PT1276753E - Método para determinar o risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares em doentes hiperglicémicos - Google Patents

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA DETERMINAR O RISCO DE DESENVOLVIMENTO DE DOENÇAS CARDIOVASCULARES EM DOENTES HIPERGLICÉMICOS" A presente invenção é relativa a um método para avaliar um risco de um doente diabético de acordo com a reivindicação 1. A presente invenção é relativa a um método para determinar o risco de doentes hiperglicémicos desenvolverem doenças cardiovasculares. A doença cardiovascular (DCV) é a complicação mais frequente, mais grave e de maior custo da diabetes tipo 2.1 É a causa principal de morte entre os doentes com a diabetes do tipo 2 independentemente da duração da diabetes.2 Diversos estudos com base na população mostraram de forma consistente que o risco relativo de DCV em indivíduos diabéticos é várias vezes maior do que naqueles sem diabetes.3 ” 7 Este maior risco parece ser ainda mais acentuado nas mulheres.4,5,8 Os factores de risco como a hipertensão, a hiperlipidemia e o tabagismo aumentam de forma independente o risco relativo de o doente diabético desenvolver DCV, mas o efeito da diabetes parece ser independente dos factores de risco convencionais.9

Enquanto a incidência de DCV é maior nos doentes diabéticos do que nos não diabéticos em todas as populações estudadas, existem claras diferenças geográficas e étnicas quanto ao risco relativo de DCV entre os doentes com diabetes, as quais não podem ser totalmente explicadas pelas diferenças nos factores de risco cardíaco convencionais entre estes 2 grupos.10 ” 20 Por exemplo, a análise do risco relativo de DCV em diferentes grupos étnicos que vivem no Reino Unido mostrou que os doentes diabéticos de origem sul asiática têm um risco marcadamente aumentado12, 15, enquanto os doentes diabéticos afro-caribenhos têm um risco marcadamente diminuído14, 16 de DCV em relação aos doentes diabéticos de origem europeia.

Estes estudos sugerem que as diferenças genéticas poderão contribuir para diferenças na susceptibilidade às DCV por parte do doente diabético.

Na concepção da presente invenção, colocou-se a hipótese de uma possibilidade tratar-se de polimorfismo alélico funcional no gene da haptoglobina. A haptoglobina (Hp) é uma proteína do soro de ligação da hemoglobina, que desempenha um papel primordial na 23 24 protecção contra o stresse oxidativo de orrgem no heme '

Os ratos que não têm o gene Hp demonstram um enorme aumento do stresse oxidativo e de danos oxidativos dos tecidos em particular nos rins. No Homem existem dois alelos comuns para a Hp (1 e 2) que manifestam três fenótipos principais 1-1, 2-1 e 2-2.21 “ 23

Demonstrou-se as diferenças funcionais dos três fenótipos na capacidade de ligação à hemoglobina. A Hp nos doentes com o fenótipo 1-1 da Hp é capaz de ligar mais hemoglobina numa base por grama do que as Hp que contêm produtos do alelo 2 da haptoglobina.23 As moléculas de haptoglobina nos doentes com o fenótipo 1-1 da haptoglobina também são antioxidantes mais eficientes, visto o tamanho mais pequeno da haptoglobina 1-1 facilitar a respectiva entrada nos 3 locais extravasculares dos danos oxidativos dos tecidos, em comparação com os produtos do alelo 2 da haptoglobina. Isto também inclui uma filtração glomerular significativamente maior da haptoglobina nos doentes com o 1-1 da haptoglobina.22

Ao que parece, o alelo 2 da haptoglobina surgiu a partir do alelo 1 por meio da ocorrência de uma duplicação parcial do gene há aproximadamente 20 milhões de anos, e disseminou-se na população mundial em resultado de pressões selectivas relacionadas com a resistência a agentes inf ecciosos.24, 25 Actualmente, os alelos da haptoglobina são drasticamente distintos na sua frequência relativa entre os diferentes grupos étnicos.26 A ocorrência da duplicação do gene teve por resultado uma enorme alteração nas propriedades biofísicas e bioquímicas da proteína haptoglobina codificada por cada um dos 2 alelos. Por exemplo, o produto proteico do alelo 1 dá mostras de ser um antioxidante superior ao produzido pelo alelo 2. O fenotipo da haptoglobina de um indivíduo, 1-1, 2-1 ou 2-2, é facilmente determinado a partir de 10 microlitros de plasma por electroforese em gel.

Demonstrou-se recentemente que o fenótipo da haptoglobina permite prever o desenvolvimento de uma série de complicações microvasculares no doente diabético.27 " 29 Em termos específicos, mostrou-se que os doentes que são homozigóticos em relação ao alelo 1 da haptoglobina apresentam um menor risco de desenvolvimento de retinopatia e de nefropatia. Observou-se este efeito, pelo menos no caso da nefropatia, tanto nos doentes com diabetes do tipo 1 como do tipo 2 e a relevância foi reforçada pela descoberta de um efeito gradiente relativamente ao número 4 de alelos 2 da haptoglobina e ao desenvolvimento da nefropatia.29 Além disso, mostrou-se que o fenótipo da haptoglobina poderá permitir prever o desenvolvimento de complicações macrovasculares no doente com diabetes. Mostrámos que o desenvolvimento de restenose após angioplastia coronária percutânea diminui de forma significativa nos doentes diabéticos com o fenótipo 1-1 da haptoglobina. ' Estudos retrospectivos e transversais anteriores, que analisaram o fenótipo da haptoglobina e as arteriopatias coronárias na população geral, produziram resultados contraditórios. Nao se estudou o papel do fenótipo da haptoglobina no desenvolvimento de arteriopatias coronárias ateroscleróticas no estado diabético.

Os índios americanos, dos quais se pensava serem resistentes ao desenvolvimento de arteriopatias coronárias, sofrem actualmente de DCV em proporções epidémicas.20 Este aumento da incidência de DCV foi atribuído ao aumento acentuado da diabetes do tipo 2 nesta população.1' 2 0 Strong Heart Study estudou a incidência, a prevalência e os factores de risco de doenças cardiovasculares nas populações de índios americanos em três áreas geográficas desde 1988, com uma supervisão continuada até aos dias de hoje.20 A relativa homogeneidade genética desta população de doentes poderá permitir identificar os factores genéticos específicos que contribuem para as doenças DCV no estado diabético.

Em conformidade com isso, ao reduzir a presente invenção à prática, tentou-se determinar o risco relativo de DCV em doentes diabéticos de acordo com o fenótipo da haptoglobina num caso/amostra de controlo do Strong Heart Study. 5 0 W098/37419 advoga um método e um kit para determinar um fenótipo da haptoglobina e diz especificamente respeito a aplicações que impliquem a haptoglobina humana. 0 defendido por este pedido foca-se na utilização do fenótipo 2-2 da haptoglobina como um factor de risco independente, especificamente em relação a danos no órgão alvo na hipertensão essencial refractária, em relação a aterosclerose (na população geral) e enfarte agudo do miocárdio e em relação à mortalidade por infecção pelo VIH. Este pedido não fala da utilização do fenótipo da haptoglobina como factor de risco nas doenças cardiovasculares no caso da DM. Devido à tendência do fenótipo 2-2 da haptoglobina para tornar os doentes mais susceptiveis ao stresse oxidativo, poderá argumentar-se que a utilização do fenótipo 2-2 como previsor negativo de doenças cardiovasculares na DM está indirectamente implicada por esta patente. No entanto, as afirmações nesta patente não incluem a ideia de que o fenótipo 1-1 da haptoglobina é um previsor positivo de uma menor tendência de doença cardiovascular no caso de DM. 0 defendido pelo PCT W098/37419 inclui a utilização de um parceiro de ligação da haptoglobina.

Por outras palavras, sabe-se que o stresse oxidativo com origem no fenótipo 2-1 ou 2-2 da Hp leva a complicações vasculares nas populações em geral. Também se sabe que certas complicações vasculares estão associadas ao stresse oxidativo ligado à DM. Por conseguinte, é plausível assumir que o stresse oxidativo com origem no fenótipo 2-1 ou 2-2 da Hp combinado com aquele originado pela DM terão por resultado complicações vasculares associadas à diabetes. No entanto, não se sabe actualmente e não se consegue prever 6 se o fenótipo 1-1 da Hp mitiga as complicações vasculares nos doentes diabéticos. Este é o caso, pois a DM e os fenótipos 1-1 da Hp produzem efeitos opostos ao nível do stresse oxidativo.

De acordo com o PCT W098/37419, o parceiro de ligação poderá ser qualquer molécula com pelo menos dois locais nos quais liga a haptoglobina. Os locais podem ser formados por um péptido, anticorpo ou uma porção dos mesmos, ou por uma lectina, um receptor celular, uma impressão molecular ou um antigénio bacteriano ou uma respectiva porção. 0 defendido por esta patente foca-se especificamente na utilização do antigénio T4 da S. pyogenes. Todas as haptoglobinas contêm tanto cadeias alfa como cadeias beta. As cadeias beta são idênticas em todas as haptoglobinas, enquanto as cadeias alfa diferem entre os dois alelos do gene da haptoglobina. A cadeia alfa 2 da haptoglobina é o resultado de uma mutação com base num crossing-over desigual e inclui 142 aminoácidos, em contraste com os 83 aminoácidos da cadeia alfa 1. A nível imunológico, as cadeias alfa 1 e alfa 2 são semelhantes, à excepção de uma única sequência de resíduos de aminoácidos na cadeia alfa 2 (Ala-Val-Gly-Asp-Lys-Leu-Pro-Glu-Cys-Glu-Ala-Asp-Asp-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Lys-Cys-Ilc, SEQ ID NO: 1). Por isso, qualquer porção desta sequência peptídica única é um epítopo adequado a levar a que os anticorpos façam a distinção entre as haptoglobinas contendo cadeias alfa 1 e alfa 2 como descrito in "Using Antibodies: A Laboratory Manual". (Ed Harlow and David Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)). Estes anticorpos podem ser monoclonais, policlonais ou qualquer porção deles, e podem ser enriquecidos ou purificados por uma série de técnicas conhecidas dos especialistas do estado da técnica. Além disso, a sequência nucleotídica que 7 codifica esta sequência pode ser facilmente empregue para se diferenciar os diferentes genótipos da Hp.

