PT1250600E - Diagnosis of tauopathies determining tau/phospho-tau ratio - Google Patents

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PT1250600E
PT1250600E PT01909655T PT01909655T PT1250600E PT 1250600 E PT1250600 E PT 1250600E PT 01909655 T PT01909655 T PT 01909655T PT 01909655 T PT01909655 T PT 01909655T PT 1250600 E PT1250600 E PT 1250600E
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Eugeen Vanmechelen
Hugo Vanderstichele
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Innogenetics Nv
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DESCRIÇÃODESCRIPTION

"DIAGNÓSTICO DE TAUPATIAS A PARTIR DA DETERMINAÇÃO DA RAZÃO TAU/FOSFO-TAU"" DIAGNOSIS OF TAUPATIAS FROM THE DETERMINATION OF THE TAU / FOSFO-TAU REASON "

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao diagnóstico de taupatias. A presente invenção fornece um novo método para a detecção e/ou diagnóstico diferencial de taupatias. A presente invenção fornece também um fosfo-péptido que pode ser utilizado para a padronização num método da invenção.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the diagnosis of taupatias. The present invention provides a novel method for the differential detection and / or diagnosis of taupatias. The present invention also provides a phospho-peptide that can be used for standardization in a method of the invention.

ANTECENDENTES DA INVENÇÃO Têm sido associadas várias formas de demência, as chamadas taupatias (Goedert et ai., 1998), ao mesmo mecanimo patofisiológico, o envolvimento da proteína estrutural Tau. A proteína Tau associada aos microtúbulos é por exemplo um componente proteico maioritário dos filamentos helicoidais emparelhados (PHF) e dos novelos neurofibrilhares (NFT) associados à doença de Alzheimer (Brion et al., 1985; Delacourte and Defossez, 1986; Grundke-Iqbal et al. , 1986; Kosik et al., 1986; Wood et al., 1986; Kondo et al., 1988). A proteína tau existe em diferentes isoformas, das quais 4 de 6 são verificadas no cérebro adulto mas apenas 1 isoforma é detectada no cérebro fetal. A diversidade das isoformas é gerada a partir de um único gene no cromossoma 17 humano através de splicing de mRNA (Himmler, 1989; Goedert et al., 1989; Andreadis et al., 1992). A característica mais marcante da proteína Tau, como deduzido a partir de clonagem molecular, é a existência de uma porção elástica de 31 ou 32 aminoácidos, que ocorre no terminal carboxilo da molécula, a qual pode ser repetida 2 tanto 3 ou 4 vezes. A diversidade adicional é gerada através de longas inserções de 29 ou 58 aminoácidos no terminal-NH2 das moléculas Tau (Goedert et al., 1989). A tau promove a junção dos microtúbulos in vivo e a estabilidade do compartimento axonal dos neurónios através de interacções envolvendo o seu dominio de ligação aos microtúbulos o qual está localizado na região repetitiva de tau (255-381) (Lewis et al., 1988). Em circunstâncias normais o cérebro adulto contém 2-3 moles de fosfato por mole de tau (Selden and Pollard, 1983; Ksiezak-Reding et al. , 1992) . A fosforilação de diferentes locais na tau normal tal como estudado em rato e humanos é dependente do estado de desenvolvimento (Lee et al., 1991; Bramblett et al., 1993; Goedert et al., 1993). As variantes Tau de 60, 64 e 68 kDa que surgem como consequência da fosforilação têm sido detectadas em áreas do cérebro que apresentam novelos neurofibrilares (Delacourte et al., 1990; Goedert et al., 1992; Flament et al., 1990, Greenberg and Davies, 1990). Estes cérebros contêm 6-8 moles de fosfato por mole de tau (Ksiezak-Reding et al., 1992). Em tau isolada a partir de PHF (Tau de PHF), a fosforilação ocorre em várias posições (Iqbal et al., 1989; Lee et al., 1991; Hasegawa et al. , 1992; Hanger et al., 1998; Buee et al., 1999). A doença de Alzheimer (AD) é o tipo mais comum de demênciaBACKGROUND OF THE INVENTION Various forms of dementia, the so-called taupatias (Goedert et al., 1998), have been associated with the same pathophysiological mechanism, the involvement of the Tau structural protein. Microtubule-associated Tau protein is for example a major component of the paired helical filaments (PHF) and neurofibrillary tangles (NFT) associated with Alzheimer's disease (Brion et al., 1985; Delacourte and Defossez, 1986; Grundke-Ibal et al. Kondo et al., 1988). The tau protein exists in different isoforms, of which 4 of 6 are found in the adult brain but only 1 isoform is detected in the fetal brain. The diversity of the isoforms is generated from a single gene on human chromosome 17 by mRNA splicing (Himmler, 1989; Goedert et al., 1989; Andreadis et al., 1992). The most striking feature of Tau protein, as deduced from molecular cloning, is the existence of an elastic moiety of 31 or 32 amino acids, which occurs at the carboxyl terminus of the molecule, which can be repeated either 3 or 4 times. Additional diversity is generated through long 29- or 58-amino acid insertions at the NH2 terminus of the Tau molecules (Goedert et al., 1989). Tau promotes the in vivo microtubule junction and axonal compartment stability of neurons through interactions involving their microtubule binding domain which is located in the repeating region of tau (255-381) (Lewis et al., 1988) . Under normal circumstances the adult brain contains 2-3 moles of phosphate per mole of tau (Selden and Pollard, 1983; Ksiezak-Reding et al., 1992). Phosphorylation of different sites in normal tau as studied in mouse and humans is developmental dependent (Lee et al., 1991; Bramblett et al., 1993; Goedert et al., 1993). The Tau variants of 60, 64 and 68 kDa that arise as a consequence of phosphorylation have been detected in areas of the brain that have neurofibrillary brains (Delacourte et al., 1990; Goeringt et al., 1992; Flament et al., 1990, Greenberg and Davies, 1990). These brains contain 6-8 moles of phosphate per mole of tau (Ksiezak-Reding et al., 1992). In tau isolated from PHF (Tau of PHF), phosphorylation occurs in various positions (Iqbal et al., 1989; Lee et al., 1991; Hasegawa et al., 1992; Hanger et al., 1998; Buee et al. al., 1999). Alzheimer's disease (AD) is the most common type of dementia

degenerativa primária associada a uma patologia tau, tendo uma prevalência de 42-75% (Brun, 1993; Gustafson, 1993; Ebly et al., 1994). A demência fronto-temporal (FTD) é uma condição clinica na qual estão presentes a nível patológico a doença de Pick, a demência fronto-temporal com Parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, a FTD esporádica e a doença neuronal motora. De acordo com um pequeno estudo efectuado por Mann et al. (2000), 16 de 37 casos com FTD 3 podem ser classificados como taupatia tendo em conta a imunohistoquímica efectuada para a tau. Os filamentos da patologia tau i.e. Novelos Neurofibrilares (NFT), são verificados com consistência na AD (Tomlinson e Corsellis, 1984) embora também possam ser verificados na FTD (Spillantini e Goedert, 1998). As proteínas Tau associadas a uma patologia são verificadas tanto na AD como na FTD (Vermersch et al., 1995; Delacourte et al., 1996), contudo estudos em tecido cerebral têm sugerido que a patologia associada a tau difere entre a AD e FTD, estando possivelmente relacionada com o grau de fosforilação (Delacourte et al., 1996). Outras formas de demência associadas a uma patologia da proteína tau incluem a Paralisia supranuclear progressiva (PSP), a Degeneração corticobasal e a Panencefalite esclerosante subaguda. O papel da hiperfosforilação na patologia destas taupatias não é bem entendido actualmente. Adicionalmente, têm sido encontradas várias dificuldades na determinação exacta do grau de fosforilação dos locais específicos de fosforilação na região de prolinas. Devido a estas dificuldades, ainda não existe um método preciso de detecção específica destas taupatias.degenerative disease associated with a tau pathology, with a prevalence of 42-75% (Brun, 1993; Gustafson, 1993; Ebly et al., 1994). Frontotemporal dementia (FTD) is a clinical condition in which Pick's disease, fronto-temporal dementia with chromosome 17-linked Parkinsonism, sporadic FTD and motor neuronal disease are present at the pathological level. According to a small study by Mann et al. (2000), 16 of 37 cases with FTD 3 can be classified as taupatia considering the immunohistochemistry performed for tau. The filaments of the tau pathology i.e. Neurofibrillary Burs (NFT), are consistently verified in AD (Tomlinson and Corsellis, 1984) although they can also be verified in FTD (Spillantini and Goedert, 1998). The Tau proteins associated with a pathology are found in both AD and FTD (Vermersch et al., 1995; Delacourte et al., 1996), however studies in brain tissue have suggested that the pathology associated with tau differs between AD and FTD , being possibly related to the degree of phosphorylation (Delacourte et al., 1996). Other forms of dementia associated with a tau protein pathology include progressive supranuclear palsy (PSP), corticobasal degeneration, and subacute sclerosing panencephalitis. The role of hyperphosphorylation in the pathology of these taupatias is not well understood at present. In addition, various difficulties have been found in accurately determining the degree of phosphorylation of specific phosphorylation sites in the proline region. Due to these difficulties, there is still no precise method of specific detection of these taupatias.

OBJECTIVOS DA INVENÇÃO É objectivo da presente invenção fornecer um método para o diagnóstico de uma taupatia num indivíduo. É outro objectivo da presente invenção fornecer um método para o diagnóstico num indivíduo da doença de Alzheimer, doença de Pick, Demência fronto-temporal e/ou Demência fronto-temporal com Parkinsonismo ligado ao cromossoma 17. 4 É outro objectivo da presente invenção fornecer um método para o diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma não-taupatia. É outro objectivo da presente invenção fornecer um método para o diagnóstico de uma taupatia versus uma neurodegeneração não-taupática. É outro objectivo da presente invenção fornecer um método para o diagnóstico diferencial de uma taupatia versus demência vascular, Doença de Creutzfeldt Jacob, derrame cerebral e/ou neurotoxicidade em doentes com leucemia. É outro objectivo da presente invenção fornecer um método para o diagnóstico diferencial da doença de Alzheimer, doença de Pick, Demência fronto-temporal esporádica e/ou Demência fronto-temporal com Parkinsonismo ligado ao cromosssoma 17 versus demência vascular, Doença de Creutzfeldt Jacob, derrame cerebral e/ou neurotoxicidade em doentes com leucemia. É outro objectivo da presente invenção fornecer um método in vitro como acima descrito. É outro objectivo da presente invenção fornecer um fosfo-péptido para utilização na padronização. É outro objectivo da presente invenção fornecer um fosfo-péptido para utilização na padronização num método para detectar fosfo-tau (181) . É outro objectivo da presente invenção fornecer um fosfo-péptido para utilização na padronização num método como acima descrito. É outro objectivo da presente invenção fornecer um kit de diagnóstico para utilização num método como acima descrito. É outro objectivo da presente invenção fornecer um péptido, um método e/ou um kit de diagnóstico para o teste ou rastreio de drogas, para a monitorização terapêutica e/ou 5 para a determinação da eficácia de um certo tratamento para uma taupatia.OBJECTS OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a method for the diagnosis of tautathy in an individual. It is another object of the present invention to provide a method for the diagnosis in a subject of Alzheimer's disease, Pick's disease, Frontotemporal Dementia and / or Frontotemporal Dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17. It is another object of the present invention to provide a method for the differential diagnosis of a taupatia versus a non-taupatia. It is another object of the present invention to provide a method for the diagnosis of taupathy versus non-taupo neurodegeneration. It is another object of the present invention to provide a method for the differential diagnosis of tautathy versus vascular dementia, Jacob's Creutzfeldt Disease, stroke and / or neurotoxicity in patients with leukemia. It is another object of the present invention to provide a method for the differential diagnosis of Alzheimer's disease, Pick's disease, sporadic fronto-temporal dementia and / or Frontotemporal dementia with Chromosome 17-linked Parkinsonism versus vascular dementia, Jacob's Creutzfeldt's disease, stroke cerebral and / or neurotoxicity in patients with leukemia. It is another object of the present invention to provide an in vitro method as described above. It is another object of the present invention to provide a phospho-peptide for use in standardization. It is another object of the present invention to provide a phospho-peptide for use in standardization in a method for detecting phospho-tau (181). It is another object of the present invention to provide a phospho-peptide for use in standardization in a method as described above. It is another object of the present invention to provide a diagnostic kit for use in a method as described above. It is another object of the present invention to provide a peptide, method and / or diagnostic kit for drug testing or screening, for therapeutic monitoring and / or for the determination of the efficacy of a certain treatment for a taupathy.

LEGENDAS DAS FIGURASPICTURE'S DESCRIPTION

Figura 1. Mapeamento fino dos anticorpos tau, HT7, taul, BT2, AT120 e AT270 em péptidos sintéticos de sobreposição. Apenas são apresentados os péptidos imunoreactivos. A. Mapeamento em péptidos sintetizados em pins. Foram utilizados 48 nonapéptidos que abrangem 8 aminoácidos para cobrir a região da tau a partir de 155 até 208. B. Sintese de péptidos em papel. Dezasseis péptidos de sobreposição com 12 aminoácidos de comprimento definem o epítopo AT120 na região 206-232. C. Mapeamento do anticorpo AT270 em fosfopéptidos biotinilados (a treonina fosforilada está indicada) envolvendo a região 166 até 196.Figure 1. Thin mapping of tau, HT7, taul, BT2, AT120 and AT270 antibodies into synthetic overlapping peptides. Only immunoreactive peptides are shown. A. Mapping in synthesized peptides in pins. We used 48 nonapeptides spanning 8 amino acids to cover the tau region from 155 to 208. B. Synthesis of peptides in paper. Sixteen 12-amino acid overlapping peptides define the AT120 epitope in the 206-232 region. C. Mapping of AT270 antibody to biotinylated phosphopeptides (phosphorylated threonine is indicated) involving region 166 to 196.

Figura 2. Especificidade do anticorpo AT270 para a fosfo-Thr 181 tal como definida através do rastreio de fosfopéptidos sintéticos. Os fosfopéptidos biotinilados foram capturados em placas revestidas com estreptavidina a uma concentração de 1 yg/ml. Ο AT270 foi detectado através de um anticorpo secundário ligado à peroxidase. As sequências dos péptidos são apresentadas na tabela 1.Figure 2. Specificity of the AT270 antibody for phospho-Thr 181 as defined by the screening of synthetic phosphopeptides. Biotinylated phosphopeptides were captured on streptavidin coated plates at a concentration of 1æg / ml. Ο AT270 was detected through a peroxidase-linked secondary antibody. Peptide sequences are shown in Table 1.

Figura 3. Relação entre os niveis de fosfo-tau, determinados pelo ensaio HT7-AT270, e os niveis totais de tau (ensaio AT120 - (HT7-BT2)). Foram efectuadas experiências de várias preparações de Tau de PHF a diferentes diluições. A figura apresenta os dados não tratados ensaiados em duplicado em duas placas diferentes a partir da diluição da preparação de Tau de PHF, a qual corresponde a aproximadamente 0,5 OD450. As barras no 6 gráfico são desvios padrão. PHF-A a D são derivadas a partir de córtex fronto-temporal, enquanto que PHF-E é preparada a partir de uma região do hipocampo de um cérebro com Alzheimer.Figure 3. Relationship between phospho-tau levels, determined by HT7-AT270 assay, and total tau levels (AT120 - (HT7-BT2) assay). Experiments were performed on various PHF Tau preparations at different dilutions. The figure shows the untreated data tested in duplicate on two different plates from the dilution of the PHF Tau preparation, which corresponds to approximately 0.5 OD450. The bars in the graph are standard deviations. PHF-A to D are derived from the frontotemporal cortex, whereas PHF-E is prepared from a hippocampal region of an Alzheimer's brain.

Figura 4. Gráfico de cotação de tau-total de CSF na demência fronto-temporal, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e encefalopatia arteriosclerótica subcortical.Figure 4. CSF tau-total quotation graph in fronto-temporal dementia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and subcortical atherosclerotic encephalopathy.

Figura 5. Gráfico de cotação de fosfo-tau (181) de CSF na demência fronto-temporal, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e encefalopatia arteriosclerótica subcortical.Figure 5. CSF phospho-tau quotation chart (181) in fronto-temporal dementia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and subcortical atherosclerotic encephalopathy.

Figura 6. Gráfico da correlação entre tau-total de CSF e fosfo-tau (181) de CSF, com todos os indivíduos do estudo incluídos.Figure 6. Correlation chart between tau-total of CSF and phospho-tau (181) of CSF, with all subjects included in the study.

Figura 7. Gráfico de cotação da razão de fosfo-tau (181)/tau total em CSF de doentes com demência fronto-temporal, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e encefalopatia arteriosclerótica subcortical.Figure 7. Factor plot of the phospho-tau ratio (181) / total tau in CSF of patients with fronto-temporal dementia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and subcortical atherosclerotic encephalopathy.

Figura 8. Tau-total de CSF (esquerda) e fosfo-tau (181) de CSF (direita) a diferentes intervalos de tempo após derrame cerebral agudo. Os traços correspondem a médias e as barras ao SD. Número de amostras a diferentes intervalos de tempo: dia 0-1: n = 9, dia 2-3: n = 18, dia 7-9: n = 22, semana 3: n = 21, mês 3-5: n = 21. Significância comparada com o dia 0-1: para tau de CSF: dia 2-3: p = 0,002, dia 7-9: p &lt; 0,0001, semana 3: mês 3-5: p = 0,0035, para fosfo-tau de CSF: Não foram encontradas diferenças significativas em qualquer intervalo de tempo comparando com o dia 0-1. 7Figure 8. Tau-total CSF (left) and phospho-tau (181) CSF (right) at different time intervals after acute stroke. Traits correspond to averages and bars to SD. Number of samples at different time intervals: day 0-1: n = 9, day 2-3: n = 18, day 7-9: n = 22, week 3: n = 21, month 3-5: n = 21. Significance compared with day 0-1: for CSF tau: day 2-3: p = 0.002, day 7-9: p < 0.0001, week 3: month 3-5: p = 0.0035, for CSF phospho-tau: No significant differences were found in any time interval compared to day 0-1. 7

Figura 9. Valores individuais para tau-total de CSF (esquerda) e fosfo-tau (181) de CSF (direita) a diferentes intervalos de tempo para 9 doentes nos quais amostras de CSF foram retiradas no dia 1.Figure 9. Individual values for tau-total of CSF (left) and phospho-tau (181) of CSF (right) at different time intervals for 9 patients in which CSF samples were withdrawn on day 1.

Figura 10. Correlação entre a tau total de CSF e fosfo-tau (181) de CSF em doentes com doença de Alzheimer (n = 54) e em controlos (n = 17) (esquerda), e em doentes com derrame cerebral agudo (n = 22, número de amostras = 91) (direita).Figure 10. Correlation between total tau of CSF and phospho-tau (181) of CSF in patients with Alzheimer's disease (n = 54) and in controls (n = 17) (left), and in patients with acute stroke ( n = 22, number of samples = 91) (right).

