PT116050B - DRUG-BINDING CONJUGATES AND INHIBITORS OF MODIFIED BROMODOMINUM AND EXTRATERMINAL DOMAIN -(BET) FAMILY PROTEINS - Google Patents

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Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A CONJUGADOS FÁRMACO-LIGANDO E INIBIDORES CONJUGADOS FÁRMACO-LIGANDO E INIBIDORES DAS PROTEÍNAS DA FAMÍLIA BROMODOMÍNIO E DOMÍNIO EXTRATERMINAL -(BET) MODIFICADOS PARA USO NA TERAPÊUTICA DO CANCRO. A PRESENTE INVENÇÃO APRESENTA AINDA PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DOS CONJUGADOS FÁRMACO LIGANDO.THE PRESENT INVENTION PERFORMS DRUG-BINDING CONJUGATES AND DRUG-BINDING CONJUGATE AND INHIBITORS OF BROMODOMINUM AND EXTRATERMINAL DOMAIN -(BET) PROTEINS MODIFIED FOR USE IN CANCER THERAPY. THE PRESENT INVENTION FURTHER PROVIDES FOR PROCESSES FOR PRODUCTION OF DRUG CONJUGATES.

Description

DescriçãoDescription

Conjugados Fármaco-ligando e Iníbídores das proteínas da família bromodomínio e domínio extraterminal -(BET) modificadosDrug-ligand conjugates and inhibitors of modified bromodomain and extraterminal domain -(BET) family proteins

Glossário:Glossary:

BET BET bromodomínio e domínio extraterminal bromodomain and domain extraterminal Bromodomain and extraterminal domain Bromodomain and extraterminal domain (BRD2) (BRD2) Proteína 2 contendo bromodomínio Protein 2 containing bromodomain Bromodomain-containing protein Bromodomain-containing protein (BRD3) (BRD3) Proteína 3 contendo bromodomínio Protein 3 containing bromodomain Bromodomain-containing protein 3 Bromodomain-containing protein 3 (BRD4) (BRD4) Proteína 4 contendo bromodomínio Protein 4 containing bromodomain Bromodomain-containing protein Bromodomain-containing protein (BRDT) (BRDT) Proteína específica de testículo de bromodomínio Bromodomain testis specific protein Bromodomain testisspecífíc protein Bromodomain testisspecific protein (KAc) (KAc) Lisina acetilada acetylated lysine Acetylated lysisne Acetylated lysisne MYC MYC Oncogenio MYC MYC oncogen Oncogene MYC MYC Oncogene (PSMA) (PSMA) antigénio de membrana específico da próstata prostate specific membrane antigen prostate-specific membrane antigen prostate-specific membrane antigen (AML) (AML) leucemia mieloblástica aguda leukemia acute myeloblastic acute myeloblastic leukemia acute myeloblastic leukemia (MLL) (MLL) ligando para a leucemia de linhagem mista linking to mixed lineage leukemia mixed-lineage leukemia mixed-lineage leukemia (ALL) (ALL) leucemia linfoblástica aguda leukemia acute lymphoblastic acute lymphoblastic leukemia acute lymphoblastic leukemia (GRPs) (GRPs) proteínas oncogénicas oncogenic proteins glucose-regulated proteins glucose-regulated proteins

reguladas pela glicose regulated by glucose (PC-3) (PC-3) Linha celular de cancro da próstata Prostate cancer cell line Prostate câncer cell line prostate cancer cell line (LHRH) (LHRH) hormona de libertação da hormona luteinizante luteinizing hormone releasing hormone Luteinizing hormonereleasing hormone Luteinizing hormonereleasing hormone (EGFR) (EGFR) recetor do factor de crescimento epidérmico epidermal growth factor receptor epidermal growth factor receptor epidermal growth factor receptor (HER-2) (HER-2) recetor do factor de crescimento epidérmico humano 2 human epidermal growth factor receptor 2 human epidermal growth factor receptor 2 human epidermal growth factor receptor 2 (MCF-7) (MCF-7) Linha celular de cancro da mama 7 da fundação para o cancro de Michigan Michigan Cancer Foundation Breast Cancer Cell Line 7 Michigan Câncer Foundation-7 cell line Michigan Cancer Foundation-7 cell line (C26) (C26) Linha celular de cancro do colon com expressão de glicoproteina mucinl Colon cancer cell line expressing mucinl glycoprotein mucinl-glycoproteinexpressing colon câncer cell line mucinl-glycoprotein expressing colon cancer cell line (H69AR) (H69AR) proteína transmembranar mucinl e ligandos para o carcinoma do pulmão de pequenas células mucinl transmembrane protein and ligands for small cell lung carcinoma human small cell lung carcinoma cell line human small cell lung carcinoma cell line (CD44) (CD44) Antigénio CD44 CD44 antigen antigene CD44 CD44 antigen (DUPA) (DUPA) ácido 2-[3-(1,3dicarboxipropil)ureido]pentanedióico 2-[3-(1,3dicarboxypropyl)ureido]pentanedioic acid 2- [3- (1,3dicarboxypropyl)ureido]pentanedioic acid 2- [3-(1,3dicarboxypropyl)ureido]pentanedioic acid (GPI) (GPI) glicosilfosfatidilin ositol ositol glycosylphosphatidyl glycosylphosphatidylino sitol glycosylphosphatidylino sitol (Lys- NHCONH- Glu) (Lys- NHCONH- Glu) Sequencia química Lisina-NHCONH-Ácido Glutâmico chemical sequence Lysine-NHCONH-Acid glutamic Chemical sequence Lysine-NHCONH-Glutamic acid chemical sequence Lysine-NHCONH-Glutamic acid (WQPDTAHHW ATL) (WQPDTAHHW ATL) Sequência de aminoácidos: sequence of amino acids: amino acid sequence Tryptophan, Glutamine, Proline, Aspartic acid, amino acid sequence Tryptophan, Glutamine, Proline, Aspartic acid,

Triptofano, glutamina, prolina, ácido aspártico, treonina, alanina, histidina, histidina, triptofano, alanina, treonina, leucina Tryptophan, glutamine, proline, aspartic acid, threonine, alanine, histidine, histidine, tryptophan, alanine, threonine, leucine Threonine, Alanine, Histidine, Histidine, Tryptophan, Alanine, Threonine, Leucine Threonine, Alanine, Histidine, Histidine, Tryptophan, Alanine, Threonine, Leucine (CYT-356) (CYT-356) anticorpo antibody antibody antibody (J591) (J591) anticorpo antibody antibody antibody (HAIYPRH) (HAIYPRH) Sequência de aminoácidos: Histidina, Alanina, Isoleucina, Tirosina, Prolina, Arginina, Histidina Amino Acid Sequence: Histidine, Alanine, Isoleucine, Tyrosine, Proline, Arginine, Histidine amino acid sequence: Histidine, Alanine, Isoleucine, Tyrosine, Proline, Arginine, Histidine amino acid sequence: Histidine, Alanine, Isoleucine, Tyrosine, Proline, Arginine, Histidine (siRNAs) (siRNAs) ácidos ribonucleicos pequenos interferentes ribonucleic acids small interferers small interfering ribonucleic acids small interfering ribonucleic acids (VC) (U) Dipeptideo valinacitrulina valinecitrulline dipeptide dipeptide valinecitruline dipeptide valinecitruline (PABC) (PABC) Estrutura química paminobenzilcarbamato Chemical structure paminobenzylcarbamate Chemical structure paminobenzylcarbamate Chemical structure paminobenzylcarbamate (PABQ) (PABQ) Estrutura química sal de amónio quaternário paminobenzilo Chemical structure Paminobenzyl quaternary ammonium salt Chemical structure paminobenzyl quaternary ammonium salt Chemical structure paminobenzyl quaternary ammonium salt (PEG) (PEG) Polietileno glicol polyethylene glycol polyethylene glycol polyethylene glycol (PAMPA) (PAMPA) Ensaio de permeabilidade em membrana artificial paralela Parallel artificial membrane permeability assay Parallel Membrane Permeability Assay Parallel Membrane Permeability Assay (BAZ2BA) (BAZ2BA) bromodomínio adjacente ao domínio zinco finger bromodomain adjacent to zinc finger domain Bromodomain adjacent to zinc finger domain protein 2B Bromodomain adjacent to zinc finger domain protein 2B 2B 2B Proteína 2B 2B protein 2B protein 2B protein (CREBP) cAMP (CREBP) cAMP Proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMPc cAMP response element binding protein response elementbinding protein response element binding protein

(PB1) (PB1) Proteína polimerase básica 1 Basic protein polymerase 1 Polymerase basic protein 1 Basic protein polymerase 1 (PCAF) P300/CBPassociated factor (PCAF) P300/CBPassociated factor Lisina acetiltransferase 2B lysine acetyltransferase 2B Also known as K(lysine) acetyltransfe rase 2B (KAT2B) Also known as K(lysine) acetyltransferase 2B (KAT2B) (ITC) (ITC) Calorimetria de titulação isotérmica Isothermal titration calorimetry Isothermal titration calorimetry Isothermal titration calorimetry FRET FRET Transferência de energia de ressonância por fluorescência Fluorescence resonance energy transfer Fluorescence Resonance Energy Transfer microscopy Fluorescence Resonance Energy Transfer Microscopy FAP FAP Ensaio de ligação anisotrópica fluorescente Anisotropic Fluorescent Binding Assay Fluorescence Anisotropy Binding Assay Fluorescence Anisotropy Binding Assay ITC ITC Calorimetria de titulação isotérmica Isothermal titration calorimetry Isothermal Titration Calorimetry Isothermal Titration Calorimetry Alphascree n AlphaScree n Ensaio homogéneo de proximidade luminescente amplificado Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay Bromoscan bromoscan Plataforma de ligação de inibidor de bromodomínio Bromodomain inhibitor binding platform : Novel Bromodomain Inhibitor Binding Platform : Novel Bromodomain Inhibitor Binding Platform SPR SPR Ressonância de plasmão de superfície surface plasmon resonance Surface Plasmon Resonance Surface Plasmon Resonance

A presente invenção refere-se a conjugados fármaco-ligando e a inibidores das proteínas da família bromodomínio e domínio extraterminal - (BET) modificados para uso na terapêutica do cancro.The present invention relates to drug-ligand conjugates and inhibitors of the bromodomain and extraterminal domain - (BET) family proteins for use in cancer therapy.

Fármacos direcionados para marcadores epigenéticos são uma classe emergente de agentes terapêuticos para o tratamento de cancro. Isto resulta do facto de haver um crescente avanço científico acerca dos mecanismos pós-traducionais em histonas e o respetivo impacto na carcinogénese e progressão tumoral.Drugs targeting epigenetic markers are an emerging class of therapeutic agents for the treatment of cancer. This results from the fact that there is a growing scientific advance on post-translational mechanisms in histones and their impact on carcinogenesis and tumor progression.

As proteínas da família bromodomínio e domínio extraterminal (BET) constituem reguladores epigenéticos de particular interesse como alvo biológico para o desenvolvimento de novas terapias anticancerígenas. Estas proteínas (BRD2-4 e BRDT) ligam-se à cromatina através do reconhecimento de lisinas acetiladas (KAc) presentes na cauda das histonas. Este reconhecimento por sua vez desencadeia o recrutamento e coactivação de factores de transcrição fundamentais para o desenvolvimento de neoplasias malignas, como por exemplo o oncogene MYC.The bromodomain and extraterminal domain (BET) family proteins are epigenetic regulators of particular interest as a biological target for the development of new anticancer therapies. These proteins (BRD2-4 and BRDT) bind to chromatin through the recognition of acetylated lysines (KAc) present in the histone tail. This recognition in turn triggers the recruitment and coactivation of transcription factors essential for the development of malignant neoplasms, such as the MYC oncogene.

