PT107426A - SILK FIBROIN DERIVATIVE HYDROGENS: METHODS AND THEIR APPLICATIONS - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENÇÃO REFERE-SE A UM HIDROGEL DE FIBROÍNA DE SEDA RETICULADO POR INTERMÉDIO DE UMA PEROXIDASE E COMPOSIÇÕES ADEQUADAS PARA APLICAÇÕES DE ENGENHARIA DE TECIDOS E MEDICINA REGENERATIVA OU COMO SISTEMAS DE LIBERTAÇÃO DE AGENTES TERAPEUTICOS. AS SOLUÇÕES AQUOSAS DE FIBROÍNA DE SEDA SÃO CAPAZES DE FORMAR HIDROGÉIS, NA PRESENÇA DE PEROXIDASE E PERÓXIDO A TEMPERATURAS MODERADAS/INTERVALO DE PH. O PROCESSO DE GELIFICAÇÃO PERMITE A COMBINAÇÃO DE CÉLULAS HUMANAS E ANIMAIS E/OU AGENTES TERAPEUTICOS, REAGENTES, AGENTES DE DETECÇÃO BIOACTIVOS E SUAS COMBINAÇÕES. OS DESEMPENHOS FÍSICO-QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DA MATRIZ PODEM SER AJUSTADOS PARA APLICAÇÕES ESPECÍFICAS, UTILIZANDO DIFERENTES FORMULAÇÕES E AS CONDIÇÕES DE REACÇÃO. EM TERMOS ESTRUTURAIS A MATRIZ PODE APRESENTAR DIFERENTES CONFORMAÇÕES ESPACIAIS ATRAVÉS DA IMERSÃO EM SOLVENTES ORGÂNICOS OU OUTROS TRATAMENTOS. A MATRIZ PODE SER UTILIZADA QUER COMO UM SISTEMA ACELULAR OU CELULAR E PRODUZIDA MANUALMENTE OU AUTOMATICAMENTE ATRAVÉS DE INJECÇÃO, PODENDO AINDA O PROCESSO DE RETICULAÇÃO OCORRER DIRECTAMENTE NO LOCAL DE APLICAÇÃO. PODE TAMBÉM SER PROCESSADA EM DIFERENTES FORMAS/ESTADO, TAIS COMO BIOADESIVOS, HIDROGEIS, FIBRAS, DISCOS, MEMBRANAS E MICRO/NANO PARTÍCULAS.This invention relates to a Silicate Fibroin Hydrogel intersected by a peroxide derivative and suitable compositions for application of tissue engineering and regenerative medicine or as systems for the release of therapeutic agents. THE SILK FIBROIN AQUEOUS SOLUTIONS ARE ABLE TO FORM HYDROGES IN THE PRESENCE OF PEROXIDASE AND PEROXIDE AT MODERATE TEMPERATURES / INTERVAL OF PH. The gelation process allows the combination of human and animal cells and / or therapeutic agents, reagents, bioactive agents and combinations thereof. THE PHYSICAL-CHEMICAL AND BIOLOGICAL PERFORMANCE OF THE MATRIX MAY BE ADJUSTED FOR SPECIFIC APPLICATIONS, USING DIFFERENT FORMULATIONS AND REACTION CONDITIONS. IN STRUCTURAL TERMS THE MATRIX CAN PRESENT DIFFERENT SPACIAL CONFORMATIONS THROUGH IMMERSION IN ORGANIC SOLVENTS OR OTHER TREATMENTS. THE MATRIX MAY BE USED AS WELL AS A CELLULAR OR CELLULAR SYSTEM AND MANUALLY OR AUTOMATICALLY PRODUCED THROUGH INJECTION, STILL THE RETICULATION PROCEDURE MAY OCCUR DIRECTLY AT THE APPLICATION SITE. MAY ALSO BE PROCESSED IN DIFFERENT FORMS / STATE, SUCH AS BIOADHESES, HYDROGEES, FIBERS, DISCS, MEMBRANES AND MICRO / NANO PARTICLES.
Description
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DESCRIÇÃO "HIDROGÉIS DERIVADOS DA FIBROÍNA DA SEDA: MÉTODOS E RESPECTIVAS APLICAÇÕES"DESCRIPTION OF DERIVED HYDROGES OF SILK FIBROIN: METHODS AND THEIR APPLICATIONS "
Objeto da invenção A presente invenção relaciona-se com o desenvolvimento de hidrogéis à base de fibroina de seda, reticulados por peroxidase. Os métodos de preparação de soluções aquosas concentradas de seda e hidrogéis de fibroina de seda, em diferentes condições, são apresentados. Os hidrogéis fibroina de seda podem ser formados num passo único sendo que a gelificação ocorre sob condições próxims das fisiológicas. A reticulação pode ser realizada manual ou automaticamente in-situ. Os hidrogéis de fibroina de seda reticulados enzimaticamente apresentam um desempenho controlado e permitem o encapsulamento de células e/ou agentes terapêuticos, material genético, agentes bioactivos, agentes de detecçõ e direccionamento, moléculas condutoras ou materiais inorgânicos, proporcionando sistemas versáteis que podem ser usados como matriz biodegradável em sistemas acelulares e celulares para aplicações de engenharia de tecidos e medicina regenerativa ou como sistemas de libertação de fármacos, bioadesivos, de enchimento, revestimentos para melhorar o funcionamento de um dispositivo médico, ou outras aplicações farmacêuticas ou médicas.OBJECT OF THE INVENTION The present invention relates to the development of silicone fibroin based hydrogels, cross-linked by peroxidase. Methods of preparing concentrated aqueous solutions of silk and silk fibroin hydrogels under different conditions are given. The silk fibroin hydrogels can be formed in a single step and the gelation takes place under conditions close to the physiological ones. The crosslinking can be performed manually or automatically in-situ. The enzymatically crosslinked silk fibroin hydrogels exhibit controlled performance and permit the encapsulation of therapeutic cells and / or agents, genetic material, bioactive agents, detection and targeting agents, conducting molecules or inorganic materials, providing versatile systems which can be used as biodegradable matrix in acellular and cellular systems for tissue engineering and regenerative medicine applications or as drug release, bioadhesive, fillers, coatings for improving the functioning of a medical device, or other pharmaceutical or medical applications.