TABELASTABLES

Tabela 1: Sequência de péptidos fosforilados utilizados para determinar a especificidade do AT270 para a fosfo-Thr 181Table 1: Sequence of phosphorylated peptides used to determine the specificity of AT270 for phospho-Thr 181

Nome Sequência SEQ ID N2 153 KGADGKTKIAT(p)PRGAAPPGQK 8 175 QANATRIAPKT(p)PPAPKTPPSS 9 181 RIPAKTPPAPKT(p)PPSSGEPPKS 10 198 PPKSGDRSGYS(p)SGSPGTPGSR 11 199 PKSGDRSGYSS(p)GSPGTPGSRS 12 202 SGDRSGYSSGS(p)PGTPGSRSRT 13 205 RSGYSSGSPGT(p)PGSRSRTPSL 14 208 YSSGSPGTPGS(p)RSRTPSLPTP 15 210 SGSPGTPGSRS(p)RTPSLPTPTR 16 212 SPGTPGSRSRT(p)PSLPTPTREP 17 214 GTPGSRSRTPS(p)LPTPTREPKK 18 217 GSRSRTPSLPT(p)PTREPKKVAV 19 231 RE PKKVAVVRT(p)PKSPSSAKS 20 235 KKVAVVRT PKS(p)PSSAKSRLQ 21 262 VKSKIGS(p)TENLK 22 396 TDHGAEIVYKS(p)PVVSDTSPRH 23 400 AEIVYKSPVVS(p)DTSPRHLSNV 24 403 IVYKSPVVSDT(p)SPRHLSNVSS 25 404 YKSPVVSDTS(p)PRHLSNVSST 26 409 VVSDTSPRHLS(p)NVSSTGSIDM 27 412 DTSPRHLSNVS(p)STGSIDMVDS 28 422 SSTGSIDMVDS(p)PQLATLADEV 29 (p): o aminoácido é fosforiladoSEQ ID N2 153 KGADGKTKIAT (p) PRGAAPPGQK 8 175 QANATRIAPKT (p) PPAPKTPPSS 9 181 RIPAKTPPAPKT (p) PPSSGEPPKS 10 198 PPKSGDRSGYS (p) SGSPGTPGSR 11 199 PKSGDRSGYSS (p) GSPGTPGSRS 12 202 SGDRSGYSSGS (p) PGTPGSRSRT 13 205 RSGYSSGSPGT p) PGSRSRTPSL 14 208 YSSGSPGTPGS (p) RSRTPSLPTP 15 210 SGSPGTPGSRS (p) RTPSLPTPTR 16 212 SPGTPGSRSRT (p) PSLPTPTREP 17 214 GTPGSRSRTPS (p) LPTPTREPKK 18 217 GSRSRTPSLPT (p) PTREPKKVAV 19 231 RE PKKVAVVRT (p) PKSPSSAKS 20 235 KKVAVVRT PKS (p) PSSAKSRLQ 21 262 VKSKIGS (p) TENLK 22 396 TDHGAEIVYKS (p) PVVSDTSPRH 23 400 AEIVYKSPVVS (p) DTSPRHLSNV 24 403 IVYKSPVVSDT (p) SPRHLSNVSS 25 404 YKSPVVSDTS (p) PRHLSNVSST 26 409 VVSDTSPRHLS (p) NVSSTGSIDM 27 412 DTSPRHLSNVS ( p) STGSIDMVDS 28 422 SSTGSIDMVDS (p) PQLATLADEV 29 (p): the amino acid is phosphorylated

Tabela 2: Características dos doentes envolvidos no estudo descrito no exemplo 2.Table 2: Characteristics of the patients involved in the study described in Example 2.

DuraçãoDuration

Diagnóstico N Sexo (M: F) Idade da demência (A) Grau de demênciaa Razão de albuminab FTD 18 5:13 65,518,4 4,113,2 17,716,4 9,712,9 AD prov 41 13:28 73,815,9 3,211,8 17,615,2 5,411,8 AD poss 19 11:8 78,915,7 3,012,3 21,913,7 7,912,9 SAE 17 12:5 75,814,4 2,612,2 22,117,2 11,917,2 PD 15 11:4 69,917,5 - - 6,812,4 Controlos 17 4:13 71,814,2 - - 5,311,8 a MMSE-classificação;B razãoalbumina=[AlbuminaemCSF (mg/ml)/ albumina do soro (g/L)]. Todos os valores são expressos como médias ± SD. Foram utilizadas as seguintes abreviaturas: FTD: Demência fronto-temporal; AD: Doença de Alzheimer; SAE: Encefalopatia arteriosclerótica subcortical; PD: Doença de Parkinson; Prov: Provável; Poss: Possível; N: número de indivíduos; M: homem; F: mulher; A: anos; CSF: fluído cerebroespinalDiagnosis N Sex (M: F) Age of Dementia (A) Dementia's Degree Albuminab Ratio FTD 18 5:13 65,518.4 4,113.2 17,716.4 9,712.9 AD prov 41 13:28 73,815.9 3,211.8 17,615 , 2 5,411.8 AD poss 19 11: 8 78,915.7 3,012.3 21,913.7 7,912.9 SAE 17 12: 5 75,814.4 2,612.2 22,117.2 11,917.2 PD 15 11: 4 69,917.5 - - 6,812.4 Controls 17 4:13 71,814.2 - - 5,311.8 a MMSE-classification; Albumin ratio = [AlbumininCSF (mg / ml) / serum albumin (g / L)]. All values are expressed as means ± SD. The following abbreviations were used: FTD: Frontotemporal dementia; AD: Alzheimer's disease; SAE: Subcortical atherosclerotic encephalopathy; PD: Parkinson's disease; Prov: Probable; Poss: Possible; N: number of individuals; M: man; F: woman; Years ago; CSF: cerebrospinal fluid

Tabela 3. Níveis de tau-total, fosfo-tau (181) e razão de fosfo-tau (181)/tau total de CSF em distúrbios com demência, doença de Parkinson e envelhecimento normal.Table 3. Levels of total tau, phospho-tau (181) and phospho-tau ratio (181) / total tau of CSF in disorders with dementia, Parkinson's disease and normal aging.

Diagnóstico Níveis de fluído cerebroespinal (pM) Fosfo-tauDiagnosis Cerebrospinal fluid levels (pM) Phospho-tau

FTD Provável ADProbable FTD AD

Tau total Fosfo-tau (181) (181)/tau total 9,74 ± 2,88 8,59 ± 3,88*** 0,88 ± 0,34*** 20,01 ± 7,58*** 23,12 ± 10,10** 1,16 ± 0,24***Total tau Fosfo-tau (181) (181) / total tau 9.74 ± 2.88 8.59 ± 3.88 *** 0.88 ± 0.34 *** 20.01 ± 7.58 ** * 23.12 ± 10.10 ** 1.16 ± 0.24 ***

Possível AD 16,34 ± 4,30*** 18,01 ± 5,86 1,10 ± 0,20*** 9Possible AD 16.34 ± 4.30 *** 18.01 ± 5.86 1.10 ± 0.20 *** 9

SAE 3,70 ± 2,29*** 6,39 ± 5, ^ ^ ~k ~k ~k 1,96 ± 1, 08 PD 7,45 ± 1,59 14,07 ± 3,11 1,92 ± 0, 42 Controlos 8,33 ± 2,83 15,92 ± 5, 72 1,95 ± 0, 60 Todos os valores são expressos como médias ± DPSAE 3.70 ± 2.29 *** 6.39 ± 5, ^ ^ ~ k ~ k ~ k 1.96 ± 1.08 PD 7.45 ± 1.59 14.07 ± 3.11 1.92 ± 0.42 Controls 8.33 ± 2.83 15.92 ± 5.72 1.95 ± 0.60 All values are expressed as means ± SD

Abreviaturas: FTD: Demência fronto-temporal; AD: Doença de Alzheimer; PD: Doença de Parkinson; SAE: Encefalopatia arteriosclerótica subcortical. ***: O valor é significativamente diferente quando comparado com o valor dos controlos (p &lt; 0,001). **: O valor é significativamente diferente quando comparado com o valor dos controlos (p &lt; 0,01). *: O valor é significativamente diferente quando comparado com o valor dos controlos (p &lt; 0,05)Abbreviations: FTD: Frontotemporal dementia; AD: Alzheimer's disease; PD: Parkinson's disease; SAE: Subcortical atherosclerotic encephalopathy. ***: The value is significantly different when compared to the value of the controls (p &lt; 0.001). **: The value is significantly different when compared to the value of the controls (p &lt; 0.01). *: The value is significantly different when compared to the value of the controls (p &lt; 0.05)

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico de uma taupatia num indivíduo, compreendendo o referido método os passos de: - determinação da razão de fosfo-tau (181)/tau total no indivíduo referido; - inferência que o indivíduo referido sofre de taupatia através da comparação da razão de fosfo-tau (181)/tau total obtida no indivíduo referido com a razão de fosfo-tau (181)/tau total em indivíduos controlo, sendo uma indicação uma razão alterada de fosfo-tau (181)/tau total quando comparada com a razão referida em indivíduos controlo. A presente invenção também se refere a um método de diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma não- 10 taupatia num indivíduo, compreendendo o referido método os passos de: - determinação da razão de fosfo-tau (181)/tau total no indivíduo referido; - inferência que o indivíduo referido sofre de uma taupatia através da comparação da razão de fosfo-tau (181)/tau total obtida no indivíduo referido com a razão de fosfo-tau (181)/tau total obtido em indivíduos que sofrem de uma não-taupatia ou com a razão de fosfo-tau (181)/tau total em indivíduos controlo, sendo uma indicação uma razão alterada de fosfo-tau (181)/tau total quando comparada com a referida razão em indivíduos que sofrem de uma não-taupatia ou de indivíduos controlo. A presente invenção é baseada na verificação de que a razão de fosfo-tau (181)/tau total em CSF de doentes que sofrem de AD e em CSF de doentes que sofrem de determinadas formas de FTD está significativamente alterada quando comparada com a razão de fosfo-tau (181)/tau total em CSF de indivíduos controlo. A presente invenção é adicionalmente baseada na verificação que a razão de fosfo-tau (181)/tau total em CSF de doentes que sofrem de AD está significativamente alterada quando comparada com a razão de fosfo-tau (181)/tau total em CSF de doentes que sofrem de derrame cerebral. A indicação que a razão de fosfo-tau (181)/tau total em doentes com uma taupatia está alterada, consolida a base do desenvolvimento de um teste de diagnóstico para o diagnóstico de uma taupatia num indivíduo e/ou o diagnóstico diferencial de indivíduos que sofrem de uma taupatia versus indivíduos que sofrem de uma não-taupatia. 11 'Uma taupatia' é qualquer forma de demência que está associada a uma patologia da proteína tau. A doença de Alzheimer e algumas formas de demência Fronto-temporal (doença de Pick, demência Fronto-temporal esporádica e demência Fronto-temporal com Parkinsonismo ligado ao cromossoma 17) são as formas mais comuns de taupatia. Em concordância, a presente invenção refere-se a qualquer método como acima descrito, em que a taupatia é doença de Alzheimer, doença de Pick, demência Fronto-temporal esporádica e demência Fronto-temporal com Parkinsonismo ligado ao cromossoma 17. Outras taupatias incluem, mas não estão limitadas a, Paralisisa supranuclear progressiva (PSP), Degeneração corticobasal (CBD) e panencefalite esclerosante subaguda.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for the diagnosis of a tautoma in a subject, said method comprising the steps of: determining the phospho-tau (181) / total tau ratio in the subject concerned; - an inference that the subject undergoes taupathy by comparing the phospho-tau ratio (181) / total tau obtained in the subject referred to the phospho-tau (181) / total tau ratio in control subjects, an indication being a ratio altered phospho-tau (181) / total tau when compared to the ratio reported in control subjects. The present invention also relates to a method of differential diagnosis of tautathy versus non-tautathy in a subject, said method comprising the steps of: determining the phospho-tau (181) / total tau ratio in the subject concerned; - inference that the subject undergoes a taupathy by comparing the phospho-tau ratio (181) / total tau obtained in the subject referred to the ratio of phospho-tau (181) / total tau obtained in subjects suffering from a non- (181) / total tau ratio in control subjects, an indication being an altered ratio of phospho-tau (181) / total tau when compared to said ratio in subjects suffering from a non- or control individuals. The present invention is based on the finding that the phospho-tau ratio (181) / total tau in CSF of patients suffering from AD and in CSF from patients suffering from certain forms of FTD is significantly altered when compared to the ratio of phospho-tau (181) / total CSF tau from control subjects. The present invention is further based on the finding that the total phospho-tau (181) / tau ratio in CSF of patients suffering from AD is significantly altered when compared to the phospho-tau ratio (181) / total CSF tau suffer from stroke. The indication that the ratio of phospho-tau (181) / total tau in patients with a tautathy is altered, consolidates the basis of the development of a diagnostic test for the diagnosis of a tautathy in an individual and / or the differential diagnosis of individuals who suffer from a taupatia versus individuals suffering from a non-taupatia. 'Taupatia' is any form of dementia that is associated with a tau protein pathology. Alzheimer's disease and some forms of Frontotemporal dementia (Pick's disease, sporadic Frontotemporal dementia, and Frontotemporal dementia with chromosome 17-linked Parkinsonism) are the most common forms of taupathy. Accordingly, the present invention relates to any method as described above, wherein taupatitis is Alzheimer's disease, Pick's disease, sporadic Frontotemporal dementia and Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17. Other taupatias include, but are not limited to, progressive supranuclear palsy (PSP), corticobasal degeneration (CBD), and subacute sclerosing panencephalitis.

Numa forma de realização específica, a presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico de doença deIn a specific embodiment, the present invention relates to a method for the diagnosis of

Alzheimer num indivíduo, compreendendo o referido método os passos de: - determinação da razão de fosfo-tau (181)/tau total no referido indivíduo; - inferência que o referido indivíduo sofre de doença deAlzheimer's disease in a subject, said method comprising the steps of: determining the phospho-tau ratio (181) / total tau in said subject; - Inference that the said individual suffers from

Alzheimer através da comparação da razão de fosfo-tau (181)/tau total obtida no indivíduo referido com a razão de fosfo-tau (181)/tau total obtida em indivíduos controlo, sendo uma indicação uma razão alterada de fosfo-tau (181)/tau total quando comparada com a referida razão em indivíduos controlo.Alzheimer's disease by comparing the phospho-tau ratio (181) / total tau obtained in the subject with the ratio of phospho-tau (181) / total tau obtained in control subjects, an indication being an altered ratio of phospho-tau (181 ) / total tau when compared to said ratio in control subjects.

Uma 'não-taupatia' é qualquer estado do cérebro que não está associado a uma patologia da proteína tau. Numa forma 12 de realização da invenção, a referida não-taupatia é uma neurodegeneração não taupática. Uma neurodegeneração não taupática é qualquer forma de distúrbio neurológico que não está associado a uma patologia da proteina tau. Neurodegenerações não taupáticas incluem, mas não estão limitadas a, demência vascular, doença de Creutzfeldt Jacob, derrame cerebral e/ou neurotoxicidade em doentes com leucemia.A 'non-taupatia' is any state of the brain that is not associated with a tau protein pathology. In one embodiment of the invention, said non-tautathy is a non-taupotic neurodegeneration. Non-taupotic neurodegeneration is any form of neurological disorder that is not associated with a tau protein pathology. Non-taupotic neurodegenerations include, but are not limited to, vascular dementia, Jacob's Creutzfeldt disease, stroke, and / or neurotoxicity in patients with leukemia.

Deste modo, numa forma de realização especifica, a presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico diferencial num individuo com doença de Alzheimer versus derrame cerebral, compreendendo o referido método os passos de: - determinação da razão de fosfo-tau (181)/tau total no referido individuo; - inferência que o referido individuo sofre de doença de Alzheimer e não de derrame cerebral através da comparação da razão de fosfo-tau (181)/tau total obtida no individuo referido com a razão de fosfo-tau (181)/tau total obtida em indivíduos que sofrem de derrame cerebral, sendo uma indicação uma razão alterada de fosfo-tau (181)/tau total quando comparada com a razão referida em indivíduos que sofrem de derrame cerebral. A fosfo-tau (181) inclui todas as moléculas tau que contêm um fosfato na treonina localizada na posição 181. A numeração respectiva à sequência de aminoácidos refere-se à maior isoforma tau hTau40 (Goedert et ai., 1989) . A tau total refere-se a todas as formas de tau e inclui a tau em qualquer estado de fosforilação. A presente invenção é deste modo baseada na utilização da tau e da fosfo-tau 13 (181) como marcadores neurológicos para o diagnóstico de uma taupatia e/ou para o diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma não-taupatia.Accordingly, in a specific embodiment, the present invention relates to a method for differential diagnosis in an individual with Alzheimer's disease versus stroke, said method comprising the steps of: determining the phospho-tau ratio (181 ) / total tau in said individual; - Inference that said individual suffers from Alzheimer's disease and not from stroke by comparing the phospho-tau (181) / total tau ratio obtained in said individual with the ratio of phospho-tau (181) / total tau obtained in stroke individuals, with an indication of an altered phospho-tau (181) / total tau ratio when compared to the ratio reported in individuals suffering from stroke. Phospho-tau (181) includes all tau molecules containing a phosphate in the threonine located at position 181. The numbering thereof to the amino acid sequence refers to the largest tau hTau40 isoform (Goedert et al., 1989). Total tau refers to all forms of tau and includes tau in any state of phosphorylation. The present invention is thus based on the use of tau and phospho-tau 13 (181) as neurological markers for the diagnosis of a taupathy and / or for the differential diagnosis of a taupatitis versus a non-taupathy.

