PT1105507E

PT1105507E - Overexpression of desired proteins in eukaryotic cells mediated by cyclin d1 overexpression

Info

Publication number: PT1105507E
Application number: PT99942098T
Authority: PT
Inventors: Shaw-Fen Sylvia Hu; Jean Marie Gudas; David William Brankow
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1999-08-11
Publication date: 2007-12-07
Also published as: KR100502701B1; EP1105507A1; JP4562915B2; ES2291038T3; ATE374827T1; DE69937243T2; CY1106987T1; JP2003524378A; HUP0103485A2; DE69937243D1; US6210924B1; EP1105507B1; AU5554699A; KR20020013462A; CN1151263C; WO2000009714A1; DK1105507T3; CN1322253A; WO2000009714A9; HUP0103485A3

Abstract

The invention concerns eukaryotic cells useful in protein expression comprising (a) an inserted nucleic acid encoding a cyclin D gene product and (b) an inserted nucleic acid encoding a protein of interest, wherein the cyclin D gene product and the protein of interest are expressed in the cell. The invention also concerns a process for producing a protein of interest, which comprises (a) inserting into a eukaryotic cell a nucleic acid encoding a cyclin D gene product and a nucleic acid encoding a protein of interest; (b) culturing the cell under conditions permitting the expression of the protein of interest; and (c) isolating the protein of interest. The cells are preferably mammalian, with CHO cells most preferred. The cyclin D gene product is preferably of human origin. Suitable proteins of interest include erythropoietin (EPO), osteoprotegerin (OPG), OPG-Fc, leptin, Fc-leptin, and Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP).

Description

μ iiifcMs m eterna ®câmió®i« »mm: ti» d* ssçmm t>i* lif» M tècmica à mm m zwzmçm A progressão ao longo do ciclo das células de mamíferos resulta da activação de quinases dependentes de ciclinas (CDK), por uma determinada ordem. Uma CDK activa é constituída por uma subunidade catalítica e uma subunidade regulatória denominada ciclina. Ά actividade da CCK ê regulada por interaeções com ciclinas e com inibidores de CDK (CKI) bem como por modificações pós-translacionais (por exemplo, uma fosforilação). A transiyão entre estados do ciclo celular é regulada em diversos locais de controlo por diferentes subunidades de ciciina: as ciclinas G1 monitorizam a transição Gl/S, as ciclinas S a progressão ao longo da fase S, e as ciclinas G2 ou mitóticas a entrada na mitose. C comprometimento de uma célula para entrar na fase S ocorre num ponto de restrição (R) tardio em SI, após o qual já nâa são factores mitogénicos de crescimento para as células £θ·φ.Ι®£.&ϊ« a sua divisão.Progression along the mammalian cell cycle results from the activation of cyclin-dependent kinases (CDKs) in the mammalian cell cycle, , by a certain order. An active CDK consists of a catalytic subunit and a regulatory subunit called cyclin. The activity of CCK is regulated by interactions with cyclins and with CDK (CKI) inhibitors as well as by post-translational modifications (e.g., phosphorylation). The transition between cell cycle states is regulated at various control sites by different cytokine subunits: cyclins G1 monitor the Gl / S transition, cyclins S progression along the S phase, and the G2 or mitotic cyclins enter the mitosis. C compromising a cell to enter the S-phase occurs at a late (R) restriction point at SI, after which there are no longer mitogenic growth factors for the · · Ι Ι Ι Ι Ι Ι ϊ cells. division.

As ciclina D e E são sequencialmente sintetizadas dSi-.iícS i; ίο: ii :ΐ:\ ió::;!:ó -g Riu: g g;0(0(:. ;Ú;gΐi;:| u : p::: ·>·;:κ f v:;: ib :::o vi ^ portanto ser consideradas CiClinu» Gl. lo.:.;.; ísaaos trèís 00::100 do mamíferos codificam para ciclinas do tipo D D2 e D3) . .o::s ciclinas do tipo D são progressivamente induzidas, como parte da resposta a curto prazo à estimulação mitogénica, e elas são expressas de uma forma especifica para a linhagem celular. A montagem das ciclinas de tipo D com CDK4 e com CDK6 <1 reaulada foma pós-trarislacional por mitogéneos. Oma vez montadas, as CDK ligadas a ciclinas D têm que ser fosforiladas por uma quinase activadora de CCK (CAK), para adquirirem actividade catalítica.Cyclin D and E are sequentially synthesized dSi-1iSi; ο ο f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f f: mammals encode D-type cyclins D 2 and D 3). D-type cyclins are expressed as mammals. progressively induced as part of the short-term response to mitogenic stimulation, and they are expressed in a specific way for the cell line. The assembly of the D-type cyclins with CDK4 and with CDK6 <1 reacted postmatched to mitogenic. Once assembled, the CDKs attached to cyclins D have to be phosphorylated by a CCK (CAK) activating kinase to acquire catalytic activity.

Os qenes de ciclina D encontram-se num ramo diferente da árvore da evolução, relativamente aos genes das ciclinas dos tipos A, B, C, ou E, e as ciclinas D têm algumas propriedades diferentes das propriedades das outras ciclinas. Elas são proteínas com uma vida curta ít* < 25 minutos). Quando se retiram os factores de crescimento durante G1 impede-se a acumulação continuada de ciclina D, que se correlaciona com a incapacidade das células privadas de factor de crescimento progredirem para alem do ponto R. Desta forma, a expressão da ciclina D é regulada por sinais extra celulares, ao contrario da expressão periódica das ciclinas A, B e E. A sobre expressão das ciclinas humanas Dl e E nos fibroblastos de roedores ou de seres humanos, encurta tb, diminui a dimensão das células, e àímiziií s necessidade de soro ρβΧ·& a ctu de G1 ttê S (Resnitzky et ai., MC , 4 1669-79 (1994) ; Quelle et si,. Genes & Development 7, 1559-71 (1993);Cyclin D qenes are found on a different branch of the evolution tree relative to cyclin genes of types A, B, C, or E, and cyclins D have some properties different from the properties of other cyclins. They are proteins with a short life ít * < 25 minutes). When growth factors are removed during G1, continued accumulation of cyclin D, which correlates with the inability of the private growth factor cells, is prevented from progressing beyond the R point. Thus, cyclin D expression is regulated by extra cellular signals, in contrast to the cyclic expression of cyclins A, B and E. Overexpression of human cyclins D1 and E in rodent or human fibroblasts, shortens tb, decreases cell size, and reliably requires serum ρβΧ · & (Resnitzky et al., MC, 4, 1669-79 (1994); Quelle et al., Genes & Development 7, 1559-71 (1993);

Ohtsubo & Bbfetrib;. Science 259, 1906--1¾ resultados sugerem que as ciclinas D conseguem passar por sobre uma runção fisiologicamente regulada pela ciclina E, ou p.tós?· versa. No entanto, a sobre expressão aa ciclina D ou da E não leva a que as células de transformação de fibroblastos permaneçam dependentes do soro, inibidas por contacto e incapazes de Formarem colónias em meio semi ãòliúo·. Observou-se também que a sobre expressão da ciclina D í aumenta a amplificação endógena de genes, o que sugere que desempenha un papel na instabilidade genómica durante o desenvolvimento de tumores. Zhou et ai., Câncer Res. 56: 36-9 (1996).Ohtsubo &Bbfetrib;. Science 259, 1906-1-1 results suggest that cyclins D can pass over a physiologically regulated run by cyclin E, or p.off. However, overexpression of cyclin D or E does not lead to fibroblast transformation cells remaining dependent on the serum, inhibited by contact and unable to form colonies on semiliquid medium. It has also been observed that overexpression of cyclin D increases endogenous gene amplification, which suggests that it plays a role in genomic instability during tumor development. Zhou et al., Cancer Res. 56: 36-9 (1996).

Descrição Resumida Da Invenção A invenção presente diz respeito a uma célula eucariota que inclua: (a) un produto genético de ciclina D, em que c produto genético de ciclina D gene esteja funcionalmente expresso a un nível superior a qualquer nível de expressão encontrado na natureza; e (b) uma proteína com interesse, em que a proteína com interesse se encontre expressa na célula a um nível superior a qualquer nível de expressão que se encontre na natureza. A invenção presente também diz respeito a um processo ptrt se prtth:;:;tt::i ocu proteína com interesse, o qual inclua: A, criar-se uma célula eucariota que expresse: 1. um produto genético de ciclina 3 a un teor superior a qualquer teor de expressão existente na natureza; t 2. ursa proteína com interesse a um teor superior a qualquer teor de expressão existente na natureza; pela introdução de un vector de expressão que inclua uma sequência de ADN para a proteína com interesse e introduzir-se un vector de expressão que inclua uma sequência de ADN para o produto genético de ciclina D; B. cultivar-se a célula sob condições que permitam a expressão da proteína com interesse bem como a expressão funcional do produto genético de ciclina D; e C. isolar-se a proteína com interesse.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a eukaryotic cell which comprises: (a) a cyclin D gene product, wherein the cyclin D gene product is functionally expressed at a level superior to any level of expression found in nature ; and (b) a protein of interest, wherein the protein of interest is expressed in the cell at a level above any level of expression found in nature. The present invention also relates to a process for the preparation of a protein of interest, which comprises: A, a eukaryotic cell is produced which expresses: 1. a cyclin 3 gene product higher than any content of expression existing in nature; 2. a protein of interest higher than any content of expression existing in nature; by introducing an expression vector that includes a DNA sequence for the protein of interest and introducing an expression vector that includes a DNA sequence for the cyclin D gene product; B. culturing the cell under conditions allowing the expression of the protein of interest as well as the functional expression of the cyclin D gene product; and C. isolating the protein of interest.

As células desta irwuuulu são preferivelmente de mamífero, sendo as - c. preferidas as t< : o CHO. 0 produto genético de w j*. Ο X i Ώ 3. D é de preferência de mamífero, correspondendo uma origem humana ao caço mais preferido. 8 gene de esluéiru* Dou c gene que codifica para a proteína de interesse (ou ambos) c. pode (m) estar incluído (s) suai vector ou em vectores Is expressão disUtru da céisls, ou podem estar integrados dentro Eí>d& utilizar-se na invenção presente uma diversidade de proteínas com interesse. Podem utilizar-se especificamente a EPO, a OPG, a leptína e a NESP, bem quaisquer seus derivados.The cells of this irwuuulu are preferably mammalian, being as-c. Preferred are t < : o CHO. The genetic product of wj *. Ο X i Ώ 3. D is preferably mammalian, a human source corresponding to the most preferred hatch. The gene encoding the protein of interest (or both) c. may be included in the vector or in dissolution vectors of the cells, or may be integrated within the cell. A variety of proteins of interest may be used in the present invention. EPO, OPG, leptin and NESP, and any derivatives thereof, may be specifically used.