Dominlo Técnico A presente invenção refere-se a hidrogéis à base de fibroina de seda reticulados por peroxidase, que são capazes de ser produzidos a temperaturas e pH próximos do fisiológico. Os hidrogéis de fibroina de seda 2 enzimaticamente reticulados possuem um desempenho controlado e permitem a encapsulação de células e/ou agentes terapêuticos e material genético, agentes bioactivos, agentes de detecção e direccionamento, moléculas condutoras ou materiais inorgânicos, proporcionando sistemas versáteis que podem ser usados como uma matriz biodegradável em sistemas acelulares e celulares para aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa ou como sistemas de libertação, bioadesivos e material de preeenchimento, revestimentos para melhorar a função de dispositivos médicos, em electrónica e optoelectrónica, ou outras aplicações farmacêuticas ou médicas. Os métodos de preparação de hidrogéis de fibroina de seda reticulados por peroxidase são aqui apresentados. 0 sistema é biocompatível e capaz de ser aplicado manual ou automaticamente e para polimerizar in-situ.TECHNICAL FIELD The present invention relates to peroxidase-crosslinked silk fibroin based hydrogels, which are capable of being produced at temperatures and near physiological pH. The enzymatically crosslinked silk fibroin hydrogels 2 have a controlled performance and allow the encapsulation of cells and / or therapeutic agents and genetic material, bioactive agents, detection and targeting agents, conductive molecules or inorganic materials, providing versatile systems that can be used as a biodegradable matrix in acellular and cellular systems for tissue engineering and regenerative medicine applications or as release systems, bioadhesives and fillers, coatings for improving the function of medical devices, in electronics and optoelectronics, or other pharmaceutical or medical applications . Methods of preparing peroxidase crosslinked silk fibroin hydrogels are presented herein. The system is biocompatible and able to be applied manually or automatically and to polymerize in-situ.
Estado da ArteState of art
Os hidrogéis apresentam propriedades atractivas para a sua utilização em aplicações de engenharia de tecidos, medicina regenerativa, e sistemas de libertação controlada de fármacos uma vez que: (i) incham e reteêm grandes quantidades de água, (ii) mimetizam os tecidos naturais, (iii) podem apresentar propriedades mecânicas ajustáveis, (iv) possuem uma velocidade de biodegradação que pode ser ajustada, (v) podem ser aplicados através de procedimentos minimamente invasivos (por exemplo, injecção). Desta forma, os hidrogéis proporcionam um microambiente altamente hidratado, semelhante à matriz extracelular. Podem ser injectados e posteriormente reticulados in situ permitindo o encapsulamento de células e preservação/indução de um determinado fenótipo. Um hidrogel injectável deve também apresentar um mecanismo de transição sol-gel adequado para 3 fins clínicos, isto é, deve ser líquido para facilitar a injecção e a distribuição homogénea de células, e ao mesmo tempo ser capaz de rapidamente gelificar após implantação sob condições fisiológicas (por exemplo, pH e temperatura). Esta combinação única de características, para além da capacidade de ajustar a sua velocidade de degradação in vivo, torna-os também úteis em aplicações pressupondo a libertação controlada de fármacos ou como bioadesivos.Hydrogels have attractive properties for use in tissue engineering applications, regenerative medicine, and controlled drug delivery systems as they: (i) swell and retain large amounts of water, (ii) mimic natural tissues, ( iii) may have adjustable mechanical properties, (iv) have a biodegradable rate of adjustment, (v) can be applied by minimally invasive procedures (for example, injection). In this way, hydrogels provide a highly hydrated microenvironment similar to the extracellular matrix. They can be injected and then crosslinked in situ allowing the encapsulation of cells and preservation / induction of a given phenotype. An injectable hydrogel should also have a sol-gel transition mechanism suitable for clinical purposes, i.e. it should be liquid to facilitate homogenous injection and distribution of cells, and at the same time be able to readily gel upon implantation under physiological conditions (e.g., pH and temperature). This unique combination of characteristics, in addition to the ability to adjust their rate of degradation in vivo, also makes them useful in applications assuming controlled drug release or as bioadhesives.
Até agora, vários métodos têm sido usados para preparar hidrogeis injectáveis, tais como: (i) sistemas de reticulação físicos (tais como aqueles baseados em interacções iónicas, estéreo complexação e interacções hidrofóbicas como no caso de hidrogéis termo-sensíveis), e (ii) sistemas de reticulação químicos (usando fotopolimerização e reações enzimáticas). Embora os sistemas físicos de reticulação tenham várias vantagens, tais como a formação de um hidrogel em condições pouco agressivas, apresentam também importantes desvantagens, tais como uma fraca estabilidade e reduzidas propriedades mecânicas. Os sistemas de reticulação por vi química têm várias vantagens, incluindo elevadas propriedades mecânicas e elevada estabilidade do hidrogel. No entanto, os resíduos tóxicos de foto-iniciadores ou solventes orgânicos utilizados, são muitas vezes responsáveis por reduzida biocompatibilidade e citotoxicidade dos hidrogéis.Heretofore, various methods have been used to prepare injectable hydrogeins, such as: (i) physical crosslinking systems (such as those based on ionic interactions, stereo complexation and hydrophobic interactions as in the case of thermosensitive hydrogels), and ) chemical crosslinking systems (using photopolymerization and enzymatic reactions). While physical crosslinking systems have several advantages, such as the formation of a hydrogel under non-aggressive conditions, they also have major drawbacks, such as poor stability and poor mechanical properties. Chemical crosslinking systems have several advantages, including high mechanical properties and high stability of the hydrogel. However, the toxic residues of photoinitiators or organic solvents used are often responsible for reduced biocompatibility and cytotoxicity of the hydrogels.
