PT116887B

PT116887B - Processo para a produção de micropartículas de polissacáridos direcionadas para os macrófagos alveolares, obtenção das micropartículas e uso das mesmas

Info

Publication number: PT116887B
Application number: PT116887A
Authority: PT
Inventors: Margarida Moutinho Grenha Ana; Isabel Guerreiro Rodrigues Susana; Raquel Da Silva Matos Pereira Filipa; Bernardina Dias Alves Ana
Original assignee: Univ Do Algarve
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2022-03-09
Also published as: WO2016174573A1; PT116887A; EP3288537A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE MICROPARTÍCULAS DE POLISSACÁRIDOS DIRECIONADAS PARA OS MACRÓFAGOS ALVEOLARES, ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE SECAGEM POR ATOMIZAÇÃO. ESTA INVENÇÃO TAMBÉM SE REFERE AO USO DAS MICROPARTÍCULAS DE POLISSACÁRIDOS NO TRATAMENTO DA TUBERCULOSE, COMO VEÍCULOS DE FÁRMACOS USADOS NA TERAPIA DA MESMA.

Description

.1

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE MICROPARTÍCULAS DE POLISSACÂRIDOS DIRECIONADAS PARA OS MACRÔFAGOS ALVEOLARES, OBTENÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS E USO DAS MESMAS”

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a técnicas de microencapsulação de fármacos, aplicáveis na produção de micropartículas para o tratamento da tuberculose, utilizando micropartículas à base de polissacáridos obtidas por secagem por atomização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os macrôfagos alveolares são células residentes nos pulmões, nomeadamente na zona alveolar. Estas células estão envolvidas diretamente no progresso de algumas doenças, como a tuberculose. Neste caso, os macrôfagos alojam a bactéria responsável pela doença (Mycõbacteriíún tubercul&sís) e, por esta razão, são um alvo terapêutico privilegiado. Uma vez que os macrôfagos alveolares residem nos alvéolos, qualquer fármaco direcionado para estas células terá de alcançar esta zona do trato respiratório. A inalação de fármacos destinados a alcançar a zona alveolar requer o desenvolvimento de transportadores específicos, que estejam dotados de características aerodinâmicas adequadas para que a sua distribuição dentro do pulmão seja a desejada. Para tal,, um diâmetro aerodinâmico de 0,5 - 3 um e geralmente assumido como referência. As microparticulas poliméricas são os transportadores propostos com mais frequência no âmbito da inalação de fármacos, uma vez que as suas propriedades aerodinâmicas podem ser ajustadas a requisitos específicos. Por outro lado, a atomização é o método mais utilizado para a obtenção de microparticulas. Esta é uma técnica de microencapsulação conhecida por produzir microparticulas com propriedades ajustáveis, dependendo da otimização dos parâmetros envolvidos no processo, permitindo desta forma a manipulação das propriedades das microparticulas para que estas exibam características específicas.

Os macrófagos apresentam vários recetores na sua superfície que podem ser usados para mediar o direcionamento para estas células. Na realidade, estes recetores estão envolvidas no reconhecimento de agentes patogénicos. Entre os recetores descritos, os recetores de lectina tipo-C e os recetores scavenger são os dois grupos com envolvimento reportado na maioria dos casos de reconhecimento de polissacáridos. O primeiro grupo inclui os recetores de manose, os quais têm a capacidade de reconhecer manose, fucose, 2V-acetilglucosamina e açúcares sulfatados, os quais estão presentes em muitos polissacáridos. Por seu lado, o segundo grupo tem demonstrado afinidade por vários polissacáridos como o sulfato de condroitína, sulfato de dextrano e fucoidano, entre outros. Esta capacidade aumentada para reconhecimento de certas unidades, torna os macrófagos alvos para materiais compostos por estes resíduos, nomeadamente os polissacãridos.

