PT107663B - MINI-CIRCLE PURIFICATION PROCESS - Google Patents
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Abstract
A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE UM PROCESSO PARA A PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MINICÍRCULOS SUPERENROLADOS QUE É FACILMENTE TRANSFERÍVEL PARA A ESCALA INDUSTRIAL. ESTES MINICÍRCULOS PODEM SER UTILIZADOS PELAS INDÚSTRIAS DA BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL E DA SAÚDE, ESPECIFICAMENTE NOS CAMPOS DA VACINAÇÃO POR DNA, DA TERAPIA CELULAR E GÉNICA E DA PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM CÉLULAS ANIMAIS.THIS INVENTION DESCRIBES A PROCESS FOR THE PRODUCTION AND PURIFICATION OF SUPERENROLED MINICULES THAT IS EASILY TRANSFERABLE TO INDUSTRIAL RANGE. THESE MINI-CIRCLES CAN BE USED BY INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY AND HEALTH INDUSTRIES, SPECIFICALLY IN THE FIELDS OF DNA VACCINATION, GENE CELL AND THERAPY AND PRODUCTION OF RECOMBINANT ANAL CELL PROTEINS.
Description
PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE MINICÍRCULOSMINI-CIRCLE PURIFICATION PROCESS
Campo da invençãoField of the invention
Campo técnico em que a invenção se insereTechnical field to which the invention belongs
A presente invenção descreve processos para a purificação de minicirculos (4) de DNA de cadeia dupla superenrolados que contêm todas as unidades funcionais necessárias para a expressão de genes em células eucarióticas. Estes minicirculos (4) podem ser utilizados nos campos da vacinação por DNA, da terapia celular e génica e da produção de proteínas recombinantes em células animais via transfeção transiente. A invenção refere-se ao campo técnico da Engenharia Bioquímica/Biotecnologia.The present invention describes processes for the purification of supercoiled double stranded DNA mini-circles (4) that contain all the functional units necessary for gene expression in eukaryotic cells. These minicircles (4) can be used in the fields of DNA vaccination, cell and gene therapy and recombinant protein production in animal cells via transient transfection. The invention relates to the technical field of Biochemical Engineering / Biotechnology.
Estado da técnicaState of the art
Inúmeros trabalhos têm sido desenvolvidos nos últimos 20 anos em torno da utilização de vetores de DNA plasmídico para transferir e expressar genes de forma transiente em células e tecidos animais, quer em ambiente laboratorial, quer in vivo. Esta capacidade é crucial para um número de aplicações médicas e biotecnológicas. Por exemplo, a transferência de genes pode ser usada potencialmente: i) em terapia génica, para tratar doenças adquiridas (p. ex. cancro, SIDA) e desordens do foro genético (p. ex. fibrose quística), ii) na vacinação por DNA, para imunizar contra doenças infeciosas (p. ex. gripe, malária, etc.) e iii) na produção de proteínas recombinantes (p. ex. anticorpos) por cultivo de células animais em biorreatores.Numerous work has been developed over the past 20 years on the use of plasmid DNA vectors to transiently transfer and express genes in animal cells and tissues, either in the laboratory environment or in vivo. This capability is crucial for a number of medical and biotechnology applications. For example, gene transfer can potentially be used: i) in gene therapy to treat acquired diseases (eg cancer, AIDS) and genetic disorders (eg cystic fibrosis), ii) vaccination with DNA, to immunize against infectious diseases (eg influenza, malaria, etc.) and iii) in the production of recombinant proteins (eg antibodies) by culturing animal cells in bioreactors.
vetor de DNA plasmidico típico contém regiões de origem bacteriana, que são necessárias para a sua produção num hospedeiro bacteriano, e uma cassete de expressão eucariótica, que é responsável pela produção do antigene ou da proteína de interesse em células animais. As sequências de DNA bacteriano (p. ex. a origem de replicação) e os genes necessários para a propagação dos vetores plasmídicos em células microbianas (p. ex. uma marca de seleção por antibiótico) constituem uma preocupação para as agências reguladoras uma vez que existe o risco de poderem ser adquiridas por Enterobacteriacea que vivem no trato intestinal dos sujeitos humanos e animais, e a partir daí disseminadas para outras espécies via transferência horizontal de genes.Typical plasmid DNA vector contains regions of bacterial origin, which are required for its production in a bacterial host, and a eukaryotic expression cassette, which is responsible for producing the antigen or protein of interest in animal cells. Bacterial DNA sequences (eg origin of replication) and genes required for the propagation of plasmid vectors into microbial cells (eg an antibiotic check mark) are a concern for regulatory agencies as there is a risk that they may be acquired by Enterobacteriacea living in the intestinal tract of human and animal subjects, and thereafter disseminated to other species via horizontal gene transfer.
Além disso, aquelas sequências podem prejudicar de forma severa a expressão da função codificada na cassete de expressão eucariótica. Por exemplo, o auge da expressão mediada por vetores plasmídicos, que tipicamente ocorre nas primeiras 48 horas após a transfeção das células animais, normalmente começa a decair de forma dramática devido ao silenciamento da expressão do transgene. Este silenciamento encontra-se relacionado com a presença de motivos citosinafosfato-guanina não-metilados (CpG) nas referidas sequências bacterianas que, ao estimular o sistema imune inato e a produção de citocinas, reprimem a expressão. As sequências bacterianas no vetor plasmidico podem também contribuir para silenciar a expressão ao formarem heterocromatina, uma forma de DNA altamente compacta que se propaga em direção a regiões reguladoras necessárias para a expressão eucariótica. Esta forma densa de DNA não permite a ligação de fatores de transcrição, inibindo assim a expressão da função genética codificada no transgene.In addition, those sequences can severely impair the expression of the function encoded in the eukaryotic expression cassette. For example, the peak of plasmid vector-mediated expression, which typically occurs within the first 48 hours after transfection of animal cells, usually begins to decline dramatically due to mutation of transgene expression. This silencing is related to the presence of unmethylated cytosine phosphate-guanine (CpG) motifs in said bacterial sequences which, by stimulating the innate immune system and cytokine production, suppress expression. Bacterial sequences in the plasmid vector may also contribute to silence expression by forming heterochromatin, a highly compact form of DNA that propagates toward regulatory regions necessary for eukaryotic expression. This dense form of DNA does not allow the binding of transcription factors, thus inhibiting the expression of transgene-encoded genetic function.
Os minicirculos são vetores de transferência de genes derivados de DNA plasmidico que contêm apenas a cassete de expressão eucariótica. Estes vetores já demonstraram um desempenho superior na transferência de genes quando comparados com os vetores plasmidicos convencionais. Para lá da maior segurança biológica devida à ausência das referidas sequências bacterianas, o menor tamanho dos minicirculos traduz-se também numa biodisponibilidade superior e numa expressão mais prolongada do transgene (Schleef et al., 2008).Minicircles are gene transfer vectors derived from plasmid DNA that contain only the eukaryotic expression cassette. These vectors have already demonstrated superior gene transfer performance when compared to conventional plasmid vectors. In addition to greater biological safety due to the absence of said bacterial sequences, the smaller size of the mini-circles also translates into higher bioavailability and longer transgene expression (Schleef et al., 2008).
Os minicirculos são produzidos in vivo por recombinação intramolecular especifica de um plasmideo parental (PP) através de dois locais de reconhecimento especifico que flanqueiam a cassete de expressão eucariótica. Este evento de recombinação origina duas moléculas superenroladas de DNA plasmidico: i) um minicirculo (MC) contendo a cassete de expressão eucariótica necessária para a expressão do transgene alvo nas células animais destinatárias e ii) um miniplasmideo replicante (MP) contendo os elementos bacterianos indesejáveis (Figura 2). Os minicirculos têm sido produzidos in vivo em estipes hospedeiras de Escherichia coli (E. coli) com o auxilio de diferentes recombinases expressas sob a ação de promotores induziveis. Por exemplo, a integrase do fago λ (Darquet et al., 1999) é induzida por um aumento de temperatura até 42°C que inativa a proteína cI587 repressora do promotor, enquanto a recombinase Cre, a integrase φΟ31 (e.g. Chen et al., 2003) e a resolvase ParA (e.g. Kobelt et al., 2012) são reguladas pelo sistema de expressão pBAD/araC.Mini-circles are produced in vivo by specific intramolecular recombination of a parent plasmid (PP) through two specific recognition sites flanking the eukaryotic expression cassette. This recombination event gives rise to two supercoiled plasmid DNA molecules: i) a minicircle (MC) containing the eukaryotic expression cassette required for expression of the target transgene in target animal cells and ii) a replicating miniplasmid (MP) containing the undesirable bacterial elements (Figure 2). Minicircles have been produced in vivo in Escherichia coli (E. coli) host strains with the aid of different recombines expressed under the action of inducible promoters. For example, phage integrase λ (Darquet et al., 1999) is induced by a temperature rise to 42 ° C which inactivates the promoter repressor cI587 protein, whereas Cre recombinase, φΟ31 integrase (eg Chen et al. , 2003) and ParA resolvase (eg Kobelt et al., 2012) are regulated by the pBAD / araC expression system.
Conseguir a recombinação de plasmideos parentais in vivo não é um processo trivial. Por exemplo, a colocação de uma cópia do gene de uma recombinase no cromossoma de E. coli (Bigger et al., 2001; Darquet et al., 1999, 1997; Kreiss et al., 1998) resultou numa eficiência de recombinação baixa, da ordem dos 60 %. Jechlinger e colaboradores, entre outros, demonstraram que uma recombinação completa pode ser obtida se cada plasmídeo parental codificar a sua própria recombinase (Jechlinger et al. , 2004) . Só quando dez cópias da integrase φΟ31 foram colocadas no cromossoma da estirpe hospedeira de E. coli é que todos os plasmídeos parentais recombinaram nos minicírculos e miniplasmídeos correspondentes (Kay et al., 2010) . O tipo de estirpe, o número de cópias do gene que codifica a recombinase em questão e a estratégia de fermentação são outros fatores que influenciam a eficiência de recombinação.Achieving recombination of parental plasmids in vivo is not a trivial process. For example, placing a copy of a recombinase gene on the E. coli chromosome (Bigger et al., 2001; Darquet et al., 1999, 1997; Kreiss et al., 1998) resulted in low recombination efficiency, around 60%. Jechlinger and colleagues, among others, have shown that complete recombination can be obtained if each parental plasmid encodes its own recombinase (Jechlinger et al., 2004). Only when ten copies of integrase φΟ31 were placed on the E. coli host strain chromosome did all parental plasmids recombine into the corresponding minicircles and miniplasmids (Kay et al., 2010). The type of strain, the copy number of the gene encoding the recombinase in question and the fermentation strategy are other factors that influence recombination efficiency.
Para lá da recombinação propriamente dita, um dos desafios mais importantes numa ótica de produção consiste na purificação dos minicírculos das impurezas do hospedeiro (i.e. proteínas, DNA genómico, RNA, lipopolissacáridos) e dos subprodutos da recombinação (i.e. miniplasmídeo e plasmídeos parentais que não recombinaram) (Schmeer et al., 2008). Os primeiros protocolos de purificação descritos na literatura dependiam da linearização dos miniplasmídeos e dos plasmídeos parentais não recombinados por intermédio de endonucleases de restrição, seguida de uma ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio-brometo de etídio (CsCl-EtBr). Os rendimentos máximos obtidos com este método laborioso são da ordem de 1 mg de minicírculo por litro de cultura bacteriana (Bigger et al, 2001; Chen et al, 2003; Darquet et al. , 1997; Kreiss et al., 1998). Os fragmentos lineares obtidos após restrição podem também ser separados dos minicírculos superenrolados por eletroforese em gel de agarose (Nehlsen et al., 2006) .Beyond recombination itself, one of the most important challenges in a production approach is the purification of host impurities minicircles (ie proteins, genomic DNA, RNA, lipopolysaccharides) and recombination byproducts (ie miniplasmid and non-recombining parent plasmids). ) (Schmeer et al., 2008). The first purification protocols described in the literature depended on the linearization of miniplasmids and non-recombinant parental plasmids by restriction endonucleases, followed by cesium-ethidium bromide (CsCl-EtBr) density gradient ultracentrifugation. The maximum yields obtained with this laborious method are of the order of 1 mg minicircle per liter of bacterial culture (Bigger et al, 2001; Chen et al, 2003; Darquet et al., 1997; Kreiss et al., 1998). Linear fragments obtained after restriction can also be separated from the supercoiled mini-circles by agarose gel electrophoresis (Nehlsen et al., 2006).
Chen e colaboradores desenvolveram uma estratégica elegante de um passo apenas para purificar minicirculos que depende: i) da expressão simultânea da integrase PhiC31 e da endonuclease I-Scel sob controlo do sistema pBAD/araC e ii) da presença na sequência do miniplasmideo de um local de reconhecimento de 18 pares de bases para a endonuclease IScel (Che net al., 2005b). Com este sistema, a recombinação in vivo do plasmideo parental em minicirculo e miniplasmideo é seguida da restrição in vivo mediada pela enzima I-Scel do miniplasmideo e da degradação subsequente dos fragmentos lineares de DNA resultantes por nucleases bacterianas. Numa situação ótima, os lisados obtidos destas células estarão deste modo livres de plasmideos parentais e de miniplasmideos e assim os minicirculos poderão ser isolados e purificados por intermédio de um kit convencional de purificação de plasmideos. A co-expressão da integrase do bacteriófago PhiC31 e da endonuclease IScel resulta normalmente em rendimentos baixos já que um grande número de plasmideos parentais é destruído antes da formação dos minicirculos por recombinação. De modo a contornar este problema, Chen e colaboradores inseriram duas cópias adicionais de pBAD-PhiC31 na região bacteriana do plasmideo parental e usaram uma temperatura baixa de 32°C e um pH baixo de modo favorecer a recombinação e depois uma temperatura mais elevada de 37°C e a adição de meio Luria-Bertani (LB) fresco a pH 8 para aumentar a atividade da I-Scel. Estes esforços para desacoplar a recombinação da linearização foram recompensados com rendimentos de até 1.8 mg de minicirculo por litro e com purezas de minicirculo da ordem dos 95% (Chen et al. , 2005). O método foi ainda melhorado inserindo dez cópias de pBAD-PhiC31 e seis cópias de pBAD-I-Scel no cromossoma da estirpe BW27783 de E. coli. Como resultado obtiveram-se rendimentos globais na ordem de 3,4- 4,8 mg minicirculos/L com 0,4-1,5% de impurezas (Kay et al., 2010) . Graças a esta nova estirpe o método de produção de minicirculos foi grandemente simplificado, tornando-se comparável em termos de complexidade aos métodos laboratoriais de produção de plasmideos convencionais. Apesar destas melhorias, o rendimento e pureza dos minicirculos permanece altamente dependente da fisiologia da estirpe hospedeira e dos fatores ambientais dominantes durante o crescimento, replicação recombinação.Chen and colleagues have developed an elegant one-step strategy for purifying minicircles that depends on: i) simultaneous expression of PhiC31 integrase and I-Scel endonuclease under control of the pBAD / araC system and ii) presence of a site miniplasmid sequence base pair recognition factor for IScel endonuclease (Che net al., 2005b). With this system, in vivo recombination of the parental plasmid into minicircle and miniplasmid is followed by in vivo restriction mediated by the miniplasmid I-Scel enzyme and subsequent degradation of the resulting linear DNA fragments by bacterial nucleases. Optimally, the lysates obtained from these cells will thus be free of parent plasmids and miniplasmids and thus the minicircles may be isolated and purified by means of a standard plasmid purification kit. The coexpression of bacteriophage PhiC31 integrase and IScel endonuclease normally results in low yields since a large number of parental plasmids are destroyed prior to formation of the mini-circles by recombination. To circumvent this problem, Chen and colleagues inserted two additional copies of pBAD-PhiC31 into the bacterial region of the parental plasmid and used a low temperature of 32 ° C and a low pH to favor recombination and then a higher temperature of 37 ° C. ° C and the addition of fresh Luria-Bertani (LB) medium at pH 8 to increase I-Scel activity. These efforts to decouple linearization recombination have been rewarded with yields of up to 1.8 mg minicircle per liter and minicircle purity of the order of 95% (Chen et al., 2005). The method was further improved by inserting ten copies of pBAD-PhiC31 and six copies of pBAD-I-Scel into the E. coli strain BW27783 chromosome. As a result overall yields of 3.4- 4.8 mg minicircles / L with 0.4-1.5% impurities were obtained (Kay et al., 2010). Thanks to this new strain the mini-circle production method has been greatly simplified, making it comparable in complexity to laboratory methods of conventional plasmid production. Despite these improvements, yield and purity of minicircles remains highly dependent on host strain physiology and dominant environmental factors during growth, recombination replication.