Recentemente, as metodologias de reticulação enzimáticas têm emergido como uma via alternativa para ultrapassar as dificuldades associadas aos métodos mais convencionais de reticulação química. Diferentes hidrogéis teêm sido obtidos por reacções de reticulação utilizando peroxidase de rábano (horseradish peroxidase-HRP) como catalisador. 0 HRP é uma 4 hemoproteína de cadeia única do tipo b que catalisa o acoplamento dos derivados de fenol ou anilina por meio da decomposição de peróxido de hidrogénio (H202) . Vários polímeros sintéticos e naturais funcionalizados com tiramina, tirosina (também conhecido como 4-hydroxifenilalanina) e grupos laterais aminofenol estão actualmente em desenvolvimento para formar hidrogéis in situ utilizando esta estratégia. Os exemplos incluem: alginato reticulado por HRP com grupos fenólicos (Sakai, et al Acta Biomaterialia, 2007, 3:495-501.), conjugados dextrano-tiramina (Jin et ai Biomaterials, 2007, 28:2791-2800.), ácido glicólico e de ácido floretico com enxertos de quitosano (jin, et al. Biomaterials, 2009, 30:2544-2551), conjugados de ácido hialurónico-tiramina (Kurisawa, et al. Chemical Communications, 2005, 14:4312-4314), conjugados de ácido poliaspártico com cada um dos três grupos laterais aromáticos (Sofia, et al. Jornal of Macromolecular Science Parte A, 2002, A39:1151-1181) , péptidos contendo tirosina (Gly-Tyr-Gly) (Oudgenoeg, et ai. Journal of Agrícultural and Food Chemistry, 2001, 49:2503-2510), a proteína de caseína alimentar (Li, et al. jornal Africano da biotecnologia, 2009, 8:5508-5515), tirosina contendo um marcador peptídico (Minamihata, et al. Bioconjugate Chemistry, 2011, 22:74-81). Estes sistemas apresentam várias vantagens, tais como biocompatibilidade e fácil controlo da taxa de reacção sob condições pouco agressivas, imitando os processos biológicos de reticulação. Além disso, podem obter-se propriedades mecânicas ajustáveis através da variação da concentração de H202, tal como tem sido demonstrado para hidrogéis de gelatina-ácido hydroxifenilpropiónico (Wang, et al. Biomaterials, 2010, 31:8608-8616) onde a rigidez varia em função da concentração de H202, sem alterar o teor de 5 polímero na solução precursora. Os hidrogéis desenvolvidos neste estudo foram capazes de suportar a adesão e proliferação celular e de uma forma dependente da rigidez. Além disso, foi relatado que através do controlando do teor de grupos fenólicos no hidrogel conjugado de carboximetilcelulose (CMC)-tiramina foi possível controlar eficazmente a adesão e proliferação celular resultantes (Sakai, et al Acta biomaterialia, 2009, 5:554-559). Notavelmente, um hidrogel obtido a partir de CMC, o qual é conhecido por ser um biopolímero anti-adesivo, mostrou adesividade celular após a gelificação por meio de reticulação de grupos fenólicos. Hidrogéis conjugados de proteína-polissacarídeo a partir de derivados de alginato e de proteínas (gelatina e albumina) foram também desenvolvidos (Sakai, et al, 2010, Biomacromolecules 11: 1370-1375.), todos possuindo porções de grupos fenol através de uma reacção enzimática catalizada por HRP. Noutro estudo, foi possível alcançar, simultaneamente, a hidrogelificação in situ e a conjugação RGD de um conjugado de tiramina com um copolímero em bloco de PPO-PEO (Park, et al. Soft Matter, 2011, 7:986-992). O efeito de RGDs conjugados na adesão e proliferação celular foi superior e pode ser ajustado de um modo dependente da concentração. De acordo com a literatura publicada anteriormente, alguns materiais à base de proteínas (tais como gelatina, péptidos, e caseína) deram origem a hidrogéis ou conjugados, utilizando a peroxidase (Li, et al African Journal of Biotecnology, 2009, 8:5508-5515;. Minamihata , et ai Bioconjugate chemistry, 2011, 22:74-81; Wang, et al Biomaterials, 2010, 31:8608-8616). Até à data, não foram descrita a produção de hidrogéis de fibroína de seda mediados pela peroxidase e por um peróxido (por exemplo, peróxido de hidrogénio) como o agente oxidante. Apenas a 6 caseína foi reportada por Li et al. como tendo sido reticulada por intermédio de peroxidase/peróxido de hidrogénio, e a caseína reticulada resultante não originou um hidrogel (Li, et al. African Journal of Biotecnology, 2009, 8:5508-5515). A caseína é principalmente um derivado do leite, e a sua estrutura e propriedades são muito diferentes de fibroína de seda que derivam principalmente do casulo. Minamihata et al. sintetizou um peptídeo recombinante contendo tirosina utilizando Escherichia coli., que é uma fibroína de seda completamente diferente em termos de estrutura da proteína, sequência, peso molecular, etc. (Minamihata, et al. Bioconjugate chemistry, 2011, 22:74-81). A gelatina é uma proteína derivada de colagénio cuja composição de aminoácidos, estrutura molecular e propriedades são diferentes das da fibroína de seda. A tirosinase é uma enzima também usada para reticular polímeros contendo tirosina (Moreira Teixeira et al. Biomaterials, 2012, 33:1281-1290). Conjugados de quitosano e gelatina foram desenvolvidos utilizando a tirosinase (Chen, et al Biometerials, 2003, 24:2831-2841; Chen, et al Biopolymers, 2002, 64:292-302). Nestes estudos, a gelatina não foi capaz de formar um hidrogel sem o quitosano. Por outro lado, o hidrogel de gelatina/quitosano presentou pouca estabilidade (Moreira Teixeira et al. Biomaterials, 2012, 33:1281-1290). Estudos semelhantes sugerem que os conjugados preparados por tirosinase podem apenas formar uma matriz semelhante a uma "cola", (Yamada, et ai, 2000, Biomacromolecules 1:252-258, Demolliens, et ai Bioconjugate Chemistry, 2008,19:1849-1854). Conjugados de fibroína de seda e quitosano mediados por tirosinase têm também sido relatados (Kang et al Macromolecular Research, 2004,12:534- 7 539; . Anghileri, et al Journal of Biotechnology, 2007, 127:508-519;. Freddi, et al . Biotecnology Journal, 2006, 125:281-294). Nestes estudos, hidrogéis fibroína de seda puros ou materiais de fibroína de seda puros reticulados por tirosinase de não foram relatadas. Apenas conjugados de fibroína de seda/quitosano ou sericina/quitosano foram considerdos. Além disso, o mecanismo de formação dos conjugados de fibroína seda/quitosano e sericina/quitosano mediados por tirosinase é diferente da de um conjugado de um polímero contendo tirosina mediado por peroxidase. A fibroína de seda (ou sericina) conjuga-se com o quitosano através da reacção de