançou a estabilidade a todos os pH. A figura 3 mostra a razão molermole de creatinina e creatina ao dia 124 (17,7 semanas) a diferentes pH a partir do qual foi possível calcular a quantidade de creatinina exigida para obter a creatina mais e estável.

Conclusão

Começando com uma composição que compreende creatina e nenhuma creatinina leva 4 semanas ou mais para solu- 25 ΡΕ1363509 ções incubadas a 22°C para alcançar a estabilidade. O tempo tomado para alcançar a estabilidade aumenta a pH inferior uma vez que deve ser convertida mais creatina a creatinina. A quantidade de creatinina exigida para obter uma solução de creatina estável depende do pH da solução. Geralmente, a quantidade de creatinina requerida aumenta com o pH decrescente. Porém, a cada pH é possível predizer a razão de creatinina a creatina que alcançaria a estabilidade máxima.

Exemplo 3 0 objectivo deste ensaio era determinar o efeito da creatinina na proporção de 1:1 (w/w) para creatina mono-hidratada na estabilidade de creatina a diferentes pH depois de aquecer a mistura durante 30 minutos a 90°C.

Foram dissolvidas quantidades de 1,5 g de creatina mono-hidratada e 1,5 g creatinina em 100 mL de tampões citrato a 0,2 M - fosfato de potássio a 0,2 M a pH 3, 4, 5, 6 e 7. As soluções foram aquecidas a 90°C durante 30 minutos, arrefecidas, o pH medido novamente e permaneceu a temperatura ambiente (22°C) até 95 dias.

Resultados

Como apresentado nas Fig. 4 e 5, a pH 6 e 7 não houve nenhuma perda de creatina durante o período de aquecimento. Perdas pequenas mas progressivamente maiores aconteceram a pH 5, 4 e 3 com o tempo. 26 ΡΕ1363509 A estabilidade da creatina aconteceu a todos os pH. A pH 5, 6 e 7 havia uma tendência para aumentar a concentração de creatina.

Conclusões

Na presença de uma quantidade suficiente de creatina (a qual para pH 5, 6 e 7 era iqual a ou inferior a uma razão de peso creatinina:creatina mono-hidratada de 1:1), a creatina é excepcionalmente estável, até mesmo quando aquecida durante 30 minutos a 90°C. Com uma quantidade insuficiente de creatinina (para amostras a pH 3 e 4) aquecendo durante 30 minutos a 90°C também resultou na produção suficiente de creatinina para obter a restante creatina estável durante pelo menos 95 dias.

Exemplo 4

Este exemplo ilustra um método de aquecer uma solução de creatina para formar creatinina e acrescentar isto numa bebida aromatizada que contém creatina para dar uma concentração que é substancialmente estável. Simultaneamente é desejado que a concentração de creatina restante esteja perto de sua solubilidade máxima tal que não precipitará fora do frigorifico a 3°C. Esta é uma exigência para a maioria das bebidas uma vez que elas podem ser arrefecidas num frigorifico antes do consumo. 27 ΡΕ1363509

Passo 1 Foram dissolvidas 5 g de creatina mono-hidratada em 100 mL de ácido cítrico 0,1 M (pH 3) e aquecido a 90°C durante duas horas. Isto converteu a maioria da creatina em creatinina.

Passo 2 A solução foi preparada contendo 5 g de creatina mono-hidratada em 650 mL de tampão citrato 0,1 M a pH 5 à temperatura ambiente, sem aquecer. Além disso, a solução continha 15 por cento de sumo de Aloé Vera, aromatizante e dextrose para adoçar.

Passo 3 AS soluções de passos 1 e 2 foram depois misturadas e aquecidas a 90°C durante 30 minutos para esterilizar a mistura e depois colocar numa garrafa de vidro ou de plástico e armazenadas a 22°C. As 5 g de creatina mono-hidratada adicionadas no passo 2, permaneceram substancialmente estáveis na formulação do produto final. A anterior bebida quando colocada num frigorífico a 3°C não precipita a creatina. Na presença de creatinina foi determinado que a máxima solubilidade de creatina num frigorífico a 3°C é aproximadamente 1,2 g/100 mL (equivalente a aproximadamente 1,4 g de creatina mono-hidratada) .