Prabha P S et al refere padrões da haptoglobina na hipertensão essencial e as condições associadas - risco aumentado no caso de HP 2-2, "human heredity", Karger, Basel, CH, vol. 37, 1987, páginas 345 - 348. 0 WO 98/37419 é relativo a um método para determinar o fenótipo da haptoglobina num fluido biológico, caracterizado por contemplar as etapas de (a) fazer contactar o fluido biológico com um parceiro de ligação da haptoglobina, em particular com a Streptococcus pyogenes, que tem pelo menos dois locais pelos quais se pode ligar à haptoglobina, de modo a ser capaz de aglutinar as haptoglobinas e/ou a poder ser dessa forma aglutinada com diferentes graus em função do fenótipo da haptoglobina; (b) medir o grau de aglutinação; e (c) determinar, com base no grau de aglutinação, o fenótipo da haptoglobina no fluido biológico. 0 kit contém o parceiro de ligação da haptoglobina e opcionalmente uma amostra de haptoglobina de referência. É possivel empregar este kit e o método para estimar o prognóstico de um doente a seguir a infecção virai, para determinar a sobrevivência de enxerto a seguir ao transplante hepático, e para melhorar a interpretação de diferentes parâmetros laboratoriais. Em comparação com os ensaios existentes, eles permitem uma rápida determinação do fenótipo da haptoglobina.

Levy A P et al descreve o fenótipo da haptoglobina e as complicações vasculares em doentes com diabetes. "The New England Journal of Medicine" 28 SEP 2000, vol. 343, no. 13, 28 September 2000 (2000-09-28), páginas 969 - 970.

Roguin A et al revela um fenótipo da haptoglobina como previsor de restenose após angioplastia coronária transluminal percutânea. "The American Journal of Cardiology", 1 Feb 2001, vol. 87, no. 3, 1 February 2001 (2001-02-01), páginas 330 - 332. Há uma necessidade amplamente reconhecida de um método, e seria altamente vantajoso tê-lo, de prever que doentes com DM específicos apresentam um menor risco de doença cardiovascular. Um método deste tipo permitiria aos profissionais médicos dar o melhor uso aos recursos disponíveis, minimizando ao mesmo tempo ao máximo o risco para cada doente. O método para avaliar o risco dum doente diabético encontra-se definido na reivindicação 1.

Em conformidade com a presente invenção, fornece-se um método para avaliar o risco de um doente diabético desenvolver uma doença cardiovascular (DCV). O método contempla determinar um fenótipo da haptoglobina do doente diabético e, com isso, avaliar o risco de o doente diabético desenvolver a doença cardiovascular (DCV), sendo o risco diminuído nos doentes diabéticos com o fenótipo 1-1 da haptoglobina relativamente aos doentes com os fenótipos 1-2 ou 2-2 da haptoglobina.

Em conformidade com outras características em execuções preferidas da invenção abaixo descritas, o risco também está diminuído em doentes diabéticos com o fenótipo 1-2 da haptoglobina em comparação com os doentes com o fenótipo 2-2 da haptoglobina. 9

Em conformidade com a presente invenção, fornece-se um kit para avaliar o risco de um doente diabético desenvolver uma doença cardiovascular (DCV). 0 kit contém reagentes embalados para determinar um fenótipo da haptoglobina do doente diabético, e o kit está identificado para ser empregue na avaliação do risco de um doente diabético desenvolver uma doença cardiovascular (DCV).

Em conformidade com outras caracteristicas em execuções preferidas da invenção abaixo descritas, a etapa da determinação do fenótipo da haptoglobina contempla a determinação do genótipo da haptoglobina do doente diabético.

Em conformidade ainda com outras caracteristicas nas execuções preferidas descritas, a etapa de determinação do genótipo da haptoglobina do doente diabético contempla um método seleccionado do grupo composto por um método de amplificação de sinal, um método de detecção directa e a detecção de pelo menos uma modificação de sequência.

Em conformidade ainda com outras caracteristicas nas execuções preferidas descritas, o método de amplificação de sinal amplifica uma molécula seleccionada do grupo composto por uma molécula de ADN e uma molécula de ARN.

Em conformidade ainda com outras caracteristicas nas execuções preferidas descritas, o método de amplificação de sinal é seleccionado do grupo composto por PCR, LCR (LAR) , Self-Sustained Synthetic Reaction (3SR/NASBA) (reacção sintética autossustentada) e reacção da Q-Beta (ζ)β) Replicase. 10

Em conformidade ainda com outras caracteristicas nas execuções preferidas descritas, o método de detecção directa é seleccionado do grupo composto por cycling probe reaction (CPR) (reacção de amostras ciclizadas) e análise de ADN ramificado.

Em conformidade ainda com outras caracteristicas nas execuções preferidas descritas, a detecção de pelo menos uma modificação de sequência emprega um método seleccionado do grupo composto por um polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (análise RFLP), análise de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), electroforese em gel de gradiente de temperatura/desnaturante (TGGE/DGGE), análise de polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP) e impressão de didesoxi (ddF).

Em conformidade ainda com outras caracteristicas nas execuções preferidas descritas, a etapa de determinação do fenótipo da haptoglobina contempla determinar directamente o fenótipo da haptoglobina do doente diabético.

Em conformidade ainda com outras caracteristicas nas execuções preferidas descritas, a etapa de determinação do fenótipo da haptoglobina é realizada por um método de detecção imunológico.

Em conformidade ainda com outras caracteristicas nas execuções preferidas descritas, o método de detecção imunológico é seleccionado do grupo composto por radioimunoensaio (RIA) , um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), um western blot (imunotransferência enzimática), uma análise imuno-histoquimica e separação 11 celular de activaçao por fluorescência (FACS). A presente invenção aborda com êxito as falhas das configurações presentemente conhecidas, ao fornecer um método para avaliar o risco de doentes hiperglicémicos desenvolverem doenças cardiovasculares, de modo a permitir a prática da medicina preventiva onde aplicável.

DESCRIÇÃO DAS EXECUÇÕES PREFERIDAS A presente invenção trata-se de um método para avaliar o risco de doentes hiperglicémicos desenvolverem doenças cardiovasculares, de modo a permitir a prática da medicina preventiva onde aplicável.

Antes de explicar pelo menos uma execução da invenção em detalhe, deverá ter-se em conta que a invenção não se encontra limitada na respectiva aplicação aos detalhes de construção e de disposição dos componentes apresentados na descrição que se segue ou ilustrados nas figuras. A invenção é capaz de outras execuções ou de ser posta em prática ou de ser executada de diversas formas. Também se deverá ter em conta que a fraseologia e a terminologia empregues no presente documento destinam-se a descrever e não a limitar. A presente invenção é executada por um método de avaliar o risco de um doente diabético desenvolver doenças cardiovasculares (DCV). 0 método contempla a determinação do fenótipo da haptoglobina do doente diabético e, logo, avaliar o risco de o doente diabético desenvolver a doença cardiovascular (DCV), sendo o risco diminuído nos doentes diabéticos com o fenótipo 1-1 da haptoglobina relativamente 12 aos doentes como os fenótipos 1-2 ou 2-2 da haptoglobina. É mostrado de forma inequívoca no presente documento que o risco também está diminuído nos doentes diabéticos com o fenótipo 1-2 da haptoglobina em comparação com os doentes com o fenótipo 2-2 da haptoglobina. A presente invenção também fornece um kit para avaliar o risco de um doente diabético desenvolver doenças cardiovasculares (DCV). 0 kit contém reagentes embalados para determinar o fenótipo da haptoglobina do doente diabético, e o kit está identificado para ser empregue na avaliação do risco de um doente diabético desenvolver doenças cardiovasculares (DCV). A natureza dos reagentes será evidente aos especialistas da técnica a partir das descrições que se seguem, e ainda de dados de sequências bem conhecidos e caracterizados dos alelos 1 e 2 da haptoglobina. A utilidade do método e do kit da invenção é demonstrada pelos dados apresentados nas Tabelas 1 - 3 da secção dos Exemplos que se segue.

Por conseguinte, demonstra-se no presente documento, numa amostragem dum estudo longitudinal com base na população, que o fenótipo da haptoglobina é um previsor significativo do desenvolvimento de DCV em indivíduos com diabetes, mesmo após ajuste relativamente a factores de risco conhecidos das DCV.

Esta hipótese é ainda apoiada pela correlação entre a frequência do alelo 1 da haptoglobina em diferentes grupos étnicos e a incidência relativa de complicações microvasculares e macrovasculares da diabetes nestes 13 grupos .