A manipulação pré-clínica da actividade das proteínas BET em diversos modelos cancerígenos, através da inibição com compostos de baixo peso molecular, tem revelado alterações fenotípicas significativas e benefícios terapêuticos promissores. Por este motivo existe um grande número de inibidores de proteínas BET que têm sido analisados em ensaios clínicos para o tratamento de diversos tumores, incluindo tumores sólidos e hematológicos. Contudo, resultados preliminares dos primeiros ensaios clínicos têm revelado um efeito modesto destes compostos, com poucos pacientes a responder ao tratamento e respostas de curtaduração a serem observadas. Simultaneamente, efeitos secundários adversos significativos foram observados em diversos pacientes, e que incluíram por exemplo trombocitopenia persistente (baixa contagem de plaquetas no sangue), fadiga, problemas do trato gastrointestinal, náusea e vómitos, que limitam fortemente a adesão de pacientes ao tratamento.Preclinical manipulation of BET protein activity in different cancer models, through inhibition with low molecular weight compounds, has revealed significant phenotypic changes and promising therapeutic benefits. For this reason, there are a large number of BET protein inhibitors that have been analyzed in clinical trials for the treatment of various tumors, including solid and hematological tumors. However, preliminary results from early clinical trials have revealed a modest effect of these compounds, with few patients responding to treatment and short-lived responses to be observed. Simultaneously, significant adverse side effects were observed in several patients, which included for example persistent thrombocytopenia (low blood platelet count), fatigue, gastrointestinal tract problems, nausea and vomiting, which severely limit patients' adherence to treatment.

A entrega seletiva de fármacos tem sido aplicada a vários agentes terapêuticos em uso clínico. Esta estratégia consiste na ligação reversível de um agente terapêutico bem estabelecido com um ligando que é reconhecido por recetores presentes unicamente nas células alvo a serem tratadas. Esta estratégia demonstra grande potencial para maximizar a segurança e eficácia de agentes terapêuticos, uma vez que a entrega seletiva às células alvo evita a atividade nãoespecífica e tóxica em células saudáveis [1, e que pode resultar em doses máximas toleradas (DMT) mais elevadas. A maioria dos fármacos anticancerigenos são utilizados em doses próximas das DMT para produzirem num efeito terapêutico clinicamente significativo, o que limita significativamente a janela terapêutica destes compostos. [2]. Fármacos conjugados com ligandos devem produzir o mesmo efeito clinico a doses mais baixas do que os mesmos fármacos usados de forma isolada. A interação do ligando com o recetor nas células alvo, e consequente internalização favorece uma maior concentração de fármaco nestas células em comparação com células saudáveis que não apresentam recetores para o ligando [3] .Selective drug delivery has been applied to several therapeutic agents in clinical use. This strategy consists of reversibly binding a well-established therapeutic agent with a ligand that is recognized by receptors present uniquely on the target cells to be treated. This strategy demonstrates great potential for maximizing the safety and efficacy of therapeutic agents, since selective delivery to target cells prevents non-specific and toxic activity in healthy cells [1, which may result in higher maximum tolerated doses (DMT). Most anticancer drugs are used at doses close to DMT to produce a clinically significant therapeutic effect, which significantly limits the therapeutic window of these compounds. [two]. Drugs conjugated to ligands should produce the same clinical effect at lower doses than the same drugs used alone. The interaction of the ligand with the receptor on the target cells, and consequent internalization, favors a higher concentration of drug in these cells compared to healthy cells that do not have receptors for the ligand [3] .

A presente invenção apresenta conjugados fármaco-ligando que permitem a entrega seletiva de inibidores de BET a células cancerígenas de modo a que a eficácia é aumentada pela libertação localizada destes inibidores dentro células cancerígenas, poupando células saudáveis e efeitos tóxicos associados.The present invention features drug-ligand conjugates that allow selective delivery of BET inhibitors to cancer cells so that efficacy is increased by localized release of these inhibitors within cancer cells, sparing healthy cells and associated toxic effects.

A presente invenção também apresenta inibidores de BET modificados e pró-fármacos de inibidores de BET, que permitem alcançar a entrega seletiva de inibidores de BET.The present invention also features modified BET inhibitors and prodrugs of BET inhibitors, which allow achieving selective delivery of BET inhibitors.

A presente invenção apresenta um conjugado fármaco-ligando compreendendo:The present invention features a drug-ligand conjugate comprising:

a) um ligando seletivo para células alvo cancerígenas;a) a selective ligand for cancer target cells;

b) uma ponte clivável, eb) a cleavable bridge, and

c) um inibidor de BET.c) a BET inhibitor.

A presente invenção também apresenta um inibidor de BET modificado, um pró-farmaco de um inibidor de BET, um método de preparação de um conjugado fármaco ligando, o conjugado fármaco ligando para uso como medicamento, e um método de tratamento médico usando um conjugado de fármaco ligando.The present invention also provides a modified BET inhibitor, a prodrug of a BET inhibitor, a method of preparing a drug ligand conjugate, the drug ligand conjugate for use as a medicine, and a method of medical treatment using a drug ligand conjugate. drug binding.

A maior determinante para a entrega seletiva de fármacos reside na diferente expressão de recetores alvo em células não-saudáveis em comparação com células saudáveis. Exemplos de antigéneos/recetores que são altamente expressos em células cancerígenas incluem o recetor de folatos, antigénio de membrana específico da próstata {prostate-specific membrane antigen - PSMA) e transportador de glicose 1 [3].The major determinant for selective drug delivery lies in the different expression of target receptors in unhealthy cells compared to healthy cells. Examples of antigens/receptors that are highly expressed on cancer cells include the folate receptor, prostate-specific membrane antigen (PSMA) and glucose transporter 1 [3].

A enzima PSMA presente na superfície de células de cancro da próstata está sobre-expressada 1000 vezes em comparação com células saudáveis em que é minimamente detetada [l]e[4]..The PSMA enzyme present on the surface of prostate cancer cells is overexpressed 1000-fold compared to healthy cells where it is minimally detected [1]e[4].

Uma vez estabelecidos o critérios para a identificação de um recetor específico para uma doença, o ligando que será apropriado para ser um veículo de entrega seletiva de fármacos deve ser selecionado. Todos os ligandos atualmente em desenvolvimento clínico são caracterizados por uma alta afinidade e especificidade para o recetor alvo. Ligandos com uma afinidade para o alvo na gama de concentração de nanomolar são preferidos Kd < 10 nM [1]Once the criteria for identifying a specific receptor for a disease have been established, the ligand that will be appropriate to be a selective drug delivery vehicle must be selected. All ligands currently in clinical development are characterized by high affinity and specificity for the target receptor. Ligands with a target affinity in the nanomolar concentration range are preferred Kd < 10 nM [1]

Ligandos devem permitir o acoplamento de uma ponte clivável enquanto presevam a sua capacidade de se ligarem ao recetor alvo. As funcionalidades mais utilizadas para ligar ligandos a espaçadores ou pontes cliváveis incluem ácidos carboxílicos, aminas, álcoois, tióis e aldeídos [1].Ligands must allow the coupling of a cleavable bridge while preserving their ability to bind to the target receptor. The most commonly used functionalities to attach ligands to spacers or cleavable bridges include carboxylic acids, amines, alcohols, thiols and aldehydes [1].

ligando no conjugado fármaco-ligando da presente invenção pode compreender um ligando para o cancro. 0 ligando para o cancro pode compreender um ligando para o cancro da próstata, um ligando para o cancro cerebral, um ligando para o cancro da mama, um ligando para o cancro do colon, um ligando para o cancro do pâncreas, um ligando para o cancro do fígado, um ligando para o cancro do pulmão, um ligando para o cancro dos ovários, um ligando para o cancro do sangue como um ligando para o mieloma múltiplo, ligando para o linfoma de Burkitt, ligando para a leucemia mieloblástica aguda (AML),ligando para a leucemia de linhagem mista (MLL) ligando para a leucemia linfoblástica aguda(ALL), ou ligando para o cancro da medula óssea.ligand in the drug-ligand conjugate of the present invention may comprise a cancer ligand. The cancer ligand may comprise a prostate cancer ligand, a brain cancer ligand, a breast cancer ligand, a colon cancer ligand, a pancreatic cancer ligand, a liver cancer, a ligand for lung cancer, a ligand for ovarian cancer, a ligand for blood cancer as a ligand for multiple myeloma, ligand for Burkitt's lymphoma, ligand for acute myeloblastic leukemia (AML ), binding to mixed lineage leukemia (MLL), binding to acute lymphoblastic leukemia (ALL), or binding to bone marrow cancer.

Ligandos apropriados para o cancro da próstata incluem ligandos para o PSMA, ligandos para recetor de transferrina, ligandos para recetor de folatos, ligandos para proteínas oncogénicas reguladas pela glicose {glucose-regulated proteins - GRPs) em cancro da próstata (PC-3), ou ligandos para recetor da hormona de libertação da hormona luteinizante {luteinizing hormone-releasing hormone - LHRH). Por conseguinte, o conjugado fármaco-ligando da presente invenção pode compreender um ligando para o PSMA, ligando para recetor de transferrina, ligando para recetor de folatos, ligando para proteínas oncogénicas reguladas pela glicose {glucose-regulated proteins - GRPs) em cancro da próstata (PC-3), ou ligando para recetor da hormona de libertação da hormona luteinizante {luteinizing hormonereleasing hormone - LHRH) .Suitable ligands for prostate cancer include ligands for PSMA, ligands for transferrin receptor, ligands for folate receptor, ligands for oncogenic glucose-regulated proteins (GRPs) in prostate cancer (PC-3), or luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) receptor ligands. Therefore, the drug-ligand conjugate of the present invention may comprise a ligand for PSMA, ligand for transferrin receptor, ligand for folate receptor, ligand for oncogenic glucose-regulated proteins (GRPs) in prostate cancer (PC-3), or luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) receptor ligand.

Ligandos apropriados para o cancro do cérebro incluem ligandos para o recetor do factor de crescimento epidural {epidermal growth factor receptor - EGFR) do glioblastoma. Por conseguinte, o conjugado da presente invenção pode compreender um ligando para o recetor do factor de crescimento epidural (epidermal growth factor receptor EGFR) do glioblastoma.Suitable ligands for brain cancer include ligands for the glioblastoma epidermal growth factor receptor (EGFR). Accordingly, the conjugate of the present invention may comprise a ligand for the glioblastoma epidermal growth factor receptor (EGFR receptor).

Ligandos apropriados para o cancro da mama incluem ligandos para o recetor da hormona de libertação da hormona luteinizante (luteinizing hormone-releasing hormone - LHRH), ligandos para a N-acetilgalactosamina e galactose, ligandos para cancro com expressão do recetor do factor de crescimento epidermal humano 2 (Human epidermal growth factor 2 - HER2) ou ligando para o cancro da mama MCF-7. Por conseguinte, o conjugado da presente invenção pode compreender um ligando para o ligando para o recetor da hormona de libertação da hormona luteinizante (luteinizing hormone-releasing hormone - LHRH) , ligando para a N-acetilgalactosamina e galactose, ligando para cancro com expressão do recetor do factor de crescimento epidermal humano 2 (Human epidermal growth factor 2 - HER-2) ou ligando para o cancro da mama MCF-7.Suitable ligands for breast cancer include ligands for the luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) receptor, ligands for N-acetylgalactosamine and galactose, ligands for cancer with epidermal growth factor receptor expression human 2 (Human epidermal growth factor 2 - HER2) or breast cancer ligand MCF-7. Accordingly, the conjugate of the present invention may comprise a ligand for the ligand for the luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) receptor, ligand for N-acetylgalactosamine and galactose, ligand for cancer with expression of the human epidermal growth factor 2 receptor (HER-2) or breast cancer ligand MCF-7.