Em 2008, Mayrhofer e colaboradores introduziram um protocolo muito eficiente de purificação de minicirculos baseado em cromatografia que explora interações de afinidade proteina-DNA (Mayrhofer et al. , 2008) . O método depende da integração de dois locais lacOs (locais do operador da lactose) no plasmideo parental, numa posição localizada na região do minicirculo. Os locais lacOs são pequenas sequências de reconhecimento que possuem elevada afinidade para a proteína repressora do operão da lactose (repressor LacI). O repressor LacI foi então sintetizado, modificado por biotinilação e imobilizado em partículas porosas de Sepharose contendo estreptavidina tetramérica covalentemente ligada de modo a construir uma matriz cromatográfica com afinidade seletiva para os minicirculos com locais lacOs. As amostras contendo os minicirculos e miniplasmídeos foram então purificadas levando a cabo uma separação cromatográfica no modo ligação-lavagem-eluição habitual. A ligação não específica do miniplasmídeo (i.e. plasmideos sem locais lacOs) foi minimizada aumentando a concentração de NaCl no tampão de lavagem até 400 mM. Os minicirculos foram então eluídos com um tampão contendo 50 mM de Tris, pH 8, 500 mM de NaCl e 5 mM de isopropil β-D-l tiogalactopiranosideo (IPTG). A capacidade da coluna foi em média de 0,184 ± 0,045 mg de minicirculo por mL de matriz cromatográfica. Uma análise quantitativa por reação de polimerização em cadeia (q-PCR) revelou que o DNA eluido após um único passo de purificação com a matriz de afinidade com repressor LacI imobilizado consistia em 98,8% de minicirculo, 1% de miniplasmideo e 0,2% de plasmideo parental (Mayrhofer et al., 2008) . Este método apresenta-se assim como uma opção promissora para purificar minicirculos, originando um produto que vai de encontro às recomendações das agências reguladoras em termos de qualidade final. No entanto, o método não é capaz de separar minicirculos de plasmideos parentais não recombinados já que as duas moléculas contêm os locais lacOs de reconhecimento. Isto significa que é necessária uma recombinação altamente eficiente de modo a obter no final minicirculos livres de plasmideos parentais.In 2008, Mayrhofer and colleagues introduced a very efficient chromatography-based mini-circle purification protocol that explores protein-DNA affinity interactions (Mayrhofer et al., 2008). The method depends on the integration of two lacOs (lactose operator sites) sites in the parental plasmid, in a position located in the minicircle region. LacO sites are short recognition sequences that have high affinity for the lactose operon repressor protein (LacI repressor). The LacI repressor was then synthesized, biotinylated modified and immobilized on porous Sepharose particles containing covalently linked tetrameric streptavidin to construct a selective affinity chromatographic matrix for the lacO site minicircles. Samples containing the minicircles and miniplasmids were then purified by chromatographic separation in the usual binding-wash-elution mode. Non-specific binding of the miniplasmid (i.e. plasmids without lacOs sites) was minimized by increasing the NaCl concentration in the wash buffer to 400 mM. The minicircles were then eluted with a buffer containing 50 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl and 5 mM isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG). The column capacity averaged 0.184 ± 0.045 mg minicircle per ml chromatographic matrix. A quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis revealed that the DNA eluted after a single purification step with the immobilized LacI repressor affinity matrix consisted of 98.8% minicircle, 1% miniplasmid and 0, 2% parental plasmid (Mayrhofer et al., 2008). This method thus presents itself as a promising option for purifying mini-circles, resulting in a product that meets the recommendations of regulatory agencies in terms of final quality. However, the method is not capable of separating minicircles from non-recombined parent plasmids since the two molecules contain the lacO recognition sites. This means that highly efficient recombination is required in order to ultimately obtain free minicircles of parental plasmids.
A patente US8236548B2 descreve um protocolo de produção de minicirculos que utiliza uma estirpe que contém os genes que codificam para a recombinase PhiC31 e para a endonuclease I-Scel. A expressão simultânea destes dois enzimas é necessária para i) recombinar o plasmideo parental em minicirculo e miniplasmideo e ii) linearizar especificamente o miniplasmideo e as moléculas de plasmideo parental não recombinadas in vivo. As moléculas de DNA linearizadas assim obtidas são concomitantemente digeridas por nucleases bacterianas de tal modo que no final do processo de cultura celular as células contêm apenas minicirculos.US8236548B2 describes a minicircle production protocol that utilizes a strain containing genes encoding PhiC31 recombinase and endonuclease I-Scel. Simultaneous expression of these two enzymes is necessary to i) recombine the parent plasmid into minicircle and miniplasmid and ii) specifically linearize the miniplasmid and non-recombinant parent plasmid molecules in vivo. The linearized DNA molecules thus obtained are concomitantly digested by bacterial nucleases such that at the end of the cell culture process the cells contain only minicircles.
A patente EP1620559B1 descreve um método de purificação de minicirculos que explora interações de afinidade DNA proteína. A estrutura do minicírculo contém dois locais lacOs que possuem grande afinidade para a proteína repressora do operão da lactose (LacI) . A captura dos minicírculos a partir de uma mistura complexa é conseguida utilizando suportes cromatográficos com LacI imobilizada.EP1620559B1 describes a minicircle purification method that exploits DNA protein affinity interactions. The minicircle structure contains two lacO sites that have high affinity for the lactose operon repressor protein (LacI). Minicircle capture from a complex mixture is accomplished using immobilized LacI chromatographic supports.
A patente US7622252B2 descreve um método de produção de minicírculos que utiliza uma estirpe bacteriana sob condições tais que a atividade de topoisomerase IV é inibida, produzindo-se assim uma variedade de minicírculos e miniplasmídeos concatenados. Os minicírculos superenrolados são então libertados dos catenanos utilizando uma enzima de restrição que lineariza o miniplasmídeo e purificados subsequentemente por um método do estado da arte como a cromatografia ou a eletroforese em gel.US7622252B2 describes a minicircle production method that utilizes a bacterial strain under conditions such that topoisomerase IV activity is inhibited, thereby producing a variety of concatenated minicircles and miniplasmids. The supercoiled minicircles are then released from the catenanes using a restriction enzyme that linearises the miniplasm and subsequently purified by a state of the art method such as chromatography or gel electrophoresis.
A patente EP2439276 descreve um processo para a preparação de um vetor de DNA circular na forma superenrolada que utiliza um plasmídeo parental que contém a sequência de interesse flanqueada por dois locais de restrição. Após produção num hospedeiro bacteriano, os plasmídeos parentais são linearizados in vitro com uma enzima de restrição que reconhece os referidos locais e a sequência de interesse é purificada e circularizada. Após purificação dos outros produtos de ligação, a molécula de DNA circular relaxada é enrolada por intermédio de uma girase de modo a produzir a molécula de DNA superenrolada.EP2439276 describes a process for preparing a circular DNA vector in supercoiled form using a parental plasmid containing the sequence of interest flanked by two restriction sites. After production in a bacterial host, parental plasmids are linearized in vitro with a restriction enzyme that recognizes said sites and the sequence of interest is purified and circularized. After purification of the other ligation products, the relaxed circular DNA molecule is coiled by a gyrase to produce the supercoiled DNA molecule.
De acordo com o exposto, existe a necessidade de desenvolver um processo de produção e purificação de minicírculos de DNA livres das impurezas do hospedeiro dos subprodutos da recombinação, que seja facilmente transferível para a escala industrial.Accordingly, there is a need to develop a process for producing and purifying DNA minicircles free from the host impurities of the recombination byproducts, which is easily transferable to industrial scale.
Sumáriosummary
Os minicírculos (4) são pequenas moléculas de DNA circular que podem ser usadas para transferir e expressar transientemente genes em células animais. Os perfis de segurança e eficiência únicos dos minicírculos (4) torna—os especialmente úteis em aplicações nos campos da vacinação por DNA, da terapia celular e génica e da produção de proteínas recombinantes em células animais. A aplicação dos minicírculos (4) nestas áreas tem sido dificultada pela inexistência de tecnologias de produção capazes de gerar as quantidades da ordem dos gramas/quilogramas necessárias para levar a cabo ensaios pré-clínicos e clínicos ou para montar campanhas de produção de proteínas recombinantes. A presente invenção descreve um método de produção e purificação de minicírculos (4) que pode ser transposto para a escala industrial.Minicircles (4) are small circular DNA molecules that can be used to transiently transfer and express genes in animal cells. The unique safety and efficiency profiles of the mini-circles (4) make them especially useful in applications in the fields of DNA vaccination, cell and gene therapy and recombinant protein production in animal cells. The application of minicircles (4) in these areas has been hampered by the lack of production technologies capable of generating the gram / kilogram quantities needed to carry out preclinical and clinical trials or to set up recombinant protein production campaigns. The present invention describes a method of producing and purifying minicircles (4) that can be transposed to industrial scale.
Descrição detalhada da invençãoDetailed Description of the Invention
A invenção refere-se a um processo adequado à purificação de minicírculos (4) superenrolados que é facilmente transferível para a escala industrial. Estes minicírculos (4) são moléculas de DNA circular superenroladas que contêm uma cassete de expressão eucariótica funcional e que são livres de sequências bacterianas e outras impurezas. Estes minicírculos (4) podem ser usados como vetores de entrega de genes nos campos da vacinação por DNA, da terapia celular e génica e da produção de proteínas recombinantes em células animais.The invention relates to a process suitable for the purification of supercoiled mini-circles (4) which is easily transferable to industrial scale. These minicircles (4) are supercoiled circular DNA molecules that contain a functional eukaryotic expression cassette that are free of bacterial sequences and other impurities. These minicircles (4) can be used as gene delivery vectors in the fields of DNA vaccination, cell and gene therapy, and recombinant protein production in animal cells.
A característica única do processo aqui descrito é que os minicírculos (4) podem ser produzidos com elevado grau de pureza, livres de miniplasmideos (5) ou de plasmideos parentais (3) , recorrendo a processos cromatográficos genéricos (p. ex., cromatografia de permuta iónica ou cromatografia de interação hidrofóbica). Esta caracteristica contribui grandemente para a facilidade de aumentar a escala do processo, tornando possível pela primeira vez antever a possibilidade de manufaturar grandes quantidades de minicírculos (4) de forma económica.The unique feature of the process described herein is that minicircles (4) can be produced in high purity, free of miniplasmids (5) or parent plasmids (3), using generic chromatographic processes (e.g. ion exchange or hydrophobic interaction chromatography). This feature greatly contributes to the ease of scaling up the process, making it possible for the first time to foresee the possibility of economically manufacturing large quantities of mini-circles (4).
termo DNA plasmídico (pDNA) ou vetor plasmídico ou plasmídeo, refere-se a uma unidade genética extracromossómica composta por uma dupla cadeia de ácido desoxirribonucleico capaz de replicação autónoma intracelular.The term plasmid DNA (pDNA) or plasmid vector or plasmid refers to an extrachromosomal genetic unit composed of a double strand of deoxyribonucleic acid capable of autonomous intracellular replication.
termo plasmídeo parental (3) refere-se à molécula de plasmídeo (pDNA) composta por uma cassete de expressão eucariótica funcional flanqueada por dois locais de resolução de multímeros reconhecidos pela resolvase para, e pelas sequências bacterianas essenciais à propagação do plasmídeo no hospedeiro bacteriano. A parte bacteriana do plasmídeo parental (3) possui vários locais de reconhecimento específico para endonucleases de restrição com capacidade para introduzir cortes duplos (e.g. PvuII) ou simples (e.g. Nb.BbvCI) na cadeia açúcar fosfato do DNA.The term parental plasmid (3) refers to the plasmid molecule (pDNA) composed of a functional eukaryotic expression cassette flanked by two multimer resolution sites recognized by resolvase to and by bacterial sequences essential for propagation of the plasmid in the bacterial host. The bacterial part of the parental plasmid (3) has several restriction endonuclease specific recognition sites capable of introducing double (e.g. PvuII) or single (e.g. Nb.BbvCI) cuts into the DNA phosphate sugar chain.
termo minicírculo (4) refere-se a um plasmídeo possuindo a cassete de expressão eucariótica funcional que adicionalmente pode possuir outros elementos eucarióticos funcionais e um dos locais de resolução multiméricos.The term minicircle (4) refers to a plasmid having the functional eukaryotic expression cassette which may additionally have other functional eukaryotic elements and one of the multimeric resolution sites.
termo miniplasmídeo (5) refere-se a um plasmídeo derivado do plasmídeo parental (3) que possui locais de reconhecimento especifico para endonucleases de restrição em localizações regulares ao longo da sequência e um dos locais de resolução multiméricos.The term miniplasmid (5) refers to a plasmid derived from the parent plasmid (3) that has restriction endonuclease specific recognition sites at regular locations along the sequence and one of the multimeric resolution sites.
termo produtos de recombinação refere-se às moléculas de DNA covalentemente circularizadas que são obtidas depois da recombinação intramolecular do plasmideo parental (3) , nomeadamente minicirculo (4), miniplasmideo (5) e plasmideo parental (3) não recombinado residual.The term "recombination products" refers to covalently circularized DNA molecules that are obtained after intramolecular recombination of the parent plasmid (3), namely minicircle (4), miniplasmid (5), and residual non-recombined parental plasmid (3).
termo locais de reconhecimento especifico para endonucleases refere-se a locais no miniplasmideo (5) que são reconhecidos por endonucleases de restrição, que concomitantemente modificam a estrutura dos miniplasmideos (5) por ação enzimática especifica (e.g. restrição simples ou dupla da cadeia de DNA) . Tais sequências são geneticamente introduzidas de modo a ser possível hidrolisar o miniplasmideo (5) em pequenos fragmentos lineares de DNA (6) ou transformar o miniplasmideo (5) superenrolado em miniplasmideo (5) relaxado.The term endonuclease-specific recognition sites refers to sites in the miniplasmid (5) that are recognized by restriction endonucleases, which concomitantly modify the structure of the miniplasmids (5) by specific enzymatic action (eg single or double stranded DNA restriction). . Such sequences are genetically introduced so that it is possible to hydrolyze the miniplasmid (5) into small linear DNA fragments (6) or to transform the supercoiled miniplasmid (5) into relaxed miniplasmid (5).