Atualmente, os transportadores propostos para a terapia inalatória da tuberculose são desprovidos de estratégias de direcionamento específicas. A sua aplicação baseia-se apenas nas propriedades aerodinâmicas dos transportadores e na capacidade natural dos macrófagos fagocitarem inespecificamente material particulado. Abordagens que incluem capacidade de direcionamento ativo requerem a modificação da superfície de transportadores de fármacos tubérculostáticos pré-formados com resíduos de manose (manosilação). Desta forma, os transportadores manosilados são os únicos descritos como tendo capacidade de direcionamento específica para os macrófagos alveolares. Os transportadores pré-formados são frequentemente compostos por polímeros sintéticos, nomeadamente poliésteres, dos quais os mais utilizados são o ácido polilático (PLA) e o ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA).

GRENHA A. et al. Natural carriers for application in tuberculosis treatment in Journal of Mícroencapsulation:

Micro and Nano Carriers, Volume 30, Issue 3, 2013, descrevem a utilidade de usar os macrófagos alveolares como alvo terapêutico na terapia tuberculostãtica. Os mesmos autores mencionam que nano e micropartículas compostas por

- 4— polímeros naturais, como o quitosano ou o ácido hialurónico, poderiam ser usados para este fim.

LAURIENZO P., Marine polysaccharides in pharmaceutical applications: an overview in Marine Drugs, 2010,- 8(9):2435-2465, descrevem que micropartícuias de alginato permitiram uma maior biodisponib.ilidade e redução dos efeitos adversos quando comparadas com a administração de fármacos tuberculostáticos na sua forma livre.

KUNDAWALA A. et al, Preparation of Microparticles containing rifampicin as dry powder formulation: in vitro studies on aerossol performance in American Journal of Pharmtech Research 2(4), 2012, descrevem a produção, por atomização, de pos secos de rifampicina que correspondem a micropartícuias de quitosano, para aplicar na terapêutica da tuberculose.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a morfologia das micropartículas observada por mi.croscopia eletrónica de varrimento, onde CRG indica carragenina, FUC indica fucoidano, KGM indica, glucomanano de konjac, LBG indica goma de alfarroba e PHGG indica goma guar parcialmente hidrolisada.

A Figura 2 mostra a internaiização comparativa de micropartículas compostas por diferentes polissacáridos e por álcool polívinílico (PVA, controlo), pelas células NR8383 (macrófagos alveolares de rato), após 2 horas de exposição a 50 - 60 pg/cm² de microparticuias marcadas com fluorescência (média ± SEM, η 1 3) , onde CRG indica carragenina, FUC indica fucoidano, LBG indica goma de alfarroba e PHGG indica goma guar parcialmente hidrolisada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a micropartícuias produzidas num único passo pelo processo de secagem por atomização, as quais são compostas por polissacáridos selecionados com o objetivo de conseguir um direcionamento específico para os macrófagos alveolares. Os parâmetros do processo de secagem por atomização são otimizados para permitir a produção de micropartículas que evidenciem propriedades aerodinâmicas apropriadas para chegarem à região alveolar, onde os macrófagos alveolares residem. As micropartículas têm o objetivo de proporcionar uma estratégia inalatória para o tratamento da tuberculose, exigindo desta forma o direcionamento para os macrófagos. Com o objetivo de demonstrar a capacidade das micropartículas alcançarem os macrófagos, micropartículas sem fãrmacos associados foram produzidas e usadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção usa. materiais naturais, nomeadamente polissacáridos, os quais são absolutamente vantajosos, porque se forem utilizados para produzir as micropartículas de polissacáridos compostos pelos resíduos identificáveis pelos macrófagos que foram referidos anteriormente, torna-se possível a produção de transportadores de fármacos direcionados numa única etapa, sem a necessidade de incluir ligandos de interesse numa fase posterior. Além disso, os polissacáridos são obtidos a relativamente baixo custo, são estruturas muito flexíveis e têm grande possibilidade de evidenciar biocompatibilidade. A estratégia de desenvolver transportadores de polissacáridos para uma terapia inalatória da tuberculose envolve a produção num único passo de um transportador que irá alcançar os macrófagos de forma natural.