Exemplo 5 É bem conhecido dos peritos na técnica que quando as soluções tampão são aquecidas o pH diminui. Assim um 28 ΡΕ1363509 tampão citrato-fosfato 0,1 a 0,2 M com um pH de 4,75 a 20°C vai aquecer a 40 °C mudando para pH 4,5. Reciprocamente arrefecendo uma solução tampão aumentarão o seu pH. Estas mudanças em pH afectarão a razão mole:mole de creati-na:creatinina necessária para alcançar estabilidade de acordo com a relação ilustrada graficamente na Fig. 3. Assim a relação mudará de aproximadamente 1,7:1 a pH 4,75 a 2,5:1 a pH 4,5. Assim uma composição que é estável a 20°C mudará para uma nova composição estável quando armazenada a 40°C. 0 objectivo deste exemplo é estabelecer e comparar as razões requeridas para estabilidade a 2°C, 22°C e 39°C numa gama de pH que rondam 3,8 a 8,25.

Protocolo 1. 2.

Foram preparados tampões de ácido cítrico 0,2 M -fosfato de potássio 0,2 M a pH 3,8 e 8,25 Utilizando as soluções de 1. acima foram preparadas as seguintes soluções à temperatura ambiente: a) creatina mono-hidratada 67,06 mM em tampão a pH 3,8 (1 g em 100 mL) b) creatinina 67,06 mM em tampão a pH 3,8 (0,758 g em 100 mL) c) creatina mono-hidratada 67,06 mM em tampão a pH 8,25 (1 g em 100 mL) d) creatinina 67,06 mM em tampão a pH 8,25 (0,758 g em 100 mL)

As soluções 2a e 2c estavam misturados em várias proporções para obter soluções de creatina mono-hidratada a 67,06 mM com valores de pH como segue: 3 . 29 ΡΕ1363509 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6, 0, 6,25, 6,5, 6, 75, 7, 0, 7, 25, 7, 5, 7, 75, 8,0, 8,25 4. Semelhantemente, as soluções 2b e 2d foram misturados em várias proporções obter soluções de creatinina 67,06 mM aos mesmos valores de pH identificados no 3 acima. 5. As soluções de creatina mono-hidratada e creatinina dos passos 3 e 4 estavam misturados, para formar soluções aos valores correctos de pH necessários para produzir a razão mole:mole de creatinina para creatina apresentados em Tabela 1 (inicialmente derivam da Fig. 3) num volume final de 10 mL num tubo de vidro com tampa de rosca. Foram preparadas amostras em triplicado. 6. As amostras foram tapadas e esterilizadas com calor durante 30 minutos a 90°C. 7. Um conjunto de amostras foi armazenado a 2°C, outro conjunto a 22°C e o conjunto final armazenado a 39 °. 8. Foram retiradas alíquotas após 5 e 6 semanas para medição de pH e análise de creatina pelo método enzimático descrito no Exemplo 1 e na 6a semana amostras para creatinina pelo método de picrato alcalino (utilizando um "Kit de Diagnóstico de Creatinina" método de ponto final; kit fornecido por Sigma-Aldrich Company Limitada, Poole, Dorset, Reino Unido). Apesar da semelhança química da creatina e creatinina, o anterior não dá nenhuma reacção com o método de picrato alcalino. 30 ΡΕ1363509

Tabela 1. Razões mole:mole de creatinina para creatina inicialmente adicionada no exemplo 5 (em todos os casos a concentração total final de creatinina + creatina é 67,06 mM.)