Em algumas concretizações da invenção as enzimas de restrição são especificamente a enzima PvuII ou a enzima Nb.BbvCI.In some embodiments of the invention the restriction enzymes are specifically the enzyme PvuII or the enzyme Nb.BbvCI.
termo fragmentos lineares de DNA (6) refere-se aos produtos da hidrólise enzimática do miniplasmideo (5) e do plasmideo parental (3) por ação de endonucleases de restrição que cortam as duas cadeias de DNA.The term linear DNA fragments (6) refers to the enzymatic hydrolysis products of the miniplasmid (5) and the parent plasmid (3) by restriction endonucleases that cut the two DNA strands.
termo miniplasmideo (5) relaxado refere-se ao produto da hidrólise enzimática do miniplasmideo (5) superenrolado por ação de endonucleases de restrição que cortam apenas uma das duas cadeias de DNA.The term relaxed miniplasmid (5) refers to the enzyme hydrolysis product of the supercoiled miniplasmid (5) by the action of restriction endonucleases that cut only one of the two strands of DNA.
termo moléculas derivadas dos miniplasmideos (5) refere-se a fragmentos lineares de DNA (6) e/ou a miniplasmideo (5) relaxado.The term miniplasmid-derived molecules (5) refers to linear DNA fragments (6) and / or the relaxed miniplasmid (5).
momento de densidade celular adequada refere-se ao momento que antecede a fase exponencial do crescimento celular, o qual pode ter uma duração mais ou menos extensa consoante o estado fisiológico da cultura usada como inoculo e as condições de crescimento. Este momento deve ser entendido como a fase estacionária inicial do crescimento celular.Appropriate cell density moment refers to the moment preceding the exponential phase of cell growth, which may have a more or less extended duration depending on the physiological state of the culture used as inoculum and the growth conditions. This moment should be understood as the initial stationary phase of cell growth.
plasmideo parental (3) no cerne do processo que aqui se descreve é construído para que seja possível obter minicirculos (4) com grau de pureza elevado e adequado a aplicações farmacêuticas, por um processo baseado em etapas cromatográficas que é fácil de implementar à escala industrial. As etapas do processo usado para produzir os minicirculos (4) são mostradas de forma esquemática na Figura 1.Parental plasmid (3) at the heart of the process described herein is constructed so that it is possible to obtain high purity minicircles (4) suitable for pharmaceutical applications by a chromatographic step-based process that is easy to implement on an industrial scale. . The process steps used to produce the mini-circles (4) are shown schematically in Figure 1.
plasmideo parental (3) contém: i) o polinucleótido de interesse, tipicamente uma cassete de expressão eucariótica que contém o gene alvo adequado à aplicação em causa, flanqueado por dois locais de recombinação orientados que são reconhecidos por uma recombinase específica e ii) um esqueleto com sequências de origem essencialmente bacteriana contendo os elementos necessários para a propagação do plasmideo parental (3) num hóspede bacteriano, incluindo uma origem de replicação e uma marca de seleção, que contém pelo menos um e geralmente vários locais de restrição (simples ou dupla) que não estão presentes no polinucleótido de interesse e nos locais de recombinação (Figura 2) . Este plasmideo parental (3) é primeiramente usado para transformar um estirpe bacteriana adequada à produção de DNA plasmidico, normalmente deficiente em endonuclease I funcional e em recombinase A (p. ex. Escherichia coli DH5a).Parental plasmid (3) contains: i) the polynucleotide of interest, typically a eukaryotic expression cassette that contains the target gene suitable for the particular application, flanked by two targeted recombination sites that are recognized by a specific recombinase and ii) a backbone having sequences of essentially bacterial origin containing the elements necessary for the propagation of parental plasmid (3) in a bacterial guest, including an origin of replication and a check mark, which contain at least one and generally several restriction sites (single or double). not present in the polynucleotide of interest and recombination sites (Figure 2). This parental plasmid (3) is primarily used to transform a bacterial strain suitable for plasmid DNA production, usually deficient in functional endonuclease I and recombinase A (e.g. Escherichia coli DH5a).
As etapas do processo de produção e purificação, objeto da presente invenção, são descritas em seguida:The steps of the production and purification process, object of the present invention, are described below:
Etapa 1: Fermentação + recombinação.Step 1: Fermentation + recombination.
As células de E. coli contendo o plasmideo parental (3) são crescidas normalmente em balões de Erlenmeyer ou num fermentador, usando meios de cultura, temperatura e pHs adequados. 0 valor do pH deverá ser mantido entre 7 e 8, especialmente durante o processo de recombinação intramolecular. 0 crescimento é deixado progredir até se atingir uma densidade celular e fase de crescimento adequada (p. ex. fase estacionária inicial) de modo a maximizar os rendimentos de plasmideo parental (3). A recombinação intramolecular do plasmideo parental (3) em minicirculo (4) e miniplasmideo (5) é então despoletada introduzindo um fator de indução na cultura celular. 0 crescimento é mantido por um período de tempo suficiente para maximizar a eficiência de recombinação.E. coli cells containing the parental plasmid (3) are normally grown in Erlenmeyer flasks or in a fermenter using appropriate culture media, temperature and pH. The pH value should be kept between 7 and 8, especially during the intramolecular recombination process. Growth is allowed to progress to an appropriate cell density and growth phase (e.g. initial stationary phase) to maximize parental plasmid yields (3). Intramolecular recombination of parental plasmid (3) into minicircle (4) and miniplasmid (5) is then triggered by introducing an induction factor into the cell culture. Growth is maintained for a period of time sufficient to maximize recombination efficiency.
plasmideo parental (3) usado nesta invenção contém os locais de resolução multimérica (MRS) do operão parABCDE do plasmideo de largo espetro RK2. A recombinase específica que atua sobre os MRS é a resolvase ParA (1) cuja expressão se encontra sob o controlo do sistema pBAD/araC (Figura 3). As cassetes de DNA responsáveis pela recombinação (quer a pBAD/araC-parA quer a pBAD/araC-RBS-parA, que contém um local sintético de ligação ao ribossoma (RBS)) podem ser colocadas: 1) no plasmideo parental (3), 11) num plasmideo ajudante de baixo número de cópias que contém uma origem de replicação distinta daquela que se encontra no plasmideo parental (3) ou iii) no cromossoma do hospedeiro bacteriano usado para a propagação do plasmideo.Parental plasmid (3) used in this invention contains the multimeric resolution (MRS) sites of the parABCDE operon of the broad spectrum plasmid RK2. The specific recombinase acting on MRS is resolvase ParA (1) whose expression is under the control of the pBAD / araC system (Figure 3). Recombinant DNA cassettes (either pBAD / araC-parA or pBAD / araC-RBS-parA, which contain a synthetic ribosome binding site (RBS)) can be placed: 1) on the parental plasmid (3) , 11) a low copy helper plasmid containing a different origin of replication from that found in the parent plasmid (3) or iii) the bacterial host chromosome used for plasmid propagation.
A proteína AraC atua negativamente na ausência de arabinose, inibindo a expressão da resolvase ParA (1) a partir do promotor BAD. Quando presente, a L-( + )arabinose (2) liga-se à AraC, estimulando de forma positiva a expressão da resolvase ParA (1) (Figura 3) . A glucose, e numa fase posterior os baixos niveis de cAMP, inibem a expressão descontrolada da resolvase ParA (1) a partir do promotor pBAD, prevenindo a ocorrência de recombinação prematura. Uma vez que os miniplasmideos (5) contêm a origem de replicação, este controlo apertado da expressão da resolvase ParA (1) é imprescindível para impedir que os miniplasmideos (5) se propaguem e sobreponham aos plasmideos parentais (3) , conduzindo assim à perda de minicirculos (4). Normalmente adiciona-se 0,5%-l% de glucose ao meio de cultura durante a preparação dos bancos celulares, crescimento de pré-inóculos e manipulação de plasmideos de modo a garantir que o plasmideo parental (3) se mantém intacto e predominante nas células.The AraC protein acts negatively in the absence of arabinose, inhibiting ParA resolvase (1) expression from the BAD promoter. When present, L- (+) arabinose (2) binds to AraC, positively stimulating ParA resolvase expression (1) (Figure 3). Glucose, and at a later stage low cAMP levels, inhibit uncontrolled expression of ParA resolvase (1) from the pBAD promoter, preventing premature recombination from occurring. Since miniplasmids (5) contain the origin of replication, this tight control of ParA resolvase expression (1) is essential to prevent miniplasmids (5) from propagating and overlapping parental plasmids (3), thus leading to loss. mini-circles (4). Normally 0.5% -1% glucose is added to the culture medium during cell bank preparation, pre-inoculum growth and plasmid manipulation to ensure that parental plasmid (3) remains intact and predominant in cells
A indução da resolvase ParA (1) a partir das cassetes de expressão descritas acima é efetuada por intermédio da adição de L-( + ) arabinose (2) ao meio de cultura a pH 7-8 e 37°C. A resolvase ParA (1) expressa catalisará então a recombinação intramolecular especifica dos dois MRS que flanqueiam a cassete de expressão no plasmídeo parental (3) (Figura 4) . Este evento origina duas moléculas de DNA circular fechado superenroladas: i) um minicírculo (4) (MC) que contém a cassete de transcrição eucariótica necessária para expressar o gene alvo e ii) um miniplasmídeo (5) replicativo (MP) que contém as sequências de origem bacteriana indesejadas (Figura 4). 0 processo de recombinação é deixado ocorrer por um tempo suficiente para maximizar a sua eficiência.Induction of ParA resolvase (1) from the expression cassettes described above is performed by the addition of L- (+) arabinose (2) to the culture medium at pH 7-8 and 37 ° C. The expressed ParA resolvase (1) will then catalyze specific intramolecular recombination of the two MRS flanking the expression cassette in the parental plasmid (3) (Figure 4). This event gives rise to two supercoiled closed circular DNA molecules: i) a minicircle (4) (MC) containing the eukaryotic transcription cassette needed to express the target gene and ii) a replicative (5) miniplasmid (MP) containing the sequences of unwanted bacterial origin (Figure 4). The recombination process is allowed to take place long enough to maximize its efficiency.
Nesta invenção, o controlo de expressão pelo sistema pBAD/araC foi ainda melhorado utilizando uma estire de E. coli (BW27783) otimizada para incorporar arabinose (Khlebnikov et al., 2001). Estas células expressam continuamente o transportador de membrana AraE que entrega a arabinose de modo rápido e uniforme no interior das células, eliminado assim a indução tudo-ou-nada do pBAD. Como resultado podem ser usadas quantidades muito menores de L-(+)arabinose (2) (cerca de 10000 vezes menos) para induzir o pBAD.In this invention, expression control by the pBAD / araC system was further improved using an E. coli strain (BW27783) optimized to incorporate arabinose (Khlebnikov et al., 2001). These cells continually express the AraE membrane transporter that delivers arabinose rapidly and uniformly within the cells, thereby eliminating all-or-nothing induction of pBAD. As a result much smaller amounts of L - (+) arabinose (2) (about 10,000 times less) can be used to induce pBAD.
Etapa 2: Preparação dos produtos de recombinação.Step 2: Preparation of the recombination products.
Após a recolha, as células de E. coli sofrem um processo de rutura celular, por exemplo por lise alcalina, mecânica, térmica ou enzimática, que permite libertar os produtos de recombinação, minicírculo (4) e miniplasmídeo (5) das células. Os lisados obtidos são então tratados de modo a proporcionarem as condições ambientais adequadas para promover a atividade das endonuclease de restrição selecionadas sobre os miniplasmídeos (5). Em algumas situações o tratamento envolve a adição de isopropanol aos lisados de modo a promover a precipitação dos plasmídeos parentais (3), miniplasmideos (5), minicirculos (4) e DNA em geral. Após centrifugação e re-solubilização dos precipitados de DNA num tampão adequado, a restrição enzimática pode ser efetuada diretamente nos lisados clarificados, adicionando quantidades apropriadas das enzimas de restrição selecionadas. Preferencialmente, e de modo a obter minicirculos (4) com grau de pureza elevado, os produtos de recombinação são primeiramente isolados por um processo que utiliza cromatografia de interação hidrofóbica. Uma etapa de cromatografia de exclusão molecular é então usada para substituir o tampão por outro mais adequado à hidrólise enzimática que se segue. A preparação dos produtos de recombinação antes da hidrólise enzimática poderá também ser efetuada usando qualquer técnica de purificação descrita no estado da arte (e.g. cromatografia de permuta iónica).After collection, E. coli cells undergo a cell disruption process, for example by alkaline, mechanical, thermal or enzymatic lysis, which allows the recombination, minicircle (4) and miniplasmid (5) products to be released from the cells. The obtained lysates are then treated to provide the appropriate environmental conditions to promote the activity of the selected restriction endonuclease on the miniplasmids (5). In some situations treatment involves the addition of isopropanol to the lysates to promote precipitation of parental plasmids (3), miniplasmids (5), minicircles (4) and DNA in general. After centrifugation and re-solubilization of the DNA precipitates in a suitable buffer, enzyme restriction can be performed directly on the clarified lysates by adding appropriate amounts of the selected restriction enzymes. Preferably, and in order to obtain high purity minicircles (4), the recombination products are first isolated by a process using hydrophobic interaction chromatography. A molecular exclusion chromatography step is then used to replace the buffer with one more suitable for the following enzymatic hydrolysis. Preparation of the recombination products prior to enzymatic hydrolysis may also be performed using any prior art purification technique (e.g. ion exchange chromatography).
Etapa 3: Hidrólise enzimática in vitro do miniplasmideo (5) e do plasmideo parental (3) por endonucleases de restrição.Step 3: In vitro enzymatic hydrolysis of miniplasmid (5) and parental plasmid (3) by restriction endonucleases.
Nesta etapa, a mistura de produtos de recombinação obtida na etapa anterior é sujeita a uma reação de hidrólise enzimática seletiva in vitro, por ação de endonucleases de restrição, tendo em vista a modificação da estrutura das moléculas de miniplasmideo (5) e de plasmideo parental (3) não recombinado. São utilizadas endonucleases de restrição que atuam sobre os locais de reconhecimento especifico para endonucleases que foram colocados na porção bacteriana do plasmideo parental (3).In this step, the mixture of recombination products obtained in the previous step is subjected to an in vitro selective enzymatic hydrolysis reaction by restriction endonucleases in order to modify the structure of the miniplasmid (5) and parental plasmid molecules. (3) not recombined. Restriction endonucleases that act on endonuclease-specific recognition sites that have been placed on the bacterial portion of the parental plasmid (3) are used.
Numa das concretizações da invenção, utilizam-se enzimas de restrição especificas que atuam cortando as duas cadeias de DNA por meio de duas incisões, uma em cada uma das cadeias açúcar-fosfato (e.g. PvuII), originando assim fragmentos lineares de DNA (6) de cadeia dupla.In one embodiment of the invention, specific restriction enzymes are used which act by cutting the two DNA strands by means of two incisions, one in each of the sugar phosphate chains (eg PvuII), thus yielding linear DNA fragments (6). Double stranded.
No caso do plasmídeo pMINI8, descrito esquematicamente na Figura 2, a hidrólise com a endonuclease de restrição PvuII produz fragmentos de DNA lineares curtos com tamanhos entre 337 e 414 pares de bases (pb), que têm origem no miniplasmídeo, e fragmentos com 337 e 414 pares de bases mais um fragmento com (x + 281) pares de bases, que têm origem em plasmídeos parentais (3) que possam estar presentes na mistura, onde x corresponde ao tamanho do minicírculo (4) (que depende do gene de interesse que foi clonado) (Figura 5).In the case of plasmid pMINI8, schematically described in Figure 2, hydrolysis with restriction endonuclease PvuII yields short linear DNA fragments between 337 and 414 base pairs (bp) in size, and fragments of 337 and 414 base pairs plus a fragment with (x + 281) base pairs, which originate from parental plasmids (3) that may be present in the mixture, where x corresponds to the size of the minicircle (4) (which depends on the gene of interest). that was cloned) (Figure 5).
A restrição enzimática pode ser levada a cabo por adição de quantidades adequadas da enzima de restrição ao lisado clarificado que contém os produtos de recombinação ou às soluções que contêm os produtos de recombinação purificados. A temperatura ótima para a enzima de restrição PvuII é de 37°C e a restrição é conduzida durante 1-8 horas por adição de 0,5-4,0 unidades de enzima por μρ de plasmídeo total num tampão adequado. Desejavelmente os fragmentos de DNA linearizados deverão ser tão pequenos quanto possível de modo a maximizar a separação das moléculas de minicírculo (4) das impurezas de DNA durante os passos cromatográficos subsequentes.Enzyme restriction may be carried out by adding appropriate amounts of the restriction enzyme to the clarified lysate containing the recombination products or to the solutions containing the purified recombination products. The optimal temperature for the PvuII restriction enzyme is 37 ° C and the restriction is conducted for 1-8 hours by adding 0.5-4.0 enzyme units per μρ of total plasmid in a suitable buffer. Desirably the linearized DNA fragments should be as small as possible in order to maximize the separation of minicircle molecules (4) from DNA impurities during subsequent chromatographic steps.
Em algumas concretizações da invenção, fragmentos lineares de DNA (6) adicionais mais pequenos ou maiores poderão surgir consoante a construção do plasmídeo parental (3) e o local onde a cassete pBAD/araC-parA de expressão da resolvase ParA (1) é colocada. Se a cassete de expressão da resolvase ParA (1) for colocada num plasmídeo ajudante de baixo número de cópias que também contenha locais de restrição PvuII, esse plasmideo será também digerido, originado um conjunto de fragmentos de restrição próprio. Se a cassete for colocada no plasmideo parental (3) , o conjunto de fragmentos gerado a partir da restrição do miniplasmideo (5) e do plasmideo parental (3) também virá alterado. Nesse caso, modificações genéticas adicionais deverão ser consideradas para criar locais de restrição PvuII adicionais de modo a que seja possível manter uma separação satisfatória entre minicírculos (4) e fragmentos lineares de DNA (6) durante o processo de separação subsequente. Alternativamente, locais de restrição diferentes reconhecíveis por outras endonucleases de restrição que não a PvuII, que atuam cortando as duas cadeias de DNA, podem ser colocados no plasmideo parental (3) em locais ligeiramente diferentes.In some embodiments of the invention, additional smaller or larger linear DNA fragments (6) may appear depending on the construction of the parental plasmid (3) and where the ParA resolvase expression pBAD / araC-parA cassette (1) is placed . If the ParA resolvase expression cassette (1) is placed on a low copy helper plasmid that also contains PvuII restriction sites, that plasmid will also be digested, resulting in a set of restriction constructs of its own. If the cassette is placed on the parental plasmid (3), the fragment set generated from the restriction of the miniplasmid (5) and the parental plasmid (3) will also change. In this case, additional genetic modifications should be considered to create additional PvuII restriction sites so that satisfactory separation can be maintained between minicircles (4) and linear DNA fragments (6) during the subsequent separation process. Alternatively, different restriction sites recognizable by non-PvuII restriction endonucleases acting by cutting the two DNA strands can be placed on the parental plasmid (3) at slightly different sites.