Por exemplo, os afro-caribenhos com diabetes têm um risco relativo baixo de DCV14' 16 e de complicações microvasculares e têm uma elevada frequência do alelo 1 da haptoglobina (até 0,87 em algumas populações)26, enquanto os povos aborígenes australianos19 e sul asiáticos12, 15 com diabetes apresentam um risco relativo elevado de DCV e de complicações microvasculares47 da diabetes e uma frequência relativamente baixa do alelo 1 da haptoglobina (0,18 e 0,09, respectivamente) .26

Identificou-se recentemente dois mecanismos pelos quais o fenótipo da haptoglobina poderá influenciar a evolução clínica das DCV ateroscleróticas. Primeiro, demonstrou-se um risco escalonado de restenose após angioplastia arterial coronária transluminal percutânea estar relacionado com o número de alelos 2 da haptoglobina. 27, 30 Segundo, demonstrou-se que os indivíduos diabéticos com o fenótipo 2-1 da haptoglobina têm uma probabilidade significativamente maior de ter vasos colaterais coronários do que os indivíduos com o fenótipo 2-2 da haptoglobina com um grau semelhante de doença arterial coronária. As diferenças entre os indivíduos na área da circulação coronária colateral foram previamente demonstradas serem um determinante-chave na dimensão de um enfarte do miocárdio.48

Atribuiu-se diversas funções à proteína haptoglobina, as quais poderão ter um impacto no desenvolvimento de aterosclerose. Verificou-se ao longo de mais de 60 anos que uma função principal da haptoglobina sérica é a de ligar a hemoglobina livre.22 Pensa-se que esta interacção ajuda a 14 captar o ferro e a impedir que este se perca na urina, e que a mesma serve de antioxidante, protegendo assim os tecidos contra a oxidação tecidular mediada pela hemoglobina.23 Verificou-se que a capacidade antioxidante dos diferentes fenótipos da haptoglobina varia, sendo que a proteína 1-1 da haptoglobina parece conferir uma protecção antioxidante superior às outras formas da proteína.23 Uma hipótese antioxidante deste género é particularmente intrigante, dado o papel aparentemente importante do stresse oxidativo no desenvolvimento de complicações vasculares da diabetes. 49, 50 Talvez outras diferenças aparentes de amplificação da protecção oxidativa conferida pelos diferentes tipos de haptoglobina sejam grandes diferenças no tamanho da proteína haptoglobina presente nos indivíduos com os diferentes fenótipos. A haptoglobina 1-1 é marcadamente mais pequena do que a haptoglobina 2-2 e poderá, assim, ter uma maior capacidade de passar para o compartimento extravascular e prevenir os danos tecidulares mediados pela hemoglobina nos locais com lesão vascular. 23

Também se demonstrou que a haptoglobina desempenha um papel como imunomodulador, o qual poderá ter uma relação com o seu papel no metabolismo da hemoglobina. 21' 23 Identificou-se recentemente sem margem de dúvida um receptor específico do complexo haptoglobina-hemoglobina em monócito/macrófagos como DC16351, um elemento da superfamília rica em cisteína do receptor de captaçao do grupo B. Demonstrou-se anteriormente que outro membro desta superfamília de receptores de captação, CD36, desempenha um papel importante no metabolismo das LDL com um significado c q _ profundo no desenvolvimento de lesões ateroscleróticas. 55 Descobriu-se que a haptoglobina 2-2 na forma de complexo com a hemoglobina apresenta uma afinidade 10 vezes maior em 15 relação ao respectivo receptor do que a haptoglobina 1-1 na forma de complexo com a hemoglobina.51 Descobriu-se que a ligação de ligando ao CD163 induz uma cascata de sinal dependente de tirosinase-quinase, resultando na secreção de uma série de citoquinas inflamatórias.56 Também se demonstrou que a haptoglobina por si só se liga a granulócitos e a monócitos. Parece que a haptoglobina bloqueia a resposta neutrófila a uma série de agonistas com certos receptores de membrana plasmática, o que sugere que poderá funcionar como antagonista da interacção de receptor-ligando do sistema imunitário. 57 Demonstrou-se a ligação especifica da haptoglobina ao receptor MAC-1 ou CD11b/CD1858, como membro da família das integrinas. Estas integrinas deram mostras de desempenhar um papel crucial na resposta da parede dos vasos a lesões. 59

Muitos investigadores sugeriram recentemente que um papel importante da infecção bacteriana é o desenvolvimento e a desestabilização da placa aterosclerótica. 60 A este respeito, poderá ser importante, relativamente ao risco diferencial de aterosclerose associada ao fenótipo da haptoglobina, que os fenótipos pareçam ser diferentes em termos da respectiva capacidade de impedir a replicação virai e bacteriana in vitro e in vitro. 23 “ 25 Isto poderá dever-se a diferenças na captura do ferro23 e a diferenças na imunorregulação conferida pelos diferentes fenótipos.51

Estas descobertas estão em total sintonia com as nossas descobertas relativamente ao fenótipo da haptoglobina e ao desenvolvimento de complicações microvasculares diabéticas. As diferenças acentuadas no risco relativo dos doentes com os diferentes fenótipos da haptoglobina aparentariam justificar a realização de testes em grande escala dos 16 doentes diabéticos em algoritmos de estratificação de risco de DCV e na avaliação de potenciais intervenções terapêuticas concebidas para prevenir as DCV no doente diabético.

Em conformidade com diferentes execuções preferidas do método da presente invenção, realiza-se a determinação do fenótipo da haptoglobina de um indivíduo testado, recorrendo a uma série de métodos, os quais incluem sem ficarem a eles limitados, um método de amplificação de sinal, um método de detecção directa e a detecção de pelo menos uma modificação de sequência. Estes métodos determinam indirectamente um fenótipo, ao determinar um genótipo. Como se explicará seguidamente, a determinação de um fenótipo da haptoglobina também poderá ser realizada directamente por meio de análise dos produtos genéticos da haptoglobina. 0 método de amplificação de sinal, de acordo com diversas execuções preferidas da presente invenção, poderá amplificar, por exemplo, uma molécula de ADN ou uma molécula de ARN. Os métodos de amplificação de sinal que se poderá empregar como parte da presente invenção incluem, sem ficarem a eles limitados, PCR, LCR (LAR), Self-Sustained Synthetic Reaction (3SR/NASBA) ou uma reacção de Q-Beta (Qβ) Replicase.

Reacção em cadeia da polimerase (PCR): A reacção em cadeia da polimerase (PCR), como descrita nas patentes U. S. n.°s 4 683 195 e 4 683 202 para Mullis and Mullis et al., trata-se de um método para aumentar a concentração de um segmento de uma sequência alvo numa mistura de ADN genómico sem clonagem ou purificação. Esta tecnologia proporciona uma 17 abordagem aos problemas de baixa concentração da sequência alvo. Pode-se utilizar PCR para aumentar directamente a concentração do alvo para um nível de fácil detecção. Este processo de amplificação da sequência alvo implica a introdução de um excesso molar de dois primers (iniciadores) oligonucleotídicos, que são complementares em relação às respectivas cadeias da sequência alvo de cadeia dupla, na mistura de ADN que contém a sequência alvo pretendida. Desnatura-se a mistura e deixa-se a mesma sofrer hibridação. A seguir à hibridação, aumenta-se os primers com polimerase de modo a formarem cadeias complementares. É possível repetir as etapas de desnaturação, hibridação (anelação) e de aumento com polimerase (alongamento) com a frequência necessária, de modo a obter concentrações relativamente elevadas de um segmento da sequência alvo pretendida. 0 comprimento do segmento da sequência alvo pretendida é determinado pelas posições relativas dos primers em relação uns aos outros e, por isso, este comprimento constitui um parâmetro controlável. Dado que os segmentos pretendidos da sequência alvo se tornam as sequências dominantes (em termos de concentração) na mistura, diz-se que os mesmos são "amplificados por PCR".

Reacção em cadeia da ligase (LCR ou LAR): A reacção em cadeia da ligase [LCR; por vezes referida "reacção de amplificação com ligase" (LAR)], descrita por Barany, "Proc. Natl. Acad. Sei.", 88:189 (1991); Barany, "PCR Methods and Applic.", 1:5 (1991); e Wu and Wallace, "Genomics" 4:560 (1989), tornou-se um método alternativo bem reconhecido de amplificação de ácidos nucleicos. Na LCR, mistura-se quatro oligonucleotidos, dois 18 oligonucleótidos adjacentes que hibridam de forma única numa cadeia de ADN alvo, e um conjunto complementar de oligonucleótidos adjacentes, que hibridam na cadeia oposta e adiciona-se ADN ligase à mistura. Desde que haja complementaridade total na junção, a ligase ligará de forma covalente cada conjunto de moléculas hibridadas. E importante referir que na LCR duas amostras ligam-se uma à outra apenas quando emparelham as bases com sequências na amostra alvo, sem intervalos ou desemparelhamentos. Ciclos repetidos de desnaturação e de ligação amplificam um segmento curto de ADN. Também se empregou LCR em combinação com PCR para alcançar uma detecção aumentada de modificações de uma única base. Segev, publicação PCT n.° WO9001069 AI (1990) . No entanto, devido a os quatro oligonucleótidos empregues neste ensaio poderem emparelhar para formar dois fragmentos de ligação curtos, existe um potencial de geração de sinal de fundo independente do alvo. A utilização de LCR para rastreio de mutantes está limitada à análise de posições específicas de ácidos nucleicos.