quinonas activadas na seda com os grupos amina no quitosano. Por sua vez, os polímeros que contêm tirosina formam conjugados através de reacções entre os grupos de tirosina (Moreira Teixeira et al. Biomaterials, 2012, 33:1281-1290).Recently, enzymatic crosslinking methodologies have emerged as an alternative way to overcome the difficulties associated with more conventional methods of chemical crosslinking. Different hydrogels have been obtained by crosslinking reactions using horseradish peroxidase (horseradish peroxidase-HRP) as the catalyst. HRP is a 4-chain single chain hemoprotein that catalyzes the coupling of the phenol or aniline derivatives by the hydrogen peroxide (H2O2) decomposition. Various synthetic and natural polymers functionalized with tyramine, tyrosine (also known as 4-hydroxyphenylalanine) and aminophenol side groups are currently under development to form hydrogels in situ using this strategy. Examples include: HRP cross-linked alginate with phenolic groups (Sakai, et al. Acta Biomaterialia, 2007, 3: 495-501.), Dextran-tyramine conjugates (Jin et al. Biomaterials, 2007, 28: 2791-2800.), (Kurisawa, et al., Chemical Communications, 2005, 14: 4312-4314), and the compounds of the general formula conjugates of polyaspartic acid with each of the three aromatic side groups (Sofia, et al., Journal of Macromolecular Science Part A, 2002, A39: 1151-1181), peptides containing tyrosine (Gly-Tyr-Gly) (Oudgenoeg, et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49: 2503-2510), food casein protein (Li et al., African Journal of Biotechnology, 2009, 8: 5508-5515), tyrosine containing a peptidic marker (Minamihata, et al. al. Bioconjugate Chemistry, 2011, 22: 74-81). These systems have several advantages, such as biocompatibility and easy control of the reaction rate under non-aggressive conditions, mimicking biological crosslinking processes. In addition, adjustable mechanical properties can be obtained by varying the H202 concentration, as has been demonstrated for gelatine-hydroxyphenylpropionic acid hydrogels (Wang, et al., Biomaterials, 2010, 31: 8608-8616) where rigidity varies as a function of H 2 O concentration, without changing the polymer content in the precursor solution. The hydrogels developed in this study were able to withstand cell adhesion and proliferation and in a rigidity dependent manner. Furthermore, it has been reported that by controlling the content of phenolic groups in the carboxymethylcellulose (CMC) -thramine conjugated hydrogel it was possible to effectively control the resulting cell adhesion and proliferation (Sakai, et al. Acta biomaterialia, 2009, 5: 554-559) . Notably, a hydrogel obtained from CMC, which is known to be an anti-adhesive biopolymer, showed cell adhesiveness after gelation by cross-linking phenolic groups. Protein-polysaccharide conjugated hydrogels from alginate derivatives and proteins (gelatin and albumin) have also been developed (Sakai, et al, 2010, Biomacromolecules 11: 1370-1375.), All having moieties of phenol groups through a reaction enzyme catalyzed by HRP. In another study, the in situ hydrogelification and the RGD conjugation of a tyramine conjugate with a PPO-PEO block copolymer (Park, et al., Soft Matter, 2011, 7: 986-992) were simultaneously achievable. The effect of conjugated RGDs on cell adhesion and proliferation was higher and could be adjusted in a concentration dependent manner. According to the previously published literature, some protein based materials (such as gelatin, peptides, and casein) gave rise to hydrogels or conjugates using peroxidase (Li et al., African Journal of Biotechnology, 2009, 8: 5508- 5515; Minamihata, et al. Bioconjugate chemistry, 2011, 22: 74-81; Wang, et al. Biomaterials, 2010, 31: 8608-8616). The production of peroxidase-mediated silk fibroin hydrogels and a peroxide (e.g., hydrogen peroxide) as the oxidizing agent has not been reported so far. Only 6 casein was reported by Li et al. as crosslinked by peroxidase / hydrogen peroxide, and the resulting cross-linked casein did not give rise to a hydrogel (Li, et al., African Journal of Biotechnology, 2009, 8: 5508-5515). Casein is mainly a derivative of milk, and its structure and properties are very different from silk fibroin which derive primarily from the cocoon. Minamihata et al. synthesized a recombinant tyrosine-containing peptide using Escherichia coli, which is a completely different silk fibroin in terms of protein structure, sequence, molecular weight, etc. (Minamihata, et al., Bioconjugate chemistry, 2011, 22: 74-81). Gelatin is a collagen-derived protein whose amino acid composition, molecular structure and properties are different from those of silk fibroin. Tyrosinase is an enzyme also used to crosslink tyrosine-containing polymers (Moreira Teixeira et al. Biomaterials, 2012, 33: 1281-1290). Conjugates of chitosan and gelatin were developed using tyrosinase (Chen, et al. Biometries, 2003, 24: 2831-2841; Chen, et al. Biopolymers, 2002, 64: 292-302). In these studies, gelatin was not able to form a hydrogel without chitosan. On the other hand, the gelatine / chitosan hydrogel presented little stability (Moreira Teixeira et al. Biomaterials, 2012, 33: 1281-1290). Similar studies suggest that conjugates prepared by tyrosinase may only form a "glue-like" matrix (Yamada, et al., 2000, Biomacromolecules 1: 252-258, Demolliens, et al. Bioconjugate Chemistry, 2008, 19: 1849- 1854). Tyrosinase-mediated silk and chitosan fibroin conjugates have also been reported (Kang et al., Macromolecular Research, 2004, 12: 534-7399), Anghileri et al Journal of Biotechnology, 2007, 127: 508-519; Freddi, et al Biotechnology Journal, 2006, 125: 281-294). In these studies, pure silk fibroin hydrogels or pure silk fibroin materials crosslinked by tyrosinase have not been reported. Only silk fibroin / chitosan or sericin / chitosan conjugates were considered. Furthermore, the mechanism of formation of tyrosinase-mediated silk / chitosan and sericin / chitosan conjugates is different from that of a peroxidase-mediated tyrosine-containing polymer conjugate. Silk fibroin (or sericin) is conjugated to chitosan by the reaction of activated quinones on the silk with the amine groups in the chitosan. In turn, tyrosine-containing polymers form conjugates through reactions between tyrosine groups (Moreira Teixeira et al., Biomaterials, 2012, 33: 1281-1290).