Baseada no nivel de fosfo-tau (181) e tau total num indivíduo, a razão de fosfo-tau (181)/tau total no referido indivíduo pode então ser determinada. A razão de fosfo-tau (181)/tau total pode ser detectada in vitro assim como in vivo. 0 método para a detecção in vitro da razão de fosfo-tau (181)/tau total num indivíduo compreende os passos de: - obtenção de uma amostra do indivíduo referido; - determinação da razão de fosfo-tau (181)/tau total na amostra referida; - inferência que o indivíduo referido sofre de uma taupatia através da comparação da razão de fosfo-tau (181)/tau total obtida no indivíduo referido com a razão de fosfo-tau (181)/tau total numa amostra de indivíduos que sofrem de uma não-taupatia ou com a razão de fosfo-tau (181)/tau total numa amostra de indivíduos controlo, sendo uma indicação uma razão alterada de fosfo-tau (181)/tau total quando comparada com a razão referida em indivíduos que sofrem de uma não-taupatia ou em indivíduos controlo. 0 termo 'amostra' refere-se a qualquer fonte de material biológico, por exemplo fluidos corporais, extracto de cérebro, sangue periférico ou qualquer outra amostra contendo a proteína fosfo-tau (181) . Numa forma de realização da invenção, a razão de fosfo-tau (181)/tau total é determinada in vitro através da análise da razão de 14 fosfo-tau (181)/tau total numa amostra de fluído corporal do doente. 0 termo 'fluído corporal' refere-se a todos os fluídos que estão presentes no corpo humano incluindo, mas não limitados a, sangue, linfa, urina e fluído cerebroespinal (CSF) contendo proteína fosfo-tau (181). Numa outra forma de realização da presente invenção a razão de fosfo-tau (181)/tau total é determinada numa amostra de fluído cerebroespinal (CSF) retirada de um doente. Em concordância, a presente invenção refere-se a um método como acima descrito, compreendendo os passos de: - obtenção de uma amostra de fluído cerebroespinal do indivíduo; - determinação da razão de fosfo-tau (181)/tau total na amostra de fluído cerebroespinal referida; - inferência que o indivíduo referido sofre de uma taupatia através da comparação da razão de fosfo-tau (181)/tau total obtida no referido indivíduo com a razão de fosfo-tau (181)/tau total no CSF de indivíduos que sofrem de não-taupatia ou com a razão de fosfo-tau (181)/tau total no CSF de indivíduos controlo, sendo uma indicação uma razão de fosfo-tau (181)/tau total alterada quando comparada com a razão referida no CSF de indivíduos que sofrem de não-taupatia ou no CSF de indivíduos controlo. A tau total pode ser quantificada através de qualquer método conhecido, incluindo, mas não limitado a, utilização de anticorpos ou então através de um ensaio funcional (Bramblett et al., 1992). Qualquer anticorpo monoclonal ou policlonal que reconheça especificamente a tau total pode ser utilizado para a quantificação da tau total. Os anticorpos que reconhecem tau fosforiladas de modo normal 15 ou de modo anormal incluem Alz50 (Ghanbari et ai., 1990), HT7 (Mercken et al., 1992) e AT120 (Vandermeeren et ai., 1993). Também podem ser utilizados outros anticorpos conhecidos na técnica, os quais reconhecem tau total. Um método muito rápido e de fácil utilização para a quantificação de tau total é o INNOTEST hTau-Ag (Innogenetics, Gent, Bélgica). A fosfo-tau (181) pode ser quantificada através de qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, utilização de anticorpos. Numa preferida forma de realização, a fosfo-tau (181) é quantificada através de um imunoensaio compreendendo pelo menos os seguintes passos: obtenção de uma amostra do doente; colocação da amostra referida em contacto com um anticorpo monoclonal que reconheça especificamente a fosfo-tau (181), sob condições que são apropriadas para a produção de um complexo anticorpo-antigénio; - detecção da ligação imunológica do anticorpo referida à amostra referida.Based on the level of phospho-tau (181) and total tau in a subject, the phospho-tau (181) / total tau ratio in said subject can then be determined. The phospho-tau ratio (181) / total tau can be detected in vitro as well as in vivo. The method for the in vitro detection of the phospho-tau (181) / total tau ratio in a subject comprises the steps of: obtaining a sample of the subject concerned; determination of the phospho-tau ratio (181) / total tau in said sample; - an inference that the subject undergoes a taupathy by comparing the phospho-tau (181) / total tau ratio obtained in the subject referred to the phospho-tau (181) / total tau ratio in a sample of individuals suffering from a (181) / total tau ratio in a sample of control individuals, an indication being an altered ratio of phospho-tau (181) / total tau when compared to the ratio reported in subjects suffering from a non-taupatia or in control individuals. The term 'sample' refers to any source of biological material, for example body fluids, brain extract, peripheral blood or any other sample containing the phospho-tau protein (181). In one embodiment of the invention, the phospho-tau (181) / total tau ratio is determined in vitro by analyzing the ratio of phospho-tau (181) / total tau in a patient's body fluid sample. The term "body fluid" refers to all fluids that are present in the human body including, but not limited to, blood, lymph, urine and cerebrospinal fluid (CSF) containing phospho-tau protein (181). In another embodiment of the present invention the phospho-tau (181) / total tau ratio is determined in a sample of cerebrospinal fluid (CSF) withdrawn from a patient. Accordingly, the present invention relates to a method as described above, comprising the steps of: obtaining a cerebrospinal fluid sample from the subject; determination of the phospho-tau ratio (181) / total tau in said cerebrospinal fluid sample; - inference that the subject undergoes a taupathy by comparing the phospho-tau ratio (181) / total tau obtained in said subject with the phospho-tau ratio (181) / total tau in the CSF of non-subject subjects (181) / total tau in the CSF of control subjects, an indication of a phospho-tau (181) / total tau ratio being altered when compared to the ratio reported in the CSF of subjects suffering of non-tautathy or in the CSF of control individuals. Total tau can be quantified by any known method including, but not limited to, the use of antibodies or by a functional assay (Bramblett et al., 1992). Any monoclonal or polyclonal antibody that specifically recognizes total tau can be used for quantification of total tau. Antibodies recognizing tau normally or abnormally phosphorylated tau include Alz50 (Ghanbari et al., 1990), HT7 (Mercken et al., 1992) and AT120 (Vandermeeren et al., 1993). Other antibodies known in the art which recognize total tau may also be used. A very quick and user-friendly method for total tau quantification is INNOTEST hTau-Ag (Innogenetics, Gent, Belgium). Phospho-tau (181) can be quantified by any method known in the art, including, but not limited to, the use of antibodies. In a preferred embodiment, phospho-tau (181) is quantitated by an immunoassay comprising at least the following steps: obtaining a sample from the patient; placing said sample in contact with a monoclonal antibody specifically recognizing phospho-tau (181) under conditions which are suitable for the production of an antibody-antigen complex; detecting the immunological binding of the antibody to said sample.

Numa forma de realização ainda mais preferida, a fosfo-tau (181) pode ser quantificada por &quot;ELISA sandwich&quot; compreendendo os seguintes passos: - obtenção de uma amostra do doente; - colocação da referida amostra em contacto com um anticorpo monoclonal (anticorpo primário ou anticorpo de captura) que reconhece a fosfo-tau (181), sob condições que são apropriadas para a produção do complexo anticorpo-antigénio; 16 colocar a referida amostra em contacto com um anticorpo monoclonal (anticorpo secundário ou anticorpo de detecção) que reconhece especificamente a fosfo-tau (181), sob condições que são apropriadas para a produção do complexo anticorpo-antigénio; - colocar o complexo anticorpo-antigénio em contacto com um marcador quer para uma sinalização especifica ou acoplado ao referido anticorpo secundário, sendo o referido marcador qualquer marcador possivel conhecido pelos especialistas na técnica; - possivelmente também, com objectivos de padronização, colocar os anticorpos em contacto com a proteína fosfo-tau purificada ou o fosfo-péptido reactivo com ambos os anticorpos.In an even more preferred embodiment, the phospho-tau (181) can be quantified by &quot; ELISA sandwich &quot; comprising the following steps: obtaining a sample from the patient; - placing said sample in contact with a monoclonal antibody (primary antibody or capture antibody) which recognizes phospho-tau (181), under conditions which are suitable for the production of the antibody-antigen complex; Placing said sample in contact with a monoclonal antibody (secondary antibody or detection antibody) that specifically recognizes phospho-tau (181), under conditions that are suitable for the production of the antibody-antigen complex; placing the antibody-antigen complex in contact with a marker for either a specific signaling or coupled to said secondary antibody, said marker being any marker capable of being known to those skilled in the art; - possibly also, for standardization purposes, to place the antibodies in contact with the purified phospho-tau protein or the reactive phospho-peptide with both antibodies.

De um modo vantajoso, o próprio anticorpo secundário transporta um marcador ou um grupo para acoplamento a um marcador de modo directo ou indirecto.Advantageously, the secondary antibody itself carries a label or a group for coupling to a label directly or indirectly.

As expressões 'reconhecimento', 'reagir com', 'ligação imunológica' ou 'produzindo um complexo anticorpo-antigénio' como são utilizadas na presente invenção devem ser interpretadas de modo que a ligação do anticorpo e antigénio ocorra sob todas as condições que respeitem as propriedades imunológicas do anticorpo e do antigénio. A expressão 'reconhecendo de modo específico' como utilizada na presente invenção deve ser interpretada de modo que o referido anticorpo seja capaz de formar um complexo imunológico com a fosfo-tau (181) mas não com uma molécula tau que não apresente fosforilação na treonina 181. 17The terms 'recognition', 'react with', 'immunological binding' or 'producing an antibody-antigen complex' as used in the present invention should be interpreted so that antibody and antigen binding occurs under all conditions that immunological properties of the antibody and antigen. The term 'specifically recognizing' as used in the present invention should be interpreted so that said antibody is capable of forming an immunological complex with phospho-tau (181) but not with a tau molecule which does not have phosphorylation on the threonine 181 17

Qualquer anticorpo monoclonal que reconheça especificamente a fosfo-tau (181) pode ser utilizado no referido método para a quantificação da fosfo-tau (181) . Um anticorpo preferido para a utilização na quantificação da fosfo-tau (181) é ο AT270 (Aplicação Internacional publicada sob WO 95/17429). Embora também possam ser utilizados outros anticorpos conhecidos na técnica que reconheçam de modo especifico a fosfo-tau (181).Any monoclonal antibody specifically recognizing phospho-tau (181) may be used in said method for the quantification of phospho-tau (181). A preferred antibody for use in the quantification of phospho-tau (181) is AT270 (International Application published under WO 95/17429). Although other antibodies known in the art that specifically recognize phospho-tau (181) may also be used.

Para propósitos de padronização, podem ser utilizados a proteina tau ou o péptido fosforilado na treonina 181. Isto pode ser obtido através de qualquer método como a extracção a partir de cérebro ou a fosforilação in vitro da tau normal. Uma vez que é difícil determinar de modo preciso o grau de fosforilação de locais fosforilados específicos concentrados na região de prolinas, numa forma de realização da invenção, é utilizado um fosfo-péptido sintético para a padronização. 0 referido fosfo-péptido sintético deve ser capaz de formar um complexo imunológico com os anticorpos utilizados no imunoensaio.For standardization purposes, the tau protein or the phosphorylated peptide may be used in threonine 181. This may be obtained by any method such as extraction from the brain or in vitro phosphorylation of normal tau. Since it is difficult to precisely determine the degree of phosphorylation of specific phosphorylated sites concentrated in the proline region, in one embodiment of the invention, a synthetic phosphopeptide is used for standardization. Said synthetic phosphopeptide should be capable of forming an immunological complex with the antibodies used in the immunoassay.

Deste modo, a presente invenção também se refere a um fosfo-péptido que inclui pelo menos dois epítopos que são reconhecidos por um anticorpo monoclonal, sendo o referido fosfo-péptido responsável pela formação de um complexo imunológico com os referidos anticorpos monoclonais num ensaio &quot;ELISA sandwich&quot;. Um trabalho anterior demonstrou que, apesar do péptido conter um epítopo para um determinado anticorpo monoclonal, o referido anticorpo monoclonal nem sempre reconhece o referido péptido (DeLeys et al., 1996) . Os presentes inventores foram capazes de definir um fosfo-péptido com dois epítopos de modo que, de facto, o referido fosfo-péptido seja capaz de formar um 18 complexo imunológico com os anticorpos monoclonais que reconhecem os referidos epítopos. Por outro lado, os presentes inventores foram capazes de definir ambos os epitopos de modo que o fosfo-péptido seja capaz de formar um complexo imunológico com os anticorpos monoclonais que reconhecem os referidos anticorpos num ensaio &quot;ELISA sandwich&quot;. 0 termo 'péptido' refere-se a um polímero de aminoácidos (aa) e não se refere a um comprimento específico do produto. Numa forma de realização da invenção, o comprimento do fosfo-péptido tem entre 15 a 100 aminoácidos. Numa preferida forma de realização da invenção, o fosfo-péptido contém entre 20 a 50 aminoácidos. Numa outra forma preferida da invenção, o fosfo-péptido contém entre 30 a 40 aminoácidos. O péptido da invenção pode ser produzido através de qualquer método conhecido na técnica tal como a síntese química clássica como descrito por Houbenweyl (1974) e Atherton e Shepard (1989), através de qualquer método comercial disponível tal como descrito nas secções de exemplos, ou através de recursos a técnicas de DNA recombinante como descrito por Sambrook et ai. (1989).Accordingly, the present invention also relates to a phospho-peptide comprising at least two epitopes which are recognized by a monoclonal antibody, said phospho-peptide being responsible for forming an immunological complex with said monoclonal antibodies in a &quot; ELISA sandwich ". An earlier work has shown that although the peptide contains an epitope for a particular monoclonal antibody, said monoclonal antibody does not always recognize said peptide (DeLeys et al., 1996). The present inventors were able to define a phospho-peptide with two epitopes so that said phospho-peptide is in fact capable of forming an immunological complex with the monoclonal antibodies recognizing said epitopes. On the other hand, the present inventors were able to define both epitopes so that the phospho-peptide is capable of forming an immunological complex with the monoclonal antibodies that recognize said antibodies in a &quot; ELISA sandwich &quot; The term "peptide" refers to a polymer of amino acids (aa) and does not refer to a specific length of the product. In one embodiment of the invention, the length of the phospho-peptide is 15 to 100 amino acids. In a preferred embodiment of the invention, the phosphopeptide contains from 20 to 50 amino acids. In another preferred form of the invention, the phospho-peptide contains from 30 to 40 amino acids. The peptide of the invention may be produced by any method known in the art such as classical chemical synthesis as described by Houbenweyl (1974) and Atherton and Shepard (1989), by any commercial method available as described in the examples sections, or through recombinant DNA techniques as described by Sambrook et al. (1989).

Um fosfo-péptido é um péptido que contém um fosfato em pelo menos um aminoácido. A utilização do fosfopéptido da invenção permitiu aos presentes inventores determinar a relação do fosfo-péptido com isoformas específicas fosforiladas e estimar o grau de fosforilação dos locais específicos de fosforilação (ver exemplo 1, 1.5). A utilização do fosfo-péptido da invenção permitirá a 19 quantificação de determinadas formas moleculares da proteina tau de um modo padronizado.A phospho-peptide is a peptide which contains a phosphate in at least one amino acid. The use of the phosphopeptide of the invention enabled the present inventors to determine the ratio of phospho-peptide to phosphorylated specific isoforms and to estimate the degree of phosphorylation of specific phosphorylation sites (see Example 1, 1.5). The use of the phospho-peptide of the invention will permit the quantification of certain molecular forms of the tau protein in a standardized manner.

Os péptidos fosforilados podem ser produzidos através de qualquer método conhecido. Estes podem ser produzidos pós-processamento, através de reacção por exemplo com di-isopropilfosfoaramidito de di-t-butilo di-isopropilo e oxidação com hidroperóxido de t-butilo dos residuos desprotegidos de serina e treonina. Também podem ser produzidos através da incorporação com aminoácidos fosforilados durante a sintese de péptidos. Recentemente, estão disponiveis comercialmente novos derivados de serina fosforilada (N-cx-Fmoc-O-benzilo-L-f osf oSer) (Calbiochem-The phosphorylated peptides may be produced by any known method. These may be produced post-processing by reaction with, for example, di-t-butyl diisopropyl di-isopropylphosphoaramidite and oxidation with t-butyl hydroperoxide of the deprotected serine and threonine residues. They may also be produced by incorporation with phosphorylated amino acids during peptide synthesis. Recently, novel phosphorylated serine derivatives (N-α-α-Fmoc-O-benzyl-L-phosphate) (Calbiochem-

Novabiochem AG, São Diego, CA 92121) para a sintese directa de fosfopéptidos sem fosforilação pós-processamento.Novabiochem AG, San Diego, CA 92121) for the direct synthesis of phosphopeptides without postprocessing phosphorylation.

Numa forma de realização, a presente invenção refere-se a um fosfo-péptido responsável pela formação de um complexo imunológico com o anticorpo monoclonal HT7 e o anticorpo monoclonal AT270, compreendendo pelo menos: - o epitopo mínimo de HT7: PPGQK (SEQ ID N°l); e - o epitopo mínimo de AT270: PPAPKT(p)P (SEQ ID N°2).In one embodiment, the present invention relates to a phospho-peptide responsible for the formation of an immune complex with the monoclonal antibody HT7 and the monoclonal antibody AT270, comprising at least: - the minimal epitope of HT7: PPGQK (SEQ ID NO: (1); and - the minimal epitope of AT270: PPAPKT (p) P (SEQ ID NO: 2).

Numa forma de realização ainda mais preferida, a presente invenção refere-se a um fosfo-péptido como acima descrito, compreendendo a seguinte sequência: PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE (SEQ ID N°3) em que ' (p) ' significa que a treonina é fosforilada, ou sequências variantes nas condições em que as mesmas se continuam a ligar aos anticorpos monoclonais HT7 e AT270. 0 20 termo 'sequências variantes' refere-se a qualquer variante ou fragmento do péptido representado no SEQ ID N°3, através da substituição ou delecção de um ou mais aminoácidos, os quais continuam a reconhecer os anticorpos monoclonais HT7 e AT270. O termo não se refere especificamente a, nem exclui, modificações pós-traducionais do péptido como a glicosilação, acetilação, fosforilação, modificações com ácidos gordos e semelhantes. Estão incluídas na definição, por exemplo, péptidos que contenham um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo aminoácidos não naturais), péptidos com ligações substituídas, versões mutadas, péptidos contendo ligações disulfito entre resíduos de cisteina, péptidos biotinilados assim como outras modificações conhecidas na técnica.In a still more preferred embodiment, the present invention relates to a phospho-peptide as described above, comprising the following sequence: PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT (p) PPSSGE (SEQ ID NO: 3) wherein '(p)' means that the threonine is phosphorylated, or variant sequences under the conditions in which they continue to bind to the monoclonal antibodies HT7 and AT270. The term "variant sequences" refers to any variant or fragment of the peptide depicted in SEQ ID NO: 3, by substituting or deleting one or more amino acids, which still recognize the monoclonal antibodies HT7 and AT270. The term does not specifically refer to, or exclude, post-translational modifications of the peptide such as glycosylation, acetylation, phosphorylation, modifications with fatty acids and the like. Included in the definition are, for example, peptides containing one or more amino acid analogues (including unnatural amino acids), substituted linking peptides, mutated versions, peptides containing disulfide bonds between cysteine residues, biotinylated peptides as well as other modifications known in the art. technique.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se à utilização do fosfo-péptido referido num método para medir o nível de fosfo-tau (181) .In addition, the present invention relates to the use of the phospho-peptide in a method for measuring the level of phospho-tau (181).