Ligandos apropriados para o cancro do colon incluem ligandos para o cancro EGFR colorectal e ligandos para o cancro do colon (C26) com expressão de glicoproteina mucinl. Por conseguinte, o conjugado da presente invenção pode compreender um ligando para o cancro EGFR colorectal ou ligando para o cancro do colon (C26) com expressão de glicoproteina mucin 1.Suitable colon cancer ligands include colorectal cancer ligands EGFR and colon cancer ligands (C26) expressing mucinl glycoprotein. Accordingly, the conjugate of the present invention may comprise an EGFR colorectal cancer ligand or colon cancer ligand (C26) expressing mucin 1 glycoprotein.

Ligandos apropriados para o cancro do pulmão incluem ligandos para a proteína transmembranar mucinl e ligandos para o carcinoma do pulmão de pequenas células (human small cell lung carcinoma - H69AR) . Por conseguinte, o conjugado da presente invenção pode compreender um ligando para a proteína transmembranar mucin 1 e ligandos para o carcinoma do pulmão de pequenas células (human small cell lung carcinoma H69AR) .Suitable ligands for lung cancer include ligands for the transmembrane protein mucinl and ligands for human small cell lung carcinoma (H69AR). Therefore, the conjugate of the present invention may comprise a ligand for the mucin 1 transmembrane protein and ligands for human small cell lung carcinoma H69AR.

Ligandos apropriados para o cancro dos ovários incluem ligandos para o antigénio CD44+. Por conseguinte, o conjugado da presente invenção pode compreender um ligando para o antigénio CD44+.Suitable ligands for ovarian cancer include ligands for the CD44+ antigen. Therefore, the conjugate of the present invention may comprise a ligand for the CD44+ antigen.

Ligandos apropriados para o cancro do sangue incluem ligandos para leucemia com expressão de recetores para o folato. Por conseguinte, o conjugado da presente invenção pode compreender um ligando para a leucemia com expressão de recetores para o folato.Suitable blood cancer ligands include leukemia ligands expressing folate receptors. Therefore, the conjugate of the present invention may comprise a leukemia ligand expressing folate receptors.

Ligandos apropriados para o PSMA incluem pequenas moléculas (ex: ácido 2-[3-(1,3-dicarboxipropil)-ureido]pentanedióico (DUPA), glicosilfosfatidilinositol (GPI), péptidos (ex: LysNHCONH-Glu) e aptâmeros (ex: WQPDTAHHWATL)) e anticorpos monoclonais (ex: CYT-356 e J591). Por conseguinte, o conjugado da presente invenção pode compreender DUPA, GPI, Lys-NHCONH-Glu, WQPDTAHHWATL, CYT-356 ou J591.Suitable ligands for PSMA include small molecules (eg, 2-[3-(1,3-dicarboxypropyl)-ureido]pentanedioic acid (DUPA), glycosylphosphatidylinositol (GPI), peptides (eg, LysNHCONH-Glu) and aptamers (eg: WQPDTAHHWATL)) and monoclonal antibodies (eg CYT-356 and J591). Therefore, the conjugate of the present invention may comprise DUPA, GPI, Lys-NHCONH-Glu, WQPDTAHHWATL, CYT-356 or J591.

Ligandos apropriados para todos os cancros com expressão de recetores de folatos incluem ácido fólico.Suitable ligands for all folate receptor-expressing cancers include folic acid.

Ligandos apropriados para recetores de transferrina incluem transferrina, péptido HAIYPRH (T7) e anticorpos monoclonais (ex: 8D3 e RI7-217).Suitable ligands for transferrin receptors include transferrin, HAIYPRH peptide (T7) and monoclonal antibodies (eg, 8D3 and RI7-217).

Ligandos apropriados para oncogenes GRPs em células PC-3 incluem siRNAs.Appropriate ligands for GRPs oncogenes in PC-3 cells include siRNAs.

Ligandos apropriados para recetores LHRH incluem LHRH e (DLys6) - LHRH.Suitable ligands for LHRH receptors include LHRH and (DLys 6 )-LHRH.

Ligandos apropriados para recetores EGFR incluem EGFR e anticorpos EGFRvIII.Suitable ligands for EGFR receptors include EGFR and EGFRvIII antibodies.

Ligandos apropriados para N-acetil-galactosamina e Dgalactose incluem aglutinina de soja.Suitable ligands for N-acetyl-galactosamine and D-galactose include soy agglutinin.

Ligandos para cancro da mama com expressão de recetores HER2 incluem anticorpos HER-2.Ligands for breast cancer expressing HER2 receptors include HER-2 antibodies.

Ligandos apropriados para cancros da mama MCF-7 incluem ácido fólico.Suitable ligands for MCF-7 breast cancers include folic acid.

Ligandos apropriados para o cancro do colon C26 incluem aptâmeros (ex: 5TR1).Suitable ligands for C26 colon cancer include aptamers (eg, 5TR1).

Ligandos apropriados para a proteína transmembranar mucinl incluem aptâmeros.Suitable ligands for the mucinl transmembrane protein include aptamers.

Ligandos apropriados para o carcinoma do pulmão de pequenas células (human small cell lung carcinoma - H69AR) incluem péptidos (ex. JB434).Suitable ligands for human small cell lung carcinoma (H69AR) include peptides (eg JB434).

Ligandos apropriados para o CD44+ incluem ácido hialurónico.Suitable ligands for CD44+ include hyaluronic acid.

Enquanto o objetivo do ligando é garantir que o conjugado fármaco ligando é transportado para as células alvo, o objetivo da ponte clivável é assegurar que o fármaco permanece acoplado ao ligando enquanto em circulação pelo organismo, mas que é prontamente libertado nas células alvo. A libertação do fármaco acontece com um evento especifico nas células alvo que leva a uma cascata de reações e consequente libertação do fármaco na sua forma ativa.While the purpose of the ligand is to ensure that the ligand-drug conjugate is transported to the target cells, the purpose of the cleavable bridge is to ensure that the drug remains coupled to the ligand while circulating in the body, but is readily released into the target cells. Drug release happens with a specific event in the target cells that leads to a cascade of reactions and consequent drug release in its active form.

Pontes cliváveis podem compreender uma estrutura clivável, opcionalmente em combinação com uma união química que permite a libertação do fármaco na sua forma ativa.Cleavable bridges may comprise a cleavable structure, optionally in combination with a chemical linkage that allows release of the drug in its active form.

evento de ativação da ponte clivável, e consequente libertação do fármaco, pode compreender uma clivagem proteolitica dentro de lisossomas ou clivagem redutiva no citosol celular.cleavable bridge activation event, and consequent drug release, may comprise a proteolytic cleavage within lysosomes or reductive cleavage in the cellular cytosol.

A utilização de pontes cliváveis sensíveis a atividade proteolitica exploram a expressão significativamente aumentada dessas enzimas nas células alvos, em comparação com células saudáveis, o que contribui para um mecanismo de libertação controlado.The use of cleavable bridges sensitive to proteolytic activity exploits the significantly increased expression of these enzymes in target cells compared to healthy cells, which contributes to a controlled release mechanism.

dipeptídeo valina-citrulina (VC) tem sido frequentemente incluído em pontes cliváveis em aplicações para células cancerígenas, uma vez que está bem estabelecido a sua ativação por protéases do lisossoma, particularmente pela catepsina B, uma protéase de cisteína altamente expressa numa variedade de cancros [5]. Outros dipeptídeos sensíveis à catepsina B incluem os dipeptídeos fenilalaniana-arginina, fenilalanina-lisina e valina-alanina.The valine-citrulline dipeptide (VC) has been frequently included in cleavable bridges in cancer cell applications, as its activation by lysosomal proteases, particularly by cathepsin B, a cysteine protease highly expressed in a variety of cancers, is well established [ 5]. Other cathepsin B-sensitive dipeptides include the phenylalanine-arginine, phenylalanine-lysine, and valine-alanine dipeptides.

Outros tipos de estruturas utilizadas em pontes cliváveis incluem funções dissulfato, funções hidrazona (tais como hidrazona acetil butirato) e estruturas sensíveis à glicosidase (que podem ser ativadas por enzimas como a βgalactosidase.Other types of structures used in cleavable bridges include disulfate functions, hydrazone functions (such as hydrazone acetyl butyrate) and glycosidase sensitive structures (which can be activated by enzymes such as βgalactosidase.

A união p-aminobenzilcarbamato (PABC) ter sido extensivamente utilizada em pontes cliváveis de conjugados fármaco anticorpo, mas apresentam desvantagens associadas à sua natureza hidrofóbica. Grupos de amónia quaternária têm sido explorados como forma de melhorar a solubilidade e reduzir agregação de pequenos péptidos ou proteínas. A combinação deste conhecimento levou ao desenvolvimento de um sal de amónia quaternária de p-aminobenzilo (PABQ) para a libertação controlada e limpa de fármacos em conjugados.The p-aminobenzylcarbamate (PABC) linkage has been used extensively in cleavable bridges of drug-antibody conjugates, but has disadvantages associated with its hydrophobic nature. Quaternary ammonium groups have been explored as a way to improve solubility and reduce aggregation of small peptides or proteins. The combination of this knowledge has led to the development of a p-aminobenzyl quaternary ammonium salt (PABQ) for the controlled and clean release of drugs in conjugates.

Desta forma, a ponte clivável no conjugado fármaco ligando da presente invenção pode compreender uma estrutura PABQ e VC ou PABC e VC.Thus, the cleavable bridge in the drug-ligand conjugate of the present invention may comprise a structure PABQ and VC or PABC and VC.

Adicionalmente, o conjugado fármaco ligando da presente invenção pode compreender um espaçador. Espaçadores são utilizados para separar fisicamente o ligando da estrutura da ponte clivável que será ativada nas células alvo, reduzindo assim o impedimento estérico que poderia dificultar a ação da enzima responsável pela ativação da ponte clivável, e como tal facilitando a entrega do fármaco nas células alvo. Espaçadores adequados incluem cadeias alquilicas como cadeia propilo ou pentilo, cadeia de polietilenoglicol (PEG) como uma cadeia de PEG com 5 ou 8 átomos.Additionally, the drug ligand conjugate of the present invention may comprise a spacer. Spacers are used to physically separate the ligand from the cleavable bridge structure that will be activated in the target cells, thus reducing the steric hindrance that could hamper the action of the enzyme responsible for the cleavable bridge activation, and as such facilitating drug delivery to the target cells. . Suitable spacers include alkyl chains such as propyl or pentyl chain, polyethylene glycol (PEG) chain such as a 5 or 8 atom PEG chain.

Vários inibidores de BET estão em fase I ou II de desenvolvimento clinico para doentes com tumores sólidos e hematológicos. Apesar dos resultados disponíveis à data são preliminares, muitos dos compostos apresentam potencial para tratar vários tipos de cancros incluindo I--BET762 (CAS: 1260907-17-2), (+)-JQ1 (CAS: 1268524-70-4), MS417 (CAS: 916489-36-6), OXT015, (2), RVX-208, (3), OXFBD02, OXFBD03, I-BET151 (CAS: 1300031-49-5), (4), PFI-1 (CAS: 1403764-726), I-BET726 (CAS: 2010159-45-0), MS436 (CAS: 1395084-25-9) ou XD14.Several BET inhibitors are in phase I or II clinical development for patients with solid and hematologic tumors. Although the results available to date are preliminary, many of the compounds have the potential to treat various types of cancers including I--BET762 (CAS: 1260907-17-2), (+)-JQ1 (CAS: 1268524-70-4), MS417 (CAS: 916489-36-6), OXT015, (2), RVX-208, (3), OXFBD02, OXFBD03, I-BET151 (CAS: 1300031-49-5), (4), PFI-1 ( CAS: 1403764-726), I-BET726 (CAS: 2010159-45-0), MS436 (CAS: 1395084-25-9) or XD14.