Na literatura, existem estudos sobre hidrogéis ou conjugados de fibroína de seda/quitosano mediados por tyrosiase. No entanto não foram encontrados registos referindo hidrogéis de fibroína seda, reticulados por peroxidase. Tal como acima mencionado, os mecanismos de acção da tirosinase e da peroxidase são diferentes.In the literature, there are studies on tyrosine-mediated hydrogels or silk fibroin / chitosan conjugates. However no records were found referring to silk fibroin hydrogels, crosslinked by peroxidase. As mentioned above, the mechanisms of action of tyrosinase and peroxidase are different.
Aqui propõe-se a utilização de um sistema baseado num hidrogel de seda injectável com aplicação em engenharia de tecidos e medicina regenerativa e libertação controlada de fármacos, utilizando a peroxidase como estratégia para obter a reticulação. A fibroína de seda (FS) , que é uma proteína natural composta principalmente de glicina, alanina, serina e tirosina, tem sido cada vez mais estudada para novas aplicações biomédicas devido à sua biocompatibilidade, degradabilidade lenta e notáveis propriedades mecânicas. A capacidade de controlar a estrutura molecular e morfologia através do processamento e as possibilidade de funcionalizar a sua superfície, expandiram as aplicções desta proteína. 0 seu peso molecular é de cerca de 300-350 kDa. A unidade de repetição na região cristalina da SF é conhecida como Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly. A FS também contém tirosina na região semi-cristalino ou amorfo. A percentagem deste aminoácido aromático é de cerca de 5% mol de FS. Desta forma, a FS apresenta a química mais adequada para promover a reticulação mediada por peroxidase. Esta é uma vantagem sobre os sistemas poliméricos acima descritos que têm de ser conjugados com derivados de fenol ou anilina antes da reacção enzimática catalisada por HRP. Embora as reacções de reticulação de FS têm sido amplamente relatadas (tais como a utilização para preparar conjugados de tirosinase de seda/quitosano), até à data não há estudos relatados sobre a utilização de peroxidase na reticulação de FS para produzir um hidrogel estável, em que a gelificação pode ocorrer sob condições fisiológicas. Várias patentes foram concedidas com base na utilização de fibroína de seda e suas soluções para as diferentes aplicações. Os exemplos que se seguem devem ser tomadas em conta pela sua relevância na(s) área(s) da presente invenção:Here we propose the use of a system based on an injectable silk hydrogel with application in tissue engineering and regenerative medicine and controlled release of drugs, using peroxidase as a strategy to obtain the cross-linking. Silk fibroin (FS), a natural protein composed mainly of glycine, alanine, serine and tyrosine, has been increasingly studied for new biomedical applications because of its biocompatibility, slow degradability and remarkable mechanical properties. The ability to control the molecular structure and morphology through processing and the possibility of functionalizing its surface, expanded the applications of this protein. Its molecular weight is about 300-350 kDa. The repeating unit in the crystalline region of SF is known as Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly. FS also contains tyrosine in the semi-crystalline or amorphous region. The percentage of this aromatic amino acid is about 5 mol% FS. Thus, FS presents the most appropriate chemistry to promote peroxidase-mediated cross-linking. This is an advantage over the above-described polymer systems which must be conjugated to phenol or aniline derivatives prior to the HRP-catalyzed enzymatic reaction. Although crosslinking reactions of FS have been widely reported (such as the use to prepare silk tyrosinase / chitosan conjugates), to date there have been no reported studies on the use of peroxidase in FS crosslinking to produce a stable hydrogel in that gelation may occur under physiological conditions. Several patents were awarded based on the use of silk fibroin and its solutions for different applications. The following examples should be taken into account for their relevance in the area (s) of the present invention:
Patente dos EUA 2011/0171239, de 14 de julho de 2011 e patente WO 2010/036992 de 01 de abril de 2010 descreve um método para a obtenção de gel de fibroína seda com aplicação direta de corrente ou seja, através de eletrogelificação. 0 gel de fibroína de seda pode ser reversivelmente convertido num líquido através da aplicação 9 de corrente inversa. A invenção estende-se também a um método para a obtenção de geis de seda adesivos por intermédio da redução do pH da solução de seda. A patente dos EUA 2011/0129531 de 2 de junho de 2011 refere-se ao uso de hidrogel de fibroina de seda e suas composições como enchimento dérmico. As composições compreendem de cerca de 1 até 10% (w / v) de fibroina de seda e um polipéptido semelhante à resilina. O precipitado de seda é obtido utilizando um acelerador de 23RGD/ethanol ou meio de desidratação. Para a obtenção dos geis que é necessário um tempo de gelificação 24 horas.US Patent 2011/0171239 of July 14, 2011 and WO 2010/036992 of April 1, 2010 describes a method for obtaining silk fibroin gel with direct current application ie through electrogelification. The silk fibroin gel can be reversibly converted into a liquid through the reverse current application. The invention also extends to a method for obtaining adhesive silk geis by reducing the pH of the silk solution. US Patent 2011/0129531 of June 2, 2011 relates to the use of silk fibroin hydrogel and its compositions as dermal filler. The compositions comprise from about 1 to 10% (w / v) of silk fibroin and a polypeptide similar to resilin. The silk precipitate is obtained using a 23RGD accelerator / ethanol or dehydration medium. For obtaining the geis a gel time of 24 hours is required.
Patente dos EUA 2011/0111031 de 12 de Maio 2011 compreende o uso hidrogel fibroina de seda desprovido de sericina com e suas composições para utilização como um sistema de libertação de fármacos. Uma solução de fibroina de seda livre de sericina é usada para melhorar o tempo de gelificação. É usado um meio de desidratação para produzir os géis, tal como soluções de metanol, etanol, acetona, ou de sal.US Patent 2011/0111031 of May 12, 2011 comprises the use of sericin-depleted silica fibroin hydrogel and compositions thereof for use as a drug delivery system. A solution of sericin-free silk fibroin is used to improve the gelling time. A dehydration medium is used to produce the gels, such as solutions of methanol, ethanol, acetone, or salt.