Temperatura 22C to to 10 O 39eC de Incubação pH inicial= 3, 8 oo/1 oo /1 oo/1 4,0 3,90/1 oo /1 oo/1 4,2 2,75/1 3,90/1 oo/1 4,4 2,10/1 2,75/1 3,90/1 4,6 1,55/1 2,10/1 2,75/1 4,8 1,12/1 1,55/1 2,10/1 5, 0 0,92/1 1,12/1 1,55/1 5,2 0,80/1 0,92/1 1,12/1 5,4 0,70/1 0,80/1 0,92/1 5, 6 0,62/1 0,70/1 0,80/1 5, 8 0,56/1 0,62/1 0,70/1 6, 0 0,49/1 0,56/1 0,62/1 6,25 0,43/1 0,49/1 0,56/1 6,5 0,38/1 0,43/1 0,49/1 6, 75 0,335/1 0,38/1 0,43/1 7,0 0,30/1 0,335/1 0,38/1 7,25 0,27/1 0,30/1 0,335/1 7,5 0,24/1 0,27/1 0,30/1 7,75 0,21/1 0,24/1 0,27/1 8, 0 0,18/1 0,21/1 0,24/1 8,25 0,15/1 0,18/1 0,21/1 31 ΡΕ1363509

Resultados A análise do conteúdo de creatina das amostras das soluções incubadas a 39°C não mostrou nenhuma variação significativa entre as semanas 5 e 6. A variação média na concentração foi de + 0,76 (SD 1,3) mmol/L que corresponde a um aumento de apenas 0,113 g de creatina mono-hidratada por litro. A variação de percentagem das semanas 5 e 6 nestas amostras foi de 3,1 (3,8)% que é da mesma ordem como o erro analítico do método.

Como apresentado na Figo 6, a 39°C a razão creatinina para creatina aumenta rapidamente em amostras onde o pH final está entre 4,6 (aproximadamente 2,1:1) e 3,7 (aproximadamente 10,0:1). Entre pH 5,2 e 8,8 a razão é igual a ou inferior a 1,0. A pH superior a 6,0 a razão diminui aproximadamente linearmente de 0,9 para uma razão a pH 8,8 de 0,6.

Apesar de começar ao mesmo pH e com concentrações iguais de creatina e creatinina, havia diferenças claras no pH no final de 6 semanas de incubação a 2, 22 e 39°C (tabela 2). Em todos os casos as soluções incubadas a 39°C tinham o pH mais baixo e aqueles a 2°C o pH mais elevado. O pH final atingido é o resultado directo de: a) O efeito imediato de temperatura na actividade de ião hidrogénio das soluções, uma vez que o 32 ΡΕ1363509 aumento da temperatura provoca uma diminuição no PH; e b) 0 efeito de conversão de creatina a creatinina, um processo que remove iões hidrogénio aumentam o pH, ou, a conversão de creatinina a creatina que liberta iões hidrogénio e provoca uma diminuição no pH, até que é atingido o equilíbrio entre as concentrações de creatina e creatinina. A extensão de qualquer mudança dependerá em como distante as concentrações iniciais de creatina e creatinina estão das do equilíbrio e será maior ao começar apenas com creatina ou creatinina (como em Exemplo 2) . Este pode ser um processo lento e, como apresentado em Fig. 2, pode levar 8 semanas com uma solução de pH baixo, composta inicialmente só de creatina. (Como a temperatura de incubação no Exemplo 2 era de 22°C então seria esperado um tempo ligeiramente mais curto para alcançar equilíbrio a 39°C.) A magnitude da variação provocada no pH pela interconversão de creatina e creatinina é dependente das concentrações absolutas de creatina e creatinina, como também a capacidade de tampão dos meios utilizados. Porém, um conhecimento destes factores permite soluções de composições finais conhecidas de creatina e creatinina e pH a ser preparado. 33 ΡΕ1363509