Adicionalmente, a presente invenção refere-se à utilização do referido fosfo-péptido num método para o diagnóstico de uma taupatia e/ou diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma não-taupatia.In addition, the present invention relates to the use of said phospho-peptide in a method for the diagnosis of a taupatia and / or differential diagnosis of taupatia versus non-taupatia.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se à utilização do referido fosfo-péptido num método de diagnóstico da doença de Alzheimer.In addition, the present invention relates to the use of said phospho-peptide in a method of diagnosing Alzheimer's disease.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se à utilização do referido fosfo-péptido num método para o diagnóstico diferencial de doença de Alzheimer versus derrame cerebral. 21 0 método para a detecção in vitro da razão de fosfo-tau (181)/ tau total num indivíduo pode também ser utilizada para o teste ou rastreio de drogas, para monitorização terapêutica e/ou para avaliar o efeito de um determinado tratamento da taupatia no referido indivíduo. 0 método para a detecção precoce in vivo da razão de fosfo-tau (181)/tau total num indivíduo compreende os passos de determinação da razão de fosfo-tau (181)/tau total no indivíduo referido e a comparação com a razão de fosfo-tau (181)/tau total em indivíduos controlo saudáveis. Numa forma de realização, a fosfo-tau (181) e a tau total podem ser quantificadas através de imagiologia in vivo. A fosfo-tau (181) e a tau total podem ser quantificadas in situ através de métodos não-invasivos incluindo, mas não limitados a, métodos de imagiologia do cérebro descritos por Arbit et al. (1995), Tamada et al. (1995), Wakabayashi et al. (1995), Huang et al. (1996), Sandrock et al. (1996), Mariani et al. (1997). Estes métodos de imagiologia in vivo podem permitir a localização e quantificação de fosfo-tau (181) e tau total, por exemplo, através da utilização de anticorpos marcados que reconhecem especificamente a fosfo-tau (181) ou que reconhecem a tau total, respectivamente. A fosfo-tau (181) e a tau total podem também ser utilizadas como marcadores para imagiologia in vivo para o teste ou rastreio de drogas, para monitorização terapêutica e/ou para avaliar o efeito de determinado tratamento da taupatia no referido indivíduo.In addition, the present invention relates to the use of said phospho-peptide in a method for the differential diagnosis of Alzheimer's disease versus stroke. The method for in vitro detection of the phospho-tau (181) / total tau ratio in a subject can also be used for drug testing or screening, for therapeutic monitoring and / or for evaluating the effect of a particular treatment of taupati in said individual. The method for the in vivo early detection of the phospho-tau (181) / total tau ratio in a subject comprises the steps of determining the phospho-tau ratio (181) / total tau in the subject subject and comparing the phospho (181) / total tau in healthy control subjects. In one embodiment, phospho-tau (181) and total tau can be quantified by in vivo imaging. Phospho-tau (181) and total tau can be quantified in situ by noninvasive methods including, but not limited to, brain imaging methods described by Arbit et al. (1995), Tamada et al. (1995), Wakabayashi et al. (1995), Huang et al. (1996), Sandrock et al. (1996), Mariani et al. (1997). These in vivo imaging methods may allow the localization and quantification of phospho-tau (181) and total tau, for example, by the use of labeled antibodies that specifically recognize phospho-tau (181) or which recognize total tau respectively . Phospho-tau (181) and total tau may also be used as markers for in vivo imaging for drug testing or screening, for therapeutic monitoring and / or for evaluating the effect of a particular treatment of taupatitis in said subject.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um kit de diagnóstico para o diagnóstico da taupatia num indivíduo e/ou diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma 22 não-taupatia compreendendo pelo menos um anticorpo que reconhece a fosfo-tau (181).Additionally, the present invention relates to a diagnostic kit for the diagnosis of tautathy in a subject and / or differential diagnosis of a taupatitis versus a non-taupathy comprising at least one antibody that recognizes phospho-tau (181).

Numa outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um kit de diagnóstico como acima descrito que compreende pelo menos: - um anticorpo que reconhece especificamente a fosfo-tau (181) ; - um anticorpo que reconhece a tau.In another embodiment, the present invention relates to a diagnostic kit as described above which comprises at least: an antibody that specifically recognizes phospho-tau (181); an antibody recognizing tau.

Numa outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um kit de diagnóstico como acima descrito que compreende pelo menos um fosfo-péptido de acordo com a invenção.In another embodiment, the present invention relates to a diagnostic kit as described above comprising at least one phospho-peptide according to the invention.

Numa outra forma de realização, se a um kit de diagnóstico compreende pelo menos: - um anticorpo que reconhece (181) ; - um fosfo-péptido de acordoIn another embodiment, if a diagnostic kit comprises at least: an antibody that recognizes (181); - a phospho-peptide according to

Numa outra forma de realização, se a um kit de diagnóstico compreende pelo menos: - um anticorpo que reconhece (181); a presente invenção refere-como acima descrito que especificamente a fosfo-tau com a invenção. a presente invenção refere-como acima descrito que especificamente a fosfo-tau - um anticorpo que reconhece a tau; - um fosfo-péptido de acordo com a invenção.In another embodiment, if a diagnostic kit comprises at least: an antibody that recognizes (181); the present invention relates to as described above specifically the phospho-tau of the invention. the present invention relates to as above described that specifically to phospho-tau - an antibody that recognizes tau; - a phospho-peptide according to the invention.

Um kit preferido para o diagnóstico de uma taupatia num individuo é baseado num imunoensaio e compreende: 23 - um anticorpo monoclonal (anticorpo primário), o qual forma um complexo imunológico com um epitopo da fosfo-tau (181); — um anticorpo monoclonal (anticorpo secundário) que reconhece especificamente a fosfo-tau (181); - um marcador quer para a sinalização especifica quer para o acoplamento com o referido anticorpo secundário; — soluções tampão apropriadas para a ocorrência da reacção imunológica entre o anticorpo primário e a amostra teste, entre o anticorpo secundário e a amostra teste e/ou entre o anticorpo secundário ligado e o marcador; - um fosfo-péptido de acordo com a invenção. A presente invenção refere-se à utilização de um kit de diagnóstico como acima descrito para o diagnóstico de uma taupatia num indivíduo e/ou diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma não-taupatia. A presente invenção refere-se à utilização de um kit de diagnóstico como acima descrito para o diagnóstico da doença de Alzheimer, doença de Pick, demência Fronto-temporal esporádica e/ou demência Fronto-temporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17. A presente invenção refere-se à utilização de um kit de diagnóstico como acima descrito para o diagnóstico diferencial da doença de Alzheimer, doença de Pick, demência Fronto-temporal esporádica e/ou demência Fronto-temporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17 versus demência vascular, Doença de Creutzfeldt Jacob, derrame cerebral e/ou neurotoxicidade em doentes com leucemia. 24 A presente invenção também se refere à utilização de tau total e fosfo-tau (181) como marcadores neurológicos para o fabrico de um kit de diagnóstico de uma taupatia e/ou para o diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma não-taupatia. A presente invenção também se refere à utilização de um fosfo-péptido, um método e/ou um kit de diagnóstico de uma invenção para o teste ou rastreio de drogas, para a monitorização terapêutica e/ou para a determinação da eficácia de um determinado tratamento para uma taupatia.A preferred kit for the diagnosis of a taupati in an individual is based on an immunoassay and comprises: a monoclonal antibody (primary antibody), which forms an immunological complex with a phospho-tau epitope (181); A monoclonal antibody (secondary antibody) that specifically recognizes phospho-tau (181); a label either for specific signaling or for coupling with said secondary antibody; Buffer solutions suitable for the occurrence of the immunological reaction between the primary antibody and the test sample between the secondary antibody and the test sample and / or between the bound secondary antibody and the marker; - a phospho-peptide according to the invention. The present invention relates to the use of a diagnostic kit as described above for the diagnosis of a tautathy in an individual and / or differential diagnosis of a taupatitis versus a non-taupathy. The present invention relates to the use of a diagnostic kit as described above for the diagnosis of Alzheimer's disease, Pick's disease, sporadic Frontotemporal dementia and / or Frontotemporal dementia with chromosome-linked parkinsonism 17. The present invention refers to the use of a diagnostic kit as described above for the differential diagnosis of Alzheimer's disease, Pick's disease, sporadic Frontotemporal dementia and / or Frontotemporal dementia with chromosome 17-linked parkinsonism versus vascular dementia, Creutzfeldt Jacob, stroke and / or neurotoxicity in patients with leukemia. The present invention also relates to the use of total tau and phospho-tau (181) as neurological markers for the manufacture of a diagnostic kit of a taupatia and / or for the differential diagnosis of taupatia versus non-taupatia. The present invention also relates to the use of a phospho-peptide, a method and / or a diagnostic kit of an invention for the testing or screening of drugs, for therapeutic monitoring and / or for determining the efficacy of a particular treatment for a taupatia.

Através desta especificação e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto requeira o contrário, a palavra &quot;compreende&quot;, e variações como &quot;compreendem&quot; e &quot;compreendendo&quot; serão entendidas de modo a implicar a inclusão de um número inteiro definido ou passo ou grupo de números inteiros definidos ou passos mas não para a exclusão de qualquer outro número inteiro ou passo ou grupo de números inteiros ou passos. A referência a qualquer técnica precedente nesta especificação não é, e não deve ser tida como, um conhecimento ou qualquer outra forma de sugestão que essa técnica faça parte do conhecimento geral comum na Austrália. A presente invenção será agora ilustrada através da referência aos seguintes exemplos que descrevem de um modo particular formas de realização vantajosas. Contudo, deve ser notado que estes exemplos são ilustrativos e não podem de forma alguma ser interpretados como restringentes da invenção. 25Through this specification and the claims that follow, unless the context requires otherwise, the word &quot; comprises &quot;, and variations like &quot; comprise &quot; and &quot; comprising &quot; will be understood to imply the inclusion of a defined integer or step or group of defined integers or steps but not to the exclusion of any other integer or step or group of integers or steps. Reference to any prior art in this specification is not, and should not be taken as, a knowledge or any other form of suggestion that such technique be part of the common general knowledge in Australia. The present invention will now be illustrated by reference to the following examples which particularly describe advantageous embodiments. However, it should be noted that these examples are illustrative and can not in any way be construed as restricting the invention. 25

EXEMPLOSEXAMPLES

Exemplo 1: Desenho de um fosfo-péptido para utilização na padronização 1.1 Síntese de tau e de péptidos derivados de tauExample 1: Design of a phospho-peptide for use in standardization 1.1 Synthesis of tau and tau-derived peptides

Foram utilizados dois oligonucleótidos para PCR (um oligonucleótido contendo o codão iniciador metionina CATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAGTGATGG (-1 a 34) (N° de SEQ ID N°4) e o oligonucleótido reverse em torno do codão stop CCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGC (SEQ ID N°5)) para amplificar a menor forma de tau humana num sistema de expressão baseado no promotor PL (Innogenetics, Gent, Bélgica) . A sequência do produto de PCR foi confirmada através de sequenciação. Apenas foram observadas alterações na terceira base nos codões: na Pro 182 CAG em vez de CAA, na Ala 227 GCG em vez de GCA, e na Asn 251 AAC em vez de AAT. Todas as numerações referentes à sequência de aminoácidos dizem respeito à maior das isoformas tau: hTau40 (Goedert et al., 1989). Foram produzidos mutantes de delecção com base na construção de mutantes com alteração da grelha de leitura através do preenchimento do local SacII (aminoácido na posição 154-155) e do local PstI (posição 242-243) .Two oligonucleotides were used for PCR (an oligonucleotide containing the methionine initiator codon CATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAGTGATGG (-1 to 34) (SEQ ID NO: 4) and the reverse oligonucleotide around the stop codon CCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGC (SEQ ID NO: 5)) for amplifying the smallest form of human tau in an expression system based on the PL promoter (Innogenetics, Gent, Belgium). The sequence of the PCR product was confirmed by sequencing. Only the third base changes were observed in the codons: in Pro 182 CAG instead of CAA, in Wing 227 GCG instead of GCA, and in Asn 251 AAC instead of AAT. All of the amino acid sequence numberings relate to the largest of the tau: hTau40 isoforms (Goedert et al., 1989). Deletion mutants were produced based on the construction of mutants with change of the reading frame by filling the SacII site (amino acid at position 154-155) and the PstI site (position 242-243).

A sintese automática do péptido foi realizada num sintetizador Millipore 9050, de modo geral como péptidos biotinilados na posição N-terminal). A sintese em larga-escala do péptido Ac-PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p) PPSSGE-NH2 (posição 154-187) (SEQ ID N°3) para &quot;ELISA sandwich&quot; foi sintetizado no local e pela Neosystems (Estrasburgo, França). O controlo qualidade inclui RP-HPLC 26 (cromatografia liquida de alta pressão em fase reversa) (pureza &gt; 99%), análise em espectrometria de massa (média PM 3454,8), e análise de aminoácidos (conteúdo de rede do péptido 84,3%).Automatic peptide synthesis was performed on a Millipore 9050 synthesizer, generally as N-terminal biotinylated peptides). Large-scale synthesis of the peptide Ac-PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT (p) PPSSGE-NH2 (position 154-187) (SEQ ID NO: 3) for &quot; ELISA sandwich &quot; was synthesized on-site and by Neosystems (Strasbourg, France). Quality control includes RP-HPLC 26 (reverse phase high pressure liquid chromatography) (purity &gt; 99%), mass spectrometry analysis (MW 3454.8 average), and amino acid analysis (peptide 84 , 3%).

Para o mapeamento do epitopos, os péptidos foram sintetizados manualmente em pins derivatizados (Multiple Peptide Systems, São Diego, CA92121) ou em papel. Para os péptidos sintetizados em papel, o papel foi obtido utilizando um anidrido simétrico de Fmoc-p-alanina (9-fluorenilmetoxicarbonil-p-alanina) na presença de aminopiridina de dimetilo. Após a remoção do grupo Fmoc, foi adicionado um segundo residuo de β-alanina seguido de activação com TBTU (tetrafluoroborato de 2-(lH-bensotriazol-l-il)-1,1',3,3'-tetrametilurónio). De modo posterior, os péptidos foram sintetizados manualmente como manchas pontuais.For epitope mapping, the peptides were synthesized manually on derivatized pins (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA92121) or on paper. For paper synthesized peptides, the paper was obtained using a symmetrical Fmoc-β-alanine anhydride (9-fluorenylmethoxycarbonyl-β-alanine) in the presence of dimethyl aminopyridine. After removal of the Fmoc group, a second β-alanine residue was added followed by activation with TBTU (2- (1H-bensotriazol-1-yl) -1,1 ', 3,3'-tetramethyluronium tetrafluoroborate). Subsequently, the peptides were synthesized manually as spot stains.

Os péptidos fosforilados foram preparados através de reacção pós-processamento com di-isopropilfosfoaramidito de di-t-butilo di-isopropilo e oxidação dos resíduos de serina e treonina desprotegidos com hidroperóxido de t-butilo. Recentemente, estão disponíveis comercialmente novos derivados de serina fosforilada (N-a-Fmoc-O-benzilo-L-fosfoSer) (Calbiochem-Novabiochem AG, São Diego, CA 92121) para sintetizar fosfopéptidos de modo directo sem fosforilação pós-processamento. Após a separação do suporte sólido, os péptidos e os fosfopéptidos foram purificados através de cromatografia líquida em fase reversa (RP-HPLC). A qualidade dos péptidos foi averiguada através de espectrometria de massa. 27 1.2 ImunoensaiosThe phosphorylated peptides were prepared by post-processing reaction with di-t-butyl diisopropyl di-isopropylphosphoaramidite and oxidation of the deprotected serine and threonine residues with t-butyl hydroperoxide. Recently, novel phosphorylated serine derivatives (N-α-Fmoc-O-benzyl-L-phosphoSer) (Calbiochem-Novabiochem AG, San Diego, CA 92121) are commercially available to synthesize phosphopeptides directly without postprocessing phosphorylation. After separation of the solid support, peptides and phosphopeptides were purified by reverse phase liquid chromatography (RP-HPLC). The quality of the peptides was ascertained by mass spectrometry. 1.2 Immunoassays

Os detalhes de isolamento e caracterização dos anticorpos têm sido descritos para AT120 (Vandermeeren et al., 1993b), HT7 (Mercken et al., 1992), BT2 (Vandermeeren et al., 1993a) e AT270 (Goedert et al., 1994). Para quantificar as interacções péptido-anticorpo através de ensaio de captura, a estreptavidina (Roche Diagnostics, Bruxelas, Bélgica) foi revestida a 5 μg/ml durante a noite num tampão carbonato 50 mM, pH = 9,5. Após o bloqueio, foram adicionados os péptidos biotinilados e detectados com os anticorpos tau. Foi utilizado um segundo anticorpo acoplado à peroxidade de rábano para quantificar a imunoreacção. A versão de investigação do INNOTEST fosfo-tau (181P) foi concebida do seguinte modo: as imunoplacas revestidas com HT7 foram incubadas durante a noite a 4°C com 75 μΐ de amostra ou de padrão, de modo simultâneo com ο AT270 biotinilado. Após a lavagem, é adicionada a peroxidade de rábano marcada com estreptavidina (RDI, Flanders, NJ, US) durante 30 minutos. A reacção é interrompida através da adição de 50 μΐ de H2S04 a 0,9 N. A tau total foi medida utilizando o INNOTEST hTau-Ag, e um peso molecular de 41065 calculado para a tau recombinante, o qual foi utilizado como padrão, foi utilizado para converter pg/ml em pM. 1.3 Mapeamento de anticorpos tauIsolation and characterization details of the antibodies have been described for AT120 (Vandermeeren et al., 1993b), HT7 (Mercken et al., 1992), BT2 (Vandermeeren et al., 1993a) and AT270 (Goedert et al., 1994 ). To quantitate the peptide-antibody interactions by capture assay, streptavidin (Roche Diagnostics, Brussels, Belgium) was coated at 5 μg / ml overnight in a 50 mM carbonate buffer, pH = 9.5. After the blockade, the biotinylated peptides were added and detected with the tau antibodies. A second horseradish peroxidase-coupled antibody was used to quantify immunoreaction. The investigational version of INNOTEST phospho-tau (181P) was designed as follows: HT7-coated immunoplates were incubated overnight at 4 ° C with 75 μl of sample or standard, simultaneously with δ-biotinylated AT270. After washing, the peroxidation of streptavidin-labeled horseradish (RDI, Flanders, NJ, US) is added for 30 minutes. The reaction is quenched by the addition of 50 μΐ of 0.9 N H 2 SO 4. Total tau was measured using the INNOTEST hTau-Ag, and a molecular weight of 41065 calculated for the recombinant tau, which was used as standard, was used to convert pg / ml to pM. 1.3 Mapping of tau antibodies