Í-BET7S2 (t)I-BET7S2 (t)

ΒΚΒΛΠΩ) 1¾ = 36 nM (PRET) {+)JQ1; R = O^UΒΚΒΛΠΩ) 1¾ = 36 nM (PRET) {+)JQ1; R = O^U

BRD40) sCK! = 77 nMBRD40) sC K! = 77 nM

BRD4(1) 1¾ = 1800 nM (FRET) SRD4U) Kg = HE® ΠΜ (/TC) BRQ4(2} iCgg = 4-0 rsM ;ΓκΓΓ;BRD4(1) 1¾ = 1800 nM (FRET) SRD4U) Kg = HE® ΠΜ (/TC) BRQ4(2} iCgg = 4-0 rsM ;ΓκΓΓ;

BRD4U) KD = MO RM (/TQBRD4U) K D = MO RM (/TQ

MS417; R = OMe SRD4(1) KS3 = 30 nM (FAP) OTX01S; R = WR-í4-fty<#foxy.ipftenyíMS417; R = OMe SRD4(1) K S3 = 30 nM (FAP) OTX01S; R = WR-í4-fty<#foxy.ipftenyí

OFXBD32: R = HOFXBD32: R = H

BRD4{1) ÍCgo = 382 nMBRD4{1) ICgo = 382 nM

OXFBDS3; R » AcOXFBDS3; R » Ac

BRQ4nHC5C = 371 rMBRQ4nHC 5C = 371 rM

i-BETISt ^02(1/2) ICgQ = 36 nM fFAP}i-BETIst ^02(1/2) ICgQ = 36 nM fFAP}

BRD4(1/2) KD = 100 nM (SPR) (4)BRD4(1/2) K D = 100 nM (SPR) (4)

BRD2(WCS0 = 500 nM íFPET)BRD2(WC S0 = 500 nM IFPET)

PFMPFM

I-BET726I-BET726

BRD40/2) ICgo = 22 nM (FRE7}BRD40/2) ICgo = 22 nM (FRE7}

MS43SMS43S

BRD4ÍN KLí c 85 nM (FAP)BRD4IN K Li c 85 nM (FAP)

BRD4(2) KD = 340 rM (FAP)BRD4(2) K D = 340 rM (FAP)

XD14XD14

BRD4Í1 }KD= 160 ΠΜ (BPOArasca»; BRD4(1) Kd = 237 nM (FAP) inibidor de BET no conjugado fármaco ligando da presente invenção pode compreender um dos inibidores de BET listados ou uma versão modificada de um dos inibidores de BET listados, opcionalmente uma versão modificada do I-BET762. I-BET762 mostra alta afinidade para as proteínas alvo, alta solubilidade em meio fisiológico, baixa ligação a proteínas do plasma, boa permeabilidade passiva, excelente estabilidade metabólica e ausência de imunogenicidade [6]e [7] .BRD4I1 }K D = 160 ΠΜ (BPOArasca»; BRD4(1) Kd = 237 nM (FAP) BET inhibitor in the drug ligand conjugate of the present invention may comprise one of the listed BET inhibitors or a modified version of one of the BET inhibitors listed, optionally a modified version of I-BET762. I-BET762 shows high affinity for target proteins, high solubility in physiological media, low binding to plasma proteins, good passive permeability, excellent metabolic stability and absence of immunogenicity [6]e [7] .

Para permitir o acoplamento de pontes cliváveis a um fármaco, este deve ser funcionalizado para incluir um grupo funcional como um hidroxilo, carboxilo, amina, carbonilo ou tiol. Desta forma, a modificação de inibidores de BET conhecidos pode compreender a funcionalização do inibidor de BET.To allow coupling of cleavable bridges to a drug, the drug must be functionalized to include a functional group such as a hydroxyl, carboxyl, amine, carbonyl, or thiol. In this way, modification of known BET inhibitors may comprise functionalization of the BET inhibitor.

inibidor de BET modificado da presente invenção compreende um inibidor de BET e uma amina terciária terminal. A amina terciária terminal pode compreender um anel piperidina ligado a uma amina terciária terminal, ou um anel de piperazina ligado a uma amina terciária terminal. A consequente formação de uma amina quaternária na amina terciária terminal, reduz a labilidade do inibidor de BET, formando desta forma um pró-fármaco. Desta forma, o profármaco da presente invenção compreende um inibidor de BET e uma amina quaternária. A amina quaternária pode compreender uma alquilamina quaternária ou uma anilina quaternária.The modified BET inhibitor of the present invention comprises a BET inhibitor and a terminal tertiary amine. The terminal tertiary amine may comprise a piperidine ring attached to a terminal tertiary amine, or a piperazine ring attached to a terminal tertiary amine. The consequent formation of a quaternary amine at the terminal tertiary amine, reduces the lability of the BET inhibitor, thus forming a prodrug. Thus, the prodrug of the present invention comprises a BET inhibitor and a quaternary amine. The quaternary amine may comprise a quaternary alkylamine or a quaternary aniline.

inibidor de BET modificado da presente invenção pode compreender derivados do I-BET762. Como tal, o inibidor de BET modificado da presente invenção pode compreender o RT48 ( (S) -2- (6- (4-clorofenil) -8-metoxi-l-metil-42í-benzo [f] [1,2,4] triazolo [4,3-a] [1,4] diazepin-4-il)-1-(4(dimethilamino) piperidin-l-il) etan-l-ona) ou RT53 ( (S) 2- (6- (4-clorofenil) -8-metoxi-l-metil-42í-benzo [í] [1,2,4] triazolo [4,3-a] [1,4] diazepin-4-il) -N- (4- (4(dimetilamino) piperidin-l-il) fenil) acetamida):The modified BET inhibitor of the present invention may comprise derivatives of I-BET762. As such, the modified BET inhibitor of the present invention may comprise RT48((S)-2-(6-(4-chlorophenyl)-8-methoxy-1-methyl-42β-benzo[f][1,2, 4] triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-4-yl)-1-(4(dimethylamino)piperidin-1-yl)ethan-1-one) or RT53((S)2-( 6-(4-Chlorophenyl)-8-methoxy-1-methyl-42β-benzo[1][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-4-yl)-N -(4-(4(dimethylamino)piperidin-1-yl)phenyl)acetamide):

pró-fármaco da presente invenção pode compreender derivados de amónia quaternária do RT48 ( (S) -2- (6- (4clorofenil) -8-metoxi-l-metil-4H-benzo[f] [1,2,4] triazolo [4,3-a] [1,4] diazepin-4-il)-1-(4-(dimethilamino) piperidin-l-il) etan-l-ona) ou RT53 ((S) -2- (6- (4clorofenil) -8-metoxi-l-metil-4H-benzo[f] [1,2,4] triazolo [4,3-a] [1,4] diazepin-4-il) -N- (4- (4- (dimetilamino) piperidin-l-il) fenil) acetamida).prodrug of the present invention may comprise quaternary ammonium derivatives of RT48((S)-2-(6-(4chlorophenyl)-8-methoxy-1-methyl-4H-benzo[f][1,2,4]triazole [4,3-a][1,4]diazepin-4-yl)-1-(4-(dimethylamino)piperidin-1-yl)ethan-1-one) or RT53 ((S)-2-(6 -(4chlorophenyl)-8-methoxy-1-methyl-4H-benzo[f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-4-yl)-N-(4 -(4-(dimethylamino)piperidin-1-yl)phenyl)acetamide).

A presente invenção também apresenta ainda um método para preparar um conjugado fármaco ligando de acordo com a presente invenção, onde o método compreende:The present invention also further provides a method of preparing a drug ligand conjugate according to the present invention, wherein the method comprises:

i) funcionalização um inibidor de BET com uma amina terciária para formar um inibidor de BET modificado de acordo com a presente invenção;i) functionalizing a BET inhibitor with a tertiary amine to form a modified BET inhibitor in accordance with the present invention;

ii) ligar o inibidor de BET modificado formado no passo i) a uma ponte clivável;ii) linking the modified BET inhibitor formed in step i) to a cleavable bridge;

iii) ligar a ponte clivável ligada ao inibidor de BET modificado formado no passo ii) ao ligando.iii) linking the cleavable bridge linked to the modified BET inhibitor formed in step ii) to the ligand.

passo i) pode compreender a reação de condensação entre um percursor de um inibidor de BET com um ácido carboxilico e um composto compreendendo uma amina primária ou secundária e uma amina terciária terminal. A amina primária ou secundária pode reagir com o grupo ácido carboxilico para que o inibidor de BET modificado formado compreenda uma amina terciária terminal.step i) may comprise the condensation reaction between a precursor of a BET inhibitor with a carboxylic acid and a compound comprising a primary or secondary amine and a terminal tertiary amine. The primary or secondary amine can be reacted with the carboxylic acid group so that the modified BET inhibitor formed comprises a terminal tertiary amine.

passo ii) pode compreender a alquilação do derivado do inibidor de BET modificado formado no passo i) para formar um composto compreendendo uma amina quaternária.step ii) may comprise alkylating the modified BET inhibitor derivative formed in step i) to form a compound comprising a quaternary amine.

passo iii) pode compreender a reação de condensação entre a ponte clivável ligada ao inibidor de BET modificado formado no passo ii) e um ligando, em que a ponte clivável ligada ao inibidor de BET modificado compreende uma amina primária e o ligando compreende um grupo ácido carboxilico.step iii) may comprise the condensation reaction between the cleavable bridge linked to the modified BET inhibitor formed in step ii) and a ligand, wherein the cleavable bridge linked to the modified BET inhibitor comprises a primary amine and the ligand comprises an acid group carboxylic.

conjugado fármaco ligando da presente invenção pode ser utilizado como medicamento. Opcionalmente, o conjugado fármaco ligando pode ser utilizado para o tratamento de cancros incluindo cancro da próstata, cancro cerebral, cancro da mama, cancro do cólon, cancro do pâncreas, cancro do fígado, cancro do pulmão, cancro dos ovários, cancro sanguíneo como mieloma múltiplo, linfoma de Burkitt, leucemia mieloblástica aguda, leucemia de linhagem mista leucemia linfoblástica aguda, ou cancro da medula óssea.drug ligand conjugate of the present invention can be used as a medicine. Optionally, the drug ligand conjugate can be used for the treatment of cancers including prostate cancer, brain cancer, breast cancer, colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer, lung cancer, ovarian cancer, blood cancer such as myeloma multiple, Burkitt's lymphoma, acute myeloblastic leukemia, mixed lineage leukemia, acute lymphoblastic leukemia, or bone marrow cancer.

conjugado fármaco ligando da presente invenção pode ser utilizado num método para tratamento médico. Opcionalmente, o conjugado fármaco ligando pode ser utilizado num método de tratamento de cancros incluindo o cancro da próstata, cancro cerebral, cancro da mama, cancro do cólon, cancro do pâncreas, cancro do fígado, cancro do pulmão, cancro dos ovários, cancro sanguíneo como mieloma múltiplo, linfoma de Burkitt, leucemia mieloblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda, ou cancro da medula óssea.drug ligand conjugate of the present invention can be used in a method for medical treatment. Optionally, the drug ligand conjugate can be used in a method of treating cancers including prostate cancer, brain cancer, breast cancer, colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer, lung cancer, ovarian cancer, blood cancer such as multiple myeloma, Burkitt's lymphoma, acute myeloblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, or bone marrow cancer.

Descrição das figurasDescription of figures

Figura 1 Afinidade de ligação das sondas fluorescentes 19, 20 e 21 (comparado à referência I-BET762) a proteínas BET: A) BRD2(1); B) BRD3(1); C) BRD4(1) e D) BRD4(2).Figure 1 Binding affinity of fluorescent probes 19, 20 and 21 (compared to reference I-BET762) to BET proteins: A) BRD2(1); B) BRD3(1); C) BRD4(1) and D) BRD4(2).

Figura 2 Análise de microscopia confocal da taxa de internalização dos compostos 21 (e-h) e 22 (a-d) com e sem disrupção da membrana, (ampliação 40x; Verde: fluoresceina; cinzento: luz transmitida).Figure 2 Confocal microscopy analysis of the internalization rate of compounds 21 (e-h) and 22 (a-d) with and without membrane disruption, (40x magnification; Green: fluorescein; gray: transmitted light).