Na presente invenção, os polissacáridos que compõem as micropartículas foram selecionados pela sua estrutura química, já que é esta caraterística que medeia especificamente o direcionamento ativo para os macrófagos. Os polissacáridos selecionados incluem a goma de alfarroba, a goma guar, o fucoidano, o glucomanano, a carragenina, a goma xantana, o glucano, o sulfato de dextrano, o sulfato de condroitina. Todos estes polissacáridos têm na sua estrutura, como componentes naturais, grupos químicos (nomeadamente sulfato) ou resíduos (como por exemplo

- 7' manose, fucose, W-acetilglucosamina, galactose, etc.) que estão descritos como potencialmente sujeitos a um reconhecimento direto pelos recetores de superfície dos macrófagos alveolares. A ideia de base para esta estratégia de direcionamento direto para os macrõfagos foi comprovada com alguns dos materiais mencionados.

A goma de alfarroba é um galactomanano composto por resíduos de manose e galactose numa razão molar média de 4 /1.

A goma guar é um galactomanano composto por resíduos de manose e galactose numa razão molar média de 2/1 .

O fucoidano tem unidades de fucose na sua estrutura e também grupos sulfato.

glucomanano tem unidades de glucose e manose na sua estrutura numa razão molar média de 1/1,6.

Para produzir as micropartícuias, o primeiro passo consiste na solubílização dos polissacáridos. Cada polissacárido foi usado individualmente, tendo a concentração de polímero variado entre 1,5 e 2% (m/v). A menor concentração mencionada (1,5%) foi usada quando a concentração de 2% resultou em viscosidade demasiado elevada para permitir a atomização. Estas concentrações foram consideradas adequadas para obter micropartícuias com diâmetros de Feret de 1-2 μηρ o que favorece a captura macrofágica. Vários aspetos necessitaram de otimização antes do processo de secagem por atomização;

- A goma de alfarroba requereu pulverização antes da solubili zação.

A goma de alfarroba necessitou aquecimento a 85 °C durante 30 minutos para solubilizar.

- A carragenina necessitou aquecimento a 50 °C durante 30 minutos para solubilizar.

O atomizador foi usado em configuração de modo aberto, tendo-se usado ar comprimido como gás. As condições da secagem por atomização variaram, dependendo do material (polissacáridos) utilizado. Para o conjunto de polissacáridos anteriormente especificados, as condições foram: temperatura de entrada entre 140 e 180 °C, aspirador entre 80 e 90%, o fluxo de atomização entre 0,7 e 2 mL/min.

Dependendo do material de matriz selecionado (polissacárido), as micropartículas resultantes do processo evidenciaram uma forma esférica ou mais irregular, com concavidades e convexidades (Figura 1) . Do conjunto de polissacáridos mencionados anteriormente como possíveis materiais, as micropartículas de goma de alfarroba, goma guar, fucoidano, carragenina e gluçomanano foram produzidas para demonstrar o conceito. As características das micropartículas estão resumidas na Tabela 1. Os diâmetros de Feret variaram entre 1,4 e 1,8 μη, enquanto as densidades reais variaram entre 1,0 e 1,7 g/cm³, o que

- 9 resultou num diâmetro aerodinâmico teórico entre 1,7 e 2,3 No geral, as características indicam que as micropartículas são teoricamente adequadas para a iHH J. 3Ç H-O pulmonar profunda.

Embora não afete diretamente o carácter da invenção, estas micropartículas foram avaliadas em relação à sua capacidade para encapsular dois fármacos tuberculostáticos de primeira linha em combinação, a isoniazida e a rifabutina, conforme exigido no tratamento da tuberculose (a terapêutica utilizando um único fármaco não é recomendada) . Considerada a. maior potência da rifabutina em comparação com a isoniazida, de acordo com Jabês et al., Effectiveness of rifabutin alone or in combination with isoniazid in preventive therapy of mouse túberculosis, Antimicrob Agents Chemother, 38 (1994) 23462350, a isoniazida foi associada às micropartículas em quantidade correspondente a aproximadamente o dobro daquela de rifabutina. As eficácias de encapsulação variaram entre 74 e 89% para a isoniazida, e entre 57 e 92% para a rifabutina.