Tabela 2. O efeito da temperatura no pH de uma solução de creatina e creatinina de 67 mmol/L (concentração combinada) feita em tampões fosfato de potássio - ácido cítrico 0,2 M, após 6 semanas de incubação para permitir a obtenção do equilíbrio. N2 pH @ 22C 0 222C 0 392C 1 4,0 3,7 3, 6 2 4,5 4,2 4,0 3 4,9 4,6 4,4 4 5,1 4,8 4,7 5 5,3 5, 0 4,9 6 5,5 5,2 5,2 7 6,1 5,8 5,9 8 6,5 6,3 6,4 (o valor do pH inicial era essencialmente como indicado para as amostras incubadas a 22°C). A razão mole:mole final de creatinina para creatina das soluções preparadas com o mesmo pH inicial não era idêntico nos três conjuntos de incubações. Porém, como apresentado na Fig. 7, a razão mole:mole de creatinina para creatina para as 3 temperaturas estava muito perto de uma da outra quando foram comparados com o pH final de cada solução. Assim a razão molermole no equilíbrio de soluções de creatina e creatinina a diferente pH, são principalmente influenciados pelo pH e não pela temperatura. 34 ΡΕ1363509 A Fig. 8 apresenta a razão mole:mole de crea-tinina para creatina das soluções aos diferentes pH no final de 6 semanas de incubação a 22 °C juntamente com a linha polinomial de 7a ordem que melhor se ajusta a estes dados (coeficiente de regressão, r = 1,00). As razões previstas por esta linha são idênticas às apresentadas na Fig. 3 obtidas após 17,7 semanas de incubação a 22°C, mas em que as soluções eram inicialmente compostas apenas de creatina e nenhuma creatinina. Isto confirma os dados do exemplo presente.

Discussão e Conclusões

Começando com soluções compostas de creatina a creatinina em razões molermole próximas das da Fig. 3 para estarem essas no equilíbrio, a estabilidade foi alcançada em 6 semanas quando incubadas entre 2 e 39°C, e antes das 5 semanas quando incubadas a 39°C. Mais provavelmente o equilíbrio foi alcançado muito mais cedo a todas as três temperaturas. Os resultados apresentados nas Fig. 6 a 8 relacionam a creatina e creatinina quando em equilíbrio estável entre si e pode ser utilizado para construir razões moleimole de creatinina para creatina a qualquer pH de 3,8 a 8,8 o qual quando misturado estaria imediatamente a equilíbrio estável. À temperatura ambiente (22°C) a um pH final de 4,6, a razão creatinina para creatina era 2,1:1. Este é o limite superior considerado como sendo prático para uma 35 ΡΕ1363509 bebida estável que contém creatina. Abaixo de um pH final de 4,6, a quantidade de creatinina para manter a estabilidade de creatina é esbanjar excessivo de material e não é prático. A um pH final de 5,2 a relação é aproximadamente 1,0:1 que é um nível prático e proporciona uma bebida saborosa com um pH ácido. As composições com pH em que a razão é inferior que 1,0:1 também são práticas e têm a vantagem de economia de materiais, mas tem a desvantagem de não serem tão acídicas e menos saborosas.

Com refrigeração (e.g. 2°C) as composições recomendadas como úteis para bebidas são semelhantes como às descritos acima para temperatura ambiente. A 39°C (considerado como sendo o extremo de uma temperatura ambiente elevada) o pH mais baixo que suporta uma razão mole:mole de creatinina para creatina de 1,0:1 é 5,2 e define o mais baixo pH para a gama prática de composições para bebidas.