Figura 3: Ensaio de desvio da estabilidade proteica (Fluorimetria varrimento diferencial, DSF) no estudo da eficácia e selectividade de ligação a diferentes famílias de bromodominios. A imagem apresenta desvios de temperatura médios (ATmobs) em graus Celsius após a ligação dos compostos (RT20, RT48, RT53 e RT56 comparados com a referência JQ1) a uma concentração final de 10 μΜFigure 3: Protein stability shift assay (Differential Scanning Fluorimetry, DSF) in the study of efficacy and selectivity of binding to different families of bromodomains. The image shows mean temperature deviations (ATmobs) in degrees Celsius after binding of compounds (RT20, RT48, RT53 and RT56 compared to reference JQ1) at a final concentration of 10 μΜ

Figura 4 Afinidade de ligação dos compostos RT48, RT20 e RT56 (comparado à referência I-BET762) a proteínas BET: A) BRD2(1); B) BRD3(1); C) BRD4(1) e D) BRD4(2)Figure 4 Binding affinity of compounds RT48, RT20 and RT56 (compared to reference I-BET762) to BET proteins: A) BRD2(1); B) BRD3(1); C) BRD4(1) and D) BRD4(2)

Figura 5 Análise de calorimetria de titulação isotérmica dos compostos (A) RT53 e (B) RT56 contra BRD4(2) . A imagem apresenta a progressão temporal do calor de injeção (painel superior) e as entalpias de ligação normalizadas.Figure 5 Isothermal titration calorimetry analysis of compounds (A) RT53 and (B) RT56 against BRD4(2). The image shows the temporal progression of heat of injection (top panel) and normalized binding enthalpies.

Figura 6: Mapeamento dos valores de IC50 obtidos para o I_BET762, RT53, TR48 e RT56 contra linhas celulares de cancro de diferentes tecidos. Vermelho representa sensibilidade aos compostos e azul indica resistênciaFigure 6: Mapping of IC50 values obtained for I_BET762, RT53, TR48 and RT56 against cancer cell lines from different tissues. Red represents sensitivity to compounds and blue indicates resistance

Figura 7: Libertação controlada do RT53 do conjugado VCPABQ-RT53 na presença de catepsina B até 18 h. A análise foi feita por HPLC e os compostos confirmados por LC-MS com coinjeção de padrões puros. A estrela indica o pico do dipeptideo VC.Figure 7: Controlled release of RT53 from the VCPABQ-RT53 conjugate in the presence of cathepsin B up to 18 h. Analysis was performed by HPLC and compounds confirmed by LC-MS with pure standard co-injection. The star indicates the peak of the VC dipeptide.

Figura 8: Taxa de libertação do RT53 na presença de catepsina B, estimado pela área do pico (mAU*s) dividido pela soma do composto livre com os conjugados, fármaco-ligando.Figure 8: Rate of release of RT53 in the presence of cathepsin B, estimated by the peak area (mAU*s) divided by the sum of free compound and drug-ligand conjugates.

Figura 9: Eficácia terapêutica do conjugado in vivo. Células LNCaP foram implantadas em ratinho por administração subcutânea e o veículo ou compostos foram administrados de forma intravenosa a uma concentração de 12 mg/kg. Estão representados o volume médio do tumor ± desvio padrão (A) e o peso médio do tumor ± desvio padrão (B). A significância estatística foi determinada por uma análise ANOVA seguido de um teste de comparações múltiplas de Dunnet's. ** valor-p ajustado < 0.01; **** valor-p ajustado < 0.0001.Figure 9: Therapeutic efficacy of the conjugate in vivo. LNCaP cells were implanted into mice by subcutaneous administration and the vehicle or compounds were administered intravenously at a concentration of 12 mg/kg. Mean tumor volume ± standard deviation (A) and mean tumor weight ± standard deviation (B) are plotted. Statistical significance was determined by an ANOVA analysis followed by a Dunnet's multiple comparison test. ** adjusted p-value < 0.01; **** adjusted p-value < 0.0001.

Figura 10 Progressão no peso médio dos ratinhos tratados com os compostosFigure 10 Progression in mean weight of mice treated with compounds

ExemplosExamples

Exemplo 1: Validação do local de conjugação com derivados fluorescentes do I-BET762Example 1: Conjugation site validation with fluorescent derivatives of I-BET762

Ο I-BET762 foi funcionalizado quimicamente com substituintes volumosos para confirmar que o local de conjugação do fármaco podia ser derivatizado mantendo as características de interação ligando-recetor. A fluoresceína foi utilizada como estrutura modelo para ligar ao I-BET762 através de espaçadores diamina com diferentes tamanhos. Os espaçadores diamina foram preparados através de uma simples proteção com grupo protetor t—butiloxicarbonilo (BOC) como representado na imagem em baixo:Ο I-BET762 was chemically functionalized with bulky substituents to confirm that the drug conjugation site could be derivatized while maintaining the characteristics of ligand-receptor interaction. Fluorescein was used as a template structure to bind to I-BET762 through diamine spacers of different sizes. The diamine spacers were prepared through a simple protection with t-butyloxycarbonyl (BOC) protecting group as shown in the image below:

13, R® (63%)13, R® (63%)

14, r ~ ρΰ%)14, r ~ ρΰ%)

15. ·<15. ·<

Os espaçadores utilizados incluem uma simples cadeia de propilo (13) , unidade de PEG com 5 átomos (14) e unidade de PEG com 8 átomos (15). Estas estruturas foram consideradas devido às suas propriedades distintas em modular a atividade do conjugado. De forma geral, estruturas mais longas são preferíveis para substituintes mais volumosos, enquanto que cadeias de PEG de tamanho diferentes podem contribuir para a hidrofilicidade do conjugado [3]).Spacers used include a single propyl chain (13), 5-atom PEG unit (14) and 8-atom PEG unit (15). These structures were considered due to their distinct properties in modulating conjugate activity. In general, longer structures are preferable for bulkier substituents, while PEG chains of different length may contribute to the hydrophilicity of the conjugate [3]).

Foram preparados três ligandos distintos baseados no IBET762 e acoplados a um fluoróforo através da proteção de uma das aminas primárias do espaçador diamina com um grupo BOC e depois com um acoplamento da amina livre com o ácido carboxilico do percurso I-BET762 12 para produzir os compostos intermediários 16, 17 e 18 representados em baixo. Estes compostos intermediários foram depois desprotegidos e a correspondente amina livre conjugada com um derivado da fluoresceina carregando um grupo éster N-hidroxisuccinimida (NHS-éster) para produzir os conjugados de fluoresceina 19, 20 e 21 também representados em baixo.Three distinct ligands based on IBET762 and coupled to a fluorophore were prepared by protecting one of the primary amines of the diamine spacer with a BOC group and then coupling the free amine with the carboxylic acid of the I-BET762 12 pathway to produce the compounds intermediates 16, 17 and 18 shown below. These intermediate compounds were then deprotected and the corresponding free amine conjugated to a fluorescein derivative bearing an N-hydroxysuccinimide ester (NHS-ester) group to produce the fluorescein conjugates 19, 20 and 21 also shown below.

CSCS

16,A =composto 13 (45%)16.A = compound 13 (45%)

17,A =composto 14 (75%)17.A = compound 14 (75%)

18,A =composto 15 (56%)18.A = compound 15 (56%)

Como controle negativo nos estudos biológicos, uma sonda sem a estrutura do I-BET762 (22) foi também sintetizada como representado em baixo:As a negative control in the biological studies, a probe lacking the I-BET762 structure (22) was also synthesized as shown below:

ComDosto 15ComDosto 15

Uma vez preparadas as sondas fluorescentes, purificadas e caracterizadas estas foram avaliadas quanto à sua afinidade para proteínas do bromodomínio BET. Isto incluiu estabelecer a afinidade dos compostos para módulos BET BRD2(1), BRD3(1), BRD4(1) e BRD4(2) usando tecnologia AlphaScreen como método de deteção. (Os ensaios de ligação específica AlphaScreen foram executados em Cerep, Celle l'Evescault, France.) Os dados obtidos sugerem que de uma forma geral os compostos foram capazes de se ligar eficientemente às proteínas alvo apesar da presença do substituinte volumoso - fluoresceína. Todos os compostos mostraram maior consistência na ligação às proteínas BRD4(1) e BRD4(2). No entanto, foi observado que a potência de ligação tinha uma clara redução para ambas as proteínas. Este resultado foi evidente para todos os compostos na ligação à proteína BRD4(2) com um decréscimo de 6 a 10 vezes em comparação com ο I-BET762 (IC50 = 0.3 μΜ) , e para os compostos fluorescentes com espaçadores PEG 21 (IC50 = 2.77 μΜ, decréscimo de 7 vezes) e 20 (IC50 = 5.22 μΜ, decréscimo de 12 vezes) na proteína BRD4(1) (Figura 1) . Surpreendentemente, o composto 19 compreendendo uma simples cadeia de propilo como separador mostrou ligar-se com alta afinidade à proteína BRD4(1) (IC50 = 0.85 μΜ) . No entanto, quando analisando a afinidade dos compostos para as várias proteínas não se concluiu qualquer correlação entre a estrutura química dos espaçadores e a potência de ligação.Once the fluorescent probes were prepared, purified and characterized, they were evaluated for their affinity for BET bromodomain proteins. This included establishing the affinity of compounds for BET modules BRD2(1), BRD3(1), BRD4(1) and BRD4(2) using AlphaScreen technology as the detection method. (AlphaScreen specific binding assays were performed at Cerep, Celle l'Evescault, France.) The data obtained suggest that in general the compounds were able to bind efficiently to the target proteins despite the presence of the bulky substituent - fluorescein. All compounds showed greater consistency in binding to BRD4(1) and BRD4(2) proteins. However, binding potency was observed to have a clear reduction for both proteins. This result was evident for all compounds in binding to the BRD4(2) protein with a 6- to 10-fold decrease compared to ο I-BET762 (IC50 = 0.3 μΜ), and for the fluorescent compounds with PEG 21 spacers (IC50 = 2.77 μΜ, 7-fold decrease) and 20 (IC50 = 5.22 μΜ, 12-fold decrease) in the BRD4(1) protein (Figure 1). Surprisingly, compound 19 comprising a single propyl chain as a spacer was shown to bind with high affinity to the BRD4(1) protein (IC50 = 0.85 μΜ). However, when analyzing the affinity of the compounds for the various proteins, no correlation was found between the chemical structure of the spacers and the binding potency.

Apesar do último composto ser 16 vezes mais potente (IC50 = 0.24 μΜ) que ο I-BET762 (IC50 = 3.9 μΜ) contra a proteína BRD2(1), o mesmo composto mostrou ser incapaz de induzir o deslocamento competitivo de péptidos da proteína BRD3(1) a concentrações tão altas como 100 μΜ (Figura 1). Estes dados sugerem que há requisitos de ligação diferentes para o centro ativo de cada domínio.Despite the latter compound being 16 times more potent (IC50 = 0.24 μΜ) than ο I-BET762 (IC50 = 3.9 μΜ) against the BRD2(1) protein, the same compound was shown to be unable to induce competitive displacement of peptides from the BRD3 protein. (1) at concentrations as high as 100 μΜ (Figure 1). These data suggest that there are different binding requirements for the active center of each domain.