Patente WO 2011/041395 de 7 abril de 2011 descreve métodos de preparação nano-e micro-particulas de seda para uma variedade de aplicações biomédicas e farmacêuticas, tais como engenharia de tecidos ou libertação controlada de fármacos. O método utiliza álcool polivinílico (PVA) e uma técnica de separação de fases para a obtenção de partículas. Nenhum solvente orgânico é utilizado em qualquer fase da produção.WO 2011/041395 of April 7, 2011 describes methods of preparing nano- and microparticles of silk for a variety of biomedical and pharmaceutical applications, such as tissue engineering or controlled drug delivery. The method uses polyvinyl alcohol (PVA) and a phase separation technique to obtain particles. No organic solvent is used at any stage of production.
Patente WO 2011/022771 de 03 de março de 2011 refere-se a métodos de produção de extrato de seda (compreende cerca de 10 0,5% a cerca de 15% de proteínas de seda) para aplicação na produção de produtos de cuidados pessoais, plásticos, têxteis e produtos biomédicos. As proteínas de seda são obtidas a partir de células produtoras destas, sendo solubilizadas atrvés do contacto com um agente tensioactivo (por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), sulfato de amónio laurilo) ou um líquido iónico (por exemplo, de aniões, tais como cloreto e brometo; catião como o 3-4-cloropiridínio e dimetilaminopiridinium) e concentrando-se as proteínas para produzir o extrato de seda.WO 2011/022771 of March 03, 2011 relates to methods of producing silk extract (comprises about 10 0.5% to about 15% silk proteins) for application in the production of personal care products , plastics, textiles and biomedical products. Silk proteins are obtained from cells producing them, being solubilized by contact with a surfactant (for example, sodium dodecyl sulfate (SDS), ammonium lauryl sulfate) or an ionic liquid (for example anions, such as chloride and bromide, cation such as 3-4-chloropyridinium and dimethylaminopyridinium) and concentrating the proteins to produce the silk extract.
Patente WO 2011/026101 de 03 de março de 2011 refere-se a dispositivos electrónicos e optoelectrónicos feitos com fibroína de seda ou de misturas com outros biopolímeros, os seus métodos de fabricação e os métodos para usar o sistema electrónico e optoelectrónico à base de seda. Estes dispositivos à base de sedam pode ser utilizados in vitro e in vivo para aplicações biomédicas.WO patent 2011/026101 of March 03, 2011 relates to electronic and optoelectronic devices made with silk fibroin or mixtures with other biopolymers, their manufacturing methods and methods for using the silk-based electronic and optoelectronic system . These sedam-based devices can be used in vitro and in vivo for biomedical applications.
Patente dos EUA 2011/0046686 de 24 fevereiro de 2011 descreve métodos e composições que compreendem misturas de fibroína de seda e hidroxiapatite (HA). A fibroína de seda e hidroxiapatite são misturadas antes da gelificação ocorrer (formação de estado insolúvel). A invenção refere-se à reparação e substituição de osso e dentes. WO Patent2011/013145 de 03 de fevereiro de 2011, descreve um processo para melhorar o tempo de gelificação de fibroína de seda regenerada utilizando por exemplo, Ti02 ou Fe02SiN3 como o agentes gelificantes. O composito de fibroína de seda/sílica é proposto como biomaterial de suporte para aplicações em engenharia de tecidos. 11US Patent 2011/0046686 of February 24, 2011 describes methods and compositions comprising mixtures of silk fibroin and hydroxyapatite (HA). Silk fibroin and hydroxyapatite are mixed before gelation occurs (formation of insoluble state). The invention relates to the repair and replacement of bone and teeth. WO Patent2011 / 013145 dated 03 February 2011, discloses a process for improving the gelation time of regenerated silk fibroin using for example TiO2 or Fe02 SiN3 as the gelling agents. The silica / silica fibroin composite is proposed as a support biomaterial for tissue engineering applications. 11
Patente WO 2011/011347 de 27 janeiro de 2011 compreende composições e os métodos de ligação de fibroina de seda a agentes activos através da interacção especifica entre a avidina e a biotina. Os biomateriais baseados em seda funcionalizados podem ser ligados a anticorpos e factores de crescimento para o uso em várias aplicações biomédicas.WO 2011/011347 of January 27, 2011 comprises compositions and methods of attaching silk fibroin to active agents through the specific interaction between avidin and biotin. Functionalized silk-based biomaterials can be linked to antibodies and growth factors for use in various biomedical applications.
Patente dos EUA 2011/0008436 de 13 de Janeiro de 2011 refere-se aos métodos de purificação de fibroina de seda, conjugandos de fibroina com moléculas bioactivas e produção de hidrogéis de fibroina de seda e formulações com concentração de fibroina de até 6% em peso. A invenção compreende géis obtidos por mistura de fibroina de seda e péptidos, que são destinadas a aplicações como agentes de enchimento, libertação controlada de fármacos e engenharia de tecidos.US Patent 2011/0008436 of January 13, 2011 relates to methods of purification of silk fibroin, conjugates of fibroin with bioactive molecules and production of silk fibroin hydrogels and formulations with fibroin concentration of up to 6% by weight . The invention comprises gels obtained by mixing silk fibroin and peptides, which are intended for applications as fillers, controlled drug release and tissue engineering.
Patente WO 2011/005381 de 13 de janeiro de 2011 refere-se a um tratamento por vórtice de um solução de fibroina de seda que permite a obtenção de géis. O método permite o controlo da taxa de formação de lamelas com conformação β e da velocidade de gelificação. Os agentes bioactivos e células podem ser encapsulados nos hidrogéis durante o tratamento por vórtice.WO 2011/005381 of January 13, 2011 relates to a vortexing treatment of a solution of silk fibroin which enables the production of gels. The method allows the control of the rate of β-shaped lamella formation and the rate of gelation. Bioactive agents and cells may be encapsulated in the hydrogels during vortexing.
Patente WO 2011/006133 de 13 de janeiro de 2011 descreve um sistema de libertação baseado em seda que liberta ácidos nucléicos a partir de complexos de seda. Os complexos de seda destinam-se a serem aplicados em transfecção, uma vez que apresentam elevada eficiência de libertação, selectividade célular e a libertação controlada dos ácidos nucléicos. 12 A patente WO 2010/141133 de 09 de dezembro de 2010 refere-se a métodos de preparação de estruturas de suporte de fibroína de seda/antibiótico(s). A presente invenção descreve composições de fibroína de seda baseados em composições compreendendo antibiótico (s) para a prevenção de infecções bacterianas, e para implantes médicos, engenharia de tecidos, sistemas de libertação de fármacos, ou outras aplicações farmacêuticas ou médicas.WO 2011/006133 of January 13, 2011 describes a silk-based delivery system which liberates nucleic acids from silk complexes. Silk complexes are intended to be applied in transfection as they exhibit high release efficiency, cell selectivity and the controlled release of nucleic acids. WO 2010/141133 of December 9, 2010 relates to methods of preparing support structures of silk / antibiotic fibroin (s). The present invention describes silk fibroin compositions based on compositions comprising antibiotic (s) for the prevention of bacterial infections, and for medical implants, tissue engineering, drug delivery systems, or other pharmaceutical or medical applications.