Objetivos da Invenção

A primeira função da presente invenção consiste num processo para a produção de micropartículas de polissacaridos direcionadas para os macrófagos alveolares, usando um processo de secagem por atomização num só passo, compreendendo :

a) dissolução do polissacãrido de forma a obter uma concentração do polímero entre 1,5 e 2% (m/vj;

b) atomização da solução obtida num passo único, usando as seguintes condições de atomização:

i) temperatura de entrada entre 14 0 e 180 ^<!C;

ii) aspirador entre 80 e 90%;

iii) fluxo de atomização das soluções entre 0,8 e 2 mL/min.

Preferencialmente, o polissacãrido é selecionado do grupo que consiste na goma de alfarroba, fucoidano, goma guar, carragenina, glucomanano, goma xantana, glucano, sulfato de dextrano e sulfato de condroitina.

Os polissacáridos particularmente preferidos são a goma de alfarroba, o fucoidano, a goma guar e a carragenina.

O atomizador é normalmente usado na configuração de modo aberto e o gás aplicado pelo equipamento é o ar comprimido.

A segunda função da presente invenção consiste nas micropartícuias de polissacáridos direcionadas para os macrófagos alveolares, obtidas pelo processo descrito acima, com diâmetro de Feret entre 1,0 e 2,0 gm, densidade real entre 1,0 e 1,7 g/cm³ e diâmetro aerodinâmico teórico entre 1,7 e 2,3 μω.

- 11 Normalmente, as micropartículas de polissacãridos têm diâmetros de Feret entre 1,4 e 1,8 μτη.

A terceira função da presente invenção consiste no uso de tais microparti cuias de polissacãridos no tratamento da tuberculose, como transportadores de fãrmacos usados no tratamento da referida doença.

Uma combinação de fãrmacos preferida é a associação da isoniazida e rifabutina.

Exemplos de Preparação

Os exemplos seguintes pretendem ilustrar a invenção, mas não são limitativos do âmbito da invenção, o qual é apenas determinado pelos conteúdos das reivindicações.

Exemplo 1

Micropartículas de goma de alfarroba (LBG) : 1 g de LBG é pulverizada num almofariz durante 10 min, apõs o que se adicionam 5 mL de HC1 0,1M, mantendo a pulverização até mistura completa da LBG e do HC1. Ê então adicionada água purificada previamente aquecida a 85 ^<:C, até um volume final de 50 mL· (a concentração de LBG é 2%, m/v) . A dispersão é mantida em agitação durante 30 min e de seguida é colocada em banho-maria a 85 “C sob agitação lenta durante mais 30 min. No final, a dispersão é mantida em agitação â temperatura ambiente durante a noite, até ao

- 12 momento da atomização. Os parâmetros do processo de atomização são· temperatura de entradas 160 ^eC; aspirador: 85%; fluxo de atomização: 0,8 mL/min; e taxa de fluxo do ar: 473 L/h. O rendimento da produção das micropartículas é

Exemplo 2

Micropartículas de goma guar parcialmente hidrolisada (PHGG) : 1 g de PHGG é dissolvida em 50 mL de água purificada sob agitação durante 20 min (a concentração de PHGG é 2%, m/v). Após a dissolução, adiciona-se manitol, que se dissolve na solução de PHGG numa concentração final de 0,5% (m/v) , de forma a melhorar as propriedades aerodinâmicas finais das micropartículas. A solução final é mantida sob agitação durante 20 min antes da atomização. Os parâmetros do processo de atomização são: temperatura de entrada: 160 ± 2 °C; aspirador: 80%; fluxo de atomização: 1,0 mL/min; e taxa de fluxo do ar: 473 L/h. O rendimento da produção das micropartículas é 73%.