Os derivados de fluoresceína foram preparados uma vez que técnicas de fluorescência são estudos importantes para investigar interações intermoleculares. No entanto, as sondas fluorescentes apenas foram eficazes quando a membrana celular foi perturbada com detergente Triton X-100 antes da incubação dos derivados fluorescentes (não foram testados com células vivas). Ensaio de permeabilidade em membrana artificial paralela (PAMPA) confirmou que a difusão dos derivados fluorescentes através de membranas celulares está fortemente impactada enquanto que a molécula I-BET762 simples difunde facilmente através das membranas celulares.The fluorescein derivatives were prepared since fluorescence techniques are important studies to investigate intermolecular interactions. However, fluorescent probes were only effective when the cell membrane was perturbed with Triton X-100 detergent prior to incubation of the fluorescent derivatives (not tested with live cells). Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) confirmed that the diffusion of the fluorescent derivatives through cell membranes is strongly impacted while the single I-BET762 molecule easily diffuses through cell membranes.

A taxa de internalização do composto 21 (e-h) e 22 (a-d) através de membranas foi estudada por microscopia confocal, testando com e sem perturbação das membranas celulares com detergente Triton X-100. As células tratadas com todos os compostos 21 (Figura 2h) mostraram um sinal forte de fluorescência, enquanto que as amostras tratadas com 22 não mostraram sinais de fluorescência (Figura 2d) . Adicionalmente, o sinal de fluorescência do 21 foi mais forte no núcleo celular onde as proteínas BET estão localizadas sugerindo uma entrega eficiente do composto nas células. Importante referir que as células tratadas com a sonda 22, que não tem a estrutura do I-BET762, não apresentaram sinais de fluorescência mesmo com a perturbação da membrana celular, o que evidencia o papel do derivado de inibidor de BET.The rate of internalization of compound 21 (e-h) and 22 (a-d) across membranes was studied by confocal microscopy, testing with and without perturbation of cell membranes with Triton X-100 detergent. Cells treated with all compounds 21 (Figure 2h) showed a strong fluorescence signal, while samples treated with 22 showed no signs of fluorescence (Figure 2d). Additionally, the 21 fluorescence signal was strongest in the cell nucleus where BET proteins are located, suggesting an efficient delivery of the compound into cells. It is important to mention that the cells treated with probe 22, which does not have the structure of I-BET762, did not show fluorescence signals even with the disturbance of the cell membrane, which highlights the role of the BET inhibitor derivative.

A mesma tendência foi observada ao incubar células com o conjugado fluorescente 19 que compreende um espaçador pequeno de 3 átomos.The same trend was observed when incubating cells with the fluorescent conjugate 19 which comprises a small 3-atom spacer.

Exemplo 2: Modificação do I-BET762Example 2: Modification of I-BET762

Como descrito no Exemplo 1, é possível derivatizar o grupo amida no I-BET762 e manter a funcionalidade desejada. Como tal, esta posição foi utilizada para introduzir amina terciárias terminais, que por sua vez permitem a formação de pró-fármacos e o acoplamento a pontes cliváveis.As described in Example 1, it is possible to derivatize the amide group on I-BET762 and maintain the desired functionality. As such, this position has been used to introduce terminal tertiary amines, which in turn allow prodrug formation and coupling to cleavable bridges.

ácido carboxílico livre no percursor I-BET762 12 permite várias modificações sintéticas, incluindo a adição de uma anel piperidina acomodando uma amina terciária terminal para formar com (composto 27, também referido por RT48) ou sem (composto 26, também referido por RT53) um anel benzílico entre o anel piperidina e a função amida formada com o percursor do I-BET762 como representado em baixo:Free carboxylic acid in the precursor I-BET762 12 allows for several synthetic modifications, including the addition of a piperidine ring accommodating a terminal tertiary amine to form with (compound 27, also referred to as RT48) or without (compound 26, also referred to as RT53) a benzyl ring between the piperidine ring and the amide function formed with the precursor of I-BET762 as shown below:

XZ Vn 26/RT53(51%) $ \ / \XZ Vn 26/RT53(51%) $ \ / \

VX YX 27/RT48(51%)VX YX 27/RT48(51%)

Um análogo compreendendo uma amina quaternária terminal (composto 28, também referido por RT56) em vez de uma amina terciária terminal foi também sintetizada e utilizada como controlo. A carga positiva no grupo amina terminal tem como objetivo impedir a permeabilidade da molécula através de membranas e consequentemente de efeitos celulares como demonstrado em baixo:An analog comprising a terminal quaternary amine (compound 28, also referred to as RT56) instead of a terminal tertiary amine was also synthesized and used as a control. The positive charge on the terminal amine group is intended to prevent the permeability of the molecule through membranes and consequently cellular effects as shown below:

RT48 m TSAit DtPEÂ, DMF, 25 *C, 47%RT48 m TSAi t DtPEÂ, DMF, 25 *C, 47%

/ RT5S/ RT5S

Uma série de ensaios biofísicos foram executados, incluindo fluorimetria de varredura diferencial (differential scanning fluorimetry - DSF) , AlphaScreen, e calorimetria de titulação isotérmica {Isothermal Titration Calorimetry - ITC).A number of biophysical assays were performed, including differential scanning fluorimetry (DSF), AlphaScreen, and isothermal titration calorimetry (ITC).

DSF: experiências de fusão térmica foram executadas usando um equipamento Mx3005p Real Time PCR (Stratagene). As proteínas foram tamponadas em 10 mM HEPES pH 7.5, 500 mM NaCl e testadas numa placa de 96 poços a uma concentração final de 2 μΜ num volume de 20 pL. Os compostos foram adicionados a uma concentração final de 10 μΜ. A sonda SYPRO Orange (Molecular Probes) foi adicionada a uma diluição de 1 para 1000. Filtros de excitação e emissão para o corante SYPRO-Orange foram definidos para um comprimento de onda de 465 nm e 590 nm, respetivamente. A temperatura foi aumentada a uma taxa de 3 °C por minuto de 25 °C a 96 °C e a fluorescência foi sendo registada a cada intervalo. O impacto da temperatura na fluorescência durante o processo de desnaturação da proteína foi aproximado usando a equação em baixo:DSF: Thermal fusion experiments were performed using an Mx3005p Real Time PCR instrument (Stratagene). Proteins were buffered in 10 mM HEPES pH 7.5, 500 mM NaCl and tested in a 96-well plate at a final concentration of 2 μΜ in a volume of 20 µl. Compounds were added to a final concentration of 10 μΜ. SYPRO Orange probe (Molecular Probes) was added at a 1 in 1000 dilution. Excitation and emission filters for the SYPRO-Orange dye were set to a wavelength of 465 nm and 590 nm, respectively. The temperature was increased at a rate of 3°C per minute from 25°C to 96°C and fluorescence was recorded at each interval. The impact of temperature on fluorescence during the protein denaturation process was approximated using the equation below:

onde AuG é a diferença na energia livre da desnaturação entre o estado native e desnaturado, R é a constante dos gases perfeitos e yF e yU são as intensidades de fluorescência da sonda na presença da proteína na sua forma nativa e desnaturada, respetivamente. A linha de base do estado native e desnaturado foram aproximados por um ajuste linear. As mudanças de temperatura observadas, ATm obs, foram registadas como a diferença entre os pontos centrais de transição das amostras e os pontos de referência contendo a proteína sem ligando na mesma placa e determinada por um ajuste por um método de mínimos quadrados.where AuG is the difference in free energy of denaturation between the native and denatured state, R is the perfect gas constant and yF and yU are the fluorescence intensities of the probe in the presence of the protein in its native and denatured form, respectively. The baseline of the native and denatured state were approximated by a linear fit. The observed temperature changes, AT m obs , were recorded as the difference between the central transition points of the samples and the reference points containing the protein without ligand on the same plate and determined by a least squares fit.

DSF foi utilizado para avaliar a eficácia e seletividade de ligação nas várias famílias de bromodominios. A Figura 3 mostra as mudanças de temperatura observadas, ATm obs em graus Celsius em resposta à ligação de compostos a uma concentração final de 10 μΜ. Com a exceção BRDT(l), todos os compostos levaram a um aumento das temperaturas de desnaturação, em alguns casos em níveis comparáveis com ο I-BET762 original, o que sugere que uma interação especifica e forte com o painel de proteínas BET. No caso de proteínas fora da família BET (BAZ2BA, CREBP, PB1(5) e PCAF), não foram registadas alterações nas temperaturas de desnaturação, confirmando que estes ligandos são customizados para a família BET das proteínas de bromodominio.DSF was used to assess binding efficacy and selectivity in the various bromodomain families. Figure 3 shows the observed temperature changes, AT m obs in degrees Celsius in response to the binding of compounds at a final concentration of 10 μΜ. With the exception of BRDT(l), all compounds led to an increase in denaturation temperatures, in some cases to levels comparable to the original I-BET762, which suggests a specific and strong interaction with the panel of BET proteins. In the case of proteins outside the BET family (BAZ2BA, CREBP, PB1(5) and PCAF), no changes in denaturation temperatures were recorded, confirming that these ligands are customized for the BET family of bromodomain proteins.

A afinidade de ligação à proteína alvo foi ainda estudada usando a tecnologia AlphaScreen. Como realizado no Examplo 1, o AlphaScreen foi feito para os alvos BRD2(1), BRD3(1), BRD4(1) e BRD4(2) (Figura 4). Os dados obtidos sugerem que os compostos RT possuem uma afinidade de ligação aos bromodominios tão boa ou até mesmo superior que a referência I-BET7 62. Em particular, o RT53 mostrou um aumento de 4 vezes contra o BRD2(1) (IC50 = 19.3 nM) e BRD4(1) (IC50 = 18.2 nM) em comparação com a referência I-BET762 (IC50 BRD2(1) = 84.9 nM; IC50 BRD4(1) = 68.1 ηΜ) (Figura 4A,C). Também contra o BRD3(1), o IC50 do RT53 melhorou cerca de 3 vezes (IC50 = 67.1 nM) em comparação com ο I-BET762 (IC50 = 214.8 nM, Figura 4B), enquanto não foram observadas alterações significativas contra o BRD4(2) (RT53 IC50 = 25.9 ηΜ ; I-BET762 IC50 = 21.3 nM, Figura 4D) . A presença da carga positive no RT56 não impactou a afinidade de ligação. Na realidade, o RT56 também mostrou uma ligação potente ao BRD4(1) (IC50 = 6.6 nM,The binding affinity to the target protein was further studied using AlphaScreen technology. As performed in Example 1, AlphaScreen was made for the BRD2(1), BRD3(1), BRD4(1) and BRD4(2) targets (Figure 4). The data obtained suggest that RT compounds have a binding affinity for bromodomains as good or even higher than the reference I-BET7 62. In particular, RT53 showed a 4-fold increase against BRD2(1) (IC50 = 19.3 nM) and BRD4(1) (IC50 = 18.2 nM) compared to the reference I-BET762 (IC50 BRD2(1) = 84.9 nM; IC50 BRD4(1) = 68.1 ηΜ) (Figure 4A,C). Also against BRD3(1), the IC50 of RT53 improved about 3-fold (IC50 = 67.1 nM) compared to ο I-BET762 (IC50 = 214.8 nM, Figure 4B), while no significant changes were observed against BRD4( 2) (RT53 IC50 = 25.9 ηΜ; I-BET762 IC50 = 21.3 nM, Figure 4D). The presence of the positive charge on RT56 did not impact binding affinity. In fact, RT56 also showed potent binding to BRD4(1) (IC50 = 6.6 nM,

Figura 4C) e BRD4(2) (IC50 = 2.4 nM, Figura 4D) .Figure 4C) and BRD4(2) (IC50 = 2.4 nM, Figure 4D).