Reacção Sintética Autossustentada (3RS/NASBA): A reacção de replicação de sequências autossustentada (3SR) (Guatelli et al., "Proc. Natl. Acad. Sei.", 87: 1 874-1 878, 1990), com uma errata em "Proc. Natl. Acad. Sei.", 87:7 797, 1990) é um sistema de amplificação in vitro com base na transcrição (Kwok et ai., "Proc. Natl. Acad. Sei.", 86:1 173-1 177, 1989), que pode amplificar de forma exponencial sequências de ARN a uma temperatura uniforme. É possível empregar depois o ARN amplificado na detecção de mutações (Fahy et al., "PCR Meth. Appl., 1:25-33, 1991). Neste método, emprega-se um primer oligonucleotídico para adicionar um promotor de ARN polimerase de fago à extremidade 5' da 19 sequência em questão. Num cocktail de enzimas e substratos que inclui um segundo primer, transcriptase reversa, RNase H, ARN polimerase e trifosfatos de ribonucleósidos e de desoxirribonucleósidos, a sequência alvo é sujeita a ciclos repetidos de transcrição, sintese de ADNc e sintese da segunda cadeia para amplificar a área em questão. A utilização da 3SR para detectar mutações está cineticamente limitada ao rastreio de pequenos segmentos de ADN (por exemplo, 200-300 pares de bases). Q-Beta (Ωβ) Replicase: Neste método, uma amostra que reconheça a sequência em questão é ligada ao modelo de ARN replicável para a ζ)β replicase. Um enorme problema previamente identificado com falsos positivos resultantes da replicação de amostras não hibridadas foi abordado com a utilização de uma etapa de ligação especifica de sequência. No entanto, as ADN ligases termostáveis disponíveis não são eficazes neste substrato de ARN, pelo que a ligação deve ser feita pela T4 ADN ligase a baixas temperaturas (37°C). Isto evita a utilização de temperaturas elevadas como meio de alcançar a especificidade como na LCR, podendo utilizar-se a ocorrência da ligação para detectar uma mutação no local de junção, mas não noutro sítio.

Um método de diagnóstico de sucesso tem de ser muito específico. Um método directo de controlar a especificidade da hibridação de ácidos nucleicos é o de controlar a temperatura da reacção. Enquanto os sistemas 3SR/NASBA e ζ)β são capazes de gerar uma grande quantidade de sinal, uma ou mais das enzimas envolvidas em cada um deles não pode ou não podem ser empregues a uma temperatura elevada (ou seja, > 55°C). Por conseguinte, não se pode aumentar as temperaturas de reacção para impedir a hibridação não 20 específica das amostras. Se as amostras são encurtadas de modo a que possam ser mais facilmente fundidas a baixas temperaturas, aumentar-se-á a probabilidade de ter mais do que uma correspondência perfeita num genoma complexo. Por estes motivos, a PCR e a LCR dominam actualmente o campo de pesquisa nas tecnologias de detecção. A base do procedimento de amplificação na PCR e na LCR é o facto de os produtos de um ciclo se tornarem modelos que podem ser empregues em todos os ciclos subsequentes, o que tem por consequência a duplicação da população a cada ciclo. O rendimento final de um sistema de duplicação deste tipo pode ser expresso da seguinte forma: (1 + X)n = y, em que "X" é a eficiência média (percentagem copiada em cada ciclo) , "n" é o número de ciclos e "y" é a eficiência global ou rendimento da reacção (Mullis, "PCR Methods Applic.", 1:1, 1991). Caso se empregue todas as cópias de um ADN alvo como modelo em todos os ciclos de uma reacção em cadeia da polimerase, a eficiência média será então de 100%. Caso se realize 20 ciclos de PCR, o rendimento será de 2 ou 1 048 576 cópias do material inicial. Se as condições de reacção reduzirem a eficiência média para 85%, o rendimento nesses 20 ciclos será apenas de 1,8520 ou 220 513 cópias do material inicial. Por outras palavras, uma PCR realizada com uma eficiência de 85% renderá apenas 21% de produto final em comparação com uma reacção realizada com uma eficiência de 100%. Uma reacção reduzida para uma eficiência média de 50% renderá menos de 1% do produto possível.

Na prática, as reacções em cadeia da polimerase de rotina raramente alcançam o rendimento máximo teórico, e as PCR são usualmente realizadas durante mais de 20 ciclos para 21 compensar o rendimento mais baixo. Com uma eficiência média de 50%, levaria 34 ciclos para alcançar a amplificação de um milhão possível em teoria em 20, e com eficiências mais baixas, o número de ciclos necessário torna-se proibitivo. Além disso, quaisquer produtos de fundo com uma eficiência média de amplificação melhor do que o alvo pretendido tornar-se-ão os produtos dominantes.

Também muitas variáveis podem influenciar a eficiência média da PCR, inclusive a estrutura secundária e o comprimento do ADN alvo, o comprimento e a estrutura dos primers, as concentrações de primers e de dNTP, e a composição tampão, apenas para nomear algumas. A contaminação da reacção com ADN exógeno (por exemplo, ADN entornado em superfícies de laboratório) ou a contaminação cruzada também é uma consideração fundamental. É necessário optimizar com cuidado as condições de reacção para cada par de primers diferente e sequência alvo diferente, e o processo pode levar dias, mesmo para um investigador experiente. O aspecto trabalhoso deste processo, inclusive inúmeras considerações técnicas e outros factores, representa uma desvantagem significativa quanto a empregar a PCR no plano clínico. De facto, falta ainda à PCR penetrar no mercado clínico de forma significativa. As mesmas questões surgem com a LCR, uma vez que também é necessário optimizar a LCR com vista a utilizar diferentes sequências oligonucleotídicas para cada sequência alvo. Além disso, ambos os métodos requerem equipamento caro, capaz de ciclização precisa da temperatura.

Muitas aplicações de tecnologias de detecção de ácidos nucleicos, como nos estudos da variação alélica, implicam não apenas a detecção de uma sequência específica num fundo 22 complexo, como também a discriminação entre sequências com poucas diferenças nucleotidicas, ou uma única. Um método de detecção de variantes especificas de alelo por PCR baseia-se no facto de ser difícil à Taq polimerase sintetizar uma cadeia de ADN quando há um desemparelhamento entre a cadeia modelo e a extremidade 3' do primer. É possível detectar uma variante específica de alelo através da utilização de um primer que seja emparelhado na perfeição com apenas um dos alelos possíveis; o desemparelhamento com o outro alelo impede a extensão do primer, prevenindo assim a amplificação dessa sequência. Este método tem uma limitação substancial, na medida em que a composição de base do desemparelhamento influencia a capacidade de impedir a extensão ao longo do desemparelhamento, e certos desemparelhamentos não impedem a extensão ou produzem apenas um efeito mínimo (Kwok et al., "Nucl. Acids Res.", 18:999, 1990) .

Uma estratégia semelhante de desemparelhamento da 3' é empregue com uma melhor eficiência para impedir a ligação na LCR (Barany, "PCR Meth. Applic.", 1:5, 1991). Qualquer desemparelhamento bloqueia de forma eficaz a acção da ligase termostável, mas a LCR tem ainda a desvantagem de os produtos de ligação de fundo independentes do alvo iniciarem a amplificação. Além disso, a combinação de PCR com subsequente LCR para identificar os nucleótidos em posições individuais também é uma proposta claramente pesada para o laboratório clínico. O método de detecção directa de acordo com várias execuções preferidas da presente invenção poderá ser, por exemplo, uma cycling probe reaction (CPR) ou uma análise de ADN ramificado. 23

Quando está disponível uma quantidade suficiente de um ácido nucleico a ser detectado, é vantajoso detectar directamente essa sequência, em vez de produzir mais cópias desse alvo, (por exemplo, como na PCR e na LCR). Sobretudo, um método que não amplifique o sinal de forma exponencial é mais susceptível a análise quantitativa. Mesmo que o sinal seja aumentado pela anexação de múltiplos corantes a um único oligonucleótido, a correlação entre a intensidade de sinal final e a quantidade do alvo é directa. Um sistema deste tipo tem a vantagem adicional de os produtos da reacção não promoverem eles próprios a continuação da reacção, deixando de ser uma preocupação tao grande a contaminação das superfícies do laboratório com os produtos. Os métodos tradicionais de detecção directa, incluindo ensaios de protecção contra RNase de bandas

Northern e Southern, requerem usualmente a utilização de radioactividade e não são susceptíveis a automação. As técnicas recentemente concebidas procuraram eliminar a utilização de radioactividade e/ou melhorar a sensibilidade dos formatos automatizáveis. Dois exemplos são a "Cycling Probe Reaction" (CPR) e "ADN ramificado" (ADNr).

Cycling probe reaction (CPR): a reacção cycling probe reaction (CPR) (Duck et al., "BioTech.", 9 : 142, 1990) utiliza um oligonucleótido quimérico comprido, em que uma porção central é composta por ARN, enquanto as duas terminações são compostas por ADN. A hibridação da amostra num ADN alvo e a exposição a uma RNase H termostável leva à digestão da porção de ARN. Isto destabiliza as restantes porções de ADN do duplex, libertado o resto da amostra do ADN alvo e permitindo que outra molécula de amostra repita o processo. O sinal, na forma de moléculas de amostra clivadas, acumula-se a uma taxa linear. Enquanto o processo de repetição aumenta o sinal, a porção de ARN do oligonucleótido fica vulnerável às RNases que podem ser transportadas pela preparação das amostras. ADN ramificado: 0 ADN ramificado (ADNr), descrito por Urdea et al., "Gene" 61:253-264 (1987), inclui oligonucleótidos com estruturas ramificadas, que permitem que cada oligonucleótido individual tenha 35 a 40 títulos (por exemplo, enzimas de fosfatase alcalina). Enquanto isto aumenta o sinal de uma ocorrência de hibridação, aumenta-se de forma semelhante o sinal de ligação não específica. A detecção de pelo menos uma modificação de sequência de acordo com diversas execuções preferidas da presente invenção pode ser conseguida, por exemplo, por polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (análise RFLP), análise de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), electroforese em gel de gradiente de temperatura/desnaturante (TGGE/DGGE), análise de polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP) ou impressão de didesoxi (ddF). A procura de testes que permitam a detecção de sequências específicas de ácidos nucleicos e de modificações de sequências está a crescer rapidamente nos diagnósticos clínicos. Acumulam-se os dados de sequências de ácidos nucleicos para genes de humanos e de organismos patogénicos, aumentando rapidamente a procura de testes de fácil uso, rápidos e favoráveis em termos de custos actualmente para mutações em sequências específicas.