Noutras concretizações da invenção, poderão utilizar-se endonucleases de restrição específicas que atuam cortando apenas uma das cadeias de DNA (e.g. Nb.BbvCI), em alternativa a endonucleases de restrição que produzem fragmentos lineares de DNA (6) a partir do miniplasmideo (5). Nestes casos, os miniplasmídeos (5) superenrolados são transformados em miniplasmídeos (5) relaxados, que poderão posteriormente ser separados das moléculas de minicírculo (4) superenrolado por uma técnica cromatográfica adequada.In other embodiments of the invention, specific restriction endonucleases acting only by cutting one of the DNA strands (eg Nb.BbvCI) may be used, as an alternative to restriction endonucleases that produce linear DNA fragments (6) from the miniplasmid (5). ). In these cases, the supercoiled mini-plasmids (5) are transformed into relaxed mini-plasmids (5), which can then be separated from the supercoiled mini-circle molecules (4) by a suitable chromatographic technique.
A endonuclease de restrição (simples ou dupla) poderá ser uma enzima pura disponível comercialmente ou uma enzima produzida em células bacterianas pela tecnologia de DNA recombinante. Neste último caso, uma enzima parcialmente purificada poderá ser suficiente para que se obtenha uma hidrólise completa dos produtos de recombinação.Restriction endonuclease (single or double) may be a commercially available pure enzyme or an enzyme produced in bacterial cells by recombinant DNA technology. In the latter case, a partially purified enzyme may be sufficient to achieve complete hydrolysis of the recombination products.
Etapa 4: Separação dos minicírculos (4) dos produtos da hidrólise enzimática.Step 4: Separation of the mini-circles (4) from the enzymatic hydrolysis products.
Nesta etapa, os minicírculos (4) superenrolados são separados das moléculas derivadas dos miniplasmídeos (5), plasmídeos parentais (3) não recombinados obtidas na etapa anterior de hidrólise enzimática selectiva in vitro e de outras impurezas do processo.In this step, the supercoiled minicircles (4) are separated from the molecules derived from the miniplasmids (5), non-recombinant parental plasmids (3) obtained in the previous step of selective in vitro enzymatic hydrolysis and other process impurities.
Numa das concretizações da invenção, a separação robusta, reprodutível e escalável dos fragmentos lineares de DNA (6) obtidos por ação de enzimas de restrição específicas que atuam cortando as duas cadeias de DNA por meio de duas incisões, dos minicírculos (4) superenrolados foi conseguida através: (i) da modificação do plasmídeo parental (3) de modo a obter fragmentos de DNA após a hidrólise de miniplasmídeos (5) e plasmídeos parentais (3) com tamanhos que facilitam a separação cromatográfica dos minicírculos (4), (ii) de ligandos de permuta aniónica DEAE (dietil aminoetil) que separam as moléculas de DNA com base na sua densidade de carga, que por sua vez é função do seu comprimento e (iii) de um suporte cromatográfico que permite uma separação escalável, robusta e simples dos minicírculos (4) .In one embodiment of the invention the robust, reproducible and scalable separation of linear DNA fragments (6) obtained by specific restriction enzymes acting by cutting the two DNA strands through two incisions of the supercoiled minicircles (4) was achieved by: (i) modifying the parental plasmid (3) to obtain DNA fragments after hydrolysis of miniplasmids (5) and parental plasmids (3) with sizes that facilitate chromatographic separation of minicircles (4), (ii ) DEAE (diethyl aminoethyl) anion exchange ligands that separate DNA molecules based on their charge density, which is in turn a function of their length and (iii) a chromatographic support that allows scalable, robust and minicircles (4).
Numa das concretizações da invenção, um monólito de permuta aniónica DEAE é utilizado para purificar de forma eficiente os minicírculos (4) dos fragmentos lineares de DNA (6) . Um monólito típico consiste num leito contínuo feito de um bloco de material sólido altamente poroso com poros com tamanhos de 600-750 nm (Smrekar et al. , 2010, Urthaler et al. , 2005). A principal característica destes monólitos é permitirem que a fase fluida se escoe através desses grandes poros, aumentando em consequência o transporte de massa por convecção comparativamente aos processos lentos de difusão que prevalecem nas partículas cromatográficas convencionais. Por outro lado, os plasmideos são moléculas relativamente grandes (eixos de super-hélices com dimensões em torno de 560-1700 nm para plasmideos de 4 a 12 kilo pares de bases) que tipicamente adsorvem na superfície exterior das partículas cromatográficas. Por comparação, no caso dos monólitos a área disponível para adsorção de moléculas de plasmideos é consideravelmente maior (Smrekar et al., 2010) . Acresce ainda que as separações em monólitos são extremamente rápidas, como consequência dos caudais elevados a baixas pressões a que é possível operar, sendo normalmente caracterizadas por elevadas capacidades de ligação, rendimentos e resolução. Estas caracteristicas são independentes dos caudais e da escala, o que faz com que os monólitos sejam particularmente adequados a preparação de minicirculos (4) em grande escala.In one embodiment of the invention, a DEAE anion exchange monolith is used to efficiently purify the mini-circles (4) of the linear DNA fragments (6). A typical monolith consists of a continuous bed made of a block of highly porous solid material with pore sizes of 600-750 nm (Smrekar et al., 2010, Urthaler et al., 2005). The main feature of these monoliths is that they allow the fluid phase to flow through these large pores, thereby increasing convective mass transport compared to the slow diffusion processes prevailing in conventional chromatographic particles. On the other hand, plasmids are relatively large molecules (super-helix axes about 560-1700 nm for 4-12 kilo base pair plasmids) that typically adsorb on the outer surface of the chromatographic particles. By comparison, in the case of monoliths the area available for adsorption of plasmid molecules is considerably larger (Smrekar et al., 2010). In addition, monolith separations are extremely rapid as a result of the high flow rates at low pressures at which they can operate and are typically characterized by high bonding capacities, yields and resolution. These characteristics are independent of flow rates and scale, which makes monoliths particularly suitable for the preparation of large-scale minicircles (4).
Na presente invenção foram utilizados monólitos de polimetacrilato disponíveis comercialmente sob o nome Convective Interaction Media (CIM) (BIA Separations, Ljubljana, Slovenia).Commercially available polymethacrylate monoliths under the name Convective Interaction Media (CIM) (BIA Separations, Ljubljana, Slovenia) were used.
Separaram-se 20 μg de produtos de recombinação num monólito CIM-DEAE (BIA Separations, V=0,34 mL) equilibrado com 20 mM Tris-HCl, pH 8, utilizando um gradiente crescente de NaCl de 590 mM a 67 0 mM (24 volumes de coluna, declive do gradiente de 10 %B /min, em que o tampão B contém 1 M de NaCl em 20 mM Tris-HCl, pH 8). Contudo, verificou-se que a resolução da separação diminuiu com o aumento da carga de alimentação (75 μg de pMINI7GFPVEGF) , como se mostra na Figura 7. De modo a aumentar a carga e por conseguinte a produtividade da separação na mesma coluna, o pH da fase móvel foi otimizado como se descreve seguidamente.20 µg of recombination products were separated into a CIM-DEAE monolith (BIA Separations, V = 0.34 mL) equilibrated with 20 mM Tris-HCl, pH 8 using a 590 mM NaCl increasing gradient at 670 mM ( 24 column volumes, gradient gradient 10% B / min, where buffer B contains 1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 8). However, separation resolution was found to decrease with increasing feed loading (75 μg of pMINI7GFPVEGF) as shown in Figure 7. In order to increase the loading and therefore the separation productivity in the same column, Mobile phase pH was optimized as described below.
grupo amina do permutador aniónico fraco dietil amino etil (DEAE) encontra-se positivamente carregado a pH < 9. A valores de pH mais altos, os grupos DEAE desprotonam-se, perdendo a sua carga. 0 DNA é uma molécula grande fortemente eletronegativa que interage com matrizes de permuta aniónica através de locais múltiplos, estabelecendo uma interação muito forte. A valores elevados de pH, o número de grupos DEAE carregados é menor e portanto menos locais de ligação estão envolvidos na ligação a DNA. É assim possível eluir moléculas de DNA com concentrações de sal mais baixas. Por exemplo, a pH 9 bastou uma concentração de NaCl de 30 6 mM para eluir o DNA comparado com concentrações de 711 mM e 757 mM NaCl a pH 8 e pH 7, respetivamente (Figura 9). Além do mais, a pH 9 a resolução entre os fragmentos curtos de DNA e os minicirculos (4) aumentou, eluindo os dois grupos de molécula com uma diferença de 20 mM de NaCl. Esta diferença permite otimizar a separação por introdução de um gradiente em degrau.diethyl amino ethyl weak anion exchanger (DEAE) amine group is positively charged at pH <9. At higher pH values, the DEAE groups deprotonate, losing their charge. DNA is a large, strongly electronegative molecule that interacts with anion exchange matrices across multiple sites, establishing a very strong interaction. At higher pH values, the number of DEAE groups charged is smaller and therefore fewer binding sites are involved in DNA binding. It is thus possible to elute DNA molecules with lower salt concentrations. For example, at pH 9 a 30 mM NaCl concentration was sufficient to elute DNA compared to 711 mM and 757 mM NaCl concentrations at pH 8 and pH 7, respectively (Figure 9). Moreover, at pH 9 the resolution between the short DNA fragments and the minicircles (4) increased, eluting the two molecule groups with a 20 mM NaCl difference. This difference allows the separation to be optimized by introducing a step gradient.
A concentração de sal correspondente à cauda do pico de impurezas foi usada para guiar o estabelecimento de um esquema de eluição em degrau usando tampões 20 mM Tris-HCl, pH 9 (tampão A) e 1 M NaCl em 20 mM Tris, pH 9 (tampão B). Numa experiência típica, 2 mL de uma solução contendo minicirculos (4) e impurezas de DNA digerido (26 μg) foram injetados num monólito CIM-DEAE (0,34 mL) previamente equilibrado à temperatura ambiente com 5 volumes de coluna (CVs) de uma mistura de tampões A e B com uma concentração inicial de NaCl de 210 mM. Os minicirculos (4) foram separados dos fragmentos lineares de DNA (6) de impurezas por intermédio de um gradiente em degrau usando um caudal de 1 mL/min. A concentração de sal necessária para eluir as impurezas variou entre 230 mM e 330 mM de NaCl, dependendo dos lotes de amostra e tampões ou de fatores ambientais como a temperatura. Uma etapa de eluição longa, com uma duração de 15 CVs foi utilizada para garantir uma eluição completa das impurezas mesmo quando se utilizam cargas elevadas. Os minicirculos (4) eluíram durante o degrau de eluição a 40% de tampão B sob a forma de um pico estreito. No final de cada corrida a coluna foi regenerada com 5 CV de uma solução 1 M de NaCl.The salt concentration corresponding to the tail of the impurity peak was used to guide the establishment of a step elution scheme using 20 mM Tris-HCl buffers, pH 9 (buffer A) and 1 M NaCl in 20 mM Tris, pH 9 ( buffer B). In a typical experiment, 2 mL of a solution containing minicircles (4) and digested DNA impurities (26 μg) were injected into a CIM-DEAE monolith (0.34 mL) previously equilibrated to room temperature with 5 column volumes (CVs) of a mixture of buffers A and B with an initial NaCl concentration of 210 mM. The minicircles (4) were separated from the linear DNA fragments (6) of impurities by a step gradient using a flow rate of 1 mL / min. The salt concentration required to elute impurities ranged from 230 mM to 330 mM NaCl, depending on sample lots and buffers or environmental factors such as temperature. A long elution step of 15 CVs was used to ensure complete elution of impurities even when using high loads. The minicircles (4) eluted during the elution step at 40% buffer B as a narrow peak. At the end of each run the column was regenerated with 5 CV of a 1 M NaCl solution.
O processo de separação de minicirculos (4) de fragmentos lineares de DNA (6) descrito nesta invenção é robusto e passivel de aumento de escala. Estas características tornam-no adequado à produção de quantidades de minicirculos (4) da ordem dos gramas-quilogramas necessárias à condução de ensaios pré-clinicos e clinicos ou ao estabelecimento de campanhas de produção de proteínas recombinantes por transfeção transiente.The process of separating minicircles (4) from linear DNA fragments (6) described in this invention is robust and scalable. These characteristics make it suitable for the production of minicircle quantities (4) of the order of gram-kilograms necessary for conducting preclinical and clinical trials or for establishing transient transfection protein production campaigns.
A presente invenção pode ser colocada em prática usando outros ligandos e suportes cromatográficos, como monólitos, membranas e partículas, capazes de separar fragmentos lineares de DNA (6) de moléculas de minicirculos (4) superenrolados. Outros suportes monolíticos podem também ser usados como por exemplo monólitos baseados em sílica ou em poliacrilamida. Estes monólitos podem ter tamanhos de poros e densidades de grupos ativos variáveis.The present invention may be practiced using other ligands and chromatographic supports, such as monoliths, membranes and particles, capable of separating linear DNA fragments (6) from supercoiled minicircle (4) molecules. Other monolithic supports may also be used such as silica or polyacrylamide based monoliths. These monoliths may have varying pore sizes and active group densities.
Em algumas concretizações da invenção, quando a hidrólise enzimática é efetuada diretamente nos lisados clarificados e não produtos recombinados purificados, serão necessários passos adicionais de cromatografia para a obtenção final de minicirculos (4) com grau de pureza farmacêutica.In some embodiments of the invention, when enzymatic hydrolysis is performed directly on clarified lysates and not purified recombinant products, additional chromatography steps will be required to obtain final pharmaceutical purity grade mini-circles (4).
Noutras concretizações da invenção em que se utilizam endonucleases de restrição específicas que atuam cortando apenas uma das cadeias de DNA, os miniplasmídeos (5) relaxados obtidos poderão ser separados das moléculas de minicirculo (4) superenrolado por técnicas cromatográficas conhecidas no estado da arte como sendo capazes de separar isoformas de plasmideos.In other embodiments of the invention using specific restriction endonucleases acting by cutting only one of the DNA strands, the obtained relaxed miniplasmids (5) may be separated from the supercoiled minicircle molecules (4) by known chromatographic techniques as being capable of separating plasmid isoforms.
Etapa 5: Troca de tampãoStep 5: Buffer Change
Após a separação dos fragmentos lineares de DNA (6) ou dos miniplasmídeos (5) relaxados, os minicirculos (4) purificados encontram-se no tampão utilizado para promover a eluição do suporte cromatográfico. Este tampão é normalmente trocado por um tampão de formulação adequado à utilização final dos minicirculos (4) (p.ex. estudos in vivo e in vitro) . Os métodos conhecidos no estado da arte para trocar tampões de soluções contendo DNA como por exemplo a cromatografia de exclusão molecular, a diálise ou a precipitação de DNA são adequados a este fim.After separation of the linear DNA fragments (6) or the relaxed mini-plasmids (5), the purified mini-circles (4) are found in the buffer used to elute the chromatographic support. This buffer is usually exchanged for a formulation buffer suitable for the end use of the mini-circles (4) (eg in vivo and in vitro studies). Prior art methods for exchanging buffers of DNA containing solutions such as molecular exclusion chromatography, dialysis or DNA precipitation are suitable for this purpose.
Descrição das figurasDescription of the figures
A Figura 1 descreve esquematicamente o processo usado para produzir e purificar minicirculos (4).Figure 1 schematically depicts the process used to produce and purify minicircles (4).