ITC: Experiências foram feitas no titulador microcalorimetro ITC200 da MicroCal™, LLC (GE Healthcare) equipado com um módulo de lavagem, com um volume da célula de 0.2003 mL e uma microseringa de 40 pL. As experiências foram feitas a 15°C com agitação a 1000 rpm, em tampão ITC (20 mM HEPES pH 7.5 (a 25 °C) , 200 mM NaCl) . A microseringa foi carregada com solução da proteína a estudar (340 - 400 μΜ, em tampão ITC) e foi cuidadosamente inserida na célula calorimétrica que foi carregada com uma quantidade de proteína (0.2 ml, 27-33 μΜ em tampão ITC) . Depois de um ajuste da linha de base, um atraso de 60 segundos foi aplicado. Todas as titulações foram executadas usando uma injeção inicial controlada de 0.3 pL seguida de 38 injeções idênticas de 1 μΐι com a duração de 2 segundos (por injeção) e um espaçamento de 120 segundos entre injeções. As experiências de titulação foram desenhadas de tal maneira para garantir uma saturação das proteínas antes da injeção final. O calor de diluição das proteínas foi independente da sua concentração e correspondeu ao calor observado na última injeção, a seguir à saturação de ligação do composto, assim facilitando a estimativa da linha de bases de cada titulação da última injeção. Os dados recolhidos foram corrigidos para calores de diluição de proteínas (medidos em experiências à parte através da titulação de proteínas no tampão de ITC) e deconvoluir usando o programa MicroCal™ Origin fornecido com o instrumento para obter entalpias de ligação (Δ/ί) e constantes de ligação (KB) da mesma maneira que o previamente descrito por Wiseman e parceiros [8. Parâmetros termodinâmicos foram calculados usando a equação básica de termodinâmica (AG = ΔΗ - ΤΔ5 = -RTlníCs, onde HG, ΔΗ e Δ5 são as mudanças na energia livre, entalpia e entropia de ligação, correspondentemente). Em todos os casos um modelo simples de ligação foi utilizado como o fornecido no software MicroCal™ Origin. As contantes de dissociação e parâmetros termodinâmicos estão listados na Tabela 1 em baixo.ITC: Experiments were performed on the ITC200 microcalorimeter titrator from MicroCal™, LLC (GE Healthcare) equipped with a wash module, with a cell volume of 0.2003 mL and a 40 pL microsyringe. The experiments were done at 15°C with shaking at 1000 rpm, in ITC buffer (20 mM HEPES pH 7.5 (at 25°C), 200 mM NaCl). The microsyringe was loaded with a solution of the protein to be studied (340 - 400 μΜ, in ITC buffer) and was carefully inserted into the calorimetric cell which was loaded with an amount of protein (0.2 ml, 27-33 μΜ in ITC buffer). After a baseline adjustment, a 60 second delay was applied. All titrations were performed using an initial controlled injection of 0.3 pL followed by 38 identical injections of 1 μΐι lasting 2 seconds (per injection) and a spacing of 120 seconds between injections. The titration experiments were designed in such a way to ensure protein saturation prior to the final injection. The heat of dilution of the proteins was independent of their concentration and corresponded to the heat observed in the last injection, following the saturation of binding of the compound, thus facilitating the estimation of the baseline of each titration of the last injection. Collected data were corrected for heats of protein dilution (measured in separate experiments by titrating proteins in ITC buffer) and deconvoluted using the MicroCal™ Origin program provided with the instrument to obtain binding enthalpies (Δ/ί) and binding constants (KB) in the same way as previously described by Wiseman and partners [8. Thermodynamic parameters were calculated using the basic thermodynamic equation (AG = ΔΗ - ΤΔ5 = -RTlníCs, where HG, ΔΗ and Δ5 are the changes in free energy, enthalpy and bond entropy, correspondingly). In all cases a simple connection model was used as provided in the MicroCal™ Origin software. The dissociation constants and thermodynamic parameters are listed in Table 1 below.

A afinidade de ligação dos compostos foi ainda caracterizada em solução através de ITC. Ao contrário do AlphaScreen, o ITC permite medir a afinidade dos parceiros de ligação no seu estado nativo. Os valores KD e parâmetros termodinâmicos obtidos confirmam que que a modificação dos inibidores de BET para introduzir uma estrutura com uma amina terciária terminal (RT53) ou uma amina quaternária (RT56) não prejudica a ligação, e pode levar a uma inibição de BET mais potente. Adicionalmente, foi observado que o RT53 e RT56 se ligam ao BRD4(1) e BRD4(2) com valores de KD similares (14 e 21 nM para BRD4(1) e 21 e 18 nM para BRD4(2), respetivamente, Figura 5, Tabela 1).The binding affinity of the compounds was further characterized in solution by ITC. Unlike AlphaScreen, ITC allows you to measure the affinity of binding partners in their native state. The KD values and thermodynamic parameters obtained confirm that the modification of BET inhibitors to introduce a structure with a terminal tertiary amine (RT53) or a quaternary amine (RT56) does not impair binding, and may lead to a more potent inhibition of BET. . Additionally, RT53 and RT56 were observed to bind to BRD4(1) and BRD4(2) with similar KD values (14 and 21 nM for BRD4(1) and 21 and 18 nM for BRD4(2), respectively, Figure 5, Table 1).

Proteína Protein Composto Compound [P] (a) (μΜ)[P] (a) (μΜ) [C] (b) (μΜ)[C] (b) (μΜ) Kd(CI (μΜ)Kd (CI (μΜ) △jjobs (d) (kcal/mol) △jjobs (d) (kcal/mol) N<e>N< and > TAS(£I (kcal/mol)TAS (£I (kcal/mol) AG191 (kcal/mol)AG 191 (kcal/mol) BRD2(2) BRD2(2) I-BET762 I-BET762 392,0 392.0 25,0 25.0 0,129 + 0.007 0.129 + 0.007 -6,210 0,023 -6,210 0.023 + + 0,98 ± 0,002 0.98 ± 0.002 2,87 2.87 -9,08 -9.08 RT53 RT53 392,0 392.0 30,0 30.0 0,350 + 0,003 0.350 + 0.003 -5,549 0,052 -5,549 0.052 + + l,00± 0,006 l.00± 0.006 2, 96 2.96 -8,51 -8.51 RT56 RT56 392,0 392.0 25,0 25.0 0,101 + 0,007 0.101 + 0.007 -5,843 0,025 -5,843 0.025 + + -0, 94 + 0,002 -0.94 + 0.002 3,37 3.37 -9,21 -9.21 BRD4(1) BRD4(1) I-BET62 I-BET62 371,0 371.0 20,0 20.0 0,042 + 0,002 0.042 + 0.002 -10,55 0,026 -10.55 0.026 + + 1,10 ± 0,001 1.10 ± 0.001 -0,82 -0.82 -9,72 -9.72 RT53 RT53 371,0 371.0 25,0 25.0 0,014 + 0,001 0.014 + 0.001 -10,77 0,030 -10.77 0.030 + + 0,951± 0,001 0.951± 0.001 -0,39 -0.39 -10,38 -10.38 RT56 RT56 368,0 368.0 20,00 20.00 0,021 + 0,001 0.021 + 0.001 -11,34 0,019 -11.34 0.019 + + 1,02 ± 0,007 1.02 ± 0.007 -1,20 -1.20 -10,134 -10,134 BRD4(2) BRD4(2) I-BET762 I-BET762 397.7 397.7 25,0 25.0 0,062 + 0,006 0.062 + 0.006 -7,398 0,037 -7,398 0.037 + + 1,04 ± 0,003 1.04 ± 0.003 2,10 2.10 -9,50 -9.50 RT53 RT53 386,0 386.0 30,0 30.0 0,021 + 0,001 0.021 + 0.001 -6,957 0.019 -6.957 0.019 + + 1,01 ± 0,001 1.01 ± 0.001 3,17 3.17 -10,12 -10.12 RT56 RT56 341,0 341.0 20,0 20.0 0.018 + 0,002 0.018 + 0.002 -7,469 0,026 -7,469 0.026 + + 1,07 ± 0,002 1.07 ± 0.002 2,74 2.74 -10,21 -10.21

(a) [P] concentração da solução de amostra da proteína no tampão ITC (b) [C]quantidade de proteína na célula calorimetrica (c) Kd constante de dissociação (d) AHobs alterações da reação na entalpia de ligação (e) N estequiometria (f) TAS alterações da reação na entropia de ligação (g) a AG alterações na energia livre de ligação(a) [P] concentration of the protein sample solution in the ITC buffer (b) [C]amount of protein in the calorimetric cell (c) Kd dissociation constant (d) AH obs changes in the reaction enthalpy of binding (e) N stoichiometry (f) TAS reaction changes in binding entropy (g) to AG changes in binding free energy

Tabela 1: Caracterização termodinâmica e valores de Kd comTable 1: Thermodynamic characterization and Kd values with

ITCITC

A interação dos dois inibidores com o Segundo domínio do BRD2 e BRD4 é caracterizada por uma mudança de entropia positiva favorável (TAS ~ +2 a +3 kcal/mol), enquanto que no BRD4(1) é observado um TAS negativo (~ -0.4 a ~ -1 kcal/mol), sugerindo que os mecanismos essenciais de reconhecimento molecular e compromisso podem ser distintivos (Tabela 1) .The interaction of the two inhibitors with the second domain of BRD2 and BRD4 is characterized by a favorable positive entropy change (TAS ~ +2 to +3 kcal/mol), while in BRD4(1) a negative TAS is observed (~ - 0.4 to ~ -1 kcal/mol), suggesting that the essential mechanisms of molecular recognition and commitment may be distinctive (Table 1).

Estes dados combinados mostram que a via de síntese para converter ο I-BET762 num derivado de inibidor de BET contendo uma amina terciária terminal foi bem sucedida, e em que o RT53 mostra uma inibição potente de proteínas BET mesmo quando comparado com a molécula de referência, ο I-BET762.These combined data show that the synthetic pathway to convert ο I-BET762 into a BET inhibitor derivative containing a terminal tertiary amine was successful, and that RT53 shows potent inhibition of BET proteins even when compared to the reference molecule. , ο I-BET762.

Exemplo 3: Avaliação biológica dos derivados do I-BET762 formados no Exemplo 2Example 3: Biological evaluation of the I-BET762 derivatives formed in Example 2

Os três compostos preparados no Exemplo 2 foram testados contra várias linhas celulares cancerígenas de forma a encontrar quais as mais sensíveis. Foi realizado um ensaio semi-automático de sensibilidade a pequenas moléculas contra 26 linhas celulares referentes a diferentes tipos de cancro. 0 efeito nas linhas celulares foi avaliado após 96h de incubação e comparado com o efeito da molécula de referência, ο I-BET762. A resposta celular foi determinada em linhas celulares representativas de uma grande variedade de tumores incluindo tumores da próstata, pulmão, cérebro, pâncreas, mama, ovários, cólon e também hematológicos e da medula óssea (Figura 6).The three compounds prepared in Example 2 were tested against various cancer cell lines in order to find which ones were most sensitive. A semi-automated small molecule sensitivity assay was performed against 26 cell lines referring to different types of cancer. The effect on the cell lines was evaluated after 96h of incubation and compared to the effect of the reference molecule, ο I-BET762. The cellular response was determined in cell lines representative of a wide variety of tumors including prostate, lung, brain, pancreas, breast, ovary, colon and also hematologic and bone marrow tumors (Figure 6).