Concebeu-se alguns métodos para rastrear segmentos de 25 ácidos nucleicos em busca de mutações. Uma opção é a de determinar toda a sequência genética de cada amostra de teste (por exemplo, um isolado bacteriano) . No caso de sequências abaixo de aproximadamente 600 nucleótidos, isto poderá ser conseguido empregando material amplificado (por exemplo, os produtos de reacção da PCR). Isto evita o tempo e os custos associados à clonagem do segmento em questão. No entanto, são necessários equipamento especializado e pessoal altamente qualificado, e o método é demasiado trabalhoso e caro para ser prático e eficaz no panorama clinico.

Face às dificuldades associadas à sequenciação, é possível caracterizar um determinado segmento de ácido nucleico a vários outros níveis. Com a resolução mais baixa, é possível determinar o tamanho da molécula por electroforese, ao fazer a comparação com um padrão conhecido analisado no mesmo gel. Poderá conseguir-se uma imagem mais detalhada da molécula pela clivagem com combinações de enzimas de restrição antes da electroforese, para permitir a construção de uma mapa ordenado. A presença de sequências específicas dentro do fragmento pode ser detectada por hibridação de uma amostra titulada, ou é possível determinar a sequência nucleotídica exacta por degradação química parcial ou por extensão de primers na presença de análogos de nucleótidos de terminação da cadeia.

Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) : com vista à detecção de diferenças de uma única base entre sequências semelhantes, com frequência os requisitos da análise estão no maior grau de resolução. Nos casos em que a posição do nucleótido em questão seja à 26 partida conhecida, desenvolveram-se vários métodos para analisar modificações de uma única base sem sequenciação directa. Por exemplo, se uma mutação em questão incidir numa sequência de reconhecimento de restrição, poderá empregar-se uma modificação no padrão de digestão como ferramenta de diagnóstico (por exemplo, análise de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição [RFLP]).

Também se detectou mutações pontuais únicas pela criação ou destruição de RFLP. Detecta-se e localiza-se as mutações pela presença e pelo tamanho de fragmentos de ARN gerados pela clivagem nos desemparelhamentos. Os desemparelhamentos de nucleótidos únicos em heteroduplexes de ADN também são reconhecidos e clivados por alguns químicos, proporcionando uma estratégia alternativa de detectar substituições de uma única base, com a denominação genérica "Mismatch Chemical Cleavage" (MCC) (Gogos et al., "Nucl. Acids Res.", 18:6 807-6 817, 1990). Contudo, este método requer a utilização de tetróxido de ósmio e de piperidina, dois químicos altamente nocivos que não se adequam à utilização no laboratório clínico. A análise RFLP padece de baixa sensibilidade e requer uma grande quantidade de amostra. Caso se empregue análise RFLP na detecção de mutações pontuais, a mesma ficará limitada, pela sua natureza, à detecção apenas das modificações de uma única base que incidam numa sequência de restrição de uma endonuclease de restrição conhecida. Além disso, a maioria das enzimas disponíveis têm 4 a 6 sequências de reconhecimento de pares de bases e clivam com demasiada frequência no caso de muitas manipulações de ADN à grande escala (Eckstein and Lilley (eds.), "Nucleic Acids and 27

Molecular Biology", Vol. 2, Springer-Verlag, Heidelberg, 1988). Assim, é aplicável apenas a uma pequena fracção de casos, dado que a maioria das mutações não incide nesses locais.

Isolou-se algumas enzimas de restrição de corte raro com especificidades de 8 pares de bases e estas são amplamente empregues no mapeamento genético, mas estas enzimas são em pequeno número, estão limitadas ao reconhecimento das sequências ricas em G+C e clivam em locais que tendem a ser altamente agrupados (Barlow and Lehrach, "Trends Genet.", 3:167, 1987).

Recentemente, descobriu-se endonucleases codificadas pelos intrões do grupo I, que poderão ter uma especificidade maior do que 12 pares de bases (Perlman and Butow, "Science" 246:1 106, 1989), mas, de novo, são em reduzido número.

Oligonucleótido específico de alelo (ASO): se a modificação não for numa sequência de reconhecimento, será possível conceber oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) para hibridar na proximidade do nucleótido mutado, de forma a que uma extensão de primer ou a ocorrência de ligação possa ser utilizada como indicador de um emparelhamento ou de um desemparelhamento. Também se aplicou a hibridação com oligonucleótidos específicos alélicos (ASO) titulados por radioactividade à detecção de mutações pontuais específicas (Conner et al., "Proc. Natl. Acad. Sei.", 80:278-282, 1983). O método tem por base as diferenças na temperatura de fusão de fragmentos curtos de ADN, que difiram num único nucleótido. Estritas condições de hibridação e de lavagem conseguem diferenciar alelos mutantes de alelos de tipo 28 selvagem. A abordagem ASO aplicada a produtos de PCR também foi extensamente empregue por diversos investigadores para detectar e caracterizar mutações pontuais em genes ras (Vogelstein et al., "N. Eng. J. Med.", 319:525-532, 1988; e Farr et al., "Proc. Natl. Acad. Sei.", 85:1 629-1 633, 1988), e oncogenes gsp/gip (Lyons et al., "Science" 249:655-659, 1990). Devido à presença de diversas modificações nucleotidicas em múltiplas posições, o método ASO requer a utilização de muitos nucleótidos para cobrir todas as possíveis mutações oncogénicas.

Com qualquer uma das técnicas acima descritas (ou seja, RFLP e ASO), é necessário saber antes do teste a localização precisa da mutação de que se suspeita. Isto é o mesmo que dizer que não são aplicáveis quando é necessário detectar a presença de uma mutação num gene ou numa sequência em questão.

Electroforese em gel de gradiente de temperatura/desnaturante (TGGE/DGGE): dois outros métodos assentam na detecção de modificações na mobilidade electroforética, em resposta a reduzidas modificações de sequências. Um destes métodos, designado por "Electroforese em Gel de gradiente desnaturante" (DGGE) baseia-se na observação de que sequências ligeiramente diferentes apresentarão diferentes padrões de fusão local, quando sujeitas a resolução electroforética num gel de gradiente. Deste modo é possível distinguir variantes, na medida em que as diferenças nas propriedades de fusão dos homoduplexes versus os heteroduplexes que sejam diferentes apenas em termos dum único nucleótido, conseguem detectar a presença de mutações nas sequências alvo, devido às modificações correspondentes nas respectivas mobilidades 29 electroforéticas. Os fragmentos a serem analisados, usualmente produtos de PCR, são "presos/grampeados" (clamped) numa extremidade por um comprimento longo de pares de bases G-C (30 - 80), para permitir a desnaturação completa da sequência em questão, sem uma dissociação completa das cadeias. A ligação de um "grampo" de GC aos fragmentos de ADN aumenta a fracção de mutações que pode ser reconhecida por DGGE (Abrams et al., "Genomics" 7:463-475, 1990) . A ligação de um grampo de GC a um primer é critica para garantir que a sequência amplificada tenha uma baixa temperatura de dissociação (Sheffield et al., "Proc. Natl. Acad. Sei.", 86: 232 - 236, 1989; e Lerman and Silverstein, "Meth. Enzymol.", 155:482-501, 1987). Desenvolveu-se modificações da técnica recorrendo a gradientes de temperatura (Wartell et al., "Nucl. Acids Res.", 18:2 699-2 701, 1990), e também é possível aplicar o método a duplexes de ARN : ARN (Smith et al., "Genomics" 3: 217 - 223, 1988) .

As limitações à utilidade da DGGE incluem o requisito de ser necessário optimizar as condições de desnaturação para cada tipo de ADN a ser testado. Além disso, o método requer equipamento especializado para preparar géis e manter as temperaturas elevadas necessárias durante a electroforese. Os custos associados à síntese da extremidade de grampo num oligonucleótido para cada sequência a ser testada também se traduzem numa consideração crucial. Além disso, são necessários grandes tempos de funcionamento no caso da DGGE. Encurtou-se o longo tempo de funcionamento da DGGE numa modificação da DGGE denominada electroforese em gel desnaturante constante (CDGE) (Borrensen et al., "Proc. Natl. Acad. Sei." EUA 88:8 405, 1991). A CDGE requer que os géis sejam realizados sob diferentes condições 30 desnaturantes, de modo a alcançar uma grande eficiência na detecção de mutações.