A Figura 2 descreve esquematicamente os plasmideos parentais (3), pMINI5 e pMINI8. As sequências bacterianas contêm uma origem de replicação derivada do plasmideo pUC (pUC ORI), um marcador de seleção de resistência à canamicina (KanR), os locais de restrição PvuII que ocorrem naturalmente e os adicionados por engenharia genética (PvuII), assinaladas a preto. As cassetes de expressão eucariótica funcional contêm um promotor eucariótico (Peuk) , o gene de interesse (GOI) e um sinal de poliadenilação de terminação (poliA), assinalados a cinzento claro. As sequências bacterianas e as cassetes de expressão eucariótica funcional estão flanqueadas, em cada lado, por locais de resolução de multimeros orientados de forma semelhante (MRS), que são reconhecidas por uma recombinase especifica desses locais.Figure 2 schematically depicts the parental plasmids (3), pMINI5 and pMINI8. Bacterial sequences contain an origin of replication derived from the plasmid pUC (pUC ORI), a kanamycin resistance selection marker (KanR), naturally occurring PvuII restriction sites and those genetically engineered (PvuII) marked in black. . Functional eukaryotic expression cassettes contain a eukaryotic promoter (Peuk), the gene of interest (GOI) and a termination polyadenylation signal (polyA) marked in light gray. Bacterial sequences and functional eukaryotic expression cassettes are flanked on either side by similarly oriented multimer resolution (MRS) sites, which are recognized by a specific recombinase of these sites.
A Figura 3 representa um diagrama esquemático da cassete de DNA que possui a resolvase ParA (1) responsável pela recombinação. 0 gene ParA está sob o controle do promotor BAD (pBAD) e repressor AraC (araC) expressão. A proteína AraC atua negativamente na ausência de arabinose, inibindo a expressão da resolvase ParA (1) regulada pelo promotor BAD. Quando a L-( + ) arabinose (2) está presente, esta ligase à AraC, estimulando positivamente a expressão da resolvase ParA (1). 0 local de ligação ao ribossoma (RBS) é ilustrado no esquema em tamanho não proporcional.Figure 3 is a schematic diagram of the DNA cassette that has the ParA (1) resolvase responsible for recombination. The ParA gene is under the control of the BAD promoter (pBAD) and AraC repressor (araC) expression. The AraC protein acts negatively in the absence of arabinose, inhibiting BAD promoter-regulated ParA (1) expression. When L- (+) arabinose (2) is present, it binds to AraC, positively stimulating the expression of ParA resolvase (1). The ribosome binding site (RBS) is illustrated in the non-proportional size scheme.
A Figura 4 descreve esquematicamente e a título de exemplo, a formação de minicírculo (4) e miniplasmideo (5) resultante da recombinação do plasmideo parental (3) pMINI8 catalisada pela resolvase ParA (1) induzida por L( + )arabinose (2) . 0 minicírculo (4) contém a cassete de expressão eucariótica e um dos locais de resolução de multimeros e o miniplasmideo (5) contém os elementos bacterianos e um dos locais de resolução de multimeros.Figure 4 schematically depicts, by way of example, the formation of minicircle (4) and miniplasmid (5) resulting from the recombination of parental plasmid (3) pMINI8 catalyzed by L (+) arabinose (2) induced ParA (1) resolvase . Minicircle (4) contains the eukaryotic expression cassette and one of the multimer resolution sites and miniplasmid (5) contains the bacterial elements and one of the multimer resolution sites.
A Figura 5 mostra esquematicamente a hidrólise in vitro pela endonuclease de restrição PvuII de uma mistura contendo, miniplasmídeos (5), minicírculos (4) e plasmídeos parentais (3) . A hidrólise produz fragmentos lineares de DNA (6) pequenos com 337-414 pb, provenientes do miniplasmídeo (5) , e fragmentos de 337-414 pb de comprimento e um fragmento de (x + 281) pb, proveniente do plasmídeo parental (3), onde x é a dimensão de minicírculos (4). Os minicírculos (4) são deixados intactos pela PvuII.Figure 5 schematically shows in vitro hydrolysis by restriction endonuclease PvuII of a mixture containing miniplasmids (5), minicircles (4) and parental plasmids (3). Hydrolysis yields small 337-414 bp linear DNA (6) fragments from miniplasmid (5) and 337-414 bp long fragments and a (x + 281) bp fragment from the parent plasmid (3). ), where x is the dimension of minicircles (4). The mini-circles (4) are left intact by PvuII.
As figuras 6A e 6B ilustram uma hidrólise, pela enzima de restrição PvuII, dos produtos de recombinação presentes em amostras purificadas ou em lisados clarificados.Figures 6A and 6B illustrate a PvuII restriction enzyme hydrolysis of the recombination products present in purified samples or clarified lysates.
A figura 6A mostra a análise por eletroforese num gel de agarose de uma mistura obtida por hidrólise com PvuII do plasmídeo parental (3) pMINI8 contendo o gene da GFP, pMINI8GFP purificado. Os plasmídeos recombinados e purificados foram submetidos a hidrólise enzimática durante 1-3 horas a 37 °C por adição de 0,1-1 U da enzima de restrição PvuII (Thermo Scientific) por micrograma de produtos recombinantes, em tampão apropriado (0,1 mL) . O padrão de hidrólise do pMINI8GFP consiste em fragmentos lineares de DNA (6) pequenos, variando em tamanho entre 337 e 414 pb e um fragmento grande de 2162 pb que corresponde ao plasmídeo parental (3) não recombinado.Figure 6A shows agarose gel electrophoresis analysis of a mixture obtained by PvuII hydrolysis of the parent plasmid (3) pMINI8 containing the purified GFP gene pMINI8GFP. Purified recombinant plasmids were subjected to enzymatic hydrolysis for 1-3 hours at 37 ° C by adding 0.1-1 U of the restriction enzyme PvuII (Thermo Scientific) per microgram of recombinant products in appropriate buffer (0.1 mL). The pMINI8GFP hydrolysis pattern consists of small linear DNA fragments (6) ranging in size from 337 to 414 bp and a large 2162 bp fragment that corresponds to the unrecombined parental plasmid (3).
A figura 6B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose de uma mistura obtida por hidrólise com PvuII (0,1— 1 U PvuII/^g durante 1-3 horas a 37 °C) de um lisado clarificado contendo o plasmídeo parental (3) pMINI5GFP (pMINI5 contendo o gene da GFP) e o plasmídeo auxiliar pMMBpar2A. O padrão de hidrólise do pMINI5GFP consiste em fragmentos lineares de DNA (6) de 751, 731, 698, 360 pb a partir do miniplasmideo (5) e um fragmento adicional de 2162 pb pertencente ao plasmideo parental (3) não recombinado. 0 plasmideo ajudante pMMBpar2A também possui cinco locais de clivagem para a enzima PvuII, resultando em fragmentos lineares de DNA (6) de 6414, 3356, 836, 416, 281 e 93 bp. Os últimos quatro fragmentos mencionados possuem uma massa relativa baixa e por isso não são visíveis no gel de agarose. Pista 61- produtos de recombinação purificados. Pista 6ii- produtos de recombinação a partir do lisado clarificado, pista 6iii- hidrólise dos produtos de recombinação presentes nos lisados clarificados, pista 6ivhidrólise dos produtos de recombinação presentes em amostras purificadas, pista M- marcadores de peso molecular.Figure 6B shows agarose gel electrophoresis analysis of a mixture obtained by hydrolysis with PvuII (0.1-1 U PvuII / µg for 1-3 hours at 37 ° C) of a clarified lysate containing the parent plasmid ( 3) pMINI5GFP (pMINI5 containing the GFP gene) and the helper plasmid pMMBpar2A. The hydrolysis pattern of pMINI5GFP consists of 751, 731, 698, 360 bp linear DNA fragments (6) from the miniplasmid (5) and an additional 2162 bp fragment belonging to the parental plasmid (3) not recombined. Helper plasmid pMMBpar2A also has five cleavage sites for the enzyme PvuII, resulting in linear DNA fragments (6) of 6414, 3356, 836, 416, 281 and 93 bp. The last four fragments mentioned have a low relative mass and are therefore not visible on the agarose gel. Lane 61- purified recombination products. Lane 6 - recombination products from the clarified lysate, lane 6 - hydrolysis of the recombination products present in the clarified lysates, lane 6 - hydrolysis of the recombination products present in purified samples, lane M - molecular weight markers.
A figura 7 mostra a separação, obtida por cromatografia num monólito de permuta aniónica DEAE, entre os produtos de recombinação e os fragmentos lineares de DNA (6).Figure 7 shows the separation, obtained by chromatography on a DEAE anion exchange monolith, between the recombination products and the linear DNA fragments (6).
As figuras 7A e 7B ilustram uma separação cromatográfica num disco monólito CIM-DEAE (V=0,34 ml; BIA Separations) de 21 pg de pMINI5GFPVEGF e pMMBpar2A previamente digeridos.Figures 7A and 7B illustrate a chromatographic separation on a 21 pg previously digested pMINI5GFPVEGF and pMMBpar2A CIM-DEAE monolith disk (V = 0.34 ml; BIA Separations).
painel A mostra o cromatograma obtido com um gradiente crescente de NaCl 590-670 mM em 24 volumes de coluna (declive do gradiente de 1 % de B/min) . Tampão A: 20 mM Tris-HCl, pH 8, tampão B: 1 M de NaCl em 20 mM Tris-HCl, pH 8. O pico 71 corresponde aos fragmentos pequenos lineares de cerca de 350 pb, o pico 711 contém fragmentos de 750 pb e o pico 7111 corresponde ao minicirculo (4) MC-GFPVEGF superenrolado.panel A shows the chromatogram obtained with an increasing gradient of 590-670 mM NaCl over 24 column volumes (gradient gradient of 1% B / min). Buffer A: 20 mM Tris-HCl, pH 8, Buffer B: 1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 8. Peak 71 corresponds to small linear fragments of about 350 bp, peak 711 contains 750 fragments. bp and peak 7111 corresponds to the mini-circle (4) overcoiled MC-GFPVEGF.
O painel B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose (1%) das frações de cada um dos picos. Pista 7ivmistura carregada na coluna, pista M- marcadores de peso molecular, pistas 7i-frações correspondentes ao pico 7i, pistas 7ii-frações correspondentes ao pico 7ii, pistas 7iii-frações correspondentes ao pico 7iii.Panel B shows agarose gel electrophoresis analysis (1%) of the fractions of each peak. Lane 7mix loaded column, lane M-molecular weight markers, lanes 7i-fractions corresponding to peak 7i, lanes 7ii-fractions corresponding to peak 7ii, lanes 7iii-fractions corresponding to peak 7iii.
As figuras 8A e 8B ilustram uma separação cromatográfica num disco monólito CIM-DEAE (V=0,34 mL; BIA Separations).Figures 8A and 8B illustrate a chromatographic separation on a CIM-DEAE monolith disk (V = 0.34 mL; BIA Separations).
painel A mostra o cromatograma obtido com um gradiente crescente de NaCl de 690-770 mM de NaCl em 48 volumes de coluna (declive do gradiente de 0,5 % de B/min.). Tampão A: 20 mM Tris-HCl, pH 8, tampão B: NaCl 1 M (em 20 mM TrisHC1, pH 8) . O pico 8i corresponde aos fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 350 pb, o pico 8ii corresponde aos fragmentos de 750 pb e o pico 8iii corresponde ao minicírculo (4) MC-VEGF superenrolado.panel A shows the chromatogram obtained with an increasing NaCl gradient of 690-770 mM NaCl over 48 column volumes (gradient gradient 0.5% B / min). Buffer A: 20 mM Tris-HCl, pH 8, Buffer B: 1 M NaCl (in 20 mM TrisHCl, pH 8). Peak 8i corresponds to the linear DNA fragments (6) of about 350 bp, peak 8ii corresponds to the 750 bp fragments and peak 8iii corresponds to the supercoiled MC-VEGF minicircle (4).
O painel B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose (1%) das frações de cada um dos picos. A pista 8iv corresponde aos produtos de recombinação do pMINI7VEGF após a indução, no momento da colheita e, a pista 8v, mostra a mistura digerida com PvuII carregada na coluna. As pistas agrupadas sob as designações 8i, 8ii e 8iii correspondem às frações dos picos 8i, 8ii e 8iii, respetivamente.Panel B shows agarose gel electrophoresis analysis (1%) of the fractions of each peak. Lane 8iv corresponds to pMINI7VEGF recombination products after induction at the time of collection and lane 8v shows the column-loaded PvuII digested mixture. The tracks grouped under the names 8i, 8ii and 8iii correspond to the fractions of peaks 8i, 8ii and 8iii, respectively.
A Figura 9 mostra o efeito do pH da fase móvel na ligação, na retenção e na eluição de 13 pg de produtos recombinantes digeridos, na separação cromatográfica realizada num disco monólito CIM-DEAE (BIA Separations) . Com o aumento do pH menos grupos DEAE se apresentam carregados e devido a uma retenção mais fraca, é necessário para eluição do DNA uma concentração de sal mais baixa. %B representa a percentagem de tampão B utilizado.Figure 9 shows the effect of mobile phase pH on binding, retention and elution of 13 pg of digested recombinant products, chromatographic separation performed on a CIM-DEAE monolithic disk (BIA Separations). With increasing pH fewer DEAE groups are charged and due to weaker retention, a lower salt concentration is required for DNA elution. % B represents the percentage of buffer B used.
As figuras 10A e 10B ilustram a separação cromatográfica num disco monólito CIM-DEAE (V=0,34 mL; BIA Separations) de pg de pMINI8GFP (pMINI8 contendo o gene da GFP) previamente digeridos.Figures 10A and 10B illustrate chromatographic separation on a previously digested pMINI8GFP pg (pMINI8 containing the GFP gene) CIM-DEAE monolith disk (V = 0.34 mL; BIA Separations).
painel A mostra o cromatograma obtido com um gradiente crescente de NaCl 210-290 mM em 24 volumes de coluna (declive do gradiente de 1 % de B/min.) Tampão A: 20 mM Tris-HCl, pH 9, tampão B: NaCl 1 M (em 20 mM Tris-HCl, pH 9) . O pico 101, a 7-8 minutos, corresponde a pequenos fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 350 pb e o pico 1011, a 9,5 minutos, corresponde ao minicírculo (4) MC-GFP.panel A shows the chromatogram obtained with a rising gradient of 210-290 mM NaCl in 24 column volumes (gradient gradient of 1% B / min.) Buffer A: 20 mM Tris-HCl, pH 9, Buffer B: NaCl 1 M (in 20 mM Tris-HCl, pH 9). Peak 101 at 7-8 minutes corresponds to small linear DNA fragments (6) of about 350 bp and peak 1011 at 9.5 minutes corresponds to minicircle (4) MC-GFP.
O painel B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose (1%) das frações de cada um dos picos. A pista 10111 corresponde à mistura de produtos recombinantes digerida com PvuII carregada na coluna, as pistas 101 correspondem às frações relativas ao pico 101, e as pistas 1011 correspondem às frações relativas ao pico 1011.Panel B shows agarose gel electrophoresis analysis (1%) of the fractions of each peak. Lane 10111 corresponds to the column-loaded PvuII digested recombinant product mixture, lanes 101 correspond to fractions relative to peak 101, and lanes 1011 correspond to fractions relative to peak 1011.
As figuras 11A e 11B ilustram a separação cromatográfica num disco monólito CIM-DEAE (V=0,34 mL; BIA Separations) de 48 pg de pMINI8GFP previamente digeridos.Figures 11A and 11B illustrate chromatographic separation on a CIM-DEAE monolithic disk (V = 0.34 mL; BIA Separations) of 48 pg of previously digested pMINI8GFP.
O painel A mostra o cromatograma obtido com uma sucessão de de gradientes em degrau de NaCl: 21 % de B (5 volumes de coluna), 25,9 % de B (15 volumes de coluna), 40 % de B (5 volumes de coluna) e 100% de B (5 volumes de coluna) . Tampão A: 20 mM Tris-HCl, pH 9, tampão B: NaCl 1 M (em 20 mM Tris-HCl, pH 9) . O pico 111 corresponde aos fragmentos lineares de DNA (6) e o pico 1111, corresponde ao minicírculo (4) MC-GFP.Panel A shows the chromatogram obtained with a succession of step gradient NaCl: 21% B (5 column volumes), 25.9% B (15 column volumes), 40% B (5 column volumes). column) and 100% B (5 column volumes). Buffer A: 20 mM Tris-HCl, pH 9, Buffer B: 1 M NaCl (in 20 mM Tris-HCl, pH 9). Peak 111 corresponds to linear DNA fragments (6) and peak 1111 corresponds to minicircle (4) MC-GFP.