De modo a mapear os anticorpos que reconhecem a tau recombinante na molécula completa tau, foram construídos 28 mutantes de delecção baseados nos locais PstI e SacII. Todos os anticorpos testados, i.e. HT7, AT120, BT2 e taul, mapeiam a região rica em prolinas (posição 154-242 no hTau40, resultados não apresentados). Adicionalmente, para delinear os epítopos, foram sintetizados péptidos de pequena sobreposição. Num primeiro passo, foram sintetizados 48 péptidos em pins, com 9 aminoácidos de comprimento e abrangendo 8 aminoácidos. A sequência abrangeu a partir de 155 até 208. Foram testados AT120, HT7, BT2 e taul. Puderam ser mapeados quatro dos cinco aminoácidos: o epitopo mínimo do HT7 foi PPGQK (posição 159-163) (SEQ ID N°l), enquanto que as reactividades do BT2 e tau-1 foram indistinguíveis: DRSGYS (posição 193-198) (SEQ ID N°6) (Fig. la) . Uma vez que ο AT120 não pode ser mapeado nestes péptidos, foi sintetizada em papel uma nova série de péptidos, abrangendo a sequência desde 206-232. Foi necessário um total de 16 péptidos, com 12 aminoácidos de comprimento e abrangendo 11 aminoácidos, para abranger esta região. Foi definido o mínimo epitopo do AT120 através da sequência PPTREPK (posição 218-224) (SEQ ID N°7) (Fig. lb) . 1.4 Especificidade do ΆΤ270 A especificidade do anticorpo dependente do fosfato, AT270, foi confirmada em fosfo-péptidos sintéticos abrangendo 22 locais de fosforilação na tau. As sequências destes péptidos estão resumidas na tabela 1. Os péptidos não fosforilados que correspondem a 12 destes locais foram analisados em paralelo (Fig. 2). Ο AT270 apenas reagiu com os fosfopéptidos contendo fosfo-Thr 181 e/ou fosfo-Thr 175. Quando estes péptidos foram titulados em ensaio de captura, ο AT270 foi 18 vezes menos reactivo numa base molar com o 29 péptido contendo a fosfo-Thr 175 comparada com aquela do fosfo-Thr 181 (resultados não apresentados). Finalmente foi definido o epitopo mínimo utilizando péptidos fosforilados biotinilados com 15 aminoácidos de comprimento abrangendo a região 166-196. Os péptidos imunoreactivos são apresentados na Fig. lc, e o epitopo mínimo de AT270 foi PPAPKT (p) P (posição 176-182) (SEQ ID N°2). 1.5 Desenho do fosfo-péptido e determinação do grau de fosforilaçãoIn order to map the antibodies recognizing the recombinant tau in the complete tau molecule, 28 deletion mutants based on the PstI and SacII sites were constructed. All antibodies tested, i.e. HT7, AT120, BT2 and taul, map the proline-rich region (position 154-242 in hTau40, results not shown). Additionally, to delineate the epitopes, peptides of small overlap were synthesized. In a first step, 48 pin peptides, 9 amino acids long and comprising 8 amino acids were synthesized. The sequence spanned from 155 to 208. AT120, HT7, BT2 and taul were tested. Four of the five amino acids could be mapped: the minimal epitope of HT7 was PPGQK (position 159-163) (SEQ ID NO: 1), while the reactivities of BT2 and tau-1 were indistinguishable: DRSGYS (position 193-198) ( SEQ ID NO: 6) (Fig. 1a). Since Î "AT120 can not be mapped on these peptides, a new series of peptides was synthesized on paper, spanning the sequence from 206-232. A total of 16 peptides, 12 amino acids long and spanning 11 amino acids, were required to encompass this region. The minimal epitope of AT120 was defined through the PPTREPK sequence (position 218-224) (SEQ ID NO: 7) (Fig. 1b). 1.4 β270 Specificity The phosphate-dependent antibody specificity, AT270, was confirmed in synthetic phospho-peptides spanning 22 sites of phosphorylation in tau. The sequences of these peptides are summarized in Table 1. Non-phosphorylated peptides corresponding to 12 of these sites were analyzed in parallel (Fig. 2). Ο AT270 only reacted with phosphopeptides containing phospho-Thr 181 and / or phospho-Thr 175. When these peptides were titrated in capture assay, δ AT270 was 18-fold less reactive on a molar basis with the peptide containing phospho-Thr 175 compared to that of phospho-Thr 181 (results not shown). Finally the minimal epitope was defined using 15-amino acid biotinylated phosphorylated peptides spanning the 166-196 region. The immunoreactive peptides are shown in Fig. 1c, and the minimal epitope of AT270 was PPAPKT (p) P (position 176-182) (SEQ ID NO: 2). 1.5 Design of the phospho-peptide and determination of the degree of phosphorylation

Utilizando esta informação dos péptidos, foi sintetizado um fosfo-péptido abrangendo a posição 154 a 187. Esta sequência engloba o epitopo de HT7 (159-163) e de AT270 (176-182) e um N-terminal adicional de 5 aminoácidos para o epitopo HT7 e um C-terminal para o epitopo AT270. A concentração exacta do fosfo-péptido foi determinada utilizando uma análise de aminoácidos (Blennow et al.r 1995) . Baseado nesta concentração, o intervalo dinâmico de um ELISA baseado na peroxidase situa-se entre 5 e 300 pM utilizando perfil de precisão. Os coeficientes de variação de intra-ensaio e de interensaio foram abaixo de 10%.Using this information from the peptides, a phospho-peptide spanning position 154 to 187 was synthesized. This sequence encompasses the epitope of HT7 (159-163) and of AT270 (176-182) and an additional N-terminal of 5 amino acids for HT7 epitope and a C-terminal for the AT270 epitope. The exact concentration of the phospho-peptide was determined using an amino acid analysis (Blennow et al., 1995). Based on this concentration, the dynamic range of a peroxidase-based ELISA is between 5 and 300 pM using a precision profile. The intra-assay and inter-assay coefficients of variation were below 10%.

Para determinar como o grau de fosforilação se relaciona com os níveis absolutos de fosfo-tau (181) e tau total, foram quantificadas de modo simultâneo cinco preparações diferentes nos respectivos ensaios. A tau-PHF foi preparada de acordo com Goedert et ai. (1992) utilizando N-laurilsarcosinato a 1% para precipitar de modo selectivo Tau de PHF a partir de sobrenadantes de extracto de cérebro. O tecido do córtex temporal (PHF-A-D) ou do hipocampo (PHF-E) de doentes com AD foi obtido a partir do banco de tecidos cerebrais Born-Bunge (Dr P. Cras, 30To determine how the degree of phosphorylation relates to the absolute levels of phospho-tau (181) and total tau, five different preparations were simultaneously quantified in the respective assays. The tau-PHF was prepared according to Goedert et al. (1992) using 1% N-lauryl sarcosinate to selectively precipitate PHF Tau from brain extract supernatants. The temporal cortex (PHF-A-D) or hippocampal (PHF-E) tissue from AD patients was obtained from the Born-Bunge brain tissue bank (Dr P. Cras, 30

Antuérpia, Bélgica). Tal como apresentado na Fig. 3, o grau de fosforilação da fosfo-Thr 181 foi diferente entre as preparações de Tau de PHF. Assumindo que a preparação Tau de PHF com maiores niveis de fosfo-tau tem um grau de fosforilação próximo de 100%, a razão de fosfo-tau (181)/tau total sobrestima o grau de fosforilação pelo menos 3,3 vezes. No entanto, tendo em conta que a razão de fosfo-tau (181)/tau total sobrestima o grau de fosforilação, o estado de fosforilação da Thr 181 em tau proveniente de CSF-tau é no máximo 59% ±18% (1.952/3.3), o qual está em intima concordância com o estado de fosforilação da Thr 181 de tau derivada de cérebro em condições normais (20-30%; Watanabe et al., 1993; Matsuo et al., 1994) .Antwerp, Belgium). As shown in Fig. 3, the degree of phosphorylation of phospho-Thr 181 was different between the Tau preparations of PHF. Assuming that the Tau preparation of PHF with higher levels of phospho-tau has a degree of phosphorylation near 100%, the ratio of phospho-tau (181) / total tau overestimates the degree of phosphorylation at least 3.3 fold. However, given that the phospho-tau (181) / total tau ratio overestimates the degree of phosphorylation, the phosphorylation state of Thr 181 in tau from CSF-tau is at most 59% ± 18% (1,952 / 3.3), which is in close agreement with the phosphorylation state of Thr 181 of brain-derived tau under normal conditions (20-30%; Watanabe et al., 1993; Matsuo et al., 1994).

Exemplo 2: Utilização do fosfo-péptido na padronização de um ensaio para determinar a fosfo-tau (181) em doentes com Alzheimer, demência frontotemporal e/ou demência vascular 2.1 DoentesExample 2: Use of phospho-peptide in the standardization of an assay to determine phospho-tau (181) in patients with Alzheimer's disease, frontotemporal dementia and / or vascular dementia 2.1 Patients

Foram incluídos neste estudo 18 doentes com FTD (intervalo de idades 48-77 anos), 60 doentes com AD (intervalo de idades possível 68-88 anos, provável 58-90 anos), 17 doentes com encefalopatia arteriosclerótica subcortical (SAE; uma suposta forma de demência vascular) (intervalo de idades 67-84 anos), 15 doentes com PD (intervalo de idades de 59-82 anos), e 17 controlos (intervalo de idades 68-80 anos). As suas características estão resumidas na tabela 2.In this study, 18 patients with FTD (age range 48-77 years), 60 patients with AD (age range 68-88 years, likely 58-90 years), 17 patients with subcortical atherosclerotic encephalopathy (SAE, (age range 67-84 years), 15 PD patients (age range 59-82 years), and 17 controls (age range 68-80 years). Its characteristics are summarized in table 2.

Todos os doentes incluídos no estudo tinham um diagnóstico clínico de FTD, AD, SAE, PD e eram recrutados de modo consecutivo de estudos prospectivos longitudinais em 31 doentes com demência ou PD. Foram estabelecidos os diagnósticos clínicos e efectuada a amostragem de CSF. De seguida foram efectuadas as análises neuroquímicas no Instituto de Neurociência Clínica, Sahlgrenska, University Hospital, Mõlndal, Suécia. Foram excluídos os doentes com demência não especificada (e.g. demência mista), história de doença psiquiátrica severa (e.g. esquizofrenia), alcoolismo crónico, doença neurológica não-degenerativa distinta (e.g. hidrocéfalo normotensivo), uma história de danos severos na cabeça, várias infecções no CNS, doença sistémica (e.g. tumores malignos) e causas secundárias (e.g. hipotireose) para demência de acordo com o Manual estatístico e de diagnóstico para os distúrbios mentais (Association AP, 1987) ou critérios bioquímicos. Também foram excluídos os doentes com enfartes cerebrais grandes e/ou lacunas múltiplas. Todos os doentes incluídos foram submetidos a uma investigação clínica, incluindo história médica, exames físicos, neurológicos e psiquiátricos, rastreio de testes sanguíneos laboratoriais (testes de laboratório relevantes para excluir outras causas de demência e.g. hipotiroidismo) , análises de rotina do CSF (e.g. citologia), ECG, raio-X ao tórax, tomografia computorizado (CT) ou ressonância magnética de imagiologia (MRI) do cérebro, investigação do fluído sanguíneo cerebral (CBF) local, utilizando quer uma tomografia computorizada por emissão única de fotões (SPECT) ou técnica de inalação de 133Xenon (Cortexplorer; Risberg e Gustafson, 1983) . A FTD foi diagnosticada de acordo com os critérios Lund/Manchester (Brun et al., 1994) como previamente descrito (Sjõgren et al., 1997). Nenhum dos doentes com FTD apresentava sinais de enfarte, e apenas foram verificadas 32 moderadas alterações de matéria branca em alguns dos doentes com FTD. 0 diagnóstico de &quot;provável AD&quot; foi realizado por exclusão, de acordo com os critérios NINCDS-ADRDA (Mc Khann et al., 1984) . Os doentes com AD foram divididos num grupo com AD provável e num com AD possível, como definido pelos critérios NINCDS-ADRDA.All patients included in the study had a clinical diagnosis of FTD, AD, SAE, PD and were recruited consecutively from prospective longitudinal studies in 31 patients with dementia or PD. Clinical diagnoses were established and CSF sampling was performed. Neurochemical analyzes were then carried out at the Institute of Clinical Neuroscience, Sahlgrenska, University Hospital, Mölndal, Sweden. Patients with unspecified dementia (eg mixed dementia), history of severe psychiatric illness (eg schizophrenia), chronic alcoholism, distinct non-degenerative neurological disease (eg normotensive hydrocephalus), a history of severe head injury, CNS, systemic disease (eg malignant tumors) and secondary causes (eg hypothyroidism) for dementia according to the Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders (Association AP, 1987) or biochemical criteria. Patients with large cerebral infarcts and / or multiple gaps were also excluded. All included patients underwent a clinical investigation including medical history, physical, neurological and psychiatric examinations, laboratory blood test screening (laboratory tests relevant to exclude other causes of dementia eg hypothyroidism), routine CSF analyzes (eg cytology ), ECG, chest X-ray, computerized tomography (CT) or MRI of the brain, local cerebral blood flow (CBF) investigation using either single photon emission computed tomography (SPECT) or 133Xenon inhalation technique (Cortexplorer; Risberg and Gustafson, 1983). FTD was diagnosed according to the Lund / Manchester criteria (Brun et al., 1994) as previously described (Sjögren et al., 1997). None of the FTD patients had signs of infarction, and only moderate white matter abnormalities were seen in some FTD patients. The diagnosis of &quot; likely AD &quot; was performed by exclusion, according to the NINCDS-ADRDA criteria (Mc Khann et al., 1984). Patients with AD were divided into a probable AD group and a possible AD as defined by the NINCDS-ADRDA criteria.

Os critérios de diagnóstico para SAE foram os seguintes: a) deterioração mental (predominantemente distúrbio asteno-emocional e disfunção cognitiva frontal); b) distúrbios durante a marcha (ataxia e/ou disfunção motora); c) Sinais neurológicos focais; d) factores de risco vasculares tal como hipertensão e diabetes, ou presença de doença sistémica vascular; e) na MRI ou CT, alterações profundas (&gt; 2 mm) bilaterais múltiplas de matéria branca difusa subcortical-paraventricular, enfartes lacunares, um sistema ventricular aumentado e ausência de mais do que um enfarte lacunar. Os critérios são compatíveis com aqueles sugeridos por outros (Bennett et al., 1990). Quinze dos doentes com SAE não apresentavam enfarte lacunar; os restantes quarto apresentavam um enfarte cortical. O diagnóstico da PD foi realizado de acordo com as recomendações de Langstron e Koller (1991a, b) . Todos os doentes com PD apresentavam pelo menos duas destas três características bradicinesia, rigidez e tremor de repouso, e todos os doentes com PD eram receptivos ao tratamento com L-dopa. Nenhum dos doentes com PD apresentava sinais de demência, e todos eles apresentavam uma classificação de 27 ou menos no Exame de Estado Mínimo Mental (MMSE). (Folstein et al., 1975) 33The diagnostic criteria for SAE were as follows: a) mental deterioration (predominantly astheno-emotional disorder and frontal cognitive dysfunction); b) disturbances during gait (ataxia and / or motor dysfunction); c) Focal neurological signs; d) vascular risk factors such as hypertension and diabetes, or the presence of vascular systemic disease; e) in MRI or CT, multiple bilateral (> 2 mm) deep subcortical-paraventricular diffuse white matter changes, lacunar infarctions, an increased ventricular system and absence of more than one lacunar infarction. The criteria are compatible with those suggested by others (Bennett et al., 1990). Fifteen of the patients with SAE did not present lacunar infarction; the remaining fourth had a cortical infarction. The diagnosis of PD was performed according to the recommendations of Langstron and Koller (1991a, b). All patients with PD had at least two of these three characteristics, bradykinesia, stiffness and resting tremor, and all PD patients were receptive to L-dopa treatment. None of the PD patients had signs of dementia, and all of them had a score of 27 or less on the Minimum Mental State Examination (MMSE). (Folstein et al., 1975) 33

Todos os diagnósticos clínicos foram realizados por médicos sem conhecimento dos resultados das análises bioquímicas e vice-versa. Na altura, nenhum dos doentes estava a ser tratado para a demência (e.g. inibidores de colinesterase).All clinical diagnoses were performed by physicians without knowledge of the results of biochemical analyzes and vice versa. At the time, none of the patients were being treated for dementia (e.g., cholinesterase inhibitors).

Nos doentes dementes, o grau de demência foi avaliado utilizando o MMSE (Folstein et ai., 1997).In demented patients, the degree of dementia was assessed using MMSE (Folstein et al., 1997).

Os controlos normais e os doentes com PD foram incluídos na análise da sensibilidade e especificidade do potencial marcador. 0 grupo controlo consistiu em indivíduos sem historial, sintomas ou sinais de doença psiquiátrica ou neurológica, doença maligna ou distúrbios sistémicas (e.g. artrite reumatóide, doença infecciosa). 0 MMSE foi utilizado para avaliar o seu estado cognitivo, e foram excluídos aqueles com valores abaixo de 28. 0 Comité Ético da Universidade de Gõteborg, Lund/Malmõ e Linkõping, Suécia, aprovou o estudo. Todos os doentes (ou os seus parentes mais próximos) e controlos deram o seu consentimento informado para participar no estudo, o qual foi conduzido em concordância com as provisões da Declaração de Helsínquia. 2.2 Análises de CSF.Normal controls and PD patients were included in the sensitivity and specificity analysis of the marker potential. The control group consisted of individuals with no history, symptoms or signs of psychiatric or neurological disease, malignancy, or systemic disorders (e.g., rheumatoid arthritis, infectious disease). MMSE was used to assess their cognitive status, and those with values below 28 were excluded. The Ethics Committee of the University of Göteborg, Lund / Malmo and Linköping, Sweden, approved the study. All patients (or their close relatives) and controls gave their informed consent to participate in the study, which was conducted in accordance with the provisions of the Declaration of Helsinki. 2.2 CSF analyzes.