Uma técnica análoga à DGGE, denominada electroforese em gel de gradiente de temperatura (TGGE), emprega um gradiente térmico em vez de um gradiente desnaturante químico (Scholz, et al., "Hum. Mol. Genet." 2: 2 155, 1993). A TGGE requer a utilização de equipamento especializado que seja capaz de gerar uma gradiente de temperatura na perpendicular em relação ao campo eléctrico. A TGGE é capaz de detectar mutações em fragmentos relativamente pequenos de ADN, e logo a análise sequencial de grandes fragmentos genéticos requer a utilização de múltiplos produtos de PCR antes de fazer correr o gel.

Polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP): outro método comum, designado por "Polimorfismo de Conformação de Cadeia Simples" (SSCP), foi desenvolvido por Hayashi, Sekya and colleagues (revisto por Hayashi, "PCR Meth. Appl.", 1:34-38, 1991) e baseia-se na observação de que as cadeias simples de ácido nucleico podem assumir conformações características em condições não desnaturantes e que estas conformações influenciam a mobilidade electroforética. As cadeias complementares assumem estruturas suficientemente diferentes, de modo que uma cadeia pode ser discriminada de outra. As modificações das sequências num fragmento também modificarão a conformação, alterando consequentemente a mobilidade e permitindo que isto seja utilizado como um ensaio de variações de sequências (Orita, et al., "Genomics" 5:874-879, 1989). O processo SSCP implica a desnaturação de um segmento de ADN (por exemplo, um produto de PCR) que é titulado em 31 ambas as cadeias, a que se segue separação electroforética lenta num gel de poliacrilamida não desnaturante, de modo a que se possam produzir interacções intramoleculares e as mesmas não sejam perturbadas durante a realização. Esta técnica é extremamente sensível a variações na composição do gel e da temperatura. Uma séria limitação a este método trata-se da dificuldade relativa encontrada ao comparar os dados gerados em diferentes laboratórios sob condições aparentemente semelhantes.

Impressão de didesoxi (ddF): a impressão de didesoxi (ddF) é outra técnica desenvolvida para analisar genes quanto à presença de mutações (Liu and Sommer, "PCR Methods Appli.", 4:97, 1994) . A técnica de ddF combina componentes de sequenciação de didesoxi de Sanger com SSCP. Realiza-se uma reacção de sequenciação de didesoxi utilizando um terminador de didesoxi e, depois, sujeita-se os produtos de reacção a electroforese em géis de poliacrilamida não desnaturantes para detectar alterações na mobilidade dos segmentos de terminação como na análise SSCP. Enquanto a ddF é um aperfeiçoamento em relação à SSCP em termos de uma maior sensibilidade, a ddF requer a utilização de nucleótidos didesoxi caros e esta técnica está ainda limitada à análise de fragmentos com o tamanho adequado à SSCP (ou seja, fragmentos com 200 - 300 bases para uma detecção óptima de mutações).

Além das limitações acima referidas, todos estes métodos encontram-se limitados em termos do tamanho do fragmento de ácido nucleico que pode ser analisado. Na abordagem da sequenciação directa, as sequências com mais de 600 pares de bases requerem clonagem, com os atrasos e custos daí derivados de subclonagem de delecção ou de primer walking, 32 de modo a cobrir todo o fragmento. 0 SSCP e a DGGE têm limitações de tamanho ainda maiores. Devido a uma reduzida sensibilidade às modificações de sequência, não se considera que estes métodos sejam adequados a fragmentos maiores. Embora se relate que o SSCP é capaz de detectar 90% das substituições de uma única base num fragmento com 200 pares de bases, a detecção cai para menos de 50% no caso de fragmentos com 400 pares de bases. De forma semelhante, a sensibilidade da DGGE diminui à medida que o comprimento do fragmento chega a 500 pares de bases. A técnica de ddF, como uma combinação de sequenciação directa e SSCP, também está limitada ao tamanho relativamente pequeno do ADN que pode ser analisado.

De acordo com uma execução actualmente preferida da presente invenção, a etapa de procura da mutação ou das mutações em quaisquer dos genes acima listados, como, por exemplo, o gene transportador de folato reduzido (RFC), nas células tumorais ou nas células derivadas de um doente com cancro, é realizada por uma técnica de polimorfismo conformacional de cadeia simples (SSCP), como o SSCP de ADNc ou o SSCP de ADN genómico. No entanto, é possível empregar métodos alternativos, inclusive, sem ficarem a eles limitados, sequenciação de ácidos nucleicos, reacção em cadeia da polimerase, reacção em cadeia da ligase, self-sustained synthetic reaction, ζ)β Replicase, cycling probe reaction, ADN ramificado, análise de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, clivagem química de desemparelhamento, análise de heteroduplex, oligonucleótidos específicos de alelo, electroforese em gel de gradiente desnaturante, electroforese em gel desnaturante constante, electroforese em gel de gradiente de temperatura e impressão de didesoxi. 33

Também se pode conseguir directamente a determinação de um fenótipo da haptoglobina, como ainda exemplificado na secção dos Exemplos que se segue, ao analisar os produtos genéticos proteicos do gene da haptoglobina, ou porções do mesmo. Muitas vezes consegue-se esta análise directa recorrendo a um método de detecção imunológico.

Os métodos de detecção imunológicos encontram-se totalmente explicados, por exemplo, in "Using Antibodies: A Laboratory Manual" (Ed Harlow, David Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)), e os familiarizados com o estado da técnica serão capazes de implementar as diversas técnicas seguidamente resumidas como parte da presente invenção. Todas as técnicas imunológicas requerem anticorpos específicos de pelo menos um dos alelos da haptoglobina. Os métodos de detecção imunológicos adequados à utilização como parte da presente invenção incluem, sem ficarem a eles limitados, o radioimunoensaio (RIA), o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), o western blot, a análise imuno-histoquímica e a separação celular activada por fluorescência (FACS).

Radioimunoensaio (RIA): numa versão, este método engloba a precipitação do substrato pretendido, a haptoglobina neste caso, e nos métodos em baixo detalhados, com um anticorpo específico e uma proteína de ligação a anticorpo radiotitulada (por exemplo, a proteína A titulada com I125) imobilizada num suporte passível de precipitação como as pequenas esferas de agarose. 0 número de contagens no pelete precipitado é proporcional à quantidade de substrato. 34

Numa versão alternativa da RIA, emprega-se um substrato titulado e uma proteína de ligação de anticorpos não titulada. Adiciona-se uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de substrato em quantidades variadas. A diminuição nas contagens precipitadas do substrato titulado é proporcional à quantidade de substrato na amostra adicionada.

Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA): Este método contempla a fixação de uma amostra (por exemplo, células fixas ou uma solução proteica) contendo um substrato proteico, a uma superfície com um poço duma placa de microtítulo. Aplica-se um anticorpo específico de substrato ligado a uma enzima e deixa-se que este se ligue ao substrato. Depois, a presença do anticorpo é detectada e é quantificada por uma reacção colorimétrica recorrendo à enzima ligada ao anticorpo. As enzimas geralmente empregues neste método incluem a peroxidase de rábano e a fosfatase alcalina. Se bem calibrada e dentro da gama linear de resposta, a quantidade de substrato presente na amostra é proporcional à quantidade de cor produzida. Emprega-se geralmente um padrão de substrato para melhorar a precisão quantitativa.

Western blot: Este método engloba a separação de um substrato de outra proteína, através de um gel de acrilamida, seguindo-se transferência do substrato para uma membrana (por exemplo, nylon ou PVDF). Depois, detecta-se a presença do substrato por anticorpos específicos do substrato, que são por sua vez detectados por reagentes de ligação de anticorpos. Os reagentes de ligação de anticorpos podem ser, por exemplo, a proteína A ou outros anticorpos. Os reagentes de ligação de anticorpos podem ser 35 radiotitulados ou enzimaticamente ligados como anteriormente descrito. A detecção pode ser por autorradiografia, reacção colorimétrica ou quimioluminescência. Este método permite tanto a quantificação de uma quantidade de substrato como a determinação da sua identidade por uma posição relativa na membrana, que é indicadora de uma distância de migração no gel de acrilamida durante a electroforese.

Análise Imuno—histoquímica: Este método implica a detecção de um substrato in situ em células fixas por anticorpos específicos de substrato. Os anticorpos específicos de substrato podem estar ligados por enzimas ou ligados a fluoróforos. A detecção é feita por microscopia e por avaliação subjectiva. Caso se empregue anticorpos de ligação enzimática, poderá ser necessária uma reacção colorimétrica.

Separação celular activada por fluorescência (FACS): este método implica a detecção de um substrato in situ em células por meio de anticorpos específicos de substrato. Os anticorpos específicos de substrato estão ligados a fluoróforos. Realiza-se a detecção através de uma máquina de separação celular, que lê o comprimento de onda da luz emitida de cada célula à medida que passa por um feixe de luz. Este método pode recorrer a dois ou mais anticorpos em simultâneo.

Um especialista comum do estado da técnica saberá ver que a determinação do fenótipo da haptoglobina de um indivíduo, quer directa ou geneticamente, pode ser realizada recorrendo a qualquer amostra biológica adequada derivada do indivíduo examinado, inclusive, sem limitação a estes, 36 sangue, plasma, células sanguíneas, saliva ou células derivadas de lavagem bocal, e secreções corporais como urina e lágrimas, e de biopsias, etc.

Outros objectos, vantagens e novas características da presente invenção serão evidentes ao especialista comum do estado da técnica ao analisar os exemplos que se seguem, os quais não têm por função qualquer limitação. Além disso, todas as diferentes execuções e todos os aspectos da presente invenção, como anteriormente delineados e como reivindicados na secção em baixo das reivindicações, encontram suporte experimental nos exemplos que se seguem.