O painel B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose (1%) das frações de cada um dos picos. A pista lliii corresponde à mistura de produtos recombinantes digeridos com PvuII carregada na coluna, as pistas 111 correspondem às frações relativas ao pico 111, e as pistasPanel B shows agarose gel electrophoresis analysis (1%) of the fractions of each peak. Lane 11 corresponds to the column-loaded mixture of PvuII digested recombinant products, lanes 111 correspond to fractions for peak 111, and lanes
1111 correspondem às frações relativas ao pico 1111.1111 correspond to the fractions relative to peak 1111.
ExemplosExamples
Os exemplos seguintes são apresentados para proporcionar aos peritos na arte uma divulgação completa de como fazer e utilizar a presente invenção. Estes exemplos não se destinam a limitar o âmbito da invenção nem pretendem representar que as experiências abaixo são todas ou as únicas experiências efetuadas.The following examples are presented to provide those skilled in the art with a complete disclosure of how to make and use the present invention. These examples are not intended to limit the scope of the invention nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed.
EXEMPLO 1EXAMPLE 1
Plasmideos e estirpes bacterianas.Plasmids and bacterial strains.
Construção de pVAXmini, pMINIGFP, pMINI5GFP, pMINI8GFP plasmideo parental (3) pVAXmini (5944 pb) que contém a cassete pBAD/araC-ParA, dois locais de resolução de multimeros (MRS) do operão parABCDE e o gene da proteína verde fluorescente (GFP), foi construído usando os seguintes plasmideos base: i) pVAXIGFP (3697 pb) , que contém o gene da GFP, e foi derivado de pVAXILacZ (Invitrogen, Carlsbad, CA), como descrito anteriormente (Azzoni et al., 2007) e ii) pUC57cas, que contém uma cassete com o gene da resolvase ParA (1) sob regulação do promotor BAD, o gene repressor AraC em sentido contrário e um local de resolução de multimeros (MRS) a montante do pBAD (obtido a partir NZYTech Lda, Lisboa, Portugal). Em primeiro lugar, os locais de clivagem para as enzimas de restrição Nsil e Sall foram introduzidos no pVAXIGFP por mutagénese dirigida utilizando 0,3 μΜ do iniciador MutNSilSalIfwd (CTATGGCTTCTAATGCATGGTTTTGTCGACAGCAAGCGAACCGG), 0,3 μΜ do iniciador MutNsilSalIrev (CCGGTTCGCTTGCTGTCGACAAAACCATGCATTAGAAGCCATAG) e 10 ng de DNA molde pVAXIGFP. Um local MRS para a resolvase ParA (1) foi gerado por amplificação por reação de polimerização em cadeia (PCR) usando 0,6 μΜ de MRS2fwd (CATGCATTCGCGATTGGTCAAATTGGG) contendo o local de restrição NruI (sublinhado), 0,6 μΜ de MRS2rev (TGCAAGCAACGCGTTAGCACATATGTG) contendo o local de restrição MluI (sublinhado) e 10 ng DNA molde pUC57cas. O fragmento de PCR e o plasmídeo pVAXIGFP foram digeridos com MluI e NruI. Para a clonagem usou-se uma pré-mistura 2x de ligação Clonables™ (Novagen), obtendo-se o plasmídeo pVAXMRS. A cassete de pBAD/araC-MRS foi amplificada utilizando o iniciador casParAfwd (CCCTCATGCATTCCCCCTTGG) , que contém o local de restrição Nsil (sublinhado), o iniciador casParArev (AGCCGTCGACTGCCCGGCTTA) , que contém o local de restrição Sall (sublinhado) , e também o plasmídeo pUC57cas como DNA molde. O fragmento de PCR e o plasmídeo pVAXMRS forma digeridos e posteriormente submetidos a ligação (prémistura 2x de ligação Clonables™, Novagen) originando pVAXmini (5944 pb).Construction of pVAXmini, pMINIGFP, pMINI5GFP, pMINI8GFP parental plasmid (3) pVAXmini (5944 bp) containing the pBAD / araC-ParA cassette, two parABCDE operon multimer (MRS) resolution sites and the green fluorescent protein (GFP) gene ), was constructed using the following base plasmids: i) pVAXIGFP (3697 bp), which contains the GFP gene, and was derived from pVAXILacZ (Invitrogen, Carlsbad, CA) as described previously (Azzoni et al., 2007) and ii) pUC57cas, which contains a cassette with the ParA resolvase gene (1) under BAD promoter regulation, the antisense AraC repressor gene, and a multimer resolution site (MRS) upstream of pBAD (obtained from NZYTech Lda , Lisbon, Portugal). Firstly, cleavage sites for restriction enzymes Nsil and SalI were introduced into pVAXIGFP by directed mutagenesis using 0.3μΜ of the MutNSilSalIfwd primer (CTATGGCTTCTAATGCATGGTTTTTGTCGACAGCAGACCGGTGACTAGTCATATTCTATATATCACTATACTAGACTAGACTAGTACTAGTACTAGACTAGTACTAGTACTAGACTGATATGACTAGTACTAGACTGATACAGA pVAXIGFP mold. An MRS site for ParA resolvase (1) was generated by polymerase chain reaction (PCR) amplification using 0.6 μΜ MRS2fwd (CATGCATTCGCGATTGGTCAAATTGGG) containing the NruI (underlined) restriction site, 0.6 μΜ MRS2rev ( TGCAAGCAACGCGTTAGCACATATGTG) containing the MluI restriction site (underlined) and 10 ng pUC57cas template DNA. The PCR fragment and plasmid pVAXIGFP were digested with MluI and NruI. For cloning, a 2x Clonables ™ binding premix (Novagen) was used to obtain plasmid pVAXMRS. The pBAD / araC-MRS cassette was amplified using the casParAfwd primer (CCCTCATGCATTCCCCCTTGG), which contains the Nsil restriction site (underlined), the casParArev primer (AGCCGTCGACTGCCCGGCTTA), which contains the Sall (also underlined) restriction site. plasmid pUC57cas as template DNA. The PCR fragment and plasmid pVAXMRS were digested and subsequently ligated (Clonables ™ 2x binding premix, Novagen) to yield pVAXmini (5944 bp).
O plasmídeo parental (3) pMINIGFP (4702 pb) foi originado a partir do pVAXmini (5944 pb), removendo a região pBAD/araCParA por hidrólise com Sfil e EcoRV, e tratamento da mistura com a endonuclease de mung bean (New England Biolabs), para remover as cadeias simples das extremidades e permitir a re-ligação usando a T4 DNA ligase (Promega).Parental plasmid (3) pMINIGFP (4702 bp) originated from pVAXmini (5944 bp), removing the pBAD / araCParA region by hydrolysis with Sfil and EcoRV, and treating the mung bean endonuclease mixture (New England Biolabs) , to remove single stranded ends and allow re-ligation using T4 DNA ligase (Promega).
Os plasmídeos pMINI5GFP, pMINI6GFP, pMINI7GFP, pMINI8GFP (4702bp) foram construídos através da introdução no pMINIGFP de respetivamente três, quatro e cinco locais de restrição adicionais para endonuclease PvuII. O pMINIGFP já possui dois locais PvuII (Figura 2). Os iniciadores para a mutagénese dirigida foram obtidos a partir de STABvida (Lisboa, Portugal) e as suas sequências são mostradas na Tabela 1. A mutagénese dirigida foi realizada por PCR com 1 pL de DNA polimerase KOD Hot Start (Novagen) , 5 pL de tampão lOx KOD, 4,5 pL de MgSO4, 5 pL de dNTPs, 10 ng de DNA molde pMINI e 0,2 pM de cada iniciador direto e reverso, num volume total de 50 pL. As condições de PCR (Whatman Biometra Tgradient) foram as seguintes: 2 min de ativação da DNA polimerase a 95 °C, e 16 ciclos de 20s a 95 °C, lOs a 69 °C e 2,5 minutos (aproximadamente 30s/kb) a 70 °C. Dez unidades (1 mL) da enzima de restrição Dpnl (Promega) foram adicionados diretamente à mistura de PCR para digerir o DNA metilado, isto é, o plasmideo molde não mutado, durante 1 hora a 37 °C. Células de E. coli DH5alpha foram transformados pela adição de 20 pL da mistura de PCR tratada enzimaticamente e as colónias positivas foram confirmadas pelo padrão de restrição do novo DNA plasmidico.Plasmids pMINI5GFP, pMINI6GFP, pMINI7GFP, pMINI8GFP (4702bp) were constructed by introducing into pMINIGFP respectively three, four and five additional PvuII endonuclease restriction sites. PMINIGFP already has two PvuII locations (Figure 2). Primers for directed mutagenesis were obtained from STABvida (Lisbon, Portugal) and their sequences are shown in Table 1. Targeted mutagenesis was performed by PCR with 1 pL KOD Hot Start DNA polymerase (Novagen), 5 pL 10x KOD buffer, 4.5 pL MgSO4, 5 pL dNTPs, 10 ng pMINI template DNA and 0.2 pM of each forward and reverse primer in a total volume of 50 pL. The PCR conditions (Whatman Biometra Tgradient) were as follows: 2 min of 95Â ° C DNA polymerase activation, and 16 cycles of 20s at 95Â ° C, 10s at 69Â ° C and 2.5 minutes (approximately 30s / kb ) at 70 ° C. Ten units (1 mL) of the DpnI restriction enzyme (Promega) were added directly to the PCR mix to digest the methylated DNA, i.e. the unchanged template plasmid, for 1 hour at 37 ° C. E. coli DH5alpha cells were transformed by the addition of 20 µl of the enzymatically treated PCR mixture and positive colonies were confirmed by the restriction pattern of the new plasmid DNA.
Tabela 1: Sequências dos iniciadores utilizados para criar o pMINI8GFP pela introdução de locais de clivagem para a enzima de restrição PvuII no pMINIGFP por mutagénese dirigida.Table 1: Primer sequences used to create pMINI8GFP by introducing cleavage sites for restriction enzyme PvuII into pMINIGFP by directed mutagenesis.
Nome doName of
Sequência 5'-3' iniciador direto: CTATGGAAAAACGCCAGCTGCGCGGCCTTTTTACGGTT pMINI5 a _____________________________________________________ reverso: AACCGTAAAAAGGCCGCGCAGCTGGCGTTTTTCCATAG direto:CCCTATGCTACTCCGTCCAGCTGTCAATTGTCTGATTCG pMINI5_b ___________________________________________________ reverso:CGAATCAGACAATTGACAGCTGGACGGAGTAGCATAGGG direto:GACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCAGCTGCT AAAAC T T CAT T T T TAAT T TAAAA pMINI5_c ___________________________________________________ reverso:TTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAGCAGCTGCTATTATTSequence 5'-3 'direct primer: the reverse CTATGGAAAAACGCCAGCTGCGCGGCCTTTTTACGGTT pMINI5 _____________________________________________________: Direct AACCGTAAAAAGGCCGCGCAGCTGGCGTTTTTCCATAG: CCCTATGCTACTCCGTCCAGCTGTCAATTGTCTGATTCG pMINI5_b ___________________________________________________ reverse: Direct CGAATCAGACAATTGACAGCTGGACGGAGTAGCATAGGG: GACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCAGCTGCT AAAAC CAT T T T T T TAAT TAAAA pMINI5_c ___________________________________________________ reverse: TTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAGCAGCTGCTATTATT
GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTC direto: TGCCTGGCGTGGTGCAGCTGTCGGAGCTGG pMINI6 ___________________________________________________________ reverso: CCAGCTCCGACAGCTGCACCACGCCAGGCAGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTC direct: TGCCTGGCGTGGTGCAGCTGTCGGAGCTGG pMINI6 ___________________________________________________________ reverse: CCAGCTCCGACAGCTGCACCACGCCAGGCA
Construção dos plasmideos pMMBparA, pMMBpar2A plasmideo de baixo número de cópias pMMB206 foi comprado à ATCC (37808™) . A inserção da cassete ParA-araC com os locais de ligação ao ribossoma (RBS) originais ou sintéticas neste plasmideo originou os plasmideos pMMBparA e pMMBpar2A, respetivamente. A força do RBS sintético foi calculado e a sequência foi desenhada usando a calculadora online de RBSs (Sali set al. , 2009) .Construction of Plasmids pMMBparA, pMMBpar2A low copy number plasmid pMMB206 was purchased from ATCC (37808 ™). Inserting the ParA-araC cassette with the original or synthetic ribosome binding sites (RBS) into this plasmid gave plasmids pMMBparA and pMMBpar2A, respectively. The strength of the synthetic RBS was calculated and the sequence was drawn using the online RBS calculator (Sali set al., 2009).
RBS original ...C®1®®TTTCTCCATACCCGTTTTTTTGGATGGOriginal RBS ... C®1®®TTTCTCCATACCCGTTTTTTTGGATGG
6 AU (ParA) AGTGAAACGATGGCGACGC.··6 AU (Par) AGTGAAACGATGGCGACGC. ··
RBS sintética ...CÍÍÍÍÍBÍTTTCTCCATACTAAAACGAAGAGTAGG 20000 AU (Par2A) AGGAGACCAATGGCGACGC.··Synthetic RBS ... CIRCUITTTCTCCATACTAAAACGAAGAGTAGG 20000 AU (Par2A) AGGAGACCAATGGCGACGC. ··
A RBS sintética foi introduzida a montante do ParA, substituindo o RBS original do sistema induzivel pBAD/araC por SOEing PCR. Em primeiro lugar, dois fragmentos de tamanho semelhante apresentando sobreposição de 27 bp (nucleotideos sublinhados) do novo RBS foram sintetizados por PCR convencional utilizando os conjuntos de iniciadores Spar2Afwd (CGAAGCAGGGATTCTGCAAAC) e Spar2Arev (TGGTCTCCTCCTACTCTTCGTTTTAGTATGGAGAAACAGTAGAGAGTTGCGA) ou Spar2Bfwd (ACTAAAACGAAGAGTAGGAGGAGACCAATGGCGACGCGAGAGCAAC) e Spar2Brev (TGATAGCGGTCCGCCACA) e pVAXmini como DNA molde. No segundo passo, os dois fragmentos sintetizados foram emparelhados pelas regiões complementares e sujeitos a 5 ciclos sem iniciadores e, assim, criando um molde para a próxima reação de PCR com iniciadores das extremidades Spar2Afwd e Spar2Brev. A Figura 3 mostra um desenho esquemático da cassete pBAD/araC-RBS-ParA.Synthetic RBS was introduced upstream of ParA, replacing the original RBS of the pBAD / araC inducible system with SOEing PCR. Firstly, two similar sized fragments showing overlap of 27 bp (underlined nucleotides) of the new RBS were synthesized by conventional PCR using sets of Spar2Afwd primers (CGAAGCAGGGATTCTGCAAAC) and Spar2Arev (TGGTCTCCTCCTACTCTTCGTTTTAGTATGGAGAAACAGTAGAGAGTTGCGA) or Spar2Bfwd (ACTAAAACGAAGAGTAGGAGGAGACCAATGGCGACGCGAGAGCAAC) and Spar2Brev (TGATAGCGGTCCGCCACA) and pVAXmini as template DNA. In the second step, the two synthesized fragments were paired by complementary regions and subjected to 5 cycles without primers and thus creating a template for the next PCR reaction with Spar2Afwd and Spar2Brev end primers. Figure 3 shows a schematic drawing of the pBAD / araC-RBS-ParA cassette.
Construção da estirpe BWAABWAA strain construction
A estirpe E. coli BVI21183 [F-, Δ (araD-araB) 567,E. coli strain BVI21183 [F-, Δ (araD-araB) 567,
AlacZ4787 (: :rrnB-3) , λ~, Δ (araH-araF) 570 (: : FRT) , AaraEp532::FRT, (pPCp8araE535, rph-1, A (rhaD-rhaB) 568, hsdR514] capaz de absorção melhorada de arabinose foi comprada ao The Coli Genetic Stock Center at Yale (New Haven, CT) . A fim de obter uma estirpe adequada à produção de plasmideos, os genes responsáveis pela hidrólise não especifica de DNA (endA) e pela recombinação homóloga (recA) da estirpe BW27783 foram nocauteados por transdução PI (Baba et al. 2006), resultando na estirpe E. coli BWAA.AlacZ4787 (:: rrnB-3), λ ~, Δ (araH-araF) 570 (:: FRT), AaraEp532 :: FRT, (pP C p8araE535, rph-1, A (rhaD-rhaB) 568, hsdR514] for enhanced arabinose absorption was purchased from The Coli Genetic Stock Center at Yale (New Haven, CT) In order to obtain a strain suitable for plasmid production, the genes responsible for non-specific DNA hydrolysis (endA) and homologous recombination. (recA) strain BW27783 were knocked out by PI transduction (Baba et al. 2006), resulting in E. coli strain BWAA.