Foi efectuada uma punção lombar em todos os doentes e controlos nos interespaços L3/L4 ou L4/L5. Os primeiros 12 mL de CSF foram recolhidos em tubos de polipropileno e gentilmente misturados de modo a evitar efeitos de 34 gradiente (Blennow et ai., 1993) . Ao mesmo tempo, foi retirada uma amostra de soro. Foram excluídas todas as amostras de CSF com mais de 500 eritrócitos por μΐ. As amostras de CSF e de soro foram centrifugadas a 2000 x g durante 10 min. de modo a eliminar células e outros materiais insolúveis. As aliquotas foram então armazenadas a -80 °C até análises bioquímicas. A determinação quantitativa de albumina no soro e no CSF foi levada a cabo por nefelometria, utilizando o Analisador Nefelométrico Behring (Behringwerke AG, Marburgo,A lumbar puncture was performed in all patients and controls in the L3 / L4 or L4 / L5 interspaces. The first 12 mL of CSF were collected in polypropylene tubes and gently mixed in order to avoid gradient effects (Blennow et al., 1993). At the same time, a serum sample was withdrawn. All CSF samples with more than 500 erythrocytes per μ Foram were excluded. The CSF and serum samples were centrifuged at 2000 x g for 10 min. in order to eliminate cells and other insoluble materials. Aliquots were then stored at -80 ° C until biochemical analyzes. Quantitative determination of serum albumin and CSF was carried out by nephelometry using the Behring Nephelometric Analyzer (Behringwerke AG, Marburg,

Alemanha). Foi calculada a razão de albumina CSF/soro (Tibbling et al., 1977) como [albumina de CSF (mg/L)/albumina do soro (g/L) ] e foi utilizado como a medida de função da barreira sangue-cérebro (BBB). A tau de CSF foi determinada utilizando a metodologia &quot;ELISA sandwich&quot; (INNOTEST hTau-Ag, Innogenetics, Gent, Bélgica), construída para medir a tau total (tanto a tau normal como a tau de PHF) , como descrito previamente em detalhe (Vandermeeren et ai., 1993b; Blennow et al., 1995). O nível de fosfo-tau (181) foi determinado pela fosfo-tau (181P) da INNOTEST como descrito acima. 2.3 Análise EstatísticaGermany). The CSF / serum albumin ratio (Tibbling et al., 1977) was calculated as [CSF albumin (mg / L) / serum albumin (g / L)] and was used as the measurement of blood-brain barrier function (BBB). The CSF tau was determined using the &quot; ELISA sandwich &quot; (INNOTEST hTau-Ag, Innogenetics, Gent, Belgium), constructed to measure total tau (both normal tau and tau of PHF) as previously described in detail (Vandermeeren et al., 1993b; Blennow et al., 1995 ). The level of phospho-tau (181) was determined by the phospho-tau (181P) of INNOTEST as described above. 2.3 Statistical Analysis

Todas as variáveis foram distribuídas de modo normal e desse modo foram utilizadas estatísticas paramétricas para comparações entre grupos tendo em conta as variáveis de efeito (tau de CSF e Fosfo-tau de CSF). Foi feita uma ANOVA múltipla totalmente factorial com a tau de CSF e a Fosfo-tau de CSF respectivamente como variáveis dependentes, 35 idade, duração e severidade da demência como co-variantes, e a categoria de diagnóstico (provável e possível AD, FTD, PD, SAE, e envelhecimento normal) como factor. Os factores que não contribuíram para a variância foram excluídos da análise e foi efectuado um novo cálculo. As comparações pós-hoc foram levadas a cabo utilizando o teste pós-hoc Turkey para n's diferentes. A idade média foi significativamente mais baixa em PD (p &lt; 0,001) e em prováveis AD (p &lt; 0,05) comparado com os possíveis AD. Os doentes com provável AD foram significativamente mais dementes que os doentes com possível AD (p &lt; 0,05). Não foram encontradas diferenças entre nenhum dos doentes ou grupos controlo tendo em conta a razão de albumina CSF/soro (apenas para os grupos de demência), e género (tabela 2). 2.4 Tau total de CSF e fosfo tau de CSF (181) na demência, doença de Parkinson e envelhecimento normal A Tau de CSF aumentou significativamente em prováveis AD e possíveis AD quando comparada com FTD (p &lt; 0,001), PD (p &lt; 0,001), SAE (p &lt; 0,001), e controlos (p &lt; 0,001), e em FTD comparada com SAE (p &lt; 0,01) (tabela 3; Fig.4). A Fosfo-tau de CSF (181) aumentou significativamente em prováveis AD comparada com FTD (p &lt; 0,001), PD (p &lt; 0,001), SAE (p &lt; 0,001), e controlos (p &lt; 0, 0079), e em possíveis AD comparada com FTD (p &lt; 0,001), e SAE (p &lt; 0,001), mas não comparada com os controlos. Adicionalmente, a fosfo-tau de CSF (181) também decresceu significativamente em FTD (p &lt; 0,0001) e em SAE (p &lt; 0, 0001) quando comparado com os controlos (tabela 3; Fig. 5). 36 A Tau de CSF e a fosfo-tau de CSF (181) foram correlacionadas de modo positivo em todos os grupos de diagnóstico (AD's prováveis e possiveis: r = 0,86, p &lt; 0,001; FTD: r = 0,66, p &lt; 0,01; SAE: r = 0,58, p &lt; 0,05; PD: r = 0,62, p &lt; 0,05; controlos: r = 0,65, p &lt; 0,01; Fig. 6) .All variables were distributed in a normal way and thus parametric statistics were used for comparisons between groups taking into account the effect variables (CSF tau and CSF phospho-tau). A fully factorial multiple ANOVA was performed with CSF tau and CSF phosphos-tau respectively as dependent variables, age, duration and severity of dementia as covariates, and the diagnostic category (probable and possible AD, FTD, PD, SAE, and normal aging) as a factor. Factors that did not contribute to the variance were excluded from the analysis and a recalculation was performed. Post hoc comparisons were carried out using the Turkey post-hoc test for different n's. Mean age was significantly lower in PD (p <0.001) and in probable AD (p <0.05) compared to possible AD. Patients with probable AD were significantly more insane than patients with possible AD (p <0.05). No differences were found between any of the control patients or groups taking into account the CSF / serum albumin ratio (only for the dementia groups), and gender (table 2). 2.4 Tau total of CSF and phospho-tau of CSF (181) in dementia, Parkinson's disease and normal aging Tau of CSF significantly increased in probable AD and possible AD when compared to FTD (p <0.001), PD (p < 0.001), SAE (p <0.001), and controls (p <0.001), and in FTD compared to SAE (p <0.01) (Table 3; The phospho-tau of CSF (181) increased significantly in probable AD compared to FTD (p <0.001), PD (p <0.001), SAE (p <0.001), and controls (p <0.0099) , and in possible AD compared to FTD (p <0.001), and SAE (p <0.001), but not compared with the controls. In addition, the phospho-tau of CSF (181) also decreased significantly in FTD (p <0.0001) and in SAE (p <0.001) as compared to the controls (Table 3; Fig. 5). CSF Tau and CSF phospho-tau (181) were positively correlated in all diagnostic groups (probable ADs: r = 0.86, p <0.001, FTD: r = 0.66 , p <0.01, SAE: r = 0.58, p <0.05, PD: r = 0.62, p <0.05, controls: r = 0.65, p <0 , Fig. 6).

Foi calculada uma razão de fosfo-tau de CSF (181)/tau de CSF total e foi verificado gue esta estava decrescida de modo significativo em prováveis AD (p &lt; 0,001; 1,16 ± 0,24), possiveis AD (p &lt; 0,001; 1,10 ± 0,20), e FTD (p &lt; 0,001; 0,88 ± 0,34) comparada com os controlos (p &lt; 0,001 para o total dos três grupos; 1,95 ± 0,60), PD (p &lt; 0,001 para o total dos três grupos; 1,92 ± 0,42), e SAE (p &lt; 0,001 para o total dos três grupos; 1,96 ± 1,08) (tabela 3; Fig. 7) .A total CSF phospho-tau ratio (181) / tau was calculated and it was found that it was significantly decreased in probable AD (p <0.001; 1.16 ± 0.24), possible AD (p <0.001, 1.10 ± 0.20), and FTD (p <0.001, 0.88 ± 0.34) compared to the controls (p <0.001 for the total of the three groups, 1.95 ± 0 , P <0.001 for the total of the three groups, 1.96 ± 1.08), and SAE (p <0.001 for the total of the three groups, 1.96 ± 1.08) (Table 3; Fig. 7).

Exemplo 3: Determinação do nível de fosfo-tau de CSF (181) e de tau total de CSF em doentes com doença de Alzheimer versus doentes com derrame cerebral isquémico agudo. 3.1 Doentes O total de tau em CSF e de fosfo-tau em CSF (181) foram examinados em amostras longitudinais de CSF de 22 doentes, 16 homens e 6 mulheres, idade média ± SD, 65,7 ± 9,2 anos, com um derrame cerebral isquémico agudo. Todos os doentes foram avaliados de uma forma padronizada, como previamente descrito (Tarkowski et al., 1999). Quando possível, as amostras de CSF eram recolhidas em cinco ocasiões; no dia de chegada 0-1 (n=9), dia 2-3 (n=18), dia 7-9 (n=22), três semanas (n=21) e 3-5 meses (n=21). 37Example 3: Determination of the phospho-tau level of CSF (181) and total tau of CSF in patients with Alzheimer's disease versus patients with acute ischemic stroke. 3.1 Patients Total CSF and phospho-tau tau in CSF (181) were examined in CSF longitudinal samples from 22 patients, 16 males and 6 females, mean age ± SD, 65.7 ± 9.2 years, with an acute ischemic stroke. All patients were evaluated in a standardized manner, as previously described (Tarkowski et al., 1999). When possible, the CSF samples were collected on five occasions; on the day of arrival 0-1 (n = 9), day 2-3 (n = 18), day 7-9 (n = 22), three weeks (n = 21) and 3-5 months . 37

Foram também estudados 54 doentes com provável AD, 25 homens e 29 mulheres, idade média + SD, 73,3 +7,4 anos, e 17 controlos saudáveis, 4 homens e 13 mulheres, idade média + SD, 68,6 +7,5 anos. A idade média foi significativamente (p &lt; 0,05) maior na AD que no grupo controlo. O diagnóstico de &quot;AD provável&quot; foi efectuado por exclusão, de acordo com os critérios NINCDS-ADRDA (McKhann et al., 1984). A avaliação clinica e o procedimento de diagnóstico foram noutro local descritos em detalhe (Andreasen et al., 1998, 1999) . O grau de demência foi avaliado utilizando o MMSE (Folstein, 1975), e foi 23,8 + 4,4 no grupo de AD. O grupo controlo consistiu em indivíduos sem historial, sintomas ou sinais de doença psiquiátrica ou neurológica, doença maligna ou distúrbios sistémicas. Indivíduos com valores MMSE abaixo de 28 não foram incluídos. Todos os diagnósticos clínicos foram efectuados sem o conhecimento dos resultados das análises bioquímicas e vice-versa.Fifty-five patients with probable AD, 25 men and 29 women, mean age + SD, 73.3 +7.4 years, and 17 healthy controls, 4 men and 13 women, mean age + SD, 68.6 +7 ,5 years. Mean age was significantly (p &lt; 0.05) higher in AD than in the control group. The diagnosis of &quot; AD likely &quot; was performed by exclusion, according to the NINCDS-ADRDA criteria (McKhann et al., 1984). Clinical evaluation and diagnostic procedure were elsewhere described in detail (Andreasen et al., 1998, 1999). The degree of dementia was assessed using MMSE (Folstein, 1975), and was 23.8 + 4.4 in the AD group. The control group consisted of individuals with no history, symptoms or signs of psychiatric or neurological disease, malignancy, or systemic disorders. Individuals with MMSE values below 28 were not included. All clinical diagnoses were performed without knowledge of the results of biochemical analyzes and vice versa.

Os doentes de derrame cerebral foram examinados por tomografia computarizada (CT) e ressonância magnética imagiológica (MRI) cerca de 1 mês após o derrame cerebral, como descrito em detalhe previamente (Tarkowski et al, 1999). O tamanho (em cm2) foi determinado por CT e o volume (em mL) por MRT. O teste Kruskal-Wallis foi utilizado para comparações entre três ou mais grupos, e se signif icante, o teste Mann-Whitney U para comparações entre dois grupos. O coeficiente de correlação Spearman foi utilizado para correlações. 38 0 Comité Ético da Universidade de Gõteborg e Umeá aprovou o estudo. Todos os doentes (ou os seus parentes mais próximos) e controlos deram o seu consentimento informado para participar no estudo, o qual foi conduzido em concordância com as provisões da Declaração de Helsínquia.Stroke patients were examined by computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI) about 1 month after stroke, as described in detail previously (Tarkowski et al, 1999). Size (in cm2) was determined by CT and volume (in mL) by MRT. The Kruskal-Wallis test was used for comparisons between three or more groups, and if significant, the Mann-Whitney U test for comparisons between two groups. The Spearman correlation coefficient was used for correlations. 38 The Ethics Committee of the University of Göteborg and Umeá approved the study. All patients (or their close relatives) and controls gave their informed consent to participate in the study, which was conducted in accordance with the provisions of the Declaration of Helsinki.

3.2 Análises CSF3.2 CSF Analysis

Foi efectuada uma punção lombar nos interespaços L3/L4 ou L4/L5. Os primeiros 12 mL de CSF foram recolhidos em tubos de polipropileno e gentilmente misturados de modo a evitar possíveis efeitos de gradiente (Blennow, 1993). Foram excluídas todas as amostras de CSF com mais de 500 eritrócitos por μΐ. As amostras de CSF foram centrifugadas a 2000 x g durante 10 min. de modo a eliminar células e outros materiais insolúveis, e as alíquotas foram então armazenadas a -80 °C aguardando análises bioquímicas. O nível de Tau de CSF foi determinado utilizando a metodologia &quot;ELISA sandwich&quot; (Innotest hTAU-Ag, Innogenetics, Gent, Bélgica) , construída para medir a tau total (ambas tau normal e Tau de PHF) , como descrito previamente em detalhe (Vandermeeren et al., 1993b; Blennow et al. , 1995) . O nível de fosfo-tau de CSF (181) foi determinado pela fosfo-tau (181P) da INNOTEST como descrito acima. 3.3 Fosfo-tau de CSF (181) e total de tau em CSF em doentes com doença de Alzheimer e em doentes com derrame cerebralA lumbar puncture was performed in the L3 / L4 or L4 / L5 interspaces. The first 12 ml of CSF were collected in polypropylene tubes and gently mixed in order to avoid possible gradient effects (Blennow, 1993). All CSF samples with more than 500 erythrocytes per μ Foram were excluded. The CSF samples were centrifuged at 2000 x g for 10 min. in order to eliminate cells and other insoluble materials, and the aliquots were then stored at -80 ° C for biochemical analysis. The Tau level of CSF was determined using the &quot; ELISA sandwich &quot; (Innotest hTAU-Ag, Innogenetics, Gent, Belgium), constructed to measure total tau (both normal tau and PHF Tau) as previously described in detail (Vandermeeren et al., 1993b; Blennow et al., 1995). The phospho-tau level of CSF (181) was determined by the phospho-tau (181P) of INNOTEST as described above. 3.3 CSF phospho-tau (181) and total tau in CSF in patients with Alzheimer's disease and in stroke patients

Nos doentes com derrame cerebral, a tau total de CSF apresentou um aumento marcado aos dias 2-3 (24,4 +7,4 pM; p = 0,002) após o derrame cerebral agudo quando comparado 39 com o dia 0-1 (média + SEM 5,4 + 1,2 pM) , e permaneceram elevados nos dias 7-9 (24,1 + 4,3 pM; p &lt; 0, 0001) e após três semanas (25,0 + 4,1 pM; p &lt; 0,0001) e depois retornaram aos valores normais após 3-5 meses (8,5 + 1,2 pM; p = 0,35) (Fig.8). Os valores individuais para o total de tau de CSF para os nove doentes com amostras de CSF tomados como linha de base são dados na Fig 9.In stroke patients, total CSF tau showed a marked increase on days 2-3 (24.4 ± 7.4 pM; p = 0.002) after acute stroke when compared to day 0-1 (mean + SEM 5.4 + 1.2 pM), and remained elevated on days 7-9 (24.1 + 4.3 pM; p <0.001) and after three weeks (25.0 + 4.1 pM , p <0.0001) and then returned to normal values after 3-5 months (8.5 + 1.2 pM; p = 0.35) (Fig. 8). The individual values for total CSF tau for the nine patients with CSF samples taken as baseline are given in Fig 9.

Em contraste, não houve alteração significativa na fosfo-tau de CSF (181) entre a linha de base (média + SEM 9,1 + 3,1 pM) e os dias 2-3 (10,9 +1,0 pM), dias 7-9 (13,0 +2,1 pM), três semanas (11,5 +2,0 pM) ou 3-5 meses (10,6 +2,0 pM) (Fig. 8). Os valores individuais para a fosfo-tau de CSF (181) para os nove doentes com amostras de CSF tomados como linha de base são dados na Fig 9. A tau total de CSF foi significativamente aumentado em AD prováveis (média + SD 14,4 + 5,5 pM) comparado com os controlos (8,3 + 2,8 pM) (p &lt; 0,0001). Também a fosfo-tau de CSF (181) foi significativamente aumentado em AD prováveis (20,5 + 6,5 pM) comparado com os controlos (15,9 + 5,7 pM) (p &lt; 0,05). A Tau de CSF e a fosfo-tau de CSF (181) foram correlacionados de modo positivo nos grupos de AD (r = 0,93, p &lt; 0,0001) e no controlo (r = 0,72, p &lt; 0,01) (Fig. 10) . No grupo de derrame cerebral, a correlação foi mais alta ao dia 0-1 (r = 0,63, p &lt; 0,001) e após 3 meses (r = 0,80), depois aos dias 2-3 (r = 0,54), dias 7-9 (r = 0,58) e de modo especial após três semanas (r = 0,15) . É claro a partir da Fig. 10 que existe uma diferença entre a razão de Fosfo-tau de CSF (181)/total de tau de CSF para 40 doentes com a doença de Alzheimer comparado com doentes de derrame cerebral. A análise de regressão para valores obtidos a partir de doentes com a doença de Alzheimer (y = 0,82x + 4,39, r = 0,90, p &lt; 0,0001) e a partir de doentes de derrame cerebral (y = 0,17x + 8,09, r = 0,415, p &lt; 0,0001) revelaram uma diferença significativa (p &lt; 0,001).In contrast, there was no significant change in the phospho-tau of CSF (181) between baseline (mean + SEM 9.1 + 3.1 pM) and days 2-3 (10.9 +1.0 pM) , days 7-9 (13.0 ± 2.1 pM), three weeks (11.5 ± 2.0 pM) or 3-5 months (10.6 ± 2.0 pM) (Fig. Individual values for CSF phospho-tau (181) for the nine patients with CSF samples taken as baseline are given in Fig 9. Total CSF tau was significantly increased in probable AD (mean + SD 14.4 + 5.5 pM) compared to the controls (8.3 + 2.8 pM) (p <0.0001). Also the phospho-tau of CSF (181) was significantly increased in probable AD (20.5 + 6.5 pM) compared to the controls (15.9 + 5.7 pM) (p <0.05). CSF Tau and CSF phospho-tau (181) were positively correlated in the AD (r = 0.93, p <0.0001) and control (r = 0.72, p < 0.01) (Fig. 10). In the stroke group, correlation was highest at day 0-1 (r = 0.63, p <0.001) and after 3 months (r = 0.80), then at day 2-3 (r = 0 , 54), days 7-9 (r = 0.58) and especially after three weeks (r = 0.15). It is clear from Fig. 10 that there is a difference between the CSF phospho-tau ratio (181) / total CSF tau for 40 patients with Alzheimer's disease compared to stroke patients. Regression analysis for values obtained from patients with Alzheimer's disease (y = 0.82x + 4.39, r = 0.90, p <0.0001) and from stroke patients (and = 0.17x + 8.09, r = 0.415, p <0.0001) revealed a significant difference (p <0.001).