EXEMPLOS E feita agora referência aos exemplos que se seguem que, em conjunto com as descrições anteriores, ilustram a invenção de forma não limitadora.

Em geral, a nomenclatura empregue no presente documento e os procedimentos laboratoriais empregues na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, de microbiologia e de ADN recombinante. Estas técnicas encontram-se explicadas de forma minuciosa na literatura. Consultar, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I - III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nova Iorque (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nova Iorque; 37

Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque (1998); as metodologias apresentadas nas patentes U. S. com os números 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 e 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I - III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. I. (1994), Terceira Edição; "Current Protocols in Immunology" Volumes I - III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8.a edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nova Iorque (1980); os imunoensaios disponíveis encontram-se amplamente descritos na literatura de patentes e científica, consultar, por exemplo, as patentes U. S. com os números 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1 - 317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos incorporados por referência como totalmente apresentado no presente documento. O presente documento fornece outras 38 referências gerais. Crê-se que os procedimentos ai contidos são bem conhecidos do estado da técnica e são fornecidos para conveniência do leitor. Toda a informação aí contida encontra-se incorporada no presente documento por referência.

MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Antes de apresentar os exemplos que fornecem dados experimentais para apoiar a presente invenção, é feita referência aos seguintes métodos:

Doentes:

Foram anteriormente publicadas descrições detalhadas da concepção do estudo, dos métodos de sondagem e das técnicas laboratoriais, e das comunidades índias participantes do Strong Heart Study. 20' 39, 40 0 coorte do estudo consiste em mais de 4 549 indivíduos com idades dos 45 aos 74 anos, vistos no primeiro exame realizado entre Julho de 1989 e Janeiro de 1992. As taxas de participação de todos os membros tribais admissíveis foram em média de 64%. Os não participantes eram semelhantes aos participantes em termos de idade e de frequência autorrelatada de diabetes. As taxas de reexame daqueles ainda vivos aquando do segundo exame (Julho de 1993 a Dezembro de 1995) foram de 88% em média e o terceiro exame (Julho de 1997 a Dezembro de 1999) de 90% em média. O exame clínico em cada fase consistiu numa entrevista pessoal e num exame físico. Fez-se a colheita de amostras de sangue em jejum tendo em vista medições bioquímicas, e realizou-se um teste de tolerância à glicose oral de 75 gramas. Colheu-se as amostras de sangue na presença de 39 EDTA, fez-se a colheita do plasma e a sua armazenagem nos -20°C. Obteve-se medições da pressão arterial padrão e fez-se o registo e a codificação de electrocardiogramas como anteriormente descrito. 39, 40 Classificou-se os participantes de diabéticos de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde. 41 Os participantes foram considerados hipertensos se tomassem medicação para a hipertensão ou se tivessem uma pressão arterial sistólica superior a 140 mm Hg ou uma pressão arterial diastólica superior a 90 mm Hg.

As mortes no coorte do Strong Heart Study entre 1988 e a actualidade foram identificados por meio de registos tribais e hospitalares e pelo contacto directo do pessoal do estudo com os participantes e as suas famílias. Obteve-se cópias das certidões de óbito junto dos departamentos de saúde estatais e foram centralmente codificados por um nosologista de acordo com a ICD-9. Identificou-se inicialmente as possíveis mortes por DCV a partir das certidões de óbito como previamente descrito.42 A causa de morte foi investigada por meio de relatórios de autópsia, interpretações de registos médicos e entrevistas informantes como anteriormente descrito. Todo o material foi analisado de forma independente por pessoal médico do Strong Heart Study Mortality Review Committee para confirmar a causa de morte. Os critérios de DCV e de AVC 4 ? fatais são os anteriormente descritos.

Os registos médicos foram analisados em cada exame para identificar eventos cardiovasculares não fatais, enfarte do miocárdio definitivo e DCV definitiva como anteriormente descrito 20, 43, que tenham ocorrido desde o exame anterior. Também se analisou os registos daqueles que não 40 participaram no segundo ou no terceiro exame. No caso de todos os eventos ou intervenções de DCV potenciais, os registos médicos foram analisados por analistas qualificados de registos clínicos. Analisou-se os registos de visitas em ambulatório e foi feita a sua análise quanto a procedimentos de diagnóstico de DCV (por exemplo, prova de esforço, angiografia coronária). A informação obtida da análise aos registos foi analisada por um médico do comité de análise da mortalidade e da morbilidade do Strong Heart Study, para estabelecer o diagnóstico específico da DCV. Uma análise cega dos registos analisados por outros médicos do Morbidity Review Committee mostraram uma concordância quando ao diagnóstico > 90%.

Definição de caso e de controlos: 0 presente estudo trata-se de uma amostragem de caso-controlo, concebida para analisar a relação entre as DCV e o fenótipo da haptoglobina. Sujeitou-se a esta análise 206 casos de DCV e de controlos (agrupados por idade, sexo e área geográfica).

Fenotipagem da haptoglobina:

Determinou-se a fenotipagem da haptoglobina a partir de 10 pL de plasma-EDTA por electroforese em gel e coloração com peroxidase empregando uma modificação44' 45 do método originalmente descrito por Smithies46, que utilizou electroforese em gel de amido e coloração de peroxidase com benzidina. O plasma dos doentes foi armazenado nos -20°C. Todos os produtos químicos foram comprados à Sigma Israel (Rehovot, Israel). Preparou-se uma solução de hemoglobina a 10% em água a partir de sangue heparinizado, ao lavar primeiro as células sanguíneas 5 vezes em soro fisiológico tamponado com fosfato, e sujeitando em seguida as células a 41 lise em 9 mL de água estéril por mL de volume de células peletizadas. Centrifugou-se o lisado celular com 10 000 g durante 40 minutos, produziu-se alíquotas do sobrenadante contendo hemoglobina e procedeu-se ao seu armazenamento nos -70°C. Misturou-se o soro (10 pL) com 2 pL da solução de hemoglobina a 10% e deixou-se a amostras permanecer durante 5 minutos à temperatura ambiente, de modo a permitir a formação do complexo de haptoglobina-hemoglobina. Adicionou-se um volume igual (12 pL) de tampão de amostra, contendo Tris-Base 125 mM, pH de 6,8, 20% (w/v) de glicerol e 0,001% (w/v) de azul de bromofenol, a cada amostra antes de fazer correr sobre o gel. Analisou-se o complexo de haptoglobina-hemoglobina por electroforese em gel de poliacrilamida, recorrendo a um tampão que continha Tris-Base 25 mM e glicina 192 mM. O gel de empilhamento era a poliacrilamida a 4% (29:1 de acrilamida/bis-acrilamida) em Tris-Base 125 mM, pH de 6,8 e o gel de separação era a poliacrilamida a 4,7% (29:1 de acrilamida/bis-acrilamida) em Tris-Base 360 mM, pH de 8,8. Realizou-se a electroforese com uma voltagem constante de 250 volts durante 3 horas. Depois de terminada a electroforese, visualizou-se os complexos de haptoglobina-hemoglobina ao embeber o gel em solução corante acabada de preparar numa placa de vidro. A solução corante (preparada pela adição de reagentes na ordem listada) continha 5 mL de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina a 0,2% (w/v) em metanol, 0,5 mL de sulfóxido de dimetilo, 10 mL de ácido acético glacial a 5% (v/v), 1 mL de ferricianeto de potássio a 1% (w/v) e 150 pL de peróxido de hidrogénio a 30% (w/w) . As bandas correspondendo ao complexo de haptoglobina-hemoglobina ficaram facilmente visíveis em 15 minutos e permaneceram estáveis durante mais de 48 horas. Documentou-se todos os géis com fotografias. Determinou-se o fenótipo da 42 haptoglobina de todas as amostras no laboratório sem informação acerca do doente. 0 laboratório recebeu as amostras de plasma para análise e foi possível a fenotipagem da haptoglobina em todas as amostras à excepção de seis. No caso destes seis doentes não é claro se representam doentes que não produzem haptoglobina (fenótipo Hp 0) 22' 23 ou se a concentração da haptoglobina se encontra abaixo do limite de detecção do ensaio descrito.

Análise estatística:

Os factores de risco das DCV de idade, sexo, colesterol LDL e HDL, triglicéridos, PA sistólica, IMC, diabetes, estado tabágico, histórico familiar de DCV e centro de recrutamento foram comparados entre os casos e os controlos, assim como entre os três fenótipos da haptoglobina. Além disso, comparou-se as características da DM, consistindo na insulina, nos níveis de glicose em jejum, HbAlc, duração da DM e histórico familiar da DM entre os casos e os controlos, assim como entre os três fenótipos da haptoglobina. Realizou-se a modelação da regressão logística multinomial e univariante para determinar se estes factores de risco de DCV e se estas características da DM estavam relacionados com o fenótipo. Empregou-se a taxa de probabilidade para testar os parâmetros.

Realizou-se um modelo de regressão logística condicional, modelando a probabilidade de sofrer um acidente de DCV no caso de um doente diabético, ajustando os três fenótipos da haptoglobina aos factores de risco de DCV e às características da DM. Codificou-se a interacção entre o 43 fenótipo e a diabetes usando duas variáveis indicadoras, uma para doentes com diabetes e outra para doentes sem diabetes. 0 ajuste do modelo foi avaliado por uma análise dos residuais.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

As caracteristicas clinicas do coorte de casos-controlos de acordo com os factores de risco de DCV e com as caracteristicas da DM são mostradas na Tabela 1 em baixo.