Patente WO 2010/123945; Patente WO 2010/123946, e Patente WO 2010/123947 de 28 de outubro de 2010 descrevem métodos para purificação e funcionalização de fibroína de seda. A invenção descreve métodos para a obtenção de hidrogéis por combinação com 23RGD/ethanol destinada a encontrar aplicações em engenharia de tecidos, revestimentos para melhorar o funcionamento de um dispositivo médico, e libertação controlada de fármacos. EP patente 2010/2211876, de 4 de Agosto de 2010; Patente dos EUA 2010/0178304 de 15 de Julho de 2010; MX Patentes 2009/012978, de 23 de abril de 2010; KR Patentes 2010/1020100029217 de 16 de Março de 2010; Patentes e WO 2008/150861 de 11 dez 2008 proporcionam um processo de produção de géis de fibroína de seda através de ultra-sons. O tempo de gelificação pode ser controlado para ocorrer dentro das duas horas após o tratamento de ultra-sons e utiliza um tratamento adicional com uma solução de sal. Os agentes bioactivos e células podem ser encapsuladas nos hidrogéis durante o processo de gelificação. EP Patent 2010/2210971 de 28 de julho de 2010 refere-se a uma estrutura de tecida de fibroína de seda compreendendo uma bainha tubular concêntrica exterior e um núcleo 13 interior. A fibroina de seda usada para tecer a estrutura da presente invenção é constituída por um fio de seda destinado a aplicações em regeneração de ligamentos, particularmente o ligamento cruzado anterior, os tendões, os músculos e os vasos sanguíneos.WO 2010/123945; WO 2010/123946, and WO 2010/123947 of October 28, 2010 disclose methods for purification and functionalization of silk fibroin. The invention describes methods for obtaining hydrogels by combining with 23RGD / ethanol to find applications in tissue engineering, coatings for improving the functioning of a medical device, and controlled release of drugs. EP patent 2010/2211876, of August 4, 2010; US Patent 2010/0178304 of July 15, 2010; MX Patents 2009/012978, of April 23, 2010; KR Patents 2010/1020100029217 of 16 March 2010; Patents and WO 2008/150861 of December 11, 2008 provide a process for the production of silk fibroin gels by ultrasound. The gelation time can be controlled to occur within two hours after the ultrasonic treatment and uses an additional treatment with a salt solution. Bioactive agents and cells can be encapsulated in the hydrogels during the gelation process. EP Patent 2010/2210971 of July 28, 2010 relates to a silk fibroin tissue structure comprising an outer concentric tubular sheath and an inner core 13. The silk fibroin used to weave the structure of the present invention consists of a silk thread for regenerative applications of ligaments, particularly the anterior cruciate ligament, tendons, muscles and blood vessels.
Patente WO 2010/057142 de 20 de maio de 2010 apresenta composições e métodos para a produção de fibroina de seda funcionalizada com polietileno glicol (PEG). A seda ligada ao PEG é destinada a aplicações como materiais antiaderentes e anti-trombogénicos. Como apresenta propriedades de superfície diferentes dentro da matriz, a associação com agentes bioactivos pode melhorar o crescimento interno de tecido, no lado da matriz aderente.WO 2010/057142 of May 20, 2010 discloses compositions and methods for the production of polyethylene glycol functionalized (PEG) silk fibroin. Silk attached to PEG is intended for applications as anti-adherent and anti-thrombogenic materials. As it exhibits different surface properties within the matrix, the association with bioactive agents can improve the internal growth of tissue, on the side of the adherent matrix.
Patente dos EUA 2009/7635755, de 22 de dezembro de 2009; EP Patent 2006/1613796 11 de janeiro de 2006, e Patente WO 2005/012606 de 10 de fevereiro, 2005 referem-se 'a preparação de soluções altamente concentradas fibroina de seda. Os métodos descritos para a obtenção das soluções não utilizam de solventes orgânicos, aditivos directos e produtos químicos agressivos. As soluções seda altamente concentradas (inferior a 30% em peso) são propostas para o desenvolvimento de fibras, membranas, espumas, estruturas de suporte e hidrogéis. Os métodos de processamento para a obtenção de hidrogéis de seda são baseados no aumento de temperatura, pH, diminuição e aumento da concentração de sal ou de uma mistura com outros polímeros.US Patent 2009/7635755, of December 22, 2009; EP Patent 2006/1613796 January 11, 2006, and WO 2005/012606 of February 10, 2005 relate to the preparation of highly concentrated solutions of silk fibroin. The methods described for obtaining the solutions do not use organic solvents, direct additives and aggressive chemicals. Highly concentrated silk solutions (less than 30% by weight) are proposed for the development of fibers, membranes, foams, support structures and hydrogels. The processing methods for obtaining silk hydrogels are based on increasing temperature, pH, decreasing and increasing the concentration of salt or a blend with other polymers.
Patente WO 2009/133532 de 05 novembro de 2009 refere-se a um método de duas fases para a obtenção de uma solução de fibroina de seda regenerada, isto é, a utilização de um reagente iónico e de desgomagem de casulos de seda ou seda 14 tecida. A invenção também se estende à(s) solução(ões) fibroina de seda, e um material de fibroina de um implante que pode ser utilizado para a reparação da cartilagem.WO 2009/133532 of 05 November 2009 relates to a two-step method for obtaining a regenerated silk fibroin solution, i.e. the use of an ionic reagent and degumming of silk or silk cocoons 14 woven. The invention also extends to the silk fibroin solution (s), and a fibroin material from an implant which can be used for cartilage repair.