Construção da estirpe BW2PBW2P strain construction
A estirpe E. coli BW2P foi obtida a partir da estirpe BW27783, substituindo o gene endA pelo gene da resolvase ParA (1) fundida com o local de ligação ao ribossoma (RBS) sintético e por nocaute do gene recA. A inserção da cassete de pBAD/araC-RBS-ParA foi efetuada por uma recombinação λRed adaptada conforme descrito por Datsenko e Wanner (2000) e o nocaute do recA foi realizada através de transdução PI utilizando as técnicas conhecidas do perito na técnica (produzindo a nova estirpe E. coli BW2P.E. coli strain BW2P was obtained from strain BW27783 by replacing the endA gene with the ParA resolvase gene (1) fused to the synthetic ribosome binding site (RBS) and by knockout of the recA gene. The insertion of the pBAD / araC-RBS-ParA cassette was performed by an adapted λRed recombination as described by Datsenko and Wanner (2000) and recA knockout was performed by PI transduction using techniques known to the skilled artisan (producing the new strain E. coli BW2P.
Resumidamente, amplificou-se a cassete pBAD/araC-RBS-ParA localizada no plasmideo molde pTKIPpar2A entre Sall e Smal (Kuhlman & Cox, 2010) usando a Platinum PCR Supermix (Invitrogen) e 300 nM de cada um dos iniciadores (par2Afwd: TCGAGGTCGACTGCCCGGC e AraCSalIrev: TCCGTCAAGCCGTCGACTGTCTG).Briefly, the pBAD / araC-RBS-ParA cassette located in the pTKIPpar2A template plasmid was amplified between Sall and Smal (Kuhlman & Cox, 2010) using Platinum PCR Supermix (Invitrogen) and 300 nM from each primer (par2Afwd: TCGAGGTCGACTGCCCGGCT). and AraCSalIrev: TCCGTCAAGCCGTCGACTGTCTG).
A cassete ParA-araC-RBS-ParA foi purificada a partir dum gel de agarose e foi em seguida clonada no local Sall do plasmídeo pKD13 utilizando as técnicas conhecidas do perito na técnica. 0 plasmídeo resultante foi então usado para a amplificação da cassete de recombinação completa de Kan (canamicina) usando 300 nM de cada um dos iniciadores EndA_cass_for2: ATCTGGCTGATTGCATACCAAAACAGCTTTCGCTACGTTGCTGGCTCGTTTTAACACGG AGTAAGTGATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC e EndAPar2Acasrev: GTTGTACGCGTGGGGTAGGGGTTAACAAAAAGAATCCCGCTAGTGTAGGTTAGCTCTTT CGCGCCTGGCATTAATTCCGGGGATCCGTCG. A homologia do gene endA alvo no genoma está sublinhada. A cassete de Kan foi usada para transformar células eletrocompetentes de E. coli BW27783/pKD46recA de modo a permitir a recombinação homóloga. O gene de resistência à canamicina foi removido por FLP recombinase codificada pelo plasmídeo pCP20 (Datsenko e Wanner, 2000) .The ParA-araC-RBS-ParA cassette was purified from an agarose gel and was then cloned into the SalI site of plasmid pKD13 using techniques known to the skilled artisan. 0 resulting plasmid was then used to amplify the complete recombination Kan cassette (kanamycin) using 300 nM each of primers EndA_cass_for2: ATCTGGCTGATTGCATACCAAAACAGCTTTCGCTACGTTGCTGGCTCGTTTTAACACGG AGTAAGTGATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC and EndAPar2Acasrev: GTTGTACGCGTGGGGTAGGGGTTAACAAAAAGAATCCCGCTAGTGTAGGTTAGCTCTTT CGCGCCTGGCATTAATTCCGGGGATCCGTCG. The homology of the target endA gene in the genome is underlined. The Kan cassette was used to transform E. coli BW27783 / pKD46recA electrocompetent cells to allow homologous recombination. The kanamycin resistance gene was removed by FLP recombinase encoded by plasmid pCP20 (Datsenko and Wanner, 2000).
O nocaute do recA na estirpe de E. coli recém-formada foi realizado por transdução PI. Resumidamente, a transdução PI permite a transferência de material genético de uma estirpe dadora para uma estirpe recetora. A estirpe dadora, da coleção de Keio, contém uma cassete de resistência à canamicina (KanR) num único gene, nocauteando esse gene. As células do dador são infetadas pelo fago PI e o seu DNA é utilizado para transfetar as células recetoras. O gene de resistência à canamicina é removido utilizando a enzima recombinase de FLP (a partir do plasmídeo ajudante pCP20) pois atua nos locais FRT que ladeiam o gene KanR (Baba et al., 2006).RecA knockout in the newly formed E. coli strain was performed by PI transduction. Briefly, PI transduction allows the transfer of genetic material from a donor strain to a receptor strain. The donor strain from the Keio collection contains a kanamycin resistance cassette (KanR) in a single gene knocking out that gene. Donor cells are infected by PI phage and their DNA is used to transfect the recipient cells. The kanamycin resistance gene is removed using the FLP recombinase enzyme (from the helper plasmid pCP20) as it acts on the FRT sites flanking the KanR gene (Baba et al., 2006).
EXEMPLO 2EXAMPLE 2
Crescimento de E. coli BWAA pMINI5GFP com o plasmídeo ajudante pMMBpar2A em cultura em balão agitado.Growth of E. coli BWAA pMINI5GFP with helper plasmid pMMBpar2A in shake flask culture.
mL de meio LB (Luria Bertani) suplementado com os antibióticos apropriados (canamicina 30 pg/mL, cloranfenicol 34 pg/mL) e 0,5% (p/v) de glucose, foram inoculados com uma ansada de células congeladas de E. coli BWAA contendo o plasmideo parental (3) em conjunto com o plasmideo ajudante e incubadas durante a noite a 30 °C, 250 rpm. Em seguida, um volume adequado desse inoculo foi usado para inocular 250 mL de meio LB contendo antibióticos com uma densidade ótica (DO) de 0,1. Este meio foi incubado cerca de 4 horas a 37 °C, 250 rpm, até se atingir a fase estacionária, que, no caso da presente invenção, ocorre tipicamente para valores de densidade celular entre 3,5 e 4,5. Nessa altura, a transcrição da resolvase ParA (1) foi induzida por adição de 0,01 % de L-( + )arabinose (2) (Merck) diretamente ao meio tendo as células sido ainda incubadas durante mais uma ou duas horas, para permitir a recombinação do plasmideo parental (3) . Um desenho esquemático mostrando a recombinação do plasmideo parental (3) é apresentado na Figura 4. Este tipo de processo de produção rendeu 8,2 ± 1,0 mg/L de produtos recombinantes em que a eficiência de recombinação mais elevada foi de 95 % obtida após 2 horas de indução.mL of LB medium (Luria Bertani) supplemented with the appropriate antibiotics (30 pg / mL kanamycin, 34 pg / mL chloramphenicol) and 0.5% (w / v) glucose were inoculated with a frozen E-cell loop. coli containing the parent plasmid (3) together with the helper plasmid and incubated overnight at 30 ° C, 250 rpm. An appropriate volume of this inoculum was then used to inoculate 250 mL of LB medium containing antibiotics with an optical density (OD) of 0.1. This medium was incubated for about 4 hours at 37 ° C, 250 rpm, until reaching the stationary phase, which in the case of the present invention typically occurs at cell density values between 3.5 and 4.5. At that time, transcription of ParA resolvase (1) was induced by the addition of 0.01% L- (+) arabinose (2) (Merck) directly to the medium and the cells were further incubated for an additional one or two hours. allow recombination of the parental plasmid (3). A schematic drawing showing parental plasmid recombination (3) is shown in Figure 4. This type of production process yielded 8.2 ± 1.0 mg / L of recombinant products in which the highest recombination efficiency was 95%. obtained after 2 hours of induction.
EXEMPLO 3EXAMPLE 3
Crescimento de E. coli BW2P/pMINI8GFP em biorreator.E. coli BW2P / pMINI8GFP growth in bioreactor.
Um pré-inóculo foi preparado através da transferência de células a partir de células congeladas (1% v/v) a 5 mL de meio complexo [Bacto-peptona 10 g/L, extrato de levedura 10 g/L, (NH4)2SO4 3 g/L, K2HPO4 3,5 g/L, KH2PO4 3,5 g/L, tiamina 199 mg/L, MgSO4 1,99 g/L, solução de oligoelementos 1 ml/L] suplementado com 30 pg/mL de canamicina e 5 g/L de glucose.A pre-inoculum was prepared by transferring cells from frozen cells (1% v / v) to 5 ml complex medium [Bacto-peptone 10 g / l, yeast extract 10 g / l, (NH 4 ) 2 SO 4 3 g / l, K 2 HPO 4 3.5 g / l, KH 2 PO 4 3.5 g / l, thiamine 199 mg / l, MgSO 4 1.99 g / l, trace element solution 1 ml / L] supplemented with 30 pg / ml kanamycin and 5 g / L glucose.
As células foram cultivadas durante a noite a 30 °C e 250 rpm. No dia seguinte, um inoculo foi preparado por inoculação de 100 mL de meio complexo complementado com 2 g/L de glicerol, com 1% do inoculo de pré-cultura. Essas células foram cultivadas até a fase exponencial inicial, até valores de DO ao comprimento de onda de 600 nm de cerca de 1,1, a 37 °C e 250 rpm. As fermentações foram realizadas num biorreator Fermac 360 (Electrolab) com um volume de trabalho de 1,1 L. Em primeiro lugar, 1 L de meio complexo foi autoclavado no biorreator e os suplementos ao meio, solução de elementos traço, canamicina (30 mg/L) e glicerol (20 g/L ou 40 g/L) foram adicionados. O reator foi então inoculado com o volume de inoculo necessário para obter uma DO ao comprimento de onda de 600 nm inicial de 0,1. O ponto de ajuste para o oxigénio dissolvido foi ajustado para 30% utilizando uma cascata de agitação (200 rpm para 800 rpm) e o ar foi fornecido a um caudal de 1 vvm. O pH foi mantido a 7,10 utilizando NaOH 2 M e H2SO4 2 Μ. O antiespuma foi adicionado manualmente conforme necessário. Foram retiradas amostras periodicamente a partir do biorreator para quantificar a biomassa, glicerol, acetato e DNA plasmidico. O rendimento de produção volumétrica de DNA plasmidico analisado por HPLC foi de 53,7+6,2 mg/L, após 24 horas de crescimento. A eficiência de recombinação e a fração molar de minicirculos (4) na população plasmideo variou dependendo do esquema de indução. A indução de recombinação intramolecular por 0,01 % de L-( + ) arabinose (2) em fase exponencial (4 horas, DO cerca de 10) resultou em 100% de recombinação, após 2 horas de crescimento adicional contendo 10% da quantidade de minicirculos. A indução em fase estacionária precoce (12 horas, com um valor de DO de cerca de 40) por 12 horas resultou em 75% de recombinação com os minicirculos (4) representando 50% minicírculo (4) de plasmídeo total.Cells were grown overnight at 30 ° C and 250 rpm. The next day, an inoculum was prepared by inoculating 100 mL of complex medium supplemented with 2 g / L glycerol with 1% of the preculture inoculum. These cells were cultured to the initial exponential phase, to OD values at a wavelength of 600 nm of about 1.1 at 37 ° C and 250 rpm. Fermentations were performed in a Fermac 360 (Electrolab) bioreactor with a working volume of 1.1 L. Firstly, 1 L of complex medium was autoclaved in the bioreactor and the medium supplements, trace element solution, kanamycin (30 mg / L) and glycerol (20 g / L or 40 g / L) were added. The reactor was then inoculated with the required inoculum volume to obtain an OD at the initial 600 nm wavelength of 0.1. The setpoint for dissolved oxygen was adjusted to 30% using a stirring cascade (200 rpm to 800 rpm) and air was supplied at a flow rate of 1 vvm. The pH was maintained at 7.10 using 2 M NaOH and 2 H2 H 2 SO 4. The antifoam was added manually as needed. Samples were taken periodically from the bioreactor to quantify biomass, glycerol, acetate and plasmid DNA. The yield of plasmid DNA volumetric production analyzed by HPLC was 53.7 + 6.2 mg / L after 24 hours of growth. The recombination efficiency and mini-circle molar fraction (4) in the plasmid population varied depending on the induction scheme. Induction of intramolecular recombination by 0.01% L- (+) arabinose (2) exponentially (4 hours, OD about 10) resulted in 100% recombination after 2 hours of additional growth containing 10% of the amount. of mini circles. Early stationary induction (12 hours, with an OD value of about 40) for 12 hours resulted in 75% recombination with minicircles (4) representing 50% minicircle (4) of total plasmid.
EXEMPLO 4EXAMPLE 4
Preparação de pDNA purificado.Preparation of purified pDNA.
O DNA plasmidico total foi purificado a partir de células recolhidas no final da fermentação, usando um processo que combina rutura celular por lise alcalina, precipitação com isopropanol e sulfato de amónio, cromatográfia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatográfia de exclusão molecular (SEC), adaptado de Diogo (2000, 2005). Resumidamente, as células correspondentes a 500 mL de cultura de biorreator foram ressuspensas em 110 mL de glucose 50 mM, EDTA 10 mM e Tris 25 mM pH 8. A lise foi realizada por adição de 110 mL de NaOH a 200 mM, a solução de dodecilsulf ato de sódio (SDS) 1% (w/v) em gelo, e parado pela adição de 110 mL prérefrigerados de uma solução 5 M de acetato/3 M de potássio pH 5,0. Os detritos celulares e os precipitados de DNA genómico/proteinas foram removidos por centrifugação (40 min, 9.000 rpm, 4 °C) e os ácidos nucleicos no sobrenadante (cerca de 300 mL) foram precipitadas por adição de 0,7 volumes de isopropanol à temperatura ambiente, 1 hora a 4 °C. O precipitado foi recuperado por centrifugação (40 minutos, 13.300 rpm, 4 °C) e lavagem com etanol (70% v/v) .Total plasmid DNA was purified from cells harvested at the end of fermentation using a process that combines cell disruption by alkaline lysis, isopropanol and ammonium sulfate precipitation, hydrophobic interaction chromatography (HIC) and molecular exclusion chromatography (SEC) , adapted from Diogo (2000, 2005). Briefly, cells corresponding to 500 ml bioreactor culture were resuspended in 110 ml 50 mM glucose, 10 mM EDTA and 25 mM Tris pH 8. Lysis was performed by adding 110 ml 200 mM NaOH, the 1% (w / v) sodium dodecyl sulfate (SDS) in ice, and quenched by the addition of pre-cooled 110 mL of a 5 M acetate / 3 M potassium acetate pH 5.0 solution. Cell debris and genomic DNA / protein precipitates were removed by centrifugation (40 min, 9,000 rpm, 4 ° C) and nucleic acids in the supernatant (about 300 mL) were precipitated by adding 0.7 volumes of isopropanol to room temperature, 1 hour at 4 ° C. The precipitate was recovered by centrifugation (40 minutes, 13,300 rpm, 4 ° C) and ethanol wash (70% v / v).