Houve uma correlação positiva entre o tamanho do enfarte quando medido por CT e o nivel máximo de tau total de CSF (r = 0,72; p &lt; 0,01), enquanto a correlação com a fosfo-tau de CSF (181) não foi significativa (r = 0,349). Houve também uma correlação positiva entre o volume do enfarte quando medido por MRI e o valor máximo de tau total de CSF (r = 0,66; p &lt; 0,05), enquanto a correlação com fosfo-tau de CSF (181) não foi significativa (r = 0,59). 41There was a positive correlation between infarct size as measured by CT and maximum total tau level of CSF (r = 0.72; p <0.01), while correlation with phospho-tau of CSF (181) was not significant (r = 0.349). There was also a positive correlation between infarct volume as measured by MRI and maximal total tau value of CSF (r = 0.66; p <0.05), while correlation with phospho-tau of CSF (181) was not significant (r = 0.59). 41

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LISTA DE SEQUÊNCIAS &lt;110&gt; INNOGENETICS N.V. &lt;120&gt; Diagnosis of Tauopathies &lt;130&gt; PCT.112.T181 &lt; 14 0 &gt; &lt; 14 1 &gt; &lt;1S0&gt; 00Β70008-Θ &lt;151&gt; 2000-01-24 &lt;150 &gt; 008702S0.5 c 151 &gt; 2000-11-22 &lt;150 = 60/178,391 &lt;151=- 2000-01-27 &lt;160&gt; 54 &lt;170 = PatenCIn Ver. 2.1LIST OF SEQUENCES &lt; 110 &gt; INNOGENETICS N.V. &lt; 120 &gt; Diagnosis of Tauopathies &lt; 130 &gt; PCT.112.T181 &lt; 14 0 &gt; &lt; 14 1 &gt; &lt; 1S0 &gt; 00Β70008-Θ &lt; 151 &gt; 2000-01-24 &lt; 150 &gt; 008702S0.5 and 151 &gt; 2000-11-22 &lt; 150 = 60 / 178,391 &lt; 151 = - 2000-01-27 &lt; 160 &gt; 54 &lt; 170 = PatenCIn Ver. 2.1

&lt;210 &gt; 1 &lt;211&gt; 5 &lt;212&gt; PRT &lt; 213 .&gt; Homo sapiens &lt;4 00 &gt; 1&lt; 210 &gt; 1 &lt; 211 &gt; 5 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 1

Pro Pro Gly Gin Lys 1 sPro Pro Gly Gin Lys 1 s

&lt;210&gt; 2 &lt;211&gt; 7 &lt;212 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221 = MODJRES &lt;222 &gt; (6) &lt;223&gt; PHOSPBORYLATION &lt;400&gt; 2&lt; 210 &gt; 2 &lt; 211 &gt; 7 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 = MODJRES &lt; 222 &gt; (6) &lt; 223 &gt; PHOSPBORYLATION &lt; 400 &gt; 2

Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro 1 5 53Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro 1 5 53

&lt;210&gt; 3 &lt;211&gt; 34 &lt;222&gt; PRT &lt;213? Momo sapiens &lt;220? &lt;221&gt; MOD_RES &lt;222? Í28) &lt;223? PHOSPHORYLATIOW &lt;400&gt; 3 f?ro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Ala Asn Ala Thr 1 5 '10 15&lt; 210 &gt; 3 &lt; 211 &gt; &Lt; 222 &gt; PRT <213> Momo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOD_RES <222> (28) <223> PHOSPHORYLATIOW &lt; 400 &gt; 3 Arg Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Ala Asn Ala Thr 1 5 '10 15

Arg Ile Pro Ala Lys,Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser ser 20 25 30Arg Ile Pro Ala Lys, Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser 20 25 30

Gly G.luGly G.lu

«210&gt; 4 &lt;211&gt; 35 &lt;212? DNA &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400? 4 catggctgag ccccgccagg agttcgaagt gatgg 35«210 &gt; 4 &lt; 211 &gt; &Lt; 212 &gt; DNA &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400? 4 catggctgag ccccgccagg agttcgaagt gatgg 35

&lt;2 20&gt; 5 &lt;211? 32 &lt;212? DNA &lt;213? Komo sapiens &lt;40G? 5 cctgatcaca aaccctgctt ggccagggag 32&lt; 20 &gt; 5 <211> 32 <212> DNA &lt; 213 &quot; Komo sapiens &lt; 40G? 5 cctgatcaca aaccctgctt ggccagggag 32

&lt;210? 6 &lt;211? δ &lt;212? PRT &lt;213? Homo sapiens 54 &lt;400&gt; 6&lt; 210 &gt; 6 <211> δ <212> PRT <213> Homo sapiens &lt; 400 &gt; 6

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser 1 sAsp Arg Ser Gly Tyr Ser 1 s

&lt;21Q&gt; 7 &lt;211&gt; 7 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;4 00&gt; 7&lt; 21Q &gt; 7 &lt; 211 &gt; 7 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 7

Pro Pro Thr Arg GIu Pro Lys 1 5Pro Pro Thr Arg GIu Pro Lys 1 5

&lt;210&gt; 8 &lt;211&gt; 21 &lt;212? PRT &lt;213ϊ Homo sapiens &lt;220 &gt; &lt;221 &gt; MOD_RES &lt;222 &gt; (11) &lt;223&gt; PHOSPHORYLATION &lt;-100&gt; 8&lt; 210 &gt; 8 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOD_RES &lt; 222 &gt; (11) &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; -100 &gt; 8

Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala 1 5 10 15Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala 1 5 10 15

Pro Pro Gly Gin Lys &lt;21Õ&gt; 9 &lt;211&gt; 21 &lt;212 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221&gt; MODERES &lt;222&gt; íIX) &lt;223 &gt; PHGSPHORYIiATrON &lt;4 0 0 &gt; 9Pro Pro Gly Gin Lys &lt; 21 &gt; 9 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MODERES &lt; 222 &gt; (IX) &lt; 223 &gt; PHGSPHORYIiATrON &lt; 4 0 0 &gt; 9

Gin Ala Asn Ala Thr Arg Ile Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys 55 55 10 15 1 5Gin Ala Asn Ala Thr Arg Ile Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys 55 55 10 15 1 5

Thr Pro Pro Ser Ser 20 &lt;210^ 10 &lt;211&gt; 22Thr Pro Pro Ser Ser 20 &lt; 210 &gt; &lt; 211 &gt; 22

&lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;22 0? &lt;221&gt; MODJÍES &lt;222 &gt; í13) &lt;2 23&gt; PHOSPBORYXjATION &lt;400? 10&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens <22 0? &lt; 221 &gt; MODJIES &lt; 222 &gt; (13) &lt; 233 &gt; PHOSPBORYXjATION &lt; 400? 10

Arg He Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15Arg He Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15

Gly Glu Pro Pro Lys Ser 20Gly Glu Pro Pro Lys Ser 20

&lt;210? 11 &lt;211? 21 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;22 1&gt; MOD_R.ES &lt; 222 &gt; (11) &lt;223&gt; PHOSPHORYLATION &lt;4 0 0 &gt; 11&lt; 210 &gt; 11 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 22 1 &gt; MOD_R.ES &lt; 222 &gt; (11) &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 4 0 0 &gt; 11

Pro Pro Dys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15Pro Pro Dys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15

Thr Pro Gly Ser Arg 25Thr Pro Gly Ser Arg 25

&lt;210? 12 &lt;211&gt; 21 &lt;212 &gt; PRT 56 &lt;213&gt; Homo sapíens &lt;220&gt; &lt;221&gt; MOD_KES &lt;222&gt; (IX) &lt;223 &gt; PHOSPHORYLATXON &lt;40G&gt; 12&lt; 210 &gt; 12 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT 56 &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOD_KES &lt; 222 &gt; (IX) &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATXON &lt; 40G &gt; 12

Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly Thr X 5 10 isPro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly Thr X 5 10 is

Pro Gly Ser Arg Ser 20 &lt; 210 &gt; 13 &lt;211&gt; 21Pro Gly Ser Arg Ser 20 < 210 &gt; 13 &lt; 211 &gt; 21

&lt; 212 &gt; PRT &lt;213 &gt; Homo sapíens &lt;220&gt;&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt;

&lt;221&gt; M0D__RES &lt; 2 22 &gt; (IX) &lt;2 23 &gt; PHOSPHORYIATION &lt;40G&gt; 13&lt; 221 &gt; M0D__RES &lt; 2 22 &gt; (IX) &lt; 233 &gt; PHOSPHORYIATION &lt; 40G &gt; 13

Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly 15 10 15Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly 15 10 15

Ser Arg Ser Arg Thr 20Ser Arg Ser Arg Thr 20

&lt; 2 10 &gt; 14 &lt;211&gt; 21 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapíens &lt;22 0&gt; &lt;221&gt; M0D__RES &lt;222 &gt; {11} &lt;223&gt; PHOSPHORYLATIGN &lt;4 00&gt; 14&lt; 2 10 &gt; 14 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 22 &gt; &lt; 221 &gt; M0D__RES &lt; 222 &gt; {11} &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATIGN &lt; 400 &gt; 14

Axg Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser 15 10 15 57Axg Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser 15 10 15 57

Arg Thr Pro Ser Leu 20Arg Thr Pro Ser Leu 20

&lt;210&gt; 15 &lt;211&gt; 21 &lt;212 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221 &gt; M0D__RES &lt;222&gt; (11)&lt; 210 &gt; 15 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; M0D__RES &lt; 222 &gt; (11)

&lt;223 &gt; PHOSPHORTLÃTIGW &lt;400&gt; 15&lt; 223 &gt; PHOSPHORTLITIGW &lt; 400 &gt; 15

Tyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro 15 10 ISTyr Ser Ser Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro 15 10 IS

Ser Leu Pro Thr Pro 20Ser Leu Pro Thr Pro 20

&lt;210:5. 16 &lt; 211&gt; 21 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt; 2 2 0 &gt; &lt;22li MODERES &lt;222&gt; til) &lt;223&gt; PBOSPHORYLATION &lt;400&gt; 16&lt; 210: 5. 16 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 2 2 0 &gt; &lt; 22li MODERES &lt; 222 &gt; til) &lt; 223 &gt; PBOSPHORYLATION &lt; 400 &gt; 16

Ser Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 15 10 15Ser Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 15 10 15

Pro Thr Pro Thr Arg 20Pro Thr Pro Thr Arg 20

&lt; 210 &gt; 17 &lt;211&gt; 21 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens 58 &lt;220&gt; &lt;221? MODERES &lt;222s (11) &lt;223&gt; PHGSPHORYLATIΟΝ &lt; 4 0 0&gt; 17&lt; 210 &gt; 17 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MODERES &lt; 222s (11) &lt; 223 &gt; PHGSPHORYLATIΟΝ &lt; 4 0 0 &gt; 17

Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr 1 5 Pro Thr Arg Glu Pro 20 10 15 &lt;210? 18 &lt;211? 21 &lt;212? PRT &lt;213? Homo sapiens &lt;220? &lt;221? MODERES &lt;222? (11) &lt;223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt;400? 18Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr 1 5 Pro Thr Arg Glu Pro 20 10 15 <210> 18 <211> 21 &lt; 212 &gt; PRT <213> Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MODERES &lt; 222? (11) &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 400? 18

&lt;210&gt; 19 &lt;211&gt; 21 &lt; 212&gt; PRT &lt;213? Homo sapiens &lt;220? &lt;221&gt; Í40D__RES &lt;222 &gt; (11)&lt; 210 &gt; 19 &lt; 211 &gt; 21 < 212 &gt; PRT <213> Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; &Lt; 222 &gt; (11)

&lt;223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt;400&gt; IS 1 15&lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 400 &gt; IS 1 15

Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Thr Arg Glu Pro S 10Gly Ser Arg Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Thr Arg Glu Pro S 10

Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg 1 5 Arg Glu Pro Lys Lys 20Gly Thr Pro Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Glu Pro Lys Lys 20

Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Thr 10 15 59Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Thr 10 15 59

Lys Lys vai Ala Vai 20Lys Lys goes Ala vai 20

&lt;210&gt; 20 &lt;211&gt; 20 c212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220s &lt;221? M0D_R£S &lt;222&gt; (11) &lt;223&gt; PHOSPKORYLATIOU &lt;400&gt; 20&lt; 210 &gt; 20 &lt; 211 &gt; 20 c212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220s &lt; 221 &gt; M0D_R £ S &lt; 222 &gt; (11) &lt; 223 &gt; PHOSPKORYLATIOU &lt; 400 &gt; 20

Arg Glu Pro Lys Lys Vai Ala Vai Vai Arg Thr Pra Lys Ser Pro Ser 1 5 Ser Ala Lys Ser 20 &lt;210 &gt; 21 &lt;211 &gt; 20 &lt;212 &gt; PRT &lt;213 &gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;22 1 &gt; MOD_RES &lt;222 &gt; (11) &lt;223&gt; PHOSPHOPvYLATI GM &lt;400? 21Arg Glu Pro Lys Lys Go Ala Go Go Arg Thr Go Lys Ser Pro Ser 15 Ser Ala Lys Ser 20 &lt; 210 &gt; 21 &lt; 211 &gt; 20 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 22 1 &gt; MOD_RES &lt; 222 &gt; (11) &lt; 223 &gt; PHOSPHOPvYLATI GM &lt; 400? 21

Lys Lys Vai Ala Vai Vai Arg Thr Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 1 S 10 15Lys Lys Go Ala Go Go Arg Thr Pro Lys Ser Pro Be Ser Ala Lys 1 S 10 15

Ser Arg Leu Gin 20Ser Arg Leu Gin 20

&lt;210&gt; 22 &lt;211? 12 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens 60 &lt;220? &lt;22 1&gt; mod_res &lt;222? (7) &lt;223? phosphorylation &lt;400? 22&lt; 210 &gt; 22 <211> 12 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 22 1 &gt; mod_res <222> (7) <223> phosphorylation &lt; 400? 22

Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys 15 10Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys 15 10

&lt;210? 23 &lt;211&gt; 21 &lt;212? PKT &lt;213? Homo sapiens &lt;220? &lt;221? MODERES &lt;222? (11)&lt; 210 &gt; 23 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PKT <213> Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MODERES &lt; 222? (11)

&lt;223? PHOSPHORYLATION &lt;40O&gt; 23<223> PHOSPHORYLATION &lt; 40O &gt; 23

Thr Asp His Giy Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pr© Val Val Ser Asp 15 10 15Thr Asp His Giy Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pr © Val Val Ser Asp 15 10 15

Thr Ser Pro Arg His 20 &lt;210&gt; 24 &lt;211? 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt;213? Homo sapiens &lt;220? &lt;221&gt; MOD _RES &lt;222? (11) &lt;223&gt; PHOSPKGRYIATION &lt;400? 24Thr Ser Pro Arg His His &lt; 210 &gt; 24 <211> 21 < 212 &gt; PRT <213> Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOD _RES <222> (11) &lt; 223 &gt; PHOSPKGRYIATION &lt; 400? 24

Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val val Ser Asp Thr Ser Pro Arg 15 10 15Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Asp Thr Ser Pro Arg 15 10 15

Kis Leu Ser Asn Val 2 0 61Kis Leu Ser Asn Val 2 0 61

&lt;210&gt; 25 &lt;211&gt; 21 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221&gt; MOD_EES &lt;222&gt; (11)&lt; 210 &gt; 25 &lt; 211 &gt; 21 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOD_EES &lt; 222 &gt; (11)

&lt;223&gt; PHOSPHORYLATION &lt;400&gt; 25&lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 400 &gt; 25

Ile Vai Tyr Lys Ser Pro Vai Vai Ser Asp Thr Ser Pro Arg Hls Leu 15 10 15Ile Vai Tyr Lys Ser Pro Will Be Asp Thr Ser Pro Arg Hls Leu 15 10 15

Ser Asn Vai Ser Ser 20Being Asn is going to be 20

&lt;210&gt; 26 &lt;211&gt; 20 &lt;212&gt; PRT &lt;213 &gt; Homo sapi ens &lt;220&gt; &lt;221&gt; MOD_RES &lt;222&gt; (10) &lt;223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt;400&gt; 26&lt; 210 &gt; 26 &lt; 211 &gt; 20 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapi ens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOD_RES &lt; 222 &gt; (10) &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 400 &gt; 26

Tyr Lys Ser Pro Vai Vai Ser Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn 15 10 15Tyr Lys Ser Pro Will Be Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn 15 10 15

Vai Ser Ser Thr 20It's Gonna Be Thr 20

&lt;210 3 27 &lt;211=· 21 &lt;2 12 &gt; PRT &lt;213&gt; Hoíro sapiens &lt;220&gt; &lt;22l&gt; KOD_RES &lt;222&gt; (11) &lt;22 3 3 PHOS PBORYLATIOH 62 &lt;4 0D&gt; 27&lt; 210 3 27 &lt; 211 = 21 &lt; 2 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Hoíro sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; KOD_RES &lt; 222 &gt; (11) &lt; 22 3 3 PHOS PBORYLATIOH &lt; 4D &gt; 27

Vai Vai Ser Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asrt Vai Ser Ser Thr 15 10 15Will Be Asp Thr Be Pro Arg His Leu Be Asrt Will Be Be Thr 15 10 15

Gly Ser Ile Asp Met 20 &lt;2 10 &gt; 28 &lt; 211 &gt; 21Gly Ser Ile Asp Met 20 &lt; 2 &gt; 28 < 211 &gt; 21

&lt;212 &gt; PRT &lt;213 &gt; Homo sapiens &lt;22 0 &gt; &lt; 2 21&gt; MOD_EES &lt;222 &gt; (11) &lt;223&gt; PHOSPHGRYLATIOH &lt;400&gt; 28&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 2 21 &gt; MOD_EES &lt; 222 &gt; (11) &lt; 223 &gt; PHOSPHGRYLATIOH &lt; 400 &gt; 28

Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Vai Ser Ser Thr Gly Ser Ile 1 5 10 15Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Will Be Ser Thr Gly Ser Ile 1 5 10 15

Asp Met Vai Asp Ser 20 &lt;210&gt; 29 &lt;211&gt; 21Asp Met Val Asp Ser 20 &lt; 210 &gt; 29 &lt; 211 &gt; 21

&lt; 212 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221&gt; MOD_RES &lt;222 &gt; (11) &lt;223 &gt; PHOSPKORYLATION &lt;400&gt; 29&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOD_RES &lt; 222 &gt; (11) &lt; 223 &gt; PHOSPKORYLATION &lt; 400 &gt; 29

Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Vai Asp Ser Pro Gin Leu Ala Thr 15 10 15Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gin Leu Ala Thr 15 10 15

Leu Ala Asp Glu Vai 20 63 &lt;210» 30 &lt;211&gt; 78Leu Ala Asp Glu Vai 20 63 <210> 30 <211> 78

&lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400&gt; 30&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 30

Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Ala As.n Ala Thr Arg 15 10 15Arg Gly Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Ala As.n Ala Thr Arg 15 10 15

Xle Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 20 25 30Xle Pro Wing Lys Thr Pro Pro Wing Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 20 25 30

Glu Pro Pro Lvs Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 35 40 45Glu Pro Pro Lvs Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 35 40 45

Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leo Pro Thr Pro 50 55 60Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leo Pro Thr Pro 50 55 60

Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Vai Ala Vai Vai Arg Thr Pro 65 70 7SPro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Go Ala Go Go Arg Thr Pro 65 70 7S