Tabela 1

Factores de risco de DCV por status de caso-controlo

Factores de risco de DCV Controlos Casos média STD média STD Idade 59, 16 8,01 60,09 8,08 Colesterol LDL 112, 1 30,44 123,0 40,47 Mediana Mín. Máx. Mediana Min. Máx. Duração da DM 6,00 0, 00 41,00 PA sistólica 124, 0 81,00 210,0 131,0 88, 00 205, 0 IMC 29,76 17, 71 48,07 29,84 19,59 72,36 HbAlc 4, 00 4, 00 13,10 7,20 4, 00 15, 50 Glicose em jejum 118,5 77, 00 365, 0 148,0 57, 00 354,0 Insulina 15, 99 2,20 144, 7 18,45 1,50 314, 5 n % n % Sexo feminino 102 49,51 102 49,51 Diabetes 93 45, 15 146 70,89 Fumador actual 136 66,0 143 70,69 DM da família hx 131 63,5 145 70,34 DCV da família hx 119 57, 77 148 71,84 Centro OK 74 35,92 74 35, 92 SD 73 35, 44 73 35, 44 AZ 59 28,64 59 28,64 44 STD = desvio padrão

Fez-se a correspondência de casos e controlos em termos de idade, sexo e área geográfica. Estes dados eram consistentes com a descoberta anterior nesta população de que a diabetes, o colesterol LDL e a hipertensão são todos 2 0 previsores independentes de DCV. A fenotipagem da haptoglobina deste coorte revelou uma distribuição de 25% de 1-1, de 44% de 2-1 e de 31% de 2-2. A frequência do alelo 1 era de 0,47, o que está em conformidade com a frequência alélica da haptoglobina para esta população previamente relatada.26 Não se encontrou uma diferença significativa entre os diferentes fenótipos da haptoglobina para qualquer um dos factores de risco de DCV ou caracteristicas de DM, como determinado tanto por análise univariante como por análise de regressão logística multinomial modelando a probabilidade de ter um fenótipo 1-1. A Tabela 2 em baixo fornece a regressão logística condicional, que prevê a probabilidade de um acidente de DCV para cada um dos fenótipos da haptoglobina em indivíduos diabéticos e não diabéticos, antes e após o ajuste em relação aos factores de risco de DCV e às caracteristicas da DM.

Tabela 2

Regressão logística condicional que prevê a probabilidade

de um acidente de DCV 45

46 46 Sem DM, Hp 2-2 (vs sem DM, Hp 1-1) 2, 97 (0,90-9,77) 0,073 Sem DM, Hp 2-2 (vs sem DM, Hp 2-1) 1, 75 (0,71-4,29) 0,225 OR Cl Valor p odds ratio = taxa de probabilidade intervalo de confiança valor de probabilidade

Estes dados mostram, após ajuste em relação a todos os factores de risco de DCV e caracteristicas de DM, que dentre os participantes do Strong Heart Study com diabetes, os com o fenótipo 2-2 da haptoglobina têm uma probabilidade 4, 7 (1, 86 - 11,88 OR 95% Cl) vezes maior de sofrer um acidente de DCV do que os com um fenótipo 1-1 (p = 0,001) e uma probabilidade 2,5 (1,14 - 5,67 OR 95% Cl) maior de sofrer um acidente de DCV do que os com um fenótipo 2-1 (p = 0, 022) . Além disso, os doentes com um fenótipo 2-1 da

haptoglobina tinham uma probabilidade 1,8 (0,86 - 3,96 OR 95% Cl) vezes maior de sofrer um acidente de DCV do que aqueles com o fenótipo 1-1, embora isto não fosse significativo em termos estatísticos. No global, estes dados sugerem a existência de um risco escalonado, conferido pelo número de alelos 2 da haptoglobina, no desenvolvimento de DCV em indivíduos diabéticos.

Por fim, observou-se uma tendência nos doentes sem diabetes com significado estatístico marginal, que mostra que os doentes não diabéticos com o fenótipo 2-2 da haptoglobina têm uma probabilidade 3,0 (0, 90 - 9, 77 OR 95% Cl) vezes maior de sofrer um acidente de DCV do que aqueles não diabéticos com um fenótipo 1-1 (p = 0,073) . 47 A Tabela 3 em baixo resume estes resultados:

Tabela 3

Regressão Logística Condicional prevendo a probabilidade de acidente de DCV com ajuste em relação à DM e aos factores

de risco de DCV 95% Cl Factores de risco QR Inferior Superior Valor p (de DCV) DM e Hp 2-1 (vs dm e Hp 1-1) 1,85 0,86 3,96 0,116 DM e Hp 2-2 (vs dm e Hp 1-1) 4,70 1,86 11,88 0,001 DM e Hp 2-2 (vs dm e Hp 2-1) 2,55 1,14 5,67 ,022 Sem DM, Hp 2-1 (vs sem dm, Hp 1-1) 1,70 0,53 5,49 0,373 Sem DM, Hp 2-2 (vs sem dm, 1¾} 1-1) 2,97 0,90 9,77 0,073 Sem DM, Hp 2-2 (vs sem dm, Hp 2-1) 1,75 0,71 4,29 0,225

Determinadas caracteristicas da invenção, que são, para fins de clareza, descritas no contexto de execuções em separado, também poderão ser fornecidas em combinação numa única execução. Ao invés, diversas caracteristicas da invenção, que são, para fins de brevidade, descritas no contexto de uma única execução, também poderão ser fornecidas em separado ou numa subcombinação apropriada.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com as respectivas execuções específicas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes aos especialistas do estado da técnica. Em conformidade com isso, pretende- -se contemplar todas essas alternativas, modificações e variações que recaiam sob o espirito e o âmbito amplo das reivindicações anexas. Além disso, qualquer citaçao ou identificação de qualquer referência no presente pedido não deverá ser entendida como uma admissão 48 de que tal referência se encontra disponível como estado da técnica antecedente da presente invenção. 49

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <ÍUS> Lsvy, ftfidrew P.

<120> MÉTODO PARA DETERMINAS O RISCO DE DESENVOLVIMENTO DE DOENÇAS CARDIOVASCULARES EM DOENTES HIPERGLICÉMICOS <Í30> 01/21897 <180 1 <nu> Patentln vetsíon 3.0 <210 1 <211;» 21 <2·?> PET <213> humano <22:0 <223> cadeia alfa 2 peptídica da haptoglobina <·900> 1

Ala Vai Giy Mp LyS Leu Fro Glu Cys Glu Ala ftsp Asp Çly Gin Pro 5 10 15

PfO Pso Lys Cys íle 20

Lisboa, 6 de Abril de 2010

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método in vitro para avaliar o risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares ateroscleróticas (DCV) num doente diabético, indo o método contemplar a determinação de um fenótipo da haptoglobina do doente diabético e, com isso, a avaliação do risco de o doente diabético desenvolver a doença cardiovascular aterosclerótica (DCV), estando esse risco diminuido nos doentes diabéticos com o fenótipo 1-1 da haptoglobina em comparação com os doentes com os fenótipos 1-2 ou 2-2 da haptoglobina.

2. 0 método da reivindicação 1, em que a referida etapa de determinação do referido fenótipo da haptoglobina contempla a determinação do genótipo da haptoglobina do doente diabético.

3. 0 método da reivindicação 2, em que a referida etapa de determinação do referido genótipo da haptoglobina do doente diabético contempla um método seleccionado do grupo composto por um método de amplificação de sinal, um método de detecção directa e a detecção de pelo menos uma modificação de sequência.

4. 0 método da reivindicação 3, em que o referido método de amplificação de sinal amplifica uma molécula seleccionada do grupo composto por uma molécula de ADN e uma molécula de ARN.

5. 0 método da reivindicação 3, em que o referido método de amplificação de sinal é seleccionado do grupo composto por PCR, LCR (LAR), Self-Sustained Synthetic 2 Reaction (3SR/NASBA) e reacçao da Q-Beta (<2β) Replicase.

6. O método da reivindicação 3, em que o referido método de detecção directa é seleccionado do grupo composto por uma reacção denominada cycling probe reaction (CPR) e por análise de ADN ramificado.

7. 0 método da reivindicação 3, em que a referida detecção de pelo menos uma modificação de sequência emprega um método seleccionado do grupo composto por polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (análise RFLP), análise de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), electroforese em gel de gradiente de temperatura/desnaturante (TGGE/DGGE), análise de polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP) e impressão de didesoxi (ddF).

8. 0 método da reivindicação 1, em que a referida etapa de determinação do referido fenótipo da haptoglobina contempla a determinação directa do fenótipo da haptoglobina do doente diabético.

9. 0 método da reivindicação 8, em que a referida etapa de determinação do fenótipo da haptoglobina é realizada por um método de detecção imunológico.

10. 0 método da reivindicação 9, em que o referido método de detecção imunológico é seleccionado do grupo composto por radioimunoensaio (RIA), um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), um western blot, uma análise imuno-histoquímica e separação celular de activação por fluorescência (FACS). 3 11. 0 método da reivindicação 1, em que o risco de o doente diabético desenvolver a doença cardiovascular aterosclerótica está diminuído no caso dos doentes diabéticos com o fenótipo 1-1 da haptoglobina em comparação com os doentes como o fenótipo 1-2 da haptoglobina, e está ainda mais diminuído no caso dos doentes diabéticos com o fenótipo 1-1 da haptoglobina em comparação com os doentes com o fenótipo 2-2 da haptoglobina. Lisboa, 6 de Abril de 2010