Patente WO 2009/018610 de 12 de fevereiro, 2009 refere-se a proteínas de seda que podem ser utilizadas para a produção de seda com uma estrutura trans-beta, bem como ácidos nucleicos que codificam tais proteínas. A invenção também compreende células recombinantes e/ou organismos capazes de sintetizar proteínas de seda.WO 2009/018610 of February 12, 2009 relates to silk proteins which may be used for the production of silk with a trans-beta structure, as well as nucleic acids encoding such proteins. The invention also comprises recombinant cells and / or organisms capable of synthesizing silk proteins.
Patente WO 2008/140562 de 20 de novembro de 2008 descreve um método de produção de um material electroactivo que inclui um polímero, um substrato, vazando o polímero sobre o substrato, e polimerizando enzimaticamente um composto orgânico para gerar um polímero condutor entre o polímero fornecido e o substrato. O polímero pode ser de seda que possuem tirosinas para proporcionar uma interface a nível molecular entre o biopolímero fornecido e um substrato ou camada condutora outros através de uma polimerização por tirosina-enzima. O resultado é uma estrutura de carbono-carbono que proporciona conjugados "fios" poliméricos para utilização em dispositivos ópticos poliméricos e biopoliméricos.WO 2008/140562 of November 20, 2008 describes a method of producing an electroactive material which includes a polymer, a substrate, leaking the polymer onto the substrate, and enzymatically polymerizing an organic compound to generate a conductive polymer between the polymer supplied and the substrate. The polymer may be silk containing tyrosines to provide a molecular interface between the supplied biopolymer and a further substrate or conductive layer through a tyrosine-enzyme polymerization. The result is a carbon-carbon structure that provides conjugates " yarn " for use in polymeric and biopolymer optical devices.
Patente WO 2008/118133 de 02 de outubro de 2008 fornece um método para preparar microesferas de fibroina seda utilizando vesículas lipídicas como modelos. As microesferas são destinadas a encontrar aplicações como libertação controlada de fármacos. 15WO 2008/118133 of October 2, 2008 provides a method for preparing silk fibroin microspheres using lipid vesicles as templates. Microspheres are intended to find applications as controlled drug delivery. 15
Patente WO 2008/106485 de 04 de setembro de 2008 refere-se a uma camada de tecido em lamelas, que compreende um substrato de fibroina de seda com ranhuras contendo células especificas de um tecido. Os substratos de lamelas de fibroina de seda são destinados a encontrar aplicações em engenharia de tecidos.WO 2008/106485 of September 4, 2008 relates to a layer of woven lamella comprising a silk fibroin substrate having grooves containing tissue-specific cells. Silicone fibroin lamella substrates are intended to find applications in tissue engineering.
Patente WO 2008/069919 de 12 de junho de 2008 e Patente dos EUA 2008/0131509 de 05 de junho descrevem métodos para o tratamento o de tecido compreendendo matrizes compósitas auto-reforçadas. A matriz pode ser um sistema de gelificação composto por dois componentes com base em cola de fibrina. Nalgumas formulações as proteínas de seda ou as proteínas de seda funcionalizada podem ser combinadas com o sistema de gelificação de dois componentes através de métodos conhecidos no estado da arte.WO 2008/069919 of June 12, 2008 and U.S. Patent 2008/0131509 of June 5 describe methods for the treatment of tissue comprising self-reinforced composite matrices. The matrix may be a gelling system composed of two components based on fibrin glue. In some formulations the silk proteins or the functionalized silk proteins may be combined with the two component gelling system by methods known in the art.
Patente WO 2007/141131 de 13 de Dezembro de 2007 refere-se um dispositivo microfluídico e método para controlar a separação de fases de uma ou mistura de duas ou mais proteínas de seda de aranha que podem, em seguida, permitir a associação de proteína (s) de seda para a produção de esferas, nanofibrilas, fios, etc. EP Patent 2007/1789103 de 30 de maio de 2007 proporciona um dispositivo médico que compreende um corpo tubular que tem um lúmen e um eixo longitudinal, e uma pluralidade de elementos de seda colocados substancialmente em paralelo ao longo do eixo do lúmen do corpo tubular. A invenção estende-se a um método de fabricação do dispositivo médico que compreende a formação do corpo tubular e os elementos de introdução de seda para dentro do lúmen do corpo 16 tubular. 0 dispositivo destina-se a aplicações em regeneração de nervos. A patente WO 2007/020449, de 22 de fevereiro de 2007 e patente WO 2006/030182 de 23 de marco de 2006 descrevem um dispositivo de reparação de tecido cartilaginoso com uma seda tridimensional reabsorvivel, biocompatível ou outra fibra, e uma seda substancialmente porosa biocompatível, reabsorvivel ou um hidrogel preenchendo parcial ou substancialmente os interstícios da fibra, com ou sem um meio de ancoragem firme do dispositivo ao osso do paciente. A estrutura de suporte 3D de seda é obtida por liofilização e o hidrogel por gelificação na presença de um PBS (solução salina de fosfato tamponada)- gelificação iónica. Um gel de seda mineralizante é obtido através da combinação da solução de hidrogel de seda com uma solução de cloreto de cálcio.WO 2007/141131 of December 13, 2007 relates to a microfluidic device and method for controlling the phase separation of one or a mixture of two or more spider silk proteins which may then allow the association of protein ( s) of silk for the production of spheres, nanofibrils, threads, etc. EP Patent 2007/1789103 of May 30, 2007 provides a medical device comprising a tubular body having a lumen and a longitudinal axis, and a plurality of silk elements placed substantially parallel to each other along the axis of the lumen of the tubular body. The invention extends to a method of manufacturing the medical device which comprises forming the tubular body and the silk introducing members into the lumen of the tubular body 16. The device is intended for applications in nerve regeneration. WO 2007/020449 of February 22, 2007 and WO 2006/030182 of March 23, 2006 disclose a device for repairing cartilage tissue with a resorbable, biocompatible or other fiber silk, and a substantially biocompatible substantially porous silk , or a hydrogel partially or substantially filling the interstices of the fiber, with or without a means of firmly anchoring the device to the bone of the patient. The silk 3D support structure is obtained by lyophilization and the hydrogel by gelation in the presence of a PBS (buffered phosphate buffered saline) - ionic gelation. A mineralizing silk gel is obtained by combining the silk hydrogel solution with a calcium chloride solution.
Patente WO 2005/123114 de 29 de dezembro de 2005 refere-se a diferentes sistemas de libertação de fármacosà base de seda. A invenção estende-se a métodos para a produção destes