O sedimento contendo o plasmideo foi então ressuspenso em 10 mM Tris (pH 8) (1 mL por cada 25 mL de lisado original). Em seguida, dissolveu-se sulfato de amónio sólido na solução de plasmídeo de modo a obter uma concentração de 2,5 M para condicionar a amostra antes da cromatográfia de interação hidrofóbica. Após a incubação em gelo (15 minutos), algumas impurezas precipitaram e foram removidas por centrifugação (15 minutos, 13200 g, 4 °C) e descartadas. 0 sobrenadante contendo o plasmideo (cerca de 8 mL) foi carregado numa coluna de vidro preenchida com 25 mL de Phenyl Sepharose (GE Healthcare) e pré-equilibrada com sulfato de amónio 1,5 M em 10 mM Tris, pH 8 (2 mL/min) utilizando um sistema Akta Purifier 10. Realizou-se uma eluição isocrática com sulfato de amónio 1,5 M em 10 mM Tris-HCl, pH 8, a um caudal de 2 mL/min. Depois da eluição das moléculas não ligadas e fracamente retidas com 1,5 M de sal, a força iónica do tampão foi reduzido (Tris-HCl 10 mM, pH 8) para eluir espécies ligadas. Frações de 0,5 mL foram coletadas em tubos de 1,5 mL. As frações contendo o plasmideo foram então submetidas a cromatografia de exclusão de molecular na mesma coluna (6 mL da carga) usando uma corrida isocrática com 10 mM Tris, pH 8 (1 mL/min) como o tampão de equilíbrio e de corrida. Frações com 0,5 mL foram coletadas em tubos de 1,5 mL.The pellet containing the plasmid was then resuspended in 10 mM Tris (pH 8) (1 mL for each 25 mL of original lysate). Solid ammonium sulfate was then dissolved in the plasmid solution to a 2.5 M concentration to condition the sample prior to hydrophobic interaction chromatography. After incubation on ice (15 minutes), some impurities precipitated and were removed by centrifugation (15 minutes, 13200 g, 4 ° C) and discarded. The supernatant containing the plasmid (about 8 mL) was loaded onto a 25 mL glass column filled with Phenyl Sepharose (GE Healthcare) and pre-equilibrated with 1.5 M ammonium sulfate in 10 mM Tris, pH 8 (2 mL). / min) using an Akta Purifier 10 system. Isocratic elution with 1.5 M ammonium sulfate in 10 mM Tris-HCl, pH 8 was performed at a flow rate of 2 mL / min. After elution of unbound and weakly retained molecules with 1.5 M salt, the ionic strength of the buffer was reduced (10 mM Tris-HCl, pH 8) to elute bound species. 0.5 mL fractions were collected in 1.5 mL tubes. Fractions containing the plasmid were then subjected to molecular exclusion chromatography on the same column (6 mL of the charge) using an isocratic 10 mM Tris run, pH 8 (1 mL / min) as the equilibration and run buffer. 0.5 mL fractions were collected in 1.5 mL tubes.
EXEMPLO 5EXAMPLE 5
Hidrólise das impurezas dos produtos de recombinação (DNA plasmídico).Hydrolysis of recombination product impurities (plasmid DNA).
A hidrólise das impurezas (miniplasmideo (5) e plasmideo parental (3) não recombinado) do DNA de plasmideo é mostrada esquematicamente na Figura 5. Os plasmideos recombinados e purificados foram submetidos a hidrólise enzimática in vitro, durante 1-3 horas a 37 ° C por adição de 0,1-1 U da enzima de restrição PvuII (ThermoScientific) por pg de produtos recombinantes, num tampão apropriado. As amostras digeridas foram analisadas por eletroforese em gel (Figura 6A). A hidrólise foi realizada em volumes variáveis entre 0,1 e 7 mL. Hidrólise completa foi observada usando 1 U de enzima por micrograma de plasmideo em uma hora ou 0,5 U de enzima em 3 horas. O padrão digerido de pMINI8GFP consiste em fragmentos lineares de DNA (6) curtos variam em tamanho entre 337 e 414 pb e 2.162 pb do fragmento longo correspondente ao plasmideo parental (3) não recombinado. Os produtos de recombinação podem também ser digeridos diretamente no lisado clarificado obtido após a precipitação com isopropanol sob as mesmas condições utilizadas na hidrólise de amostras purificadas (Figura 6B). 0 padrão de hidrólise de pMINI5GFP consiste em fragmentos de 751, 731, 698, 360 pb a partir de espécies miniplasmideo (5) e um fragmento adicional de 2.162 pb correspondentes ao plasmideo parental (3) não recombinado. O plasmideo ajudante pMMBpar2A também exibe cinco locais de clivagem para a enzima PvuII, resultando em fragmentos lineares de DNA (6) de 6.414, 3.356, 836, 416, 281 e 93 bp, embora como os últimos quatro fragmentos mencionados exibam massa relativa baixa não são visíveis aparecem no gel de agarose.The hydrolysis of the impurities (miniplasmid (5) and non-recombined parent plasmid (3)) of the plasmid DNA is shown schematically in Figure 5. The purified and recombinant plasmids were subjected to enzymatic hydrolysis in vitro for 1-3 hours at 37 °. C is by adding 0.1-1 U of the restriction enzyme PvuII (ThermoScientific) per µg of recombinant products in an appropriate buffer. Digested samples were analyzed by gel electrophoresis (Figure 6A). Hydrolysis was performed in volumes ranging from 0.1 to 7 mL. Complete hydrolysis was observed using 1 U enzyme per microgram plasmid in one hour or 0.5 U enzyme in 3 hours. The digested pattern of pMINI8GFP consists of short linear DNA fragments (6) ranging in size from 337 to 414 bp and 2,162 bp of the long fragment corresponding to the non-recombined parent plasmid (3). Recombinant products can also be digested directly into the clarified lysate obtained after precipitation with isopropanol under the same conditions used in the hydrolysis of purified samples (Figure 6B). The hydrolysis pattern of pMINI5GFP consists of 751, 731, 698, 360 bp fragments from miniplasmid species (5) and an additional 2,162 bp fragment corresponding to the non-recombined parent plasmid (3). Helper plasmid pMMBpar2A also exhibits five cleavage sites for the PvuII enzyme, resulting in linear DNA fragments (6) of 6,414, 3,356, 836, 416, 281 and 93 bp, although as the last four fragments mentioned exhibit unrelated low relative mass. are visible appear on the agarose gel.
EXEMPLO 6EXAMPLE 6
Purificação dos minicirculos (4) MC-GFP, MC-VEGF e MCGFPVEGF num disco CIM-DEAE usando um gradiente de eluição a pH 8 .Purification of the MC-GFP, MC-VEGF and MCGFPVEGF minicircles (4) on a CIM-DEAE disc using a pH 8 elution gradient.
O disco monolítico Convective (diethylamino, permutador anió Ljubljana, Eslovénia), com um no sistema AKTA Purifier 10 seguintes minicirculos (4) : (1.730 pb) (ver Figura 7) e Figura 8).The Convective monolithic disk (diethylamino, anion exchanger Ljubljana, Slovenia), with one in the AKTA Purifier system 10 following minicircles (4): (1,730 bp) (see Figure 7) and Figure 8).
As sequências correspondentes possuem cinco ou sete locias dCorresponding sequences have five or seven loci d
Interaction Media (CIM)-DEAE uico fraco) (BIA Separations, volume de 0,34 mL foi usado (GE) para a separação dos MC-GFP (1.881 pb), MC-VEGFInteraction Media (CIM) -Weak Single DEAE (BIA Separations, 0.34 mL volume was used (GE) for separation of MC-GFP (1,881 bp), MC-VEGF
MC-GFPVEGF (2.457 pb) (ver nos plasmideos parentais (3) 3 restrição PvuII, originando fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 750 bp e cerca de 350 bp após hidrólise com PvuII. O tampão A consistia em 20 mM Tris-HCl (pH 8) e o tampão B de 1 M de NaCl (em 20 mM Tris-HCl, pH 8) . Mais de 50 pL das misturas de hidrólise com PvuII foram injetados manualmente ou com um injetor automático na coluna previamente equilibrada com a concentração inicial de NaCl, à temperatura ambiente. Os minicirculos (4) foram separados das impurezas linearizados usando um gradiente crescente de B (50% a 80% de B) com um declive de 0,5 % ou 1% B/min com um caudal de 1 mL/min. A absorvância do eluato foi medida continuamente ao c.d.o. de 260 nm à saida do disco. Frações de 0,3 mL foram recolhidas em placas de 96 poços. A mistura contendo as frações do pico do minicirculo (4) foi submetida a troca de tampões por diálise ou usando tubos Microcon 3K ou 50K (Millipore).MC-GFPVEGF (2,457 bp) (see Parental Plasmids (3) 3 PvuII restriction, yielding linear DNA fragments (6) of about 750 bp and about 350 bp after hydrolysis with PvuII. Buffer A consisted of 20 mM Tris -HCl (pH 8) and 1 M NaCl Buffer B (in 20 mM Tris-HCl, pH 8.) More than 50 µl of the PvuII hydrolysis mixtures were injected manually or with an automatic injector into the column previously equilibrated with the initial NaCl concentration at room temperature.The minicircles (4) were separated from the linearized impurities using a rising gradient of B (50% to 80% B) with a slope of 0.5% or 1% B / min with 1 mL / min flow rate The absorbance of the eluate was continuously measured at around 260 nm at the disc exit 0.3 ml fractions were collected in 96-well plates The mixture containing the minicircle peak fractions (4 ) was buffer exchanged by dialysis or using Microcon 3K or 50K tubes (Millipore).
EXEMPLO 7EXAMPLE 7
Purificação do minicirculo (4) MC-GFP num disco CIM-DEAE com eluição por gradiente a pH 9.Purification of the minicircle (4) MC-GFP on a gradient eluted CIM-DEAE disc at pH 9.
O disco monolítico Convective Interaction Media (CIM)-DEAE (diethylamino, permutador aniónico fraco) (BIA Separations, Ljubljana, Eslovénia) , com um volume de 0,34 mL foi usado no sistema AKTA Purifier 10 (GE) para a separação do minicirculo (4) MC-GFP. O MC-GFP é obtido a partir de um plasmídeo parental (3) contendo oito locais de restrição PvuII que origina a partir do miniplasmídeo (5) fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 350 pb após a hidrólise com PvuII. O tampão A de eluição consistia em 20 mM Tris-HCl (pH 9) e o tampão B de 1 M de NaCl (em 20 mM Tris-HCl, pH 9) . 1 ou 2 mL de produtos de recombinação digeridos foram injetados manualmente em um disco pré-equilibrada à temperatura ambiente com 5 volumes de coluna de tampão comThe Convective Interaction Media (CIM) -DEAE monolithic disk (diethylamino, weak anion exchanger) (BIA Separations, Ljubljana, Slovenia) with a volume of 0.34 mL was used in the AKTA Purifier 10 (GE) system for minicircle separation (4) MC-GFP. MC-GFP is obtained from a parental plasmid (3) containing eight PvuII restriction sites that originates from the miniplasmid (5) linear DNA fragments (6) of about 350 bp following hydrolysis with PvuII. Elution buffer A consisted of 20 mM Tris-HCl (pH 9) and 1 M NaCl buffer B (in 20 mM Tris-HCl, pH 9). 1 or 2 mL of digested recombination products were manually injected into a pre-equilibrated disc at room temperature with 5 column volumes of buffer containing
NaCl na concentração inicial desejada. 0 minicirculo (4) foi separado das impurezas linearizadas usando um gradiente crescente de B (20% a 40 % de B) com um gradiente de 1 % de B/min e um caudal de 1 mL/min.NaCl at desired initial concentration. The minicircle (4) was separated from the linearized impurities using an increasing gradient of B (20% to 40% B) with a gradient of 1% B / min and a flow rate of 1 mL / min.
A absorvância do eluato foi medida continuamente ao c.d.o. de 260 nm à saida do disco. Frações de 0,2 mL foram recolhidas em placas de 96 poços. A mistura contendo as frações do pico do minicirculo (4) foi submetida a troca de tampões por diálise contra 10 mM Tris-HCl, pH 8. O cromatograma e as frações representativas são mostrados na Figura 10.The eluate absorbance was continuously measured at c.d.o. 260 nm at the disk output. 0.2 ml fractions were collected in 96-well plates. The mixture containing the minicircle peak fractions (4) was dialysed buffered against 10 mM Tris-HCl, pH 8. The chromatogram and representative fractions are shown in Figure 10.
EXEMPLO 8EXAMPLE 8
Purificação do minicirculo (4) MC-GFP num disco CIM-DEAE com eluição em degrau a pH 9.Purification of the MC-GFP mini-circle (4) on a step-eluting CIM-DEAE disc at pH 9.
O disco monolítico Convective Interaction Media (CIM)-DEAE (diethylamino, permutador aniónico fraco) (BIA Separations, Ljubljana, Eslovénia) , com um volume de 0,34 mL foi usado no sistema AKTA Purifier 10 (GE) para a separação do minicirculo (4) MC-GFP. O MC-GFP é obtido a partir de um plasmideo parental (3) contendo oito locais de restrição PvuII que origina a partir do miniplasmideo (5) fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 350 pb após a hidrólise com PvuII. O tampão A de eluição consistia em 20 mM Tris-HCl (pH 9) e o tampão B de 1 M de NaCl (em 20 mM Tris-HCl, pH 9) . 2 mL de produtos de recombinação digeridos foram injetados manualmente num disco de pré-equilibrado à temperatura ambiente com 5 volumes de coluna de tampão de NaCl a uma concentração inicial de 210 mM. O minicirculo (4) foi separado das impurezas linearizadas usando uma série de gradientes em degrau com um caudal de 1 mL/min.The Convective Interaction Media (CIM) -DEAE monolithic disk (diethylamino, weak anion exchanger) (BIA Separations, Ljubljana, Slovenia) with a volume of 0.34 mL was used in the AKTA Purifier 10 (GE) system for minicircle separation (4) MC-GFP. MC-GFP is obtained from a parental plasmid (3) containing eight PvuII restriction sites that originates from the miniplasmid (5) linear DNA fragments (6) of about 350 bp following hydrolysis with PvuII. Elution buffer A consisted of 20 mM Tris-HCl (pH 9) and 1 M NaCl buffer B (in 20 mM Tris-HCl, pH 9). 2 mL of digested recombination products were manually injected into a pre-equilibrated disc at room temperature with 5 column volumes of NaCl buffer at an initial concentration of 210 mM. The minicircle (4) was separated from the linearized impurities using a step gradient series with a flow rate of 1 mL / min.
A concentração de sal necessária para eluição das impurezas pode variar entre 230-330 mM de NaCl, dependendo do lote de amostra ou da preparação dos tampões de eluição. Um degrau longo de eluição, usando 15 volumes de coluna, foi utilizado para garantir a eluição completa das impurezas. O minicirculo (4) eluiu como um pico estreito, durante o degrau de eluição em 40% B. No final de cada corrida, a coluna foi regenerada com 5 volumes de coluna de 1 M de NaCl. Para a identificação exata do degrau mais critico: a eluição das impurezas, um gradiente de eluição principal de 50 microlitros de amostra com inclinação gradiente de 1 % de B/min, permitiu a identificação especifica de condutividade no final do pico de impureza e, portanto, identificar a correspondente % de B necessárias para definir o esquema de eluição em degrau do gradiente.The salt concentration required for elution of the impurities may range from 230-330 mM NaCl, depending on the sample lot or preparation of the elution buffers. A long elution step using 15 column volumes was used to ensure complete elution of the impurities. The minicircle (4) eluted as a narrow peak during the 40% B elution step. At the end of each run, the column was regenerated with 5 column volumes of 1 M NaCl. For the exact identification of the most critical step: the elution of impurities, a main elution gradient of 50 microliters of sample with a gradient gradient of 1% B / min, allowed the specific identification of conductivity at the end of the impurity peak and therefore , identify the corresponding% B required to define the step gradient elution scheme.
A absorvância do eluato foi medida continuamente ao c.d.o.The eluate absorbance was continuously measured at c.d.o.
de 260 nm à saida do disco. Frações de 0,2 mL foram recolhidas em placas de 96 poços. A mistura contendo as frações do pico do minicirculo (4) foi submetida a troca de tampões por diálise contra 10 mM Tris-HCl, pH 8. O cromatograma e as frações representativas são mostrados na Figura 11.260 nm at the disk output. 0.2 ml fractions were collected in 96-well plates. The mixture containing the minicircle peak fractions (4) was dialysed buffered against 10 mM Tris-HCl, pH 8. The chromatogram and representative fractions are shown in Figure 11.
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DarquetDarquet
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P . , SchwartzP . , Schwartz
NaimiNaimi
DelaereDelaere
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CrouzetCrouzet
SchermanScherman
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Minicircle:Minicircle:
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Urthaler, J., Schlegl, R., Podgornik, A., Strancar, A., Jungbauer, A., & Necina, R. (2005) . Application of monoliths for plasmid DNA purification. Journal ofUrthaler, J., Schlegl, R., Podgornik, A., Strancar, A., Jungbauer, A., & Necina, R. (2005). Application of monoliths for plasmid DNA purification. Journal of
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