&lt;210&gt; 31 &lt;211» 9 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;4G0&gt; 31&lt; 210 &gt; 31 &lt; 211 &gt; 9 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 4G0 &gt; 31

Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gin Lys 1 5Arg Gly Ala Pro Pro Gly Gin Lys 1 5

&lt;210&gt; 32 &lt;211&gt; 9 &lt;2J2&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400&gt; 32&lt; 210 &gt; 32 &lt; 211 &gt; 9 &lt; 2J2 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 32

Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly l 5Gly Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly l 5

&lt;210&gt; 33 &lt;211» 9 &lt;212» PRT 64 &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;4 Q 0 &gt; 33&lt; 210 &gt; 33 <211> 9 <212> PRT 64 <213> Homo sapiens &lt; 4 Q 0 &gt; 33

Ala Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin 1 5 &lt;210&gt; 34 &lt;211 &gt; 9Ala Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin 1 5 &lt; 210 &gt; &Lt; tb &gt; 9

&lt;212 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400 &gt; 34&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 34

Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Ala 1 5 &lt;210&gt; 35 &lt;211&gt; 9Ala Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Ala 15 &lt; 210 &gt; &Lt; tb &gt; 9

&lt;212 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;40Q&gt; 35&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 40Q &gt; 35

Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Ala Asn 1 5Pro Pro Gly Gin Lys Gly Gin Wing Asn 1 5

&lt;210 &gt; 36 &lt;211 &gt; 9 &lt;212 &gt; PRT &lt;213 &gt; Homo sapiens &lt;400&gt; 36&lt; 210 &gt; 36 &lt; 211 &gt; 9 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 36

Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser 1 5Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser 15

&lt; 210 &gt; 3 7 &lt;21X&gt; 9 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400&gt; 37&lt; 210 &gt; 3 &lt; 21X &gt; 9 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 37

Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser 65 Ί &lt;210í 3 B &lt;211 &gt; 9 A V PRT &lt;213 &gt; Homo sapiens &lt; 40 0 &gt; 3ΘSer Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser 65 Ί &lt; 210 &gt; &lt; 211 &gt; 9 A V PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 40 0 &gt; 3Θ

Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro 1 5Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro 15

&lt;210&gt; 39 &lt;211&gt; 9 &lt;2 12 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400&gt; 39 ,&lt; 210 &gt; 39 &lt; 211 &gt; 9 &lt; 2 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 39,

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly i 5Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly I 5

¢210 &gt; 40 &lt;211&gt; 12 &lt;212j PRT &lt;213? Homo sapiens &lt;40 0 &gt; 40¢ 210 &gt; 40 &lt; 211 &gt; 12 &lt; 212j PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 40 &gt; 40

Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 15 10Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 15 10

&lt;210 &gt; 41 &lt;211&gt; 12 &lt;212PRT &lt;213i Homo sapiens &lt;40Q&gt; 41&lt; 210 &gt; 41 &lt; 211 &gt; 12 &lt; 212PRT &lt; 213i Homo sapiens &lt; 40Q &gt; 41

Ser leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys L&gt;ys 1 5 10 66Pro Thr Pro Thr Arg Glu Pro Lys L &gt; ys 1 5 10 66

&lt;210» 42 &lt;211&gt; 12 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400» 42&lt; 210 &gt; 42 &lt; 211 &gt; 12 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 42

Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Vai 15 10Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Go 15 10

&lt;210&gt; 43 &lt;211» 12 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400» 43&lt; 210 &gt; 43 &lt; 211 &gt; 12 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 43

Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Vai Ala 1 Ξ 10Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Go Ala 1 Ξ 10

&lt;210&gt; 44 &lt;211&gt; 12 &lt;212 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;400&gt; 44&lt; 210 &gt; 44 &lt; 211 &gt; 12 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 400 &gt; 44

Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Vai Ala Vai 15 10Thr Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Will Ala Go 15 10

&lt;210j 45 &lt;211&gt; 12 &lt;212&gt; PRT&lt; 210j 45 &lt; 211 &gt; 12 &lt; 212 &gt; PRT

&lt;213&gt; Homo sapiens &lt;4 0Q&gt; 4 S&lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 40O &gt; 4 S

Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Vai Ala Vai Vai 1 5 10 &lt;210&gt; 45 &lt;211» 15Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Go Ala Go Go 1 10 &lt; 210 &gt; 45 <211> 15

&lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens 67 &lt;220&gt; &lt;221&gt; K0D_RES &lt;222&gt; {24) &lt;2 2 3 &gt; PKOSPHQRYLATIGH &lt;4 00&gt; 46&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; K0D_RES &lt; 222 &gt; (24) &lt; 2 2 3 &gt; PKOSPHQRYLATIGH &lt; 400 &gt; 46

Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro 1 5 &lt; 2 10 &gt; 47 &lt;212 &gt; 25 &lt;212&gt; PRT &lt;2l3&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221&gt; M0D__RES &lt;222&gt; (13) &lt;223&gt; PHOS PHORYLATrON &lt;400&gt; 47Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro 1 5 < 2 10 &gt; 47 &lt; 212 &gt; 25 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; M0D__RES &lt; 222 &gt; (13) &lt; 223 &gt; PHOS PHORYLATRON &lt; 400 &gt; 47

Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro 15 10 15 &lt;210&gt; 48 &lt;211&gt; 15Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro 15 10 &lt; 210 &gt; 48 &lt; 211 &gt; 15

&lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapíens &lt;22 0 &gt; &lt;221&gt; M0D_SlES &lt;222 &gt; {12! &lt;223&gt; PK0SPB0SYLATI0N &lt;400&gt; 48&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 22 &gt; &lt; 221 &gt; M0D_SlES &lt; 222 &gt; {12! &lt; 223 &gt; PK0SPB0SYLATI0N &lt; 400 &gt; 48

Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser 15 10 15 &lt;210&gt; 49 &lt;211&gt; 15Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser 15 10 &lt; 210 &gt; 49 &lt; 211 &gt; 15

&lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapíens 68 &lt;22 Ο &gt; &lt;221&gt; MODERES &lt;2 22&gt; (11) &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt;40ϋ&gt; 49&lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapien 68 &lt; 22 &gt; &lt; 221 &gt; MODERES &lt; 2 22 &gt; (11) &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 40 &gt; 49

Xle Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser 15 10 ISXle Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser 15 10 IS

&lt;210&gt; SO &lt;211 = IS &lt;212= PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220 = &lt;221&gt; M0D_RES &lt;222&gt; (10) &lt;223&gt; PHQSPHORYLATIGN &lt;4 00= 50 .„,t&lt; 210 &gt; SO <211 = IS <212> PRT <213> Homo sapiens &lt; 220 = &lt; 221 &gt; M0D_RES &lt; 222 &gt; (10) &lt; 223 &gt; PHQSPHORYLATIGN &lt; 400 = 50. ", T

Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 15 10 15Pro Wing Lys Thr Pro Pro Wing Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 15 10 15

&lt;210= 51 &lt;211&gt; 15 &lt;212&gt; PRT &lt;213= Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221&gt; MOD_RES &lt;222&gt; (9) &lt;2 2 3= PHOSPHORYLATION &lt;400= 51&lt; 210 = 51 &lt; 211 &gt; 15 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 = Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOD_RES &lt; 222 &gt; (9) <2 2 3 = PHOSPHORYLATION <400 = 51

Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu 15 10 15Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu 15 10 15

&lt;210= 52 &lt;211&gt; 15 &lt; 212 &gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens 69 &lt;220&gt; &lt; 221&gt; M0D_RES &lt;222&gt; (8) &lt; 22 3 &gt; PHOSPHORYLATION &lt;400&gt; 52&lt; 210 = 52 &lt; 211 &gt; 15 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; M0D_RES &lt; 222 &gt; (8) < 22 3 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 400 &gt; 52

Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro 15 10 15Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro 15 10 15

&lt;210&gt; 53 &lt;211 &gt; 15 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221 &gt; MOO__RES &lt;222 &gt; 17) &lt; 2 2 3 &gt; PHOSPHORYLATION &lt;400&gt; 53&lt; 210 &gt; 53 &lt; 211 &gt; 15 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; MOO__RES &lt; 222 &gt; 17) &lt; 2 2 3 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 400 &gt; 53

Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro 1 5 10 15Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Gly Glu Pro Pro 1 5 10 15

&lt;210&gt; 54 &lt;211&gt; 15 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Homo sapiens &lt;220&gt; &lt;221&gt; M0D_RES &lt;222&gt; (6) &lt;223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt;400&gt; 54&lt; 210 &gt; 54 &lt; 211 &gt; 15 &lt; 212 &gt; PRT &lt; 213 &gt; Homo sapiens &lt; 220 &gt; &lt; 221 &gt; M0D_RES &lt; 222 &gt; (6) &lt; 223 &gt; PHOSPHORYLATION &lt; 400 &gt; 54

Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 1 5 10 15Pro Pro Wing Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Pro Glu Pro Lys 1 5 10 15

Lisboa, 9 de Janeiro de 2007Lisbon, January 9, 2007

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro para o diagnóstico de uma taupatia num indivíduo, compreendendo o referido método os passos de: - determinação da razão de fosfo-tau(181)/total de tau numa amostra obtida a partir do indivíduo referido; - inferência que o indivíduo referido sofre de uma taupatia comparando a razão obtida de fosfo-tau ( 1 8 1 ) /total de tau na referida amostra com a razão de fosfo-tau(181)/total de tau numa amostra obtida a partir de indivíduos controlo, sendo uma indicação a razão alterada de fosfo-tau(181)/total de tau comparado com a razão referida na amostra obtida a partir dos indivíduos controlo.An in vitro method for the diagnosis of a tautoma in a subject, said method comprising the steps of: - determining the phospho-tau ratio (181) / total tau in a sample obtained from said subject; - an inference that the subject undergoes a taupatia by comparing the obtained ratio of phospho-tau (1 8 1) / total tau in said sample with the ratio of phospho-tau (181) / total tau in a sample obtained from control subjects, with an indication of the altered ratio of phospho-tau (181) / total tau compared to the ratio reported in the sample obtained from the control subjects. 2. Método in vitro para o diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma não-taupatia num indivíduo, compreendendo o referido método os passos de: - determinação da razão de fosfo-tau(181)/total de tau numa amostra obtida a partir do indivíduo referido; - inferência que o indivíduo referido sofre de uma taupatia comparando a razão obtida de fosfo-tau ( 1 8 1 ) /total de tau na referida amostra com a razão de fosfo-tau(181)/total de tau numa amostra obtida a partir de indivíduos que sofrem de uma não-taupatia ou com a razão de fosf o-tau (181)/total de tau numa 2 amostra obtida a partir de individuos controlo, sendo uma indicação a razão alterada de fosfo-tau(181)/total de tau comparado com a razão referida da amostra obtida a partir dos individuos que sofrem uma não-taupatia ou na amostra obtida a partir de individuos controlo.An in vitro method for the differential diagnosis of tautathy versus non-tautathy in an individual, said method comprising the steps of: determining the phospho-tau ratio (181) / total tau in a sample obtained from the subject mentioned; - an inference that the subject undergoes a taupatia by comparing the obtained ratio of phospho-tau (1 8 1) / total tau in said sample with the ratio of phospho-tau (181) / total tau in a sample obtained from individuals suffering from a non-tautoma or the total tau (181) / tau phosphate ratio in a sample obtained from control individuals, an indication being the ratio of phospho-tau (181) / total of tau compared to the stated ratio of the sample obtained from individuals suffering from non-tautathy or from the sample obtained from control individuals. 3. Método de acordo com a reivindicação 2 em que a referida não-taupatia é uma neurodeqeneração não-taupática.A method according to claim 2 wherein said non-taupatio is non-taupo neurodegeneration. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3 em que a referida não-taupatia é demência vascular, Doença de Jacob Creutzfeldt, derrame cerebral e/ou neurotoxicidade em doentes com leucemia.A method according to any one of claims 2 to 3 wherein said non-tautathy is vascular dementia, Jacob Creutzfeldt Disease, stroke and / or neurotoxicity in patients with leukemia. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que a taupatia é a doença de Alzheimer, doença de Pick's, demência Frontotemporal Esporádica e/ou demência Frontotemporal com Parkinsonismo ligado ao cromossoma 17.A method according to any one of claims 1 to 4 wherein the taupathy is Alzheimer's disease, Pick's disease, Sporadic Frontotemporal dementia and / or Frontotemporal dementia with chromosome 17-linked Parkinsonism. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que o referido método compreende os seguintes passos: - determinação da razão de fosfo-tau (181)/total de tau numa amostra de fluído cerebroespinal obtida a partir do indivíduo referido; - inferência que o indivíduo referido que sofre de uma taupatia comparando a razão obtida de fosfo-tau (181) /total de tau na referida amostra de CSF com 3 a razão de fosfo-tau(181)/total de tau numa amostra de CSF obtida a partir de individuos que sofrem uma não-taupatia ou com o razão de fosfo-tau(181)/total de tau numa amostra de CSF obtida a partir de indivíduos controlo, sendo uma indicação a razão alterada de fosfo-tau(181)/total de tau comparado com a razão referida na amostra de CSF obtida a partir de indivíduos que sofrem uma não-taupatia ou na amostra de CSF obtida a partir de indivíduos controlo.A method according to any one of claims 1 to 5 wherein said method comprises the following steps: - determination of the phospho-tau (181) / total tau ratio in a sample of cerebrospinal fluid obtained from said subject; - inference that the said subject suffering from a taupacia comparing the obtained ratio of phospho-tau (181) / total tau in said CSF sample with 3 phospho-tau (181) / total tau ratio in a sample of CSF obtained from subjects suffering from non-tautathy or with the phospho-tau (181) / total tau ratio in a sample of CSF obtained from control subjects, an indication being the altered ratio of phospho-tau (181) / total of tau compared to the ratio reported in the CSF sample obtained from individuals suffering from a non-tautathy or in the CSF sample obtained from control subjects. 7. Anticorpo que reconhece especificamente tau e um anticorpo que reconhece especificamente fosfo-tau (181) para a utilização num método para o diagnóstico in vivo de uma taupatia e/ou para o diagnóstico diferencial in vivo de uma taupatia versus uma não-taupatia .An antibody that specifically recognizes tau and an antibody that specifically recognizes phospho-tau (181) for use in a method for the in vivo diagnosis of a taupathy and / or for the in vivo differential diagnosis of a taupatitis versus a non-taupathy. 8. Utilização de um anticorpo que reconhece especificamente tau e um anticorpo que reconhece especificamente fosfo-tau (181) para a produção de um kit de diagnóstico para o diagnóstico in vivo de uma taupatia e/ou para o diagnóstico diferencial in vivo de uma taupatia versus uma não-taupatia.Use of an antibody that specifically recognizes tau and an antibody that specifically recognizes phospho-tau (181) for the production of a diagnostic kit for the in vivo diagnosis of a taupatia and / or for the in vivo differential diagnosis of a taupati versus a non-taupatia. 9. Fosfopéptido sintético entre 15 e 100 aminoácidos capazes de formar um complexo imunológico com o anticorpo monoclonal HT7 e anticorpo monoclonal ΆΤ270, compreendendo pelo menos: - o epitopo mínimo de HT 7: PPGQK (SEQ ID N° 1); e - o epitopo mínimo de AT270: PPAPKT(p)P (SEQ ID N° 2) 4A synthetic phosphopeptide of between 15 and 100 amino acids capable of forming an immunological complex with the monoclonal antibody HT7 and monoclonal antibody ΆΤ270, comprising at least: - the minimal epitope of HT 7: PPGQK (SEQ ID NO: 1); and - the minimal epitope of AT270: PPAPKT (p) P (SEQ ID NO: 2) 4 10. Fosfopéptido de acordo com a reivindicação 9, em que o referido fosfopéptido compreende a seguinte sequência: PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT(p)PPSSGE (SEQ ID N° 3) ou sequências variantes em condições em que elas continuem a ligar-se aos anticorpos monoclonais HT7 e AT270.A phosphopeptide according to claim 9, wherein said phosphopeptide comprises the following sequence: PRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKT (p) PPSSGE (SEQ ID NO: 3) or variant sequences under conditions in which they continue to bind to HT7 monoclonal antibodies and AT270. 11. Utilização de um fosfopéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10 num método para a medição do nível de fosfo-tau (181).Use of a phosphopeptide according to any one of claims 9 to 10 in a method for measuring the level of phospho-tau (181). 12. Kit de diagnóstico para o diagnóstico de uma taupatia num indivíduo e/ou para o diagnóstico diferencial de uma taupatia versus uma não-taupatia compreendendo pelo menos: - um anticorpo que reconhece especificamente fosfo-tau (181) ; - um anticorpo que reconhece a tau total;A diagnostic kit for the diagnosis of a tautoma in an individual and / or for the differential diagnosis of a taupatitis versus a non-taupathy comprising at least: an antibody that specifically recognizes phospho-tau (181); an antibody which recognizes total tau; 13. Kit de diagnóstico compreendendo pelo menos um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10.A diagnostic kit comprising at least one peptide according to any one of claims 9 to 10. 14. Kit de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13 compreendendo pelo menos: um anticorpo que reconhece especificamente fosfo-tau (181); - um anticorpo que reconhece a tau total; 5 péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10.A diagnostic kit according to any one of claims 12 to 13 comprising at least: an antibody that specifically recognizes phospho-tau (181); an antibody which recognizes total tau; A peptide according to any one of claims 9 to 10. 15. Utilização de um kit de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14 para o diagnóstico in vitro de uma taupatia e/ou para o diagnóstico diferencial in vitro de uma taupatia versus uma não-taupatia de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.Use of a diagnostic kit according to any one of claims 12 to 14 for the in vitro diagnosis of a taupathy and / or for the in vitro differential diagnosis of a taupatitis versus a non-taupatitis according to any one of claims 1 to 6. 16. Utilização de um kit de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14 para o diagnóstico in vitro da doença de Alzheimer, doença de Pick's, demência Frontotemporal Esporádica e/ou demência Frontotemporal com Parkinsonsismo ligado ao cromossoma 17 e/ou para o diagnóstico diferencial in vitro da doença de Alzheimer, demência Frontotemporal doença de Pick's, demência Frontotemporal Esporádica e/ou demência Frontotemporal com Parkinsonsismo ligado ao cromossoma 17 versus a demência vascular, doença de Jacob Creutzfeldt, derrame cerebral e/ou neurotoxicidade em doentes com leucemia. Lisboa, 9 de Janeiro de 2007Use of a diagnostic kit according to any one of claims 12 to 14 for the in vitro diagnosis of Alzheimer's disease, Pick's disease, Sporadic Frontotemporal dementia and / or Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17 and / or the in vitro differential diagnosis of Alzheimer's disease, Frontotemporal dementia, Pick's disease, Frontotemporal dementia Sporadic and / or Frontotemporal dementia with chromosome-linked Parkinsonsism 17 versus vascular dementia, Jacob's disease Creutzfeldt, stroke and / or neurotoxicity in patients with leukemia . Lisbon, January 9, 2007
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