Nos tumores sólidos testados, foram observados efeitos de inibição potentes principalmente em linha celulares de cancro da próstata, particularmente nas dependentes da sinalização AR (LNCaP, VCaP e 22RV1, IC5o = 0.2 - 2.6 μΜ) . Por contraste, linhas celulares AR negativo (DU145 e PC3) foram mais resistentes ao tratamento. Surpreendentemente, as células PC3 responderam apenas ao composto RT53 (IC50 = 3.1 μΜ) , enquanto que nem o RT48 nem ο I-BET7 62 afetaram a viabilidade celular até à dose máxima testada (10 μΜ). Nas linhas celulares AR positive, a resposta ao tratamento com os compostos RT53 e RT48 foi comparável com o efeito da molécula de referência, I-BET762, no entanto o RT53 foi claramente o mais eficaz entre os 3 compostos (RT53 IC50 =In the solid tumors tested, potent inhibitory effects were observed primarily on prostate cancer cell lines, particularly those dependent on AR signaling (LNCaP, VCaP and 22RV1, IC 50 = 0.2 - 2.6 μΜ). In contrast, AR negative cell lines (DU145 and PC3) were more resistant to treatment. Surprisingly, PC3 cells responded only to compound RT53 (IC50 = 3.1 μΜ), whereas neither RT48 nor ο I-BET7 62 affected cell viability up to the maximum dose tested (10 μΜ). In AR positive cell lines, the response to treatment with compounds RT53 and RT48 was comparable to the effect of the reference molecule, I-BET762, however RT53 was clearly the most effective among the 3 compounds (RT53 IC50 =

0.2 - 0.7 μΜ; RT48 IC50 = 0.3 - 2.6 μΜ; Ι-ΒΕΤ762 IC50 = 0.2 1.5 μΜ) . Ο composto RT56 foi ineficaz em todas as linhas celulares (IC50 > 10 μΜ) , devido ao grupo de amina quaternário que impediu a internalização do composto nas células. Este efeito foi depois confirmado no ensaio PAMPA, onde se verificou que o RT56 não difundiu através das membranas celulares. No que respeita à permeabilidade por membranas, foi também verificado uma difusão modesta do composto RT53 (logPe = -5.92) em comparação com ο I-BET762 (logPe = -4.32), apesar do RT53 demonstrar atividade contra linhas celulares equivalente e em alguns casos superior. Mesmo assim, foram observados fenótipos indicativos de sensibilidade aos compostos testados em linhas celulares de cancro da mama (MDA-MB-453, IC50 = 1.3 - 5.0 μΜ) , ovários (CAOV3, IC50 = 0.5 -1.9 μΜ) e cérebro (U87-MG, IC50 = 1.72 - 7.93 μΜ) , mas também em todas as linhas celulares de cancro sanguíneo testadas, nomeadamente as referentes a leucemia aguda das células T (Jurkat, IC50 = 0.3 - 1.2 μΜ) , leucemia mieloblástica aguda (Kasumi-1, IC50 = 0.1 - 0.3 μΜ) , e linfoma de Burkitt' s (DAUDI, IC50 = 0.4 - 1.3 μΜ) . Além disso, linhas celulares referentes a cancro do pulmão, pâncreas e colon mostraram não responder à presença de todos os compostos (IC50 > 10 μΜ) .0.2 - 0.7 μΜ; RT48 IC50 = 0.3 - 2.6 μΜ; Ι-ΒΕΤ762 IC50 = 0.2 1.5 μΜ) . The RT56 compound was ineffective in all cell lines (IC50 > 10 μΜ), due to the quaternary amine group that prevented the internalization of the compound in the cells. This effect was further confirmed in the PAMPA assay, where it was found that RT56 did not diffuse across cell membranes. With regard to membrane permeability, a modest diffusion of compound RT53 was also observed (logPe = -5.92) compared to ο I-BET762 (logPe = -4.32), although RT53 demonstrates activity against equivalent cell lines and in some cases higher. Even so, phenotypes indicative of sensitivity to the tested compounds were observed in breast cancer cell lines (MDA-MB-453, IC50 = 1.3 - 5.0 μΜ), ovaries (CAOV3, IC50 = 0.5 -1.9 μΜ) and brain (U87- MG, IC50 = 1.72 - 7.93 μΜ), but also in all blood cancer cell lines tested, namely those referring to acute T-cell leukemia (Jurkat, IC50 = 0.3 - 1.2 μΜ), acute myeloblastic leukemia (Kasumi-1, IC50 = 0.1 - 0.3 μΜ), and Burkitt's lymphoma (DAUDI, IC50 = 0.4 - 1.3 μΜ). Furthermore, cell lines referring to lung, pancreas and colon cancer were shown not to respond to the presence of all compounds (IC50 > 10 μΜ).

Exemplo 4: Preparação do conjugado fármaco ligando compreendendo um derivado de I-BET762Example 4: Preparation of drug ligand conjugate comprising a derivative of I-BET762

Síntese de péptidos em fase sólida foi utilizada para preparar a estrutura clivável VC usando uma resina 2clorotritil seguido de adição sequencial e desproteção do fluorenilmetoxicarbonil (FMOC)-citrulina-OH e FMOC-valinaOH. O dipeptideo VC foi depois funcionalizado com um grupo aminofenil para derivatizar com o RT53, resultando no conjugado fármaco-ponte clivável 38 (também referido como VC-PABQ-RT53) como representado em baixo:Solid phase peptide synthesis was used to prepare the VC cleavable structure using a 2chlorotrityl resin followed by sequential addition and deprotection of fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-citrulline-OH and FMOC-valineOH. The VC dipeptide was then functionalized with an aminophenyl group to derivatize with RT53, resulting in the drug-cleavable bridge conjugate 38 (also referred to as VC-PABQ-RT53) as depicted below:

Foi avaliado se o composto RT53 era libertado do conjugado VC-PABQ-RT53, se a ponte clivável era estável, e se o inibidor de BET era libertado com na sequência de um evento específico. Num meio tamponado contendo catepsina B (pH 5.5, 37 °C) foi observado uma libertação completa do RT53 em 18h (0% de VC-PABQ-RT53) . A Figura 7 apresenta uma série de cromatogramas obtidos por HPLC e identificados por LC-MS (com a estrela a indicar o pico correspondente ao grupo VC) que mostram claramente que os sinais de VS e RT53 aumentam enquanto o sinal de VC-PABQ-RT53 diminui com o tempo. A Figura 8 mostra que a velocidade de libertação do RT53, estimada pela área do pico (mAU*s) dividida pela soma dos picos do composto RT53 livre e do conjugado fármaco ponte clivável VC-PABQ-RT53, confirma que a proporção de VC e RT53 aumentam enquanto que o VC-PABQ-RT53 diminui com o tempo, mas apenas com a presença de catepsina B. Este resultado demonstra uma libertação controlada e eficaz do RT53.It was evaluated whether the RT53 compound was released from the VC-PABQ-RT53 conjugate, whether the cleavable bridge was stable, and whether the BET inhibitor was released following a specific event. In a buffered medium containing cathepsin B (pH 5.5, 37°C) a complete release of RT53 in 18h (0% VC-PABQ-RT53) was observed. Figure 7 presents a series of chromatograms obtained by HPLC and identified by LC-MS (with the star indicating the peak corresponding to the VC group) that clearly show that the VS and RT53 signals increase while the VC-PABQ-RT53 signal increases. decreases with time. Figure 8 shows that the release rate of RT53, estimated by the peak area (mAU*s) divided by the sum of the peaks of free RT53 compound and VC-PABQ-RT53 cleavable bridge drug conjugate, confirms that the proportion of VC and RT53 increases while VC-PABQ-RT53 decreases with time, but only with the presence of cathepsin B. This result demonstrates a controlled and effective release of RT53.

HPLC: as análises foram realizadas com uma coluna Phenomenex Luna C18 10 μm, 250 χ 21.2 mm com um fluxo de 10 mL/min usando um gradiente linear de 80 % A/ 20 % B até 60 % A/ 40% B em 40 min. (A = água Milipore + 0.1% TFA, B = ACN).HPLC: analyzes were performed with a Phenomenex Luna C18 10 μm, 250 χ 21.2 mm column at a flow rate of 10 mL/min using a linear gradient from 80% A/ 20% B to 60% A/ 40% B in 40 min . (A = Millipore water + 0.1% TFA, B = ACN).

LC-MS: análises combinadas com HPLC foram realizadas como descrito em cima com deteção por espectrometria de massa por um espectrómetro de massa Bruker Daltonics microTOF ESI-TOF. Valores m/z calculados e exatos estão indicados em Daltons. O conjugado fármaco-ponte clivável VC-PABQ-RT53 foi depois acoplado ao ligando de PSMA, nomeadamente ao DUPA (42):LC-MS: Combined HPLC analyzes were performed as described above with mass spectrometry detection by a Bruker Daltonics microTOF ESI-TOF mass spectrometer. Calculated and exact m/z values are indicated in Daltons. The drug-cleavable bridge conjugate VC-PABQ-RT53 was then coupled to the PSMA ligand, namely DUPA (42):

COO^lí OCOSíiCOO^^^^^^^^^^

Desproteção do conjugado VC-PABQ-RT53 com ácido trifluoroacetico resultou no grupo amina terminal livre que foi utilizada no acoplamento mediado por benzotriazole tetrametil urónio hexafluorofosfato (HBTU) com DUPA 42, resultando no composto 43. Após desproteção dos grupos tertbutilo com ácido trifluoroacético em 1.5 h à temperatura ambiente, obteve-se o conjugado 44 (também referido como DUPA-VC-PABQ-RT53), como representado em baixo:Deprotection of the VC-PABQ-RT53 conjugate with trifluoroacetic acid resulted in the free terminal amine group which was used in the benzotriazole tetramethyl uronium hexafluorophosphate (HBTU) mediated coupling with DUPA 42, resulting in compound 43. After deprotection of tertbutyl groups with trifluoroacetic acid in 1.5 h at room temperature, conjugate 44 (also referred to as DUPA-VC-PABQ-RT53) was obtained as shown below:

MM VC - PABQ - RT53MM VC - PABQ - RT53

1. TFA, DCM 25 'Çí h1. TFA, DCM 25' h

2. consxwtó 42, HBTU.2. Consxwto 42, HBTU.

OIPEA DMF, IS b. 5S%OIPEA DMF, IS b. 5S%

Exemplo 5: Verificação da atividade terapêutica do conjugado fármaco-ligando compreendendo um derivado de I-BET762Example 5: Verification of the therapeutic activity of the drug-ligand conjugate comprising an I-BET762 derivative

Ratinhos com tumores LNCaP subcutâneos foram divididos em grupos de forma aleatória (n=5 por grupo) e depois receberam veiculo ou os compostos em estudo a uma dose de 12 mg/kg por 7 dias consecutivos. Surpreendentemente, o tratamento com o conjugado DUPA-VC-PABQ-RT53 levou a uma redução significativa to volume do tumor (93%, p=0.0001, Figura 9A) e peso do tumor (92%, p=0.0001, Figura 9B) em comparação com o veículo, enquanto que os compostos simples RT53 e I-BET762 mostraram um efeito muito menos pronunciado (redução de aproximadamente 40 a 50% no volume e peso do tumor, respetivamente, Figura 9). O conjugado DUPA-VC-PAQB-RT53 também mostrou um forte efeito de inibição do crescimento tumor em comparação com o conjugado fármaco-ponte clivávelMice with subcutaneous LNCaP tumors were randomly divided into groups (n=5 per group) and then received vehicle or study compounds at a dose of 12 mg/kg for 7 consecutive days. Surprisingly, treatment with the DUPA-VC-PABQ-RT53 conjugate led to a significant reduction in tumor volume (93%, p=0.0001, Figure 9A) and tumor weight (92%, p=0.0001, Figure 9B) in compared to vehicle, while single compounds RT53 and I-BET762 showed a much less pronounced effect (approximately 40 to 50% reduction in tumor volume and weight, respectively, Figure 9 ). The DUPA-VC-PAQB-RT53 conjugate also showed a strong tumor growth-inhibiting effect compared to the cleavable drug-bridge conjugate.

VC-PAQB-RT53 (68%), o que sugere uma acumulação bem sucedida do conjugado mediada pelo ligando DUPA em tumores LNCaP positivos para PSMA. Outra observação importante foi que todos os compostos testados foram bem tolerados nos modelos de ratinhos nas doses utilizadas e até após 15 dias de exposição aos compostos, como indicado pela estabilidade do peso corporal (Figura 10).VC-PAQB-RT53 (68%), suggesting successful DUPA ligand-mediated accumulation of the conjugate in PSMA-positive LNCaP tumors. Another important observation was that all compounds tested were well tolerated in the mouse models at the doses used and even after 15 days of exposure to the compounds, as indicated by body weight stability (Figure 10).

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