Exemplo 3

Micropart!cuias de glucomanano de konjac (KGM); 1 g de KGM (parcíalmente hidrolisado) dissolvem-se em 50 mL de água purificada a 7o °C, sob agitação durante 45 min (a concentração de KGM é 2%, m/v) . Os parâmetros do processo de atomização são: temperatura de entrada: 17 0 ± 2 ^CC; aspirador; 90%; fluxo de atomização: 0,7 mL/min; e taxa de

- 13 fluxo do ar: 473 L/h. 0 rendimento da produção das micropartículas ê 69%.

Características das Micropartículas

As caraterísticas das micropartículas compostas por polissacáridos, de acordo com a invenção, propostas para o direcionamento aos macrófagos alveolares no âmbito do tratamento da tuberculose, estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1

Material de matriz	Diâmetro de Feret (pm)	Densidade aparente (g/cm³)	Densidade real (g/cm³)	Diâmetro aerodinâmico* (pm)
Goma de alfarroba	1,63+0,86	0,24+0,05	1,07+0,01	1,69+0,19
Goma guar parcialmente hidrolisada	1,75+0,02	0,37+0,05	1,51+0,02	2,32+0,03
Carragenina	1,39±0,24	0,48+0,01	1,70 + 0,01	2,01+0,01
Fucoidano	1,49+0,14	0,35±0,02	1,62±0,01	1,90+0,01
Glucómanano de konjac	1,39+0,04	0,22+0,01	1,52+0,04	l,72±0,06

*Estimativa teórica (Diâmetro aerodinâmico

Diâmetro de

Feretjx Vdensidade real.

Ensaios in vitro

A prova de conceito relativamente à capacidade de direcionamento das micropartículas para os macrófagos alveolares foi avaliada in vitro usando dois modelos de cultura celular. As células THP-1 de origem humana podem ser diferenciadas (usando forbol-12-miristato-13-acetato, PMA) para exibirem o fenôtipo de macrófagos e desenvolverem características dos macrófagos alveolares. As células NR8383 são macrófagos alveolares de rato. Os macrófagos alveolares têm recetores na superfície, incluindo o recetor de manose (CD206), reportados como tendo capacidade de reconhecer as unidades de manose e fucose e os grupos sulfato. Está reportado que a diferenciação das células THP-1 através do ΡΜΆ não induz a expressão destes recetores, enquanto os mesmos existem nas células NR8383. Enquanto todos os polissacáridos selecionados apresentam unidades estruturais capazes de sofrer um reconhecimento específico pelos macrófagos, o álcool polivinílico (PVA) é desprovido de tais unidades e foi usado como controlo.

Para efeitos deste ensaio, que envolve a captura macrofãgica das micropartículas e subsequente determinação do número de macrófagos de uma população que fagocitou as micropartículas, cada polissacarido foi previamente marcado com fluorescência antes do processo de secagem, por atomização. As micropartículas que compõem cada formulação foram insufladas sobre uma camada de células em placas de 6 poços e incubadas durante 2 horas. Após esse período, as células foram recuperadas e analisadas por citometria de fluxo, para determinar quais as formulações que favorecem a

- 15 captura macrofágica.

As micropartículas à base de goma de alfarroba, fucoidano, goma guar e carragenina foram as selecionadas para este ensaio de captura, além do controlo de PVA. A cítometria de fluxo determina o número de macrófagos na amostra e quantifica os macrófagos que exibem fluorescência, a qual é uma consequência da fagocitose das micropartículas fluorescentes. Um ensaio controlo foi realizado usando micropartículas sem fluorescência. Nesse caso, não foi detetado nenhum macrófago com sinal de fluorescência ou o sinal detetado não foi significativo (o máximo obtido foi 1%). As células NR8383 originam os resultados mais significativos, pois esta linha celular exibe o recetor de interesse. Como se observa na Figura 2, após contacto com uma dose de 50-60 gg/cm² de micropartículas de cada polímero, a goma de alfarroba é o polímero que mostra uma maior afinidade para os macrófagos, induzindo 95% de captura, seguida da goma guar e da carragenina, as quais obtiveram resultados semelhantes (cerca de 70%). Curiosamente, a internalização observada para as micropartículas de fucoidano não foi além dos 30%, inclusive permaneceu a um nível abaixo do que registado para o controlo de PVA. O aumento da dose de contacto para 220-250 pg/cm² resultou num aumento generalizado para cerca de 100% em todos os polissacáridos, indicando um efeito depexidente da dose (dados não apresentados) . A goma de alfarroba, a goma guar parcialmente hidrolisada e o controlo de PVA também foram testados nas células THP-l diferen.cia.das em macrófagos, a. uma concentração de 50-60 ug/cm², o que resultou num aumento da captura para valores entre 90 e 100% em todos os casos, possivelmente como uma consequência da ausência do recetor específico da manose que poderia diferenciar a internaiização. Isto indica que a presença deste recetor realmente permite um direcionamento específico.