O pH é o factor mais importante que influencia a razão de creatina a creatinina no equilíbrio. Se creatina e creatinina estão misturadas nas proporções às quais eles ocorrem no equilíbrio a um pH especificado então estas composições serão imediatamente estáveis, como será também o pH. Por outro lado, quando a composição inicial está no equilíbrio então as concentrações de cada uma deslocarão na direcção de equilíbrio. Se isto envolve a formação de creatinina então o pH da composição aumentará, enquanto que se isto envolve a formação de creatina então o pH 36 ΡΕ1363509 diminuirá. A extensão para o qual o pH varia dependerá da variação absoluta em creatina ou creatinina que deve ocorrer para alcançar o equilíbrio e a capacidade tampão dos meios. 0 tempo que demora para alcançar o equilíbrio será determinado pela diferença da razão mole:mole inicial ao equilíbrio. 0 aquecimento ou arrefecimento produz um efeito imediato no pH que se não for invertido conduzirá a interconversão de creatina/creatinina a um novo estado de equilíbrio. Se o arrefecimento (e.g. refrigeração a 2°C) for aplicado a uma solução já no equilíbrio o efeito será aumentar o conteúdo de creatina às custas de creatinina. Isto vai "pull back" até certo ponto o aumento inicial (imediato) no pH com arrefecimento antes de ajustar a um valor ainda acima do inicial, suportando uma razão mole:mole creatinina para creatina mais baixa. O tempo que demora para alcançar um novo equilíbrio será o maior a pH baixos. Com aquecimento acontecerá o oposto com uma diminuição inicial no pH que, se as composições de creatina e creatinina estavam inicialmente a equilíbrio, será "pull back" alguns graus em direcção ao pH inicial. Eventualmente o pH estabelecerá a pH inferior ao pH antes do aquecimento, e a composição terá uma razão mole:mole creatinina para creatina mais elevada. Diminuindo o pH por aumento da temperatura causará sempre uma maior variação na razão mole:mole creatinina para creatina que o aumento do pH (pela mesma magnitude) por diminuição da temperatura. 37 ΡΕ1363509

Porém, a obtenção do equilíbrio será geralmente ainda mais rápido quando as soluções são esquecidas em vez de arrefecidas. Para soluções de baixo pH o tempo para atingir um novo equilíbrio pode ser bastante longo.

Onde as composições são preparadas nas quais as concentrações de creatina e creatinina são significativamente removidas das do equilíbrio, e, onde estas soluções são depois aquecidas ou arrefecidas durante períodos prolongados, então ambos os factores descritos acima se aplicarão. Em todos estes casos, porém, a extensão de mudança pode ser minimizada se a influência imediata no pH do aquecimento ou arrefecimento da solução base (i.e. a solução na ausência de creatina e creatinina adicionada) for conhecida e aplicando as razões mole:mole de creatinina para creatina descritas nas fig. 6 a 8 ao preparar a composição.

Baseada nos dados obtidos acima, a Tabela 3 mostra as razões mole:mole de creatinina para creatina das soluções de diferente pH no equilíbrio e as concentrações correspondentes de creatina (calculada como o mono-hidrato) e creatinina numa bebida de 500 mL. Para conveniência a própria concentração de creatina foi fixada em todos os casos para 5 g de creatina mono-hidratada, e consequentemente permitiu-se que a concentração de creatinina variasse. 38 ΡΕ1363509

Tabela 3. Conteúdos de creatinina e creatina estimados de uma bebida de 500 mL de diferentes pH armazenadas a 22aC durante 6 ou mais semanas. pH mole Cn /mole Cr Creatina mono-hidratada Creatinina g/500 mL g/500 mL 4,0 6,20:1 5 23,5 4,25 3,80:1 5 14,4 4,5 2,46:1 5 9,3 4,75 1,68:1 5 6,4 5, 0 1,20:1 5 4,6 5,25 0,95:1 5 3,6 5,5 0,80:1 5 3,0 5, 75 0,72:1 5 2,7 6, 0 0,64:1 5 2,4 6,25 0,59:1 5 2,2 6,5 0,54:1 5 2,1 6, 75 0,50:1 5 1,9 7,0 0,48:1 5 1,8 7,25 0,46:1 5 1,7

Exemplo 6

Este exemplo descreve a formulação detalhada de uma composição acídica de acordo com a invenção. A composição toma a forma de um pó seco, que é 39 ΡΕ1363509 para ser acrescentado a água para constituir um alimento que compreende creatina, creatinina e Aloé Vera na qual a creatina é substancialmente estável.