Breve Descrição Das FigurasBrief Description Of The Figures

As PXÔdmM LA e 1B ilustram uma transferência Western dos lísados de células AM-1 transfectadcs com praDúAS,1/cielltá id e tratados com um anticorpo específico contra ciclina Dl humana (veja-se os Materiais e Métodos) . Estas transferências demonstram a expressão da ciclina humana Dl nas células AM-l/D.PXODMS LA and 1B illustrate a Western blot of lysates from AMD-1 transfected cells with 1D / 1C cells and treated with a specific antibody against human cyclin D1 (see Materials and Methods). These blots demonstrate the expression of human cyclin D1 in AM-1 / D cells.

As FIGURAS. 2A, 2Br 2C, e 2D são histogramas ilustrando o conteúdo relativo em ADN (eixo dos xx) e o número de células (eixo dos yy) de células não sincronizadas das linhas celulares AM-l/D e AM-1 contrastadas com iodeto de propídic e analisadas por varrimento FAC (Becton Dickinson; veja-se os Materiais e Métodos}. Estas figuras ilustram a existência de um número significativamente maior de células na fase S, na população de céiuiuíí AM-l/D. A FIGURA. 3 é um gráfico que ilustra os dStmAdd de ciones que expressam OPG-Fc a diversos teores. Transfectaram-se oooczcvu no Exemplo I adiante neste documento. Este gráfico mostra que os ciones cora teores rasls elevados de exoressâo tão os derivados da Iitãm celular AM-l/D. A FIGURA 4 é um gráfico ilustrando a expressão de EPO em da concentração de MTX utilizado amplificação. Transfectaram-se células AM-1 /D com o plasmideo pDpptó/hErO ral como se descreve no Exemplo 2 adiante neste documento. Dois dos clones manifestaram uma produção elevada de EPO com o aumento de concentração em MTX, demonstrando uma amplificação bem sucedida d··:; gene. A FIGURA 5 ilustra uma comparação dos teores de expressão de OPG(22-194)-cys-Fc em 46 clones individuais provenientes de células CHO AM-1 ou de células CHO AM-l/ciclina D. Cs clones provenientes da linhagem de células CHO AM- l/ciclina D denotam teores de expressão significativamente maiores para OPG(22-194)-cys-Fc do que os clones derivados das células CHO AM-1. A FIGURA 6 ilustra \míuh comparação da expressão de OPG(22-201)-Fc nos 24 clones que se haviam previamente determinado por transferência Western ser aqueles com expressão mais forte. Em todos os casos, os clones provenientes da linha de células CHO AM-l/ciclina D denotam teores de expressão de OPG(22-201)-Fc significativamente superiores do que os provenientes das células CHO(SF).The figures. 2A, 2Br 2C, and 2D are histograms illustrating the relative DNA content (x-axis) and the number of cells (y-axis) of non-synchronized cells from AM-1 / D and AM-1 cell lines contrasted with These data show that there is a significantly higher number of cells in the S-phase in the AM-1 / D cell population. a graph illustrating the dStmAdd of cations expressing OPG-Fc at various levels The oococcus was transfected in Example I hereinafter This graph shows that the high color regions of expression such as those derived from AMI-1 / D. FIGURE 4 is a graph illustrating the expression of EPO in the concentration of MTX used amplification. AM-1 / D cells were transfected with the plasmid pDppt / hErO ral as described in Example 2 hereinafter. manifested a high production of EPO with increasing concentration in MTX, demonstrating a successful amplification d ·· :; gene. FIGURE 5 shows a comparison of OPG (22-194) -cys-Fc expression levels in 46 individual clones from CHO AM-1 or CHO AM-1 / cyclin D cells. Clones from the cell line CHO AM1 / cyclin D denote significantly higher expression contents for OPG (22-194) -cys-Fc than clones derived from CHO AM-1 cells. FIGURE 6 illustrates a comparison of OPG (22-201) -Fc expression in the 24 clones that had previously been determined by Western blot to be those with stronger expression. In all cases, clones from the CHO AM-1 / cyclin D cell line denote significantly higher OPG (22-201) -Fc expression levels than those from CHO (SF) cells.

h FIGURA 7 ' médios de expressão de NESP determinados por EIA .v:;o 14 ranlkurot cloros do casis das de células CHO originais. Obtiveram-se amostras de íiiss condicionados « partir de placas com 24 poços, eo® colheita aos 2 dias. As amostras sofreram despiste prévio por transferência Western.FIGURE 7 Mean of NESP expression by EIA determined by the number of CHO cells of the original CHO cells. Conditioned samples were obtained from 24 well plates and the harvest at 2 days. Samples underwent previous Western blotting.

r?8A e 89 ilustram transferências Western IE.F de colheitas no agitador e no biorreactor, comparando as distribuições de isoformas da proteina NESP segregada em culturas no agitador e no biorreactor. As colheitas do agitador provêm de clones não amplificados. A proteína NESP padrão, purificada a partir de meio condicionado de balão rodado, denota a distribuição de isoformas com massas moleculares elevadas que se pretende. As colheitas de meio condicionado contêm todas as isoformas. As transferências demonstram a presença de isoformas de elevada massa molecular em todas as amostras.r 8A and 89 illustrate Western IE.F transfers of harvests in the shaker and the bioreactor, comparing the isoform distributions of the NESP secreted protein in cultures on the shaker and the bioreactor. Harvests of the shaker come from non-amplified clones. Standard NESP protein, purified from rotated flask conditioned medium, denotes the distribution of isoforms with high molecular weights desired. The conditioned medium harvests contain all the isoforms. The transfers demonstrate the presence of high molecular weight isoforms in all samples.

Descrição Pormenorizada da InvençãoDetailed Description of the Invention

Aplicam-se as seguintes definições aos termos tais como são utilizados ao longo da especificação presente, a não ser quando forem limitados de outro modo em casos específicos.The following definitions apply to the terms as they are used throughout the present specification unless otherwise limited in specific cases.

Os termos "inserido" e "inserindo" em relação a ácidos nucleicos, significam que o ácido nucleico é introduzido numa célula ou num organismo por meios externos (por exemplo por transfecção) . 0 ácido nucleico inserido pode ter urra sequência estranha ao genoma da célula, ou 1« ai presente, Neste ultimo caso, o ácido selilea inserido uma ççsíuIaçIo bsiu precisa ou diferenciada da proteina codifica o àclêú uvclíiiuP inserido. A expressão "proteína cr; Ma com a EPO" refere a eritropoietína e os seus derivados e análogos que possam ser formados por ADN recombinante e por outros métodos. Incluem-se nesses derivados proteínas que apresentem truncagens terminais, de ainínoácidos internos (por exemplo por restrição e nova ligação do ADN associado), substituições de aminoácidos, e outras formas semelhantes. Incluem-se também nesses derivados proteínas de fusão (por exemplo, com uma região Fc). Estão descritos exemplos de derivados de eritropoietína nos Pedidos de patente Internacional WQ 91/05867, 94/09257, 88103808, e 86/07594, todos os quais se incorporam desta forma, por referência. A expressão "proteína relacionada com ieptina" refere a leptinâ, de preferência a Ieptina humana, e os seus derivados que se possam formar por ADN recombinante e por outros métodos. Incluem-se nesses derivados proteínas que apresentem truncagens terminais, uma remoção de aminoácidos internos, substituições de aminoácidos, e outras semelhantes. Também se incluem nesta definição as proteínas de fusão incluindo a Ieptina, tais como uma proteína de fusão incluindo Ieptina e um fragmento Fc. Estão descritos fragmentos de ieptina adequados nos pedidos de patente WO $:-6/10112 (entrado a 19 de Dezembro de 1996), WO 96/05309 {entrado m 22 de Fevereiro de 1996} {- WO 97/06816 (entrado a 27 1997), que desta forma se incorporam por referência.The terms " entered " and " inserting " in relation to nucleic acids, means that the nucleic acid is introduced into a cell or into an organism by external means (for example by transfection). The inserted nucleic acid may have a sequence that is foreign to the cell genome, or is present in the latter. In this latter case, selenium acid is inserted into a precise or differentiated sequence of the protein coding for the inserted cell line. The expression " protein cr; Ma with EPO " refers to erythropoietin and its derivatives and analogs which may be formed by recombinant DNA and other methods. Included in these derivatives are proteins having terminal truncations, internal amino acids (for example by restriction and re-ligation of the associated DNA), amino acid substitutions, and the like. Also included in these derivatives are fusion proteins (for example, with an Fc region). Examples of erythropoietin derivatives are described in International Patent Applications WO 91/05867, 94/09257, 88103808, and 86/07594, all of which are hereby incorporated by reference. The term " ieptin related protein " refers to leptin, preferably human Ieptin, and derivatives thereof which may be formed by recombinant DNA and other methods. These derivatives include proteins having terminal truncations, removal of internal amino acids, amino acid substitutions, and the like. Also included in this definition are fusion proteins including Ieptina, such as a fusion protein including Ieptina and an Fc fragment. Suitable fragments of ieptina are described in WO patent applications: 6/10112 (filed December 19, 1996), WO 96/05309 (filed Feb. 22, 1996) (WO 97/06816 (entered 27 1997), which are hereby incorporated by reference.

A expressão "proteína relacionada com OPG" refere-se à aos seus derivados que se possam tor/iá;:' por ADN wrca e por outros métodos. Incluem-se nesses derivados proteínas que apresentem truncagens terminais, uma remoção de aminoácidos internos (por exemplo, per restrição e ligação de novo do ADN associado), substituições de aord&t;â8Í.€fcí&# e outras semelhantes. Também se incluem nesta definição as proteínas de fusão i.ppp exemplo, com uma região Fc) .São descritos exemplos de derivados de OPG no pedido de Patente Internacional WO 97/23614, que desta forma se incorpora por referência.The term " OPG-related protein " refers to those derivatives thereof which may be converted to DNA by other methods. Included in these derivatives are proteins having terminal truncations, removal of internal amino acids (for example, by restriction and re-binding of the associated DNA), α-α substitutions, and the like. Also included in this definition are the i.ppp fusion proteins, for example, with an Fc region. Examples of OPG derivatives are described in International patent application WO 97/23614, which is hereby incorporated by reference.

Processo de PreparaçãoPreparation Process

Tor; tϊoutPs Sidfiè11cuPTor; tϊoutPs Sidfiè11cuP

Os ácidos nucleicos que se utilizam na invenção presente podem ser preparados por métodos de ácidos nucleicos recombinantes. Veja-se, por exemplo, os métodos de ADN recombinante de Nelles et al., J. Biol. Chem., 262, 10855 (1987) .The nucleic acids used in the present invention may be prepared by recombinant nucleic acid methods. See, for example, the recombinant DNA methods of Nelles et al., J. Biol. Chem., 262, 10855 (1987).

Os ácidos nucleicos podem ser derivados a partir de uma série de fontes, incluindo o ADN genómico, o ADN subgenómico, o cADN, de ADN sintético, e de combinações destes. Podem obter-se o ADN genómico e o cADN por uma série de métodos, tõdpm isolar-se células que codifiquem para a sequência pretendida, fragmentando-se o seu ADN genómico (por exemplo, por tratamento com uma ou mais endonucl eases de tsdítrtçso i:e clonaram-se os fragmentos resultantes, identificando-se com uma sonda complementar da sequência pretendida, e despistar-se a presença de uma que codifique para a actividade pretendida. Quanto ao cADN, pode clonar-se o cADN e despistarem- se os clones resultantes com uma sonda para cADN codificando para a região pretendida. Depois de se isolar o clone pretendido, pode manipular-se o cADN de um modo substancialmente igual ao utilizado para o ABN genómico.Nucleic acids can be derived from a number of sources, including genomic DNA, subgenomic DNA, cDNA, synthetic DNA, and combinations thereof. Genomic DNA and cDNA can be obtained by a number of methods, as well as isolating cells encoding the desired sequence, by fragmenting their genomic DNA (for example, by treatment with one or more of the DNA sequencing endonuclides : and the resulting fragments were cloned, identified with a complementary probe of the desired sequence, and the presence of a coding for the desired activity was detected. As for the cDNA, the cDNA could be cloned and the clones with a cDNA probe encoding the desired region After the desired clone has been isolated, the cDNA can be manipulated in a manner substantially the same as that used for the genomic ABN.

Para além da sequência de codificação para a proteína com interesse, o constructo genético deverá conter uma série de regiões regulatórias. Para a expressão, são necessários diversos sinais transcricionais e translacionais reconhecidos por um hospedeiro apropriado. A sequência de codificação também deve estar ligada a um promotor compatível com a célula hospedeira. 0 promotor pode ser indutível, permitindo um melhor controlo da expressão, ou constitutivo. São conhecidos na técnica uma série de promotores adequados.In addition to the coding sequence for the protein of interest, the genetic construct should contain a number of regulatory regions. For expression, several transcriptional and translational signals are required by an appropriate host. The coding sequence must also be attached to a promoter compatible with the host cell. The promoter may be inducible, allowing better expression control, or constitutive. A number of suitable promoters are known in the art.

Em alternativa, a região promotora do ADN genómico pode ser obtida em associação com a sequência de codificação, na medida em que as células do hospedeiro reconhecerem os sinais de regulação transcricíonal e de iniciação translaeional associados com a região d.e codificação, a região 5' adjacente à sequência de codificação pode ser mantida e utilizada para a regulação da transcrição e da translação. Esta região incluirá tipicamente aquelas sequências que estão otDoltidris na inicíção da e na translação, tais como a caixa TATA, a sequência de capeio, a sequência DMdq e outras semelhantes. Esta região terá tipicamente um cormorimento de pe^o menos L50 pares de bases, mais tipicamente de cerco de 200 pb, excedendo raramente iilste dê entre 1 e 2 kb. A região não codificante 3' pode também ser mantida, em especial por causa das cuco ««spiivciab reguladoras da da transcrição, tais como o sinal de parar e a região poliadenilada. Para além disto, a região não codificante 3' também pode conter um potenciadcr. Quando os sinais de terminação da transcrição nãe forem satisfatoriamente funcionais nas células hospedeira, então poderá substituir-se por uma região funcional 3' de um gene diferente, A escolha da regido 3" para a substituição dependeria do sistema celular que se escolhesse para a expressão.Alternatively, the promoter region of the genomic DNA may be obtained in association with the coding sequence, as the host cells recognize the transcriptional regulation and translaeional initiation signals associated with the coding region, the adjacent 5 'region to the coding sequence can be maintained and used for the regulation of transcription and translation. This region will typically include those sequences that are in the initiation and translation, such as the TATA box, the capping sequence, the DMdq sequence and the like. This region will typically have a cormorant of at least 50 base pairs, more typically 200 base scrap, rarely exceeding 1 to 2 kb in size. The 3 'non-coding region may also be maintained, especially because of the transcriptional regulators, such as the stop signal and the polyadenylated region. In addition, the 3 'non-coding region may also contain a potentiator. When the transcription termination signals are satisfactorily functional in the host cells, it may then be replaced by a 3 'functional region of a different gene. The choice of the 3' for the substitution would depend on the cellular system chosen for the expression.

Pode utilizar-se uma grande diversidade de sequências de regulação da transcrição e da translação, consoante a natureza do hospedeiro. As sequências de regulação da transcrição e da translação podem ser provenientes de fontes virais (por exemplo, adenovirus, vírus de papiloma bovino, vírus dos símios, e outros semelhantes) quando os sinais reguladores são provenientes de um gene que possua um grau elevado de expressão no hospedeiro. Em alternativa, pedem empregar-se promotores de produtos de expressão de mamíferos (por exemplo, ;:í:,-,fina, colagénio, miosina e outros semelhantes) . Podem seleccionar-se os sinais reguladores da iniciação da transcrição que permitam a repressão ou a activação, e deste modo pode modular-se a expressão dos genes. Uma desças técnicas de tmáúLúçào controlável é a utilização de sinais regulatórios que sejam sensíveis à temperatura, de msoiê a que a se possa reprimir ou iniciar a expressão alterando a tèsipètátuta < Outra técnica de sejam sensíveis a determinados produtos químicos.A wide variety of transcriptional and translational regulatory sequences may be used, depending on the nature of the host. The transcriptional and translational regulatory sequences may be derived from viral sources (e.g., adenovirus, bovine papilloma virus, simian virus, and the like) when the regulatory signals are from a gene having a high degree of expression in the host. Alternatively, promoters of mammalian expression products (for example, fine, collagen, myosin, and the like) may be employed. Regulatory signals of initiation of transcription that allow for repression or activation can be selected, and in this way the expression of genes can be modulated. One technical consequence of controllable detection is the use of regulatory signals that are temperature sensitive, so that one can repress or initiate the expression by altering the testis < Another technique is to be sensitive to certain chemicals.

Os podem incluir uma sequência de ácidos nucleicos que seja endógena relativamente à célula hospedeira, em conjunto num promotor, potenciador, e outras regiões regulatórias que podem ser ou não endógenas relativamente à célula, Esses constructos tornam possível o aumento da expressão estável da sequência endógena (por exemplo, através do acoplamento operável de um promotor constitutivo) ou controiado (por exemplo, por intermédio de um acoplamento operável a sinais regulatórios).They may include a nucleic acid sequence that is endogenous to the host cell, together in a promoter, enhancer, and other regulatory regions that may or may not be endogenous to the cell. Such constructs make it possible to increase the stable expression of the endogenous sequence ( for example, via operable coupling of a constitutive promoter) or controlled (e.g., via operable coupling to regulatory signals).

Para se formarem os produtos genéticos, podem ligar-se os fragmentos de ADN de acordo com as metodologias convencionais conhecidas na técnica. Essas metodologias incluem a utilização de enzimas de restrição para transformar fragmentos com extremidades coesivas noutros com extremidades planas (ou vice-versa), polimerases e nucleótidos para encher as extremidades coesivas afim de se obterem extremidades planas, fosfatase âiíttXihii para evitar ligações indesejáveis, e ligases para unir fragmentos.In order to form the genetic products, the DNA fragments can be ligated according to the conventional methodologies known in the art. These methodologies include the use of restriction enzymes to convert fragments with cohesive ends other with blunt ends (or vice versa), polymerases and nucleotides to fill the cohesive ends in order to obtain blunt ends, âiíttXihii phosphatase to avoid undesired linkages, and ligases to join fragments.

Podem os constructos numa célula por transformação em conjunto com um gene que permita uma selecção, em que o constructo vir a ficar integrado no genoma do hospedeiro (por exemplo, por recomhinação nPÉél&ga}* Em geral, o iíooútriu:::!.õ í.uuíu; um ósctõr que tenha um sistema P# replicação reconhecido podo célula hospedeira.The constructs may be in a cell by transformation together with a gene permitting a selection, wherein the construct becomes integrated into the host genome (for example, by recombination nPEL & ga). an osteoblast having a recognized P # replication system can host cell.

Inciuem-se nos veículos de expressão para a ptDdiqplo uus: moléculas da invenção, os plâSffsíditó e outros vectores. Em geral, esses vectores contém sequências de controlo que permitem a expressão em diverscs tipos de células. Podem construir-se vectores de expressão adequados que contenham a codificação e as sequências de controlo pretendidas utilizando metodologias de ADN recombinante que são conhecidas na técnica, muitas das quais se encontram descritas em Sambrcok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratcry, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).They are introduced into the expression vehicles for the molecule of the invention, the plasmids and other vectors. In general, such vectors contain control sequences that allow expression in various cell types. Suitable expression vectors containing the desired coding and control sequences can be constructed using recombinant DNA methodologies which are known in the art, many of which are described in Sambrcok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratry, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Um vector de expressão tal como contemplado na invenção presente é pelo menos capaz de dirigir a replicação e a expressão do ácido nucleico que codifica para a prcteína com interesse ou para o produto genético da ciclina 0. Uma classe de vectores utiliza elementos de ADN que proporcionam plasmídeos extra cromossómícos que se replicam autonomamente, provenientes de vírus de animais (por exemplo, vírus de papiloma de bovinos, vírus de polioma, adenovirus, ou SV40). Uma segunda classe de \rectores baseia a sua actuação na integração das sequências genéticas pretendidas no cromossoma da célula hospedeira.An expression vector as contemplated in the present invention is at least capable of directing the replication and expression of the nucleic acid encoding the subject with interest or the cyclin 0 gene product. A class of vectors utilizes DNA elements that provide autonomously replicating extra-chromosomal plasmids from animal viruses (e.g., bovine papilloma virus, polyoma virus, adenovirus, or SV40). A second class of rectors bases their action on integrating the desired genetic sequences into the host cell chromosome.

Os vectores de expressão úteis na invenção presente contêm tipicamente uma origem de replicação, um promotor localizado em $ llMm é, a montante) relativamente à sequência de ADN a expressar, e um mequênole de terminação da Incluem-se nas origens de replicação que são adequadas, por exemplo, as origens de replicação ColEl, plclOX,, M13, SV40 e EBV. As sequências de 1®ΐΜ.οχρΑο adequadas incluem, Ç P?x';b j xod) ®M<i;3pTq e : . ; \.: ' :v:··; :· v X:.; um r; S'X .r o;rX:0:aC;::?d ..:;· í>r.:a:ò:q- apod xGpeapííi « iea uin '.·χ·,ΐ. Rã,ã. ãàpv>ãã: R:: de Οχ θρ :-R; d:' ap >:·χ·Ρχχύ;.:^χ e maqxuuad anb ’ ::·aadHi o.ví:ap SerpU o r r. v ο-ηχ apod χ;:χΡίίΐί5:χ openbape oessaãdxa ap ..χα-χαχα χχ χχ-χξχχ.; O-ilí· a ' T:v 0¾ ϊΧΟΧ; ' χ νΐχ bsSrerx^nxo· 'oíduiaxa jod θ3-ρ[θλ ''Ζϊ'&ή^'ά&ύ&χρ %:ϊλ:®μ>ϊ ureiquooua as a ν&ψχ&φ* eu sopxoaquoo ofs ãj^T-zwwm soqsa srcpo^ ap saseajonuopua 2 o d ι·:;:···;·:::λ x χο e ejed s-ipqpT í8®KSl'dio4$-!d anb r,;;;:>:. ap , . θρ oqtiaurroaTquooaj ap «FTCd:;i:"l;dS: se a í^;|:s ap exouartbas ep oessajdxa e η-οχη uia uiepnbaj anb se .'oessajdxa i-p oqnpoxd op òfde&axfea e ΐνΐ^οτ:;· Jodc: :;d anb ap tdárxoxdpit ΘΡ sbt011?11^98 se 'oessajdxa ap oqnpoxd o eied Í^gpTrpq^Xwç? Si$KfôT:Dddds.2d anb r«>pfpftl:qddt® ap rcajer-api f ap d:F|:5^|;dlXssÍ?f se iSrpObÓ&Oíí· si-ssau a e--.-0:-¾ π r ο αχ *·%ρτψΜν$$ά oqnpojd op ífiiJiddp o. essejdxa euin ened spjouanbas sejqno oessajdxa ap sajoqoaA sou ^tbtXíwT uiapod as %ζψ%Μ·& 'ú-lãl J°d c;" 'p: ias apod 3nb oejado ο ψ opduiaxa uin ap no saqua-rjqnu ap jod) oessandxa çp óf: epod *qmrã ppqx-a· α-ΟηΑχιηοχ.οηα op opipqo oer • :v:a;;parp\Vd:;··'' op oiauí ou 'sajoqnpux sojqno a: j:;.p;w pob no eóuasajd eqad 'opduiaxa .Pr ηκ:® <y jrrpm^ad ejed * ra4|dspdr na o a Ά^ΝΗΟΥ sSSppf TTãd l-oaaao.rdExpression vectors useful in the present invention typically contain an origin of replication, a promoter located at ÂμM, is upstream) relative to the DNA sequence to be expressed, and a termination mequenase is included in the origins of replication which are suitable , for example, the replication origins ColEl, plclOX, M13, SV40 and EBV. Suitable β-sequences include, for example, the following sequences: ; \: ': v: ··; : • v X: .; a r; (A) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·. Frog, ã. ãàpv> ãã: R :: de Οχ θρ: -R; d: 'ap': · χ · χ · Ρ · χ · χ · χ · χ ' v ο-ηχ apod χ;: χΡίίΐί5: χ openbape oessaãdxa ap ..χα-χαχα χχ χχ-χξχχ .; O-ylyl-T: v 0¾ ϊΧΟΧ; 'Χ νΐχ bsSrerx ^ NXO ·' oíduiaxa jod θ3-ρ [θλ 'Ζϊ' & ή ^ 'ά & ύ & χρ%: ϊλ: ®μ > ϊ ureiquooua them to ν & ψχ & φ * I sopxoaquoo ofs j The results are summarized in the following table and are shown in the table below. The results are summarized in the following table. :. ap θρ oqtiaurroaTquooaj after 'FTCd:; i: "l; ds: If the R ^, |: app s exouartbas p oessajdxa and η-οχη UIA uiepnbaj anb is .'oessajdxa ip oqnpoxd op òfde & axfea and ΐνΐ ^ οτ :; • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • In the case of the invention, the composition of the compound of the formula: ## STR1 ## in which R 2 is as defined in formula (I): ## STR1 ## in which R 1 is as defined in formula -¾ π r ο αχ * ·% ρτψΜν $$ ά oqnpojd op ífiiJiddp o. In this case, it is important to note that, J = 'W: IAS apod 3NB oejado ο ψ opduiaxa uin after the Saqua-rjqnu after jod) oessandxa of CP: * EPOD QMRA ppqx to ΟηΑχιηοχ.οηα · α-op opipqo oer •: v: The PARP ;; \ Vd :; . ·· 'or op oiauí' sajoqnpux sojqno to: j:; w; w pob in eqad eóuasajd 'opduiaxa .PR ηκ: ® < jrrpm y ^ d * AR4 ejed | dspdr in Ά ^ o l- ΝΗΟΥ sSSppf TTãd Hello

o a oi içb ap Já ΧΐΟϊΐο ;::·; SOii 0-.¾ ··%·;:"! [;.n.: ·; d-dv^ÕSd o o ! οχ cRoo x-o PSd 3 l:ã-T ri A X íXv tíx:· au·-::·: . χ;:.> :· sajoqotuojd ϊ:|5»χχ.«#Ρ«χ:χϊ4 ap joqoinojd o *o ai içb ap Já ΧΐΟϊΐο; :: ·; SOii 0-.¾ ··% ·;: "![; .n: ·; d-dv ^ ÕSd o o! χ χ χ x x x x x x PS PS PS PS PS PS PS χ χ χ χ χ χ χ χ. χ;:. > : · Sajoqotuojd ϊ: | 5 »χχ« «Ρ« χ: χϊ4 ap joqoinojd o *

jod ípâdf X|SíS ^ό·:ρ.Ρρχνά p 'oídmaxa xod ap ixmrri so a 'euiAcq oquamjosaio ap e outras semelhantes. 0 gene marcador seleccionável pode estar quer directamente ligado a sequências de codificação qus serão expressas, quer ser introduzido na mesma célula por co-transfecção. Incluem-se nos exemplos de marcadores seleccíonáveís os genes que conferem resistência a neomicina, a ampicilina, a higromicina, e outros semelhantes.The invention relates to a method for the preparation of a compound of the formula (I) and the like. The selectable marker gene may be either directly linked to coding sequences that will be expressed, or introduced into the same cell by co-transfection. Examples of selectable markers include genes conferring resistance to neomycin, ampicillin, hygromycin, and the like.

As características dos vectores de expressão que sejam de facto utilizados devem incluir uma compatibilidade com a célula hospedeira que se irá empregar. Para um hospedeiro mamífero, por exemplo, o vector de expressão pode conter promotores isolados do genoma das células de mamífero, (por exemplo, promotor de metalotionina do murganho), ou de vírus que cresçam nestas células (por exemplo, o promotor 7,5 K do vírus vaccinia).The characteristics of the expression vectors that are in fact used should include compatibility with the host cell to be employed. For a mammalian host, for example, the expression vector may contain promoters isolated from the genome of mammalian cells, (for example, mouse metallothionine promoter), or from viruses that grow on these cells (e.g., promoter 7.5 K of the vaccinia virus).

Incluem-se nos vectores de expressão comercialmente disponíveis e adequados para a inserção das sequências de codificação da invenção presente, os vectores de expressão ae mamíferos pcDNA I ou pcDNA I/Neo® (que é o preferido),o vector de expressão de baculovírus pii&tB&d) o de expressão procariótico pcDM II e o vector de expressão de leveduras pYes2, todos os quais se podem obter junto da Invitrogen Corp., San Diego, Calif. im; q?:· A igcqgtçâ::; presente diz a hospedeiras que contenham sequências de para a proteína com ínieresse e o produto sabático ciclina D. As cál.Pla.õ hospedeiras adequadas são células eucariotas; por exemplo, células de insectc de Spodoptera frugiperda, células CQS-7, humanos, e células de Saccharomyces cerevisiae. Incluem-se nas células â® mamíferos que podem ser atais como hospedeiras as células com origem cas (por exemplo, VERO ou CH0-K1) ou com origem lisõMsa (por exemplo, SP2/0-AG14, ou ou os seus derivados. As células de mamíferos que são preferidas são as células de CHQ.Commercially available expression vectors suitable for insertion of the coding sequences of the present invention include mammalian expression vectors pcDNA I or pcDNA I / NeoÂ® (which is preferred), the baculovirus pii &amp; , dB and d) prokaryotic expression of pcDM II and the yeast expression vector pYes2, all of which can be obtained from Invitrogen Corp., San Diego, Calif. im; q? The present invention relates to host cells which contain sequences of the interleaved protein and the cyclin D sabbatic product. Suitable host cells are eukaryotic cells; for example, Spodoptera frugiperda insect cells, CQS-7, human cells, and Saccharomyces cerevisiae cells. Included in the mammalian cells are cells which may be host cells (for example, VERO or CHO-K1) or lysosomal origin (for example, SP2 / 0-AG14, or derivatives thereof). mammalian cells which are preferred are the CHQ cells.

Também são Úteis como células hospedeiras as células imortalizadas, tais como células de linfoma ou de mieloma. Estas células podem ser cultivadas nos meios nutrientes adequados em boiões de cultura ou injectadas num hospedeiro sinergético (por exemplo, em murganho ou em rato), ou num hospedeiro ou num local do hospedeiro que seja imunodeficiente (por exemplo, murganho nu ou bolsa de hamster) , Em especial, podem introduzir-se as células na cavidade abdominal para a produção de fluido ascítico, e colher-se a molécula quimérica. Em alternativa, podem injectar-se as células por via subcutânea e recolherem-se os anticorpos do sangue do hospedeiro. Podem utilizar-se as cêlolas do mesmo modo que as tilula; 3 de hibridoma. Veja-se Diamond et al., N. Eng. J. Med. 304, 1344 (1981); MonoclonalImmortalized cells, such as lymphoma or myeloma cells, are also useful as host cells. These cells may be cultured in the appropriate nutrient media in culture vessels or injected into a synergistic host (e.g., mouse or rat), or in a host or host site that is immunodeficient (e.g., nude mouse or hamster bag ) In particular, cells may be introduced into the abdominal cavity for the production of ascitic fluid, and the chimeric molecule is harvested. Alternatively, the cells may be injected subcutaneously and the antibodies collected from the host blood. The cello can be used in the same way as the cello; 3 hybridoma. See Diamond et al., N. Eng. J. Med. 304, 1344 (1981); Monoclonal

Antibodies: Hybridomas-A New Dimension ín Biologíc (Kennatt, et al., editores.) Plenum (1980).Antibodies: Hybridomas-A New Dimension in Biology (Kennatt, et al., Editors.) Plenum (1980).

Os vectores de expressão podem introduzidos nas células nos pedeiras por diversos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, pode-se Levar a cabo a transfecção de células hospedeiras com vectores de expressão pelo método de precipitação com fosfato de cálcio, lio entanto, também se podem utilizar outros métodos para Introduzir vectores de expressão nas células hospedeiras (por exemplo, electroporação, fusão de lipossomais, injecçãc nuclear, e infecção com vírus ou com Lagos).Expression vectors can be introduced into the cells in the pedeiras by various methods known in the art. For example, transfection of host cells with expression vectors can be carried out by the calcium phosphate precipitation method, however, other methods can also be used to introduce expression vectors into the host cells (e.g., electroporation, liposomal fusion, nuclear injection, and virus or Lagos infection).

As células contende um vector de expressão podem ser identificados por uma ou mais das seguintes tecnologias: ;'e: a hibridizayão AND - ADN; (b) a presença ou a ausência de funções de genes como mareadores; (c) a do teor de transcrição tal como é medida pela produção de mARN transcrito que codifique para os constructos genéticos na célula hospedeira; (d) a detecção imunológica do produto genético; (e) a determinação enzimática; e (f) PCR. Estes métodos são bem conhecidos na técnica; veja-se, por exemplo, a Patente . S. No. 5.744.314, que se incorpora neste documento por referência.Cells containing an expression vector may be identified by one or more of the following technologies: DNA-DNA hybridization; (b) the presence or absence of gene functions as dizziness; (c) a of the transcription content as measured by the production of transcribed mRNA encoding the genetic constructs in the host cell; (d) the immunological detection of the gene product; (e) the enzymatic determination; and (f) PCR. These methods are well known in the art; see, for example, the Patent. No. 5,744,314, which is hereby incorporated by reference.

Os vectores de expressão e as moléculas de ADN da invenção presente também podem ser sequenciados. São conhecidos diversos métodos de sequenciação na técnica. Veja-se, por exemplo, o método didesoxilo dê terminação da cadeia que foi descrito por Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-7 ίΙ-ΤΠϊ * e o método de Maxam-GíIbert descrito em Proc. Natl. tkcad, Sci USA 74, 560-4 {13Ή} ,The expression vectors and DNA molecules of the present invention may also be sequenced. Various methods of sequencing in the art are known. See, for example, the dideoxy terminus of the chain which has been described by Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Know. USA 74, 5463-7; and the Maxam-Gibber method described in Proc. Natl. tkcad, Sci USA 74, 560-4 {13Ή}

Uma vez introduzido um vector de expressão numa célula hospedeira adequada, a célula pcck; eex uuíélveciíí em c:oai.d.i.çd-®B que permitam a expressão da proteína com Interesse. Pode isolar- se a proteína com interesse, e purificar-se, de acordo ca® condições habitualmente utilizadas, tais como a extracção, a prscipiiáçidç a cromatografia, a cromatografia de a electroforese, e outras semelhantes. 0 método preferido é a cromatografia de afinidade.Once an expression vector is introduced into a suitable host cell, the pcck cell; and which can be expressed in terms of expression of the protein of interest. The protein of interest can be isolated and purified according to commonly used conditions such as extraction, chromatography, chromatography, electrophoresis, and the like. The preferred method is affinity chromatography.

Ceve portanto entender-se, * que nem todos os vectores de expressão e sequências reguladoras do «cís funcionarão igualmente bem na expressão dos ácidos nucleicos da invenção presente. Nem todas as células hospedeiras funcionarão igualmente bem com os mesmos sistemas de expressão. No entanto, cm indivíduo com conhecimentos médios da técnica pode fazer uma selecção dos vectores de expressão, das sequências reguladoras de ADN, e das células hospedeiras, utilizando as linhas mestras proporcionadas neste documento evitando experimentação extensa e sem que se ultrapasse o espírito e o âmbito da invenção presente. mmIt will therefore be understood that not all expression vectors and cDNA regulatory sequences will function equally well in the expression of the nucleic acids of the present invention. Not all host cells will work equally well with the same expression systems. However, in the person of ordinary skill in the art he can make a selection of the expression vectors, the DNA regulatory sequences, and the host cells, using the guidelines provided herein, avoiding extensive experimentation and without overcoming the spirit and scope of the present invention. mm

Descrevem-se adiante em pormenor concretizações especificas da invenção presente. Estas concretizações servem como exemplos e ilustram a larga aplicabilidade da invenção presente, A não ser quando se indique expressamente na especificação algo em contrário, estas xmizx&tiz&çá&s IsmlmB os elementos preferidos da iPPiPZçáu.Specific embodiments of the present invention will be described in detail below. These embodiments serve as examples and illustrate the wide applicability of the present invention. Unless expressly stated in the specification to the contrary, such compositions are the preferred elements of the invention.

Materiais & MétodosMaterials & Methods

Fl;Fl;

Clonou-se o gene de Ciclína Dl humana (n°. de acesso Genbank Noálill e® pcDNA 3.1 (Invítrogen) e expressou-se de forma constitutiva sob o promotor/incrementador de citomegalovirus (CMV) para se gerar ciclina Dl/pcDNA 3.1. 0 vector também é portador de gene de resistência a neomicina para a selecção de linhas celulares de mamiferos que sejam estáveis na presença de G418.The human Cyclin D1 gene (accession no. Genbank Noálill and pcDNA 3.1 (Invitrogen) was cloned and constitutively expressed under the cytomegalovirus (CMV) promoter / enhancer to generate cyclin D1 / pcDNA 3.1. The vector also carries a neomycin resistance gene for the selection of mammalian cell lines that are stable in the presence of G418.

Cultura de CélulasCell Culture

Cultivaram-se células de CHQd"(SF) em placas com 100 mm de diâmetro, em meio completo fPIIEM (Gibcc/BRL), com 5% de Soro Fetal Bovino (JRH Biosciences), 1% de aminoácidos não essenciais (Gibco/BRL), 1% de hipoxantina/timidina (HT) (Gibco/BRL), e 1% de glutamina/penicilina/estreptomicina (Gibco/BRL)}. As células foram tratadas com tripsina, contadas, e semeadas em placas de 60 mm (Falcon), a I&ltr vilgias/piao;!> Fizeram-se crescer células de CH0d~ AM-1 em cultura em suspensão num agitador, em meio AòqÇr VM-soy. Contaram-se as eiluMs, centrifugou-se, voltou a suspender-se em meio completo, e semearam-se em placas de 60 mm a IssiíT pm placa. Incubaram-se as células de um dia para o Pdifòv Três horas antes da transfecção, substituiu-se o meio das oèmlae por 4 mL de meio fresco. ή ·;··· :·:· !· ·· ,· :ϊ y ·.. .·. .s.x.- u. v ^ ·. (Invitrogen) contendo a inserção de cADN de ciclina Dl. Para cada placa de 60 :0¾ com células, 5 adicionaram-se pg ae pcDNA3.1 Ãciciina Dl (2 e 5 pg de veículo genómico de ADN de murganho (Ciontech) (100 púdmli a 172,5 pL de água destilada estéril. Adicionaram-se então 25 pL de solução 2,5 M de ChCiò a solução de ADN, oblendc-se um volume final de 250 pL. A título de controlo do vector, adicionaram-se 5 pg de ADN vector pneo (1,126 mg/mL) em conjunto com 5 pg de ADN veículo, a 170,5 pL de água estéril, em seguida 25 pL ae solução 1*5 M de CaCl·. A título de falso controlo, adicionaram-se 25 pL de solução 2,5 M de CaCl2 a 225 pL de água. Adicionaram-se as soluções de ADN gota a gota a iguais volumes (25C>pL) de 2xHBS (280 mM em NaCl, 10 mM em KC1, 1,5 mM em 0,2 mM em dextrose, 50 mM em WEPES, pH 7,05), através da qual se borbulhou constantemente ar. Incubaram-se as soluções de ADN./HBS á temperatura ambiente durante 30 minutos. Removeu-se o meio das placas com células de CHO e adicionaram-se gota a gota as soluções de ADN/HBS (500 pL de volume total por placa). Tratou-se um total de 3 placas com poMfôl:, 1/ciclina Di, e uma placa com cada um dos controlos, de vector e falso, para cada linha de células. Incubaram-se as Oâlõlês à temperatura ambiente durante 30 minutes, e em seguida adicionou-se a cada placa 3 mL de meio completo. Incubaram-se ótiâo as células de um dir para 0 outro a 37°C. No dia seguinte, atingiram a oo:*fluênci,:S: 48 horas depois da Fizeram-se reagir as células com tripsina e volPou a piaquear-se em meio complete a mm tãtãê de uma placa de 60 mm para 8 placas de 100 «u No dia seguinte, substituiu-se o adi sor meio complete contendo I rqórt de Geneticína (G418) (Gibco/BRl). As células de LHO AM-I atingiram a confluência 72 horas depois da transfecção e foram de igual forma plaqueadas de novo. Substituiu-se o meio das células duas vezes por semana com meie completo fresco -G418. Dez dias depois da adição inicial do meio selectivo G418, isolaram-se colónias das placas transfectadas com células de CHO(SF) e com as células de CHO AM-1 ciclina Dl, utilizando cilindros de vidro de clonagem (Bélico). Trataram-se as células com tripsina e voltaram a semear-se em placas de 24 poços. A frequência de transfecção nas células de CHO(SF) era muito superior (ilOS colónias/placa) do que a das células de CHO AM-1 (20-30 colónias/placa). Isolaram-se no total 72 colónias a partir das placas de CHO (SF) /ciclina Dl, e 68 colónias das placas de CHO AM-l/ciclina Dl. Não estavam presentes colónias em nenhum dos conjuntos de placas de controlo falso contendo meio selectivo G418. Depois de se terem colhido as células, trataram-se com tripsina as células restantes em cada placa e juntaram-se em culturas globais em placas de 100 mm (3 destes conjuntos para CHO(SF)/ciclina Dl, e 2 conjuntos para CHO AM-1 /ciclina Dl).CHQd cells (SF) were plated on 100 mm diameter plates in complete medium fPIIEM (Gibcc / BRL), 5% Fetal Bovine Serum (JRH Biosciences), 1% non-essential amino acids (Gibco / BRL ), 1% hypoxanthine / thymidine (HT) (Gibco / BRL), and 1% glutamine / penicillin / streptomycin (Gibco / BRL). The cells were treated with trypsin, counted, and seeded in 60 mm plates (Falcon), and the cells were cultured. CHOd-AM-1 cells were grown in suspension culture on a shaker in medium VM-soy. The cells were counted, centrifuged, resuspended in complete medium, and seeded in 60 mm plates onto the plate. One day cells were incubated for Pdifos Three hours prior to transfection, the medium was replaced with 4 ml of fresh medium. · ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ. . . (Invitrogen) containing the cyclin D1 cDNA insert. For each 60: 0¾ plate with cells, pGa and pcDNA3.1 Î »dyin (2 and 5 pg of mouse DNA genomic vehicle (Ciontech) (100 pfu) were added to 172.5 pL of sterile distilled water. 25 Âμl of 2.5 M solution of ChCl3 was added to the DNA solution, leaving a final volume of 250 Âμl. As a vector control, 5 Âμg of pneo vector DNA (1.126 mg / ml) together with 5 Âμg of carrier DNA, were added to 170.5 Âμl of sterile water, then 25 Âμl to 1 ÂμM CaClÂ · 1 solution. As a by-pass, 25 Âμl of 2.5 M solution of (25C > pL) of 2xHBS (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM 0.2 mM in dextrose, < RTI ID = 0.0 > 50 mM in WEPES, pH 7.05), by which air was continuously bubbled. The DNA / HBS solutions were incubated at room temperature for 30 minutes. The medium was removed from the plates with CHO cells, the DNA / HBS solutions (500æl total volume per plate). A total of 3 plates were treated with poMfÎ²1,1 / cyclin Di, and one plate with each of the vector and false controls for each cell line. The Ools were incubated at room temperature for 30 minutes, and then 3 ml of complete medium was added to each dish. Cells were incubated from one dir to the other at 37 ° C. On the following day, the cells were reached with trypsin and volatilized in complete medium on a 60 mm plate for 8 100 Âμl plates The next day, the complete medium containing Geneticin Iqqrt (G418) (Gibco / BR1) was replaced. LHO AM-I cells reached confluency 72 hours after transfection and were similarly plated again. The cells were replenished twice a week with fresh whole-G418 stock. Ten days after the initial addition of the selective medium G418, colonies were isolated from the CHO (SF) cells and CHO AM-1 cyclin D1 cells, using cloned (Warlike) glass cylinders. Cells were treated with trypsin and re-seeded in 24-well plates. The frequency of transfection into CHO (SF) cells was much higher (ilOS colonies / plaque) than that of CHO AM-1 cells (20-30 colonies / plaque). A total of 72 colonies were isolated from the CHO (SF) / cyclin D1 plates, and 68 colonies from the CHO AM-1 / cyclin D1 plates. No colonies were present in any of the false control plate assemblies containing G418 selective medium. After the cells were harvested, the remaining cells were treated with trypsin on each plate and pooled in 100 mm dishes (3 of these sets for CHO (SF) / cyclin D1, and 2 sets for CHO AM -1 / cyclin D1).

As células transfectadas foram cultivadas até à confluência e voltaram a ser plaqueadas em placas de 6 poços, 2 poços por clone/conjunto. Depois de se atingir a confluência, um poço dos poços atribuídos a cada clone/conjunto foi lisado com 250 mL de tampão de lise de Triton a 1% ÇU de TrítonxlOO, 1 siu em. 55finA, 50 wM em Trís/HCl, pH 8, 100 em NaCl, íníbídores de protease) . os iisados a 14 K durante 15 minutos, liypajcuram-çc os sobrenadantes e armazenaram-se a -150-5, Analisaram-se os Iisados por transferência Western para íp.âb:tif.ic-3r a expressão de ciclina Dl. Misturou-se 25 μΐ de cada amostra e das amostras de controlo das linhas células de CHO(SF) e de CHO AM-1 originais, com 5 pL de tampão de amostra em gel tlFAílEf ferveu-se durante 3 minutos, e carregou-se sobre geles de Tri.s-glicína Novex a 12%. Os geles sofreram uma electrotransf erência para filtros de 0,2 κιμ em nitrocelulose (Schleicher e Schuell). Sondaram-se os filtros com anticorpo monoclonal Ab-3 anti-ciclina Dl (Calbiochem) e desenvolveram-se utilizando reagentes da Anersham ECL. Os resultados indicavam diversos graus de sobre expressão de ciclina Dl nas culturas dos conjuntos e na maior parte dos clones.The transfected cells were cultured to confluency and re-plated in 6-well, 2-well plates per clone / pool. After confluency was reached, one well of the wells assigned to each clone / pool was lysed with 250 ml of 1% Triton 1% Triton lysis buffer of 1x Trin-100,000. 55 æM, 50 æM in Tris / HCl, pH 8, 100 in NaCl, protease inhibitors). the extracts at 14 K for 15 minutes, added the supernatants and stored at -50 DEG-5 DEG C. The Western Assays were analyzed for the expression of cyclin D1 by Western blotting. 25 μl of each sample and the control samples from the original CHO (SF) and CHO AM-1 cell lines were mixed with 5 μl of gel-buffered sample and boiled for 3 minutes, and loaded on 12% Tri-glycine Novex gels. The gels were electrotransferred to 0.2 κιμ filters on nitrocellulose (Schleicher and Schuell). The filters were probed with anti-cyclin D1 monoclonal antibody (Calbiochem) and developed using Anersham ECL reagents. The results indicated varying degrees of cyclin D1 overexpression in the set cultures and in most clones.

As duas culturas dos conjuntos de CHO AM-1 CHO/ciclina Cl e as duas culturas com maior sobre expressão dos conjuntos de CHO(SF)/ciclina Dl foram combinadas obtendo-se "material de base" para cada linha celular a ser utilizada em transfecções ulteriores. Testaram-se as culturas dos materiais de base para determinar se tinham retido o fenótipo negativo DHER fazendo crescer as células em meio selectivo isento de hipoxanfina/timidina (DMEM, 5% de soro fetal bovino dialisado (Hyclone) , aminoácidos não essenciais, glutamina/penicilina/estreptomícina). HSo se detectou qualquer crescimento celular neste meio. :'ú.··:'":·£·:· ^ uõ Ã‘:·' ·:'> À :·:'·>·: è v:- :¾.The two cultures of the CHO AM-1 CHO / cyclin Cl assemblies and the two cultures with the highest overexpression of the CHO (SF) / cyclin D1 pools were combined to obtain " base material " for each cell line to be used in subsequent transfections. The cultures of the base materials were tested to determine whether they had retained the DHER negative phenotype by growing the cells in hypoxanfin / thymidine-free selective medium (DMEM, 5% fetal calf dialysate (Hyclone), non-essential amino acids, glutamine / penicillin / streptomycin). HSo was detected any cell growth in this medium. : '': '': '': '' To::::::::::::.

A.;:, cultoras iaí το i' n ?' 1 a e dê AM-1 QHQ^/á:;u:;::l;Lnu ui f&rM suplementado com 1 íuptai: de G418. Estas células totum í um placas de 60 mm a 8xl05 uèiuaiUa/pluõa e incabãítaã Ue para o outro. Transfectararn-se as células utilizando o protocolo acima com pSWãJ derivado próximo de pDSRa2) /AND alvo osra EFC, MM de controlo de vector pDSRo.2, e ADN veículo de esperma de arenque (Gibco/BRL) . Utilizcu-se uma concentração final de 3 jiiqtpldCã em pSW19/ADN de EPO. Vinte e quatro horas depcis das transfecções, foi proporcionado meio fresco as células. Setenta e duas horas após a trançfecção as células foram tratadas com tiipsina e voltaram a plaquear-se em meio selectivo + 1 mg/inL de G418, a uma razão de 1:8, 1:10, e 1:20 (placas de 60 mm ; placas de 100 mm) . Substituiu-se o meio das placas duas vezes por semana com meio fresco contendo G418. Doze dias depois deste último plaqueamento, 48 cclónias foram isoladas a partir das placas de r/tdçliçjã Dl/transfectadas com EPO. As células remanescentes foram tratadas com tripsina e combinadas em duas culturas de base. Quinze aias depois de se haverem plaqueado de novo, isolaram-se 48 colónias a partira das células de CHO AM-1 /ciclina Dl/transfectadas com EPO, e as células remanescentes foram combinadas em duas culturas de base. Analisou-se a expressão da EPO por transferência Western em colheitas de culturas e meio condicionado isento de soro, a partir de culturas confluentes em placas de 24 poços, quer de clones isolados quer das culturas de base em placas de 100 mm. Fizeram correr-se geles em meio redutor, e sondaram-se as transferências com anticorpo monoclonal '21';$ anti-EPO.A, 1a, and give AM-1 QHQA / μM; 1 μM MMR supplemented with 1% G418. These cells totaled 60 mm plates at 8x105 urea / urea and incubated for another. Cells were transfected using the above protocol with pSRÎ ± 2 derived next to pDSRÎ ± 2 / TARGET target DNA EFC, vector control vector pDSRo.2, and herring sperm vehicle DNA (Gibco / BRL). A final concentration of 3 Âμg / cm 2 in pSW19 / EPO DNA was used. Twenty-four hours after transfections, the cells were given fresh medium. Seventy-two hours post-transfection the cells were treated with thipypsin and plagued in selective medium + 1 mg / ml G418, at a ratio of 1: 8, 1:10, and 1:20 (60 mm, 100 mm plates). The medium of plaques was replaced twice a week with fresh medium containing G418. Twelve days after the latter plating, 48 clones were isolated from the Dl / transfected EPO plates. The remaining cells were treated with trypsin and combined in two base cultures. Fifteen years after plating again, 48 colonies were isolated from CHO AM-1 / cyclin D1 / transfected EPO cells, and the remaining cells were combined in two base cultures. EPO expression was analyzed by Western blotting in crop harvests and serum free conditioned medium from confluent cultures in 24 well plates of either isolated clones or of the base cultures in 100 mm dishes. Gels were run in reducing medium, and blots were probed with anti-EPO '21' monoclonal antibody.

fr&tã Γηόρύίο* PPGfr & tã Γηόρύίο * PPG

Levaram-se a cabo as transfecções com pír de ADN de OPG nas culturas de base de CHOd" /cici'ira Dl e de CHOcT AM-1 /ciclinaoml, e na linha original de CHOd' (SF) , do mesmo modo ute: se haviam levado a cabo as transfecções de EPO.The transfections were performed with OPG DNA in the CHOd base cultures " D1 and CHOcT AM-1 / cyclinomol, and in the original line of CHOd '(SF), in the same way: the EPO transfections had been carried out.

Fizeram-se duas transfecções em separado com OPG-Fc (22-201), para todas as três Linhas de células hospedeiras. Colheram-se no total i24 colónias de CHO(SF), 110 de CHO(SF)/cycD, e 147 de CHC AM-1 /loooí· a partir das transfecções com OPG-Fc (22-201) . a expressão da transfecção com OPG nos clones resultantes por transferência Western utilizando anticorpo anti-(Pierce), ou anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade anti-huOPG.Two separate transfections were done with OPG-Fc (22-201), for all three lines of host cells. A total of 24 CHO (SF), 110 CHO (SF) / cycD, and 147 CHC AM-1 / lovii colonies were harvested from the OPG-Fc (22-201) transfections. the expression of OPG transfection in the resulting clones by Western blot using anti-Pierce antibody, or anti-huOPG affinity purified rabbit polyclonal antibody.

Contrastação de ADN com lodeto de PropidioDNA contrast with Propidium iodide

Semearam-se as células em placas de 100 mm e deixaram-se crescer até cerca de 50% de confluência. As células têm que estar na fase logarítmica para este teste. Colheram-se as células por tratamento com tripsina e transferiram-se para um tubo de centrífuga contendo igual volume de DMEM/FBS por intermédio de uma pipeta. Contou-se uma alíquota da suspensão de células com um bernocitómetrc. A densidade em células deve ser de entre cerca de 10° - 107 células em 5 SL Por centrifugação a 1000 x g obtíveram-se pastilhas de células que se lavaram por duas vezes com PBS ê temperatura de gelo. As células têm que motor itob o lulaoio do 'ama maasnotaaão dm célíu&s Adicionou-se 0r$ mL de SES e agitou-se a suspensão de células a» vortex. Fixaram-se mitãD as células adicionando 2 mL de etanol a 70%, gota e gota, ao Xcoifa da parede do tubo, ααικαοοαΡ;;.:; se agitava suavemente a od/spoaxvAo do células, d período oladasvo para esta fixação é de 30 minutos. (Nessa altura pode armazenar- se a suspensão de células durante cerca de 2 semanas a 4°C antes da contrastação e da análise). Cenirifugaram-se as eélalM para remover o etanol sobrenadante, lavou-se umu vez com FBS e deixou-se voltar a hidratar durante 5 minutos a 4°C.The cells were seeded in 100 mm plates and allowed to grow to about 50% confluency. The cells must be in the log phase for this test. The cells were harvested by trypsin treatment and transferred to a centrifuge tube containing equal volume of DMEM / FBS via a pipette. An aliquot of the cell suspension was counted with a biocytotometer. The cell density should be between about 10 - 107 cells in 5 SL. By centrifugation at 1000 x g cell pellets were obtained which were washed twice with PBS at ice temperature. Cells have to be engineered with the cell pellet and the cell pellet was added. The SES was added to the suspension and the cell suspension was vortexed. The cells were fixed by adding 2 ml of 70% ethanol, dropwise and dropwise, to the tube wall X-ray, ααικαοοαΡ; the cells were gently shaken, and the time period for this fixation was 30 minutes. (At that time the cell suspension can be stored for about 2 weeks at 4øC prior to counting and analysis). The cells were centrifuged to remove the supernatant ethanol, washed once with FBS and allowed to rehydrate for 5 minutes at 4 ° C.

Centrifugaram-se as células, removeu-se o PBS, e voltou a suspender-se a pastilha em 0,5 mL de solução de iodeto de propidio (Molecular Probes) (a v0 μ/mL, preparada em PBS). Adicionou-se-lhe 10 μΐ de RN-ase isenta de DN-ase (10 mg/mL) (Boehringer Mannheim!, e incubou-se a suspensão de células a 37°C. durante 20 minutos. Diluíram-se as amostras com 1 mL de PBS e analisaram-se por FACS menos de 1 hora depois.Cells were centrifuged, PBS was removed, and the pellet was resuspended in 0.5 ml propidium iodide solution (Molecular Probes) (a v / ml, prepared in PBS). 10 μl DN-ase-free RN-ase (10 mg / ml) (Boehringer Mannheim!) Was added, and the cell suspension was incubated at 37 ° C for 20 minutes. 1 mL of PBS and analyzed by FACS less than 1 hour later.

Amplificação dos GenesAmplification of Genes

Levou-se a cabo a amplificação dcs genes nas células pela adição gradual ao meio de crescimento, em porções, de metotrexato (MTX). Subcultivaram-se as células em placas de 100 m·'·:, a uma razão de 1:10, com três peguenas concentrações de metotrexato (X nM, 2,5 nM, e 5 nM) . Monitorizou-se o crescimento das células e utilizou-se na amplificação seguinte a placa que atingiu primeiro a Quando as células cresciam igualmente bem a mais do que uma concentração, utiliza-ia-se a mais alta para a amplificação seguinte. Fez-se uma colheita às 48 heras em meio DMEM isento de soro (4 ml/placa), para se analisar o teor da expressão proteica por transferência tcrroro ou: por EIA. Deixaram-se as uéluiúu ãt vtttuãem vou complete com metotrexato durante 74 horas «k depois subcultivaram-se a uma razão dê 1:10 a 1 pouuuuiuuuuau superiores de metotrexato. Aumentou-se a concentração em metotrexato a incrementos de 10 nM até 100 nM. Em geral, quando o teor de expressão proteico não atinge um máximo até à concentração de MTX de 100 nM, continua-se a amplificação com aumentos de a 100 nM stá se atingir um teor de expressão máximo. as tOItlSít em presenya de NTX quando se encontrou a concentração óptima.The amplification of the genes in the cells was carried out by gradual addition to the half growth medium of methotrexate (MTX). The cells were subcultured in 100 m ': placas plates at a ratio of 1:10 with three small concentrations of methotrexate (X nM, 2.5 nM, and 5 nM). The growth of the cells was monitored and the plate that reached the first plate was used in the next amplification. When the cells grew equally well at more than one concentration, the highest was used for the next amplification. The sample was harvested in serum-free DMEM (4 ml / dish) in order to analyze the protein expression content by thermophilic transfer or: by EIA. The cells were allowed to complete with methotrexate for 74 hours and then subcultured at a ratio of 1:10 to 1% greater of methotrexate. The concentration in methotrexate was increased in increments of 10 nM to 100 nM. In general, when the protein expression content does not reach a maximum up to the MTX concentration of 100 nM, amplification is continued with increases of 100 nM if a maximum expression level is reached. the titers in presence of NTX when the optimum concentration was found.

Geração da linha celular AM-l/DGeneration of AM-1 / D cell line

Derivou-se a iinha celular AM-l/D a partir da linha celular de CHGd(-) descrita na Pat. U.S. N°. 4.703.008 emitida a 27 de Outubro de 1987, e de Urlaub et ai. (1980), Proc. Natl. Acad. Sei. 77: 4461, ambos os quais se incorporam neste documento por citação. A linha celular CHOd(-) foi adaptada passando-a por meios VM-SOY com teores progressivamente menores, e por último sem, soro fetal bovino. A linha celular AM-1 resultante, adaptada a meios isentos de soro, ainda mantém o fenótipo dhfr(-). Transformou-se esta linha celular AM-1 de modo a sobre expressar a ciclina Dl humana,AM-1 / D cell line was derived from the CHGd (-) cell line described in U.S. Pat. U.S. 4,703,008 issued October 27, 1987, and Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Know. 77: 4461, both of which are hereby incorporated by reference. The CHOd (-) cell line was adapted by passing through VM-SOY media with progressively lower contents, and finally without fetal bovine serum. The resulting AM-1 cell line, adapted to serum free media, still retains the dhfr (-) phenotype. This AM-1 cell line was transformed so as to over express the human cyclin D1,

Transfectou-se - ' * Dl para a linha celular AM-1 peio processo padrão de transfecção, de prscifjit-ifiáí com fosfato de cálcio. Depois de se seleccionarem com G413, trataram-se as ccsm tripsina e combinaram-se obtendo-se duas culturas de base. Demonstrou-se a expressão siâ proteína de cl&liiha Dl humana por transferências Western rFIGBFAD IA >"· 1B) d;:lm lisiBaç :Βο1ΐ'ϋΑ:Γ€ί.5 pBBiPAtradBS « pArPtr Bac culturas de Bsvu utilizando um anticorpo específico contra a b%£úlrsã Dl humana (Ab-3 anti ciclina Dl, Calbiochem) .It was transfected into the AM-1 cell line by the standard transfection procedure, purified with calcium phosphate. After being screened with G413, trypsin and treated were combined to give two base cultures. It has been shown SIA expression protein cl & liiha human D by Western blotting rFIGBFAD IA > " · 1B) d;: lm lisiBaç: Βο1ΐ'ϋΑ: Γ € ί.5 pBBiPAtradBS 'pArPtr Bac Bsvu cultures using an antibody specific anti-human Dl antibody (Ab-3 anti-cyclin D1, Calbiochem).

Amostraram-se aleatoriamente diversas colónias com anéis de clonagem e ~repararam-sea analisaram-se também cs seus lisadoç celulares. A expressão da ciclina C-l humana variava de clone para clone, tal como se esperava. Em comparação com os clones, as duas culturas de base exibiram rendimentos globais elevados em proteína de ciclina Dl humana : /T/A/AA 1) . Misturaram-se as duas culturas de base para se obter uma cultura mãe (AM-l/D), a qual passou a ser a linha celular de origem em todas as experiências subsequentes. A ciclina Dl humana expressa na linha celular AM-l/D é funcionalSeveral colonies were randomly cloned and cloned and their cell lysates also analyzed. Expression of human cyclin C-1 varied from clone to clone, as expected. In comparison to the clones, the two base cultures exhibited high overall yields of human cyclin D1: / T / A / AA 1) protein. The two base cultures were blended to give a stock culture (AM-1 / D), which became the cell line of origin in all subsequent experiments. The human cyclin D1 expressed on the AM-1 / D cell line is functional

Determinou-se que a ciclina Dl humana se encontrava funcionalmente expressa pela alteração da dinâmica do seu ciclo celular; veja-se, por exemplo, a FIGURA 2, e adiante.Human cyclin D1 was found to be functionally expressed by altering the dynamics of its cell cycle; see, for example, FIGURE 2, and below.

Contrastaram-se células não sincronizadas provenientes das linhas celulares AM-l/D e AM-1 com iodeto de propídio e analisaram-se por FACScan (Becton Dickinson). As FIGURAS 2A-2D mostram os conteúdos relativos em ADN (eixo dos xx) e o numero de células (eixo dos yy). Havia um número significativamente imioi de células na fase S para as células AM-l/D íllvAD* 40,1/ %) em comparação com as células AM-1 (33,73 , 32,25 IK Isto demonstra que a sobre expressão da ciclina Dl humana na : :· . , . o 1·.'. · , v. v .n......o; o do cicio ÍãiãipIA U' ' ; ' , i-? ; ' : modo a expressar uma p rar;a ira da fusão de OPG humana (GenBank, n° de acesso 0903/33 iHF''> ccrs o vector de expressão pDSRa2. Utilizando a precipitação cotu fosfato de càlúio que E método padrão, transfectou-se ADN linearizado de pDSRa2/OPG-Fc, em paralelo, para células AM-l/D e para as células originais AM-1, não modificadas, Escolheram-se aleatoriamente 44 colónias de cada transfecção, depois de as células haverem sido colocadas em meios selectivos isentos de suplementos HT durante duas semanas.Non-synchronized cells from AM-1 / D and AM-1 cell lines were correlated with propidium iodide and analyzed by FACScan (Becton Dickinson). FIGURES 2A-2D show the relative contents in DNA (x-axis) and number of cells (y-axis). There was a significant number of S-cell cells for AM-1 / D cells (40.1%) compared to AM-1 cells (33.73, 32.25 IK). This demonstrates that overexpression of cyclin D1 in the form of a human cyclin D1 in the form of a compound of formula (I): (GenBank, accession no. 0903/33 iHF), and the expression vector pDSRa2. Using the precipitation of cotyphosphate which was standardized, linearized DNA was transfected of pDSRa2 / OPG-Fc in parallel to AM-1 / D cells and to the unmodified original AM-1 cells. 44 colonies were randomly selected from each transfection after cells were placed in selective, free media of HT supplements for two weeks.

Transferiram-se as colónias individualmente para placas de 24 poços e deixaram-se crescer à confluência. Passadas 48 horas, recolheram-se os meios condicionados isentos de scro, e analisaram-se por EIA utilizando anti-soro especifico para OPG humana. A FIGURA 3 mosura o número de clones que expressam diversos teores de OPG-Fc, a partir daquelas duas linhas celulares. F claro que existe um número de clones significativamente superior, provenientes da linha de células AM-l/D, que expressam teores mais elevados da proteína recombinante, e que todos os clones de os clones com maiores teores de expressão, que expressavam mais 4« que 20 Sãi/çA: de OPG-Fc, eram provenientes da linha celular 349Μ1/Ρ,The colonies were individually transferred to 24 well plates and allowed to grow to confluence. After 48 hours, the scro free media were collected, and analyzed by EIA using human OPG-specific antiserum. FIGURE 3 shows the number of clones expressing various OPG-Fc contents, from those two cell lines. It is clear that there are a number of significantly higher clones from the AM-1 / D cell line expressing higher levels of the recombinant protein, and that all clones of the clones with higher levels of expression, expressing an additional 4 ' which were from the cell line 349 1 / Ρ,

Exemplo 2: Construiu-se o plasmídeo p033ixi/b.lço de l&xm a expressar o gene humano de Epo e transf ectou-se para teia a AM-l/D acçuih-.-ú a padrão m p.rtaipl taciv de fsHio ha cálcia ara «e dascaaaea aaiaah Escolheram-se aleatoriamente quarenta e oito ahiéírFít;;: para uma análise mais detalhada, identificaram-se quatro dos clones que expressavam maiores teores foram . por análise dos meios condicionados utilizando EIA, e foram submetidos a amplificação com metotrexato, a partir de uma concentração 1 nM. A FXtSOBA 4 mostra a expressão de EPO durante e processo de amplificação. Dois dos clones, o clone AM-l/D 2 e o clone AM-l/D 33, exibiram uma produção elevada de Epo a concentrações crescentes de MTX, demonstrando una amplificação bem sucedida do gene. Testaram-se estes clones por congelação e descongelação, e por passagens extensivas sem perda da expressão de Epo, demonstrando a estabilidade da expressão da Epo nestes clones.Example 2: Plasmid p033ixi / 1mL plasmid was constructed to express the human Epo gene and was transfected into AMI-1 / D web by a standard plasmid. fsHio ha calcium and ratios were randomly selected for forty-eight years. For a more detailed analysis, four of the clones expressing the highest levels were identified. by analysis of the conditioned media using EIA, and were subjected to methotrexate amplification from a 1 nM concentration. FXtSOBA 4 shows the expression of EPO during and amplification process. Two of the clones, the AM-1 / D 2 clone and the AM-1 / D 33 clone, exhibited high Epo production at increasing concentrations of MTX, demonstrating successful amplification of the gene. These clones were tested by freezing and thawing, and by extensive passages without loss of Epo expression, demonstrating the stability of Epo expression in these clones.

Expressão de PPG em células de CHO AM-l/ciclína DExpression of PPG in CHO AM-1 / cyclin D cells

Comparou-se a expressão de dois constructos de OPG em células de CHO ΆΜ-1/ciclina D e noutras linhas celulares de CHO. Transfectou-se a OPG(22-201)-Fc para células de CHO AM-l/ciclina O e para a linha celular de CHO de origem, a qual tinha sido previamente adaptada para crescimento em meio isento de soro [CHO(SF)]. Transfectou-se a OPG(22-194).cys-Fc para células de CHC AM-l/ciclína D e para a linha celular AM-1 de CHO de origem. Levaram-se a cabo as trar.sfecções utilizando o método padrão do fosfato de cálcio e uma selecçáo por DHFR. Isolaram-se as colónias transfectadas utilizando cilindros de vidro de clonagem. Cultivaram-se as colónias individuais até à confluência em placas de 24 poços. Analisou-se a presença de OPG héááorn utilizando nm soro oalialrmil contra OPG.The expression of two OPG constructs in CHO ΆΜ-1 / cyclin D cells and in other CHO cell lines was compared. OPG (22-201) -Fc was transfected into CHO AM-1 / cyclin O cells and to the original CHO cell line, which had previously been adapted for growth in serum-free medium [CHO (SF) ]. OPG (22-194) .cys-Fc was transfected into CHC AM-1 / cyclin D cells and into the original CHO AM-1 cell line. The extracts were carried out using the standard method of calcium phosphate and a selection by DHFR. Transfected colonies were isolated using cloning glass cylinders. The individual colonies were grown to confluency in 24-well plates. The presence of human OPG was analyzed using nmalivalyl serum against OPG.

Analisaram-se por ELISA às amostras de meios condicionado provenientes destes clones *s que exibiam os maiores teores de expressão na transferência Western. Compararam-se os teores de expressão de OPG(22-194)-cys-Fc de 46 clones individuais provenientes de células AM-1 de CHO ou de células ΑΜ-1/cicIina D de CHO (FIGURA 5). TâítfeÉm se comparou a expressão de OPG(22-201)-Fc nos 24 ciones com maior expressão, tal como se haviam identificado previamente por transferência iPafara (FIGURA 6) . Em cada caso, os clones provenientes da linha celular ΆΜ-1/ciclína D de CHO evidenciam teores significativamente maiores de expressão do que os ciones provenientes de células CHO(SF) ou de células AM-1 de CHO.Analyzes were performed by ELISA on the conditioned media samples from these clones which exhibited the highest expression levels in the Western blot. The OPG (22-194) -cys-Fc expression contents of 46 individual clones from CHO AM-1 cells or CHO cells-1 / CH-cylyl D cells were compared (FIGURE 5). The expression of OPG (22-201) -Fc was compared in the 24 ciones with higher expression, as previously identified by iPafara transfer (FIGURE 6). In each case, clones from the ΆΜ-1 / cyclin D cell line from CHO exhibit significantly higher levels of expression than CHO (SF) cells or from CHO AM-1 cells.

Expressão de NESP em Diluías de CHO Adaptadas a Meio isento de SoroExpression of NESP in CHO Diluates Adapted to Serum Free Medium

Transfectou-se ADN de NESP inserido no vector de expressão pDSR»2 utilizando o método padrão com fosfato de cálcio, para três linhas diferentes de células de CHO adaptadas a meio isento de soro: CHOd'(SF), AM-1, e ΆΜ-1/ciclina D. Levaram-se a cabo a transfecção, a selecção e o isolamento dos clones em meio contendo soro, em cultura aderente, identificaram-se inicialmente os clones que expressavam teores elevados de NESP por transferência Western utilizando um anticorpo ' contra EPO. Fez-se a determinação quantitativa da expressão por EIA. Testaram-se os clones com expressão mais pzvSmMti&úã provenientes de cada linha celular, quanto ao seu crescimento em íatlairitl em suspensão em meio isento de soro. Também se submeteram os rlctstú a árpliílUUyih de ADN por crescimento aa presença de gradualmente crescentes de metotrexato ta cultura aderente em meio contendo soro. Monitorizou-se a expressão da NESP durante o processo de amplificação por análises de transferência Western e por EIA. Analisaram-se os clones em diversos estádios ao longo do processo de amplificação, quanto I sua capacidade de crescimento e de expressão em culturas em suspensão em meio de cultura isento de soro. Os clones provenientes da linha celular de CHO AM-l/ciclina D apresentavam em geral um tecr global de expressão de NESP superior ao dos provenientes das outras duas linhas de origem de células de CHO (FIGURA 7). Os clones também foram analisados por focagem isoelétrica para determinar a sua distribuição de isoformas. Não se encontraram diferenças significativas nas distribuições de isoformas dos diversos clones ou numa linha celular de controlo (61L) proveniente da linha celular de origem de CHO (FIGURAS 8A e 85).NESP DNA inserted into the pDSR2 expression vector was transfected using the standard calcium phosphate method for three different CHO cell lines adapted to serum-free medium: CHOd '(SF), AM-1, and ΆΜ Transfection, selection and isolation of the clones in serum-containing medium in adherent culture, clones expressing high NESP levels by Western blotting were first identified using an antibody against EPO. Quantitative determination of the expression by EIA was performed. More pseudomembrane-expressing clones from each cell line were tested for their growth in plasma in suspension in serum-free medium. The DNA complexes were also subjected to growth by the presence of gradually increasing methotrexate adherent culture in serum-containing medium. NESP expression was monitored during the amplification process by Western blotting and EIA analysis. Clones were analyzed at various stages throughout the amplification process as to their ability to grow and express in suspension cultures in serum free culture medium. Clones from the CHO AM-1 / cyclin D cell line generally had a higher overall NESP expression level than those from the other two CHO cell origin lines (FIGURE 7). The clones were also analyzed by isoelectric focusing to determine their isoform distribution. No significant differences were found in the isoform distributions of the various clones or in a control cell line (61L) from the CHO cell line of origin (FIGURES 8A and 85).

As abreviaturas que se utilizam todo ao longo da especifieação presente são tal como se segue: CHO Ovário de hamster chinês EBV Viris de Epstein-Barr EIA Imunoensaio enzimático EPO EritropoietinaAbbreviations which are used throughout the specification are as follows: CHO Epstein-Barr EBV Viris EBV ovary EIA Enzyme immunoassay EPO Erythropoietin

HBS Scro salino tamponizado com HEPES MTX Metotrexato UOvâ proteína da rqpti&ti·ao e 0 Q osteoprotegerina !·.: 'í. axí:1:1 itt; ia:;':''dai 1 '0 ti :v:' :HBS Scro saline buffered with MTX HEPES Methotrexate UOvÎ² protein and Î²-osteoprotegerin. axi: 1: 1 itt; (i.e.

Claims

(A) a cyclin D gene product, wherein the cyclin D gene product is functionally expressed at a level above any level of expression found in nature; and (b) a protein of interest, wherein the protein of interest is expressed in the cell at a level above any level of expression found in nature.

The cell of Claim 1, wherein the cell is a CHO cell.

The cell of Claim 3, wherein the cell is a CHO cell.

The cell of Claim 3, wherein the cell is a seV2 Xap adapted to a serum-free medium.

The cell of claim 1, wherein the cell is an AM-1 cell.

The cell of Claim 1 wherein the cyclin D kinase probe comprises a mammalian D1 cyclin. i. The cell of Claim 1, wherein the cyclin D gene product comprises a human cyclin D.

The cell of Claim 1, wherein the cyclin D gene product includes a human cyclin D1. The cell of claim 1, wherein the protein of interest is an EPO-related protein, a CPG-related protein, or an iepine-related protein.

The cell of Claim 1, wherein the protein of interest is EPO, OPG, OPG-Fc, Ieptin and Fc-leptin.

A process for producing a protein of interest, which comprises: A. creating a eukaryotic cell which expresses: 1. a cyclin D gene product at a level higher than any content of expression existing in nature; and S. a protein of interest at a level higher than, say, a content of expression in nature; by introducing an expression vector with a DNA sequence for the protein of interest and introducing the expression vector which includes a sequence of the generic cyclin D product; B. culturing the cell under conditions allowing the expression of the protein of interest as well as the functional expression of the cyclin D gene product; and C. isolating the protein of interest.

The process of Claim 11, wherein the cell is a mammalian cell.

The process of claim 10 wherein the cyclin D gene product comprises mammalian cyclin D1.

The process of Claim 13, wherein the cell is adapted to serum-free medium. 1 . The method of claim 11, wherein the cell is an AM-I cell. the cyclin C cytokinin product includes a mammalian cyclin D1

The process of Claim 11, wherein the cyclin D product includes a human cyclin C. The cyclin D gene comprises a cytidine D1 Sisia, 19. The method of claim 9, wherein the protein c1 '. interest is an EPQ-related protein, an OPG-related protein, or a leptin-related protein.

The process of Claim 19, wherein the protein of interest is EPC, CPG, leptin or Fc-leptin.

The cell of Claim 1, wherein the protein of interest has a sequence different from those in the cell genome.

The process of Claim 11, wherein the protein of interest has a sequence different from those in the cell genome.

The process of Claim 11, wherein the protein of interest is inserted into the cell by transfection.

The process of Claim 11 or 23, wherein the cyclin D gene product is inserted into the oligonucleotides by: .