Os outros polissacáridos indicados também têm a capacidade de potenciar a fagocitose, pois possuem unidades potencialmente reconhecidas pelos recetores superficiais dos macrófagos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um processo para produzir micropartículas de polissacãridos para direcionamento para os macrófagos alveolares, em que as referidas micropartículas de polissacáridos detêm as seguintes características: diâmetros de Feret entre 1,0 e 2,0 μτα, densidades reais entre 1,0 e 1,7 g/cm³ e diâmetros aerodinâmicos teóricos entre 1,7 e 2,3 gm, sendo o dito processo caraterizado por utilizar a secagem por atomização, que compreende:

a) a dissolução do polissacãrido selecionado a partir do grupo composto por goma de alfarroba, fucoidano, goma guar, carragenina, glucomanano, goma xantana, glucano, sulfato de dextra.no e sulfato de condroitina, de forma a obter uma concentração de polímero entre 1,5 e 2%, m/v;

b) a dissolução dos fãrmacos tuberculostáticos isoniazida e rifabutina;

c) a mistura das soluções referidas em a) e b) para posterior atomização, num passo único, usando as seguintes condições de atomização:

i)temperatura de entrada entre 140 e 180 T, ii) aspirador entre 80 e 90%, iii) fluxo de atomização das soluções entre 0,8 e 2 mU/min; d) a obtenção de eficácias de encapsulação entre 74 e 89% para a isoniazida, e entre 57 e 92% para a rifabutina.

Um processo para a produção de micropartículas de polissacãridos para direcionamento para os macrófagos alveolares de acordo com a reivindicação 1, caraterizado por o polissacárido ser selecionado a partir do grupe composto por goma de alfarroba, fucoidano, goma guar e carragenina.
3. Um processo para direcionamento para os macrófagos alveolares de micropartículas de polissacáridos, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caraterizado por a goma de alfarroba ser pulverizada antes da etapa a) e aquecida a 85 ’C durante 30 minutos.
4. Um processo para direcionamento para os macrófagos alveolares de micropartículas de polissacáridos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caraterizado por a carragenina ser aquecida antes da etapa a) a 50 ^:,C durante 30 minutos.
5. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caraterizado por o atomizador ser usado na configuração de modo aberto, isto é, em que o gás utilizado não é recirculado.
6. O processo de acordo com qualquer uma da.

reivindicações 1 a 4, caraterizado por o gás aplicado na secagem por atomização ser o ar comprimido.
7. Micropartículas de polissacáridos obtidas através do processo descrito nas reivindicações anteriores, caraterizadas por uma composição de goma de alfarroba, fucoidano, goma guar ou carragenina, e uma associação de isoniazida e rifabutina, em que as eficácias de encapsulação variam entre 74 e 89% para a isonizida, e entre 57 e 92% para a rifabutina, em que as referidas micropartículas apresentam diâmetros de Feret entre 1,0 e 2,0 gm e diâmetros aerodinâmicos teóricos entre 1,7 e 2,3 /xm
8. Micropartículas de polissacáridos de acordo com a reivindicação anterior para utilização como medicamento no tratamento da tiiberculose.