Ingredientes

Dextrose mono-hidratada 300 g Ácido cítrico (mono-hidratado) 50 g Pectina (estabilizador) 6,0 g Sal 5, 0 g Citrato trissódico (di-hidratado) 130 g Pó de beta Caroteno 3, 0 g Cloreto de potássio 2,9 g Aroma de Toranja 2,9 g Fosfato tricálcico 2,1 g Carbonato de Magnésio pesado 2,1 g Vitamina Premix 1,8 g Aroma de limão 1,4 g Aroma de laranja 1,4 g Aspartame O \—1 g Creatina mono-hidratada 149 g Creatinina 113 g Extracto de Aloé Vera Liofilizado 44 . g TOTAL 815 ,6 g

Aproximadamente 75 g da mistura anterior quando suspensa num litro de matriz ou dissolvida num litro de água fornece, por porção de 330 mL, aproximadamente 4,4 g 40 ΡΕ1363509 de creatina, 8,5 g de carbo-hidrato, 1,25 g de extracto de Aloé Vera, (equivalente a 250 mL de sumo), energia 34 kcal (assumindo um conteúdo de zero calorias para suporte da matriz), cálcio, potássio, magnésio e vitaminas (vitamina E 3,4 mg, vitamina C 16,2 mg, tiamina 0,3 mg, riboflavina 0,4 mg, niacina 5 mg, vitamina B6 0,4 mg, folacina 85 μρ, vitamina B12 0,9 μg, Biotina 0,08 mg e ácido pantoténico 2,2 mg) e traços de proteína, gordura, e fibra. A solução tem um pH de cerca de 5,0. A creatina é substancialmente estável durante pelo menos 7 dias à temperatura ambiente.

Exemplo 7

Este exemplo ilustra o método de fornecer uma suspensão de creatina e uma quantidade suficiente de creatinina numa matriz de suporte comestível para obter a creatina substancialmente estável à temperatura ambiente. A creatina mono-hidratada (1,7 g) é dissolvida em 100 mL de ácido cítrico 0,1 M (dar um pH de 2,5-3) e a solução aquecida durante cinco horas a 90°C. Isto converte 75 a 100 por cento da creatina em creatinina e o pH é elevado então a 5,0 pela adição de 100 mL de solução de fosfato de potássio 0,1 M. São adicionados quatro gramas de goma de xantano então e aquecimento contínuo até que a goma se dissolva. A mistura é de seguida arrefecida a 40°C. É adicionada uma suspensão de 22 g de creatina micronizada em 20 mL de água, e a mistura bem agitada durante três minutos 41 ΡΕ1363509 utilizando um misturador de vórtice para dar um gel no qual a creatina micronizada está uniformemente suspensa. A mistura inteira é subsequentemente e rapidamente arrefecida para a temperatura ambiente em cujo ponto a suspensão forma um gel sólido ou semi-sólido com um conteúdo de creatina de 10 g por 100 mL que é substancialmente estável a 22 °C durante pelo menos 30 dias.

Lisboa, 2 de Janeiro de 2007

Claims (25)

1. ΡΕ1363509 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição líquida para consumo humano, compreendendo creatina e uma quantidade de creatinina suficiente para obter a creatina dissolvida nela substancialmente estável de modo que pelo menos 75% da creatina na composição imediatamente após a formulação permaneça imutável durante o armazenamento acima da gama de temperatura de 2 a 50°C durante o período de pelo menos 30 dias, a composição tendo um pH entre 2,5 e 8,5, em que a quantidade de creatina esteja presente ab initio i.e. na formação da composição.
2. 2. Uma Composição de acordo com a reivindicação 1, na qual a razão de creatinina para creatina (mole:mole) não seja menos que 1:10 e não mais que 10:1.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 2, na qual a razão de creatinina para creatina (mole:mole) não seja menos que 1:8 e não mais que 5:1.
4. 4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, tendo um pH na gama 3,0 a 7,0.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 4, tendo um pH na gama 4,0 a 6,5. 2 ΡΕ1363509
6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 4, tendo um pH na gama 4,5-5,5.
7. 7. Composição de acordo com qualquer um das reivindicações precedentes, compreendendo um ou mais componentes adicionais seleccionados do grupo que consiste de: vitaminas, lipidos, proteínas, carbo-hidratos, polióis, aminoácidos, elementos de rastreio, corantes, aromas, adoçantes artificiais, substâncias naturais que melhoram a saúde e desempenho, antioxidantes, estabilizadores, conservantes e tampões.
8. 8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo extracto de Aloé Vera.
9. 9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, na qual a composição é uma bebida adequada para consumo humano.
10. 10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo uma concentração de creatina de pelo menos 0,15 g/100 mL.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10, compreendendo uma concentração de creatina de pelo menos 0,3 g/100 mL. 3 ΡΕ1363509
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 10, compreendendo uma concentração de creatina de pelo menos 0,4 g/100 mL.
13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 10, compreendendo uma concentração de creatina de pelo menos 0,5 g/100 mL.
14. 14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que creatina está presente na forma de creatina mono-hidratada ou fosfato de creatina.
15. 15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que uma porção normal fornece uma dose fisiologicamente eficaz de creatina.
16. 16. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que processar antes da formação da composição final envolve a conversão deliberada de creatina a creatinina.
17. 17. Método de preparar uma composição líquida aquosa que contém creatina de acordo com reivindicação 1, o método compreende os passos de: fornecer, na mesma composição, creatina dissolvida e creatinina suficiente ab initio para obter a creatina suficientemente estável tal que pelo menos 75% da creatina na composição imediatamente após a formulação permaneça imutável durante o armazenamento acima da gama de temperatura 2 a 50 °C durante um período de pelo menos 30 dias. 4 ΡΕ1363509
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, compreendendo o passo de misturar um meio aquoso com creatina e creatinina.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, compreendendo os passos de: fornecer uma solução de creatina; sujeitando a solução de creatina a condições adequadas para pelo menos parcialmente converter a creatina a creatinina, formando assim creatinina suficiente ab initio para obter a creatina na composição resultante substancialmente estável de modo a formar uma composição de acordo com reivindicação 1.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o passo de sujeitar a solução de creatina a condições adequadas envolve aquecimento da solução acima da temperatura ambiente.
21. 21. Método de acordo com reivindicação 19, em que a solução de creatina é aquecida a pelo menos 90°C durante pelo menos 30 minutos.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 18, compreendendo os passos de: fornecer uma solução de creatina; fornecer uma solução de creatinina; e misturar as soluções de modo a formar uma composição resultante na qual há creatinina suficiente ab initio para fazer a creatina substancialmente estável de modo a formar uma composição de acordo com a reivindicação 1. 5 ΡΕ1363509
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o pH da solução de creatinina é mais baixo que o pH da solução da composição resultante que compreende creatina.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o pH da solução de creatinina está na gama de 2,5 a 3,5, e o pH da solução da composição resultante que compreende creatina está na gama 4,0 a 6,5.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 17, compreendendo os passos de: fornecer creatina sólida; fornecer creatinina sólida; misturando os dois sólidos de modo a fornecer uma composição resultante que, quando dissolvida em solução aquosa, fornece uma composição na qual, quando dissolvida em solução aquosa, fornece uma composição de acordo com reivindicação 1. Lisboa, 2 de Janeiro de 2007 ΡΕ1363509 1/8 iniciai ©124 dias 3,0 pH 4.3 4*0 pH 43 pH S.Ô pH 5.5 g Cr por 100 ml

    Dias ΡΕ1363509 2/8 inicial dias inicial de Cr pH 3-0 pH 4.0 pH 5.0 4.4pH 4.9 5.5

    g, 2 ΡΕ1363509 3/8 CiiiCr molar: razão molar

    dias ΡΕ1363509 4/8 inicial §5 dias

    Dias ΡΕ1363509 5/8 inicial @95 dias pB 3,0 pH 43 pH 4,6 pH 4,9 pH5,0 pH 5,4 % inicial de Cr

    Dias ΡΕ1363509 6/8 C&:Cr molar: razão molar

    3 ΡΕ1363509 7/8

    to J Fig. 7 ΡΕ1363509 8/8 Cn:Or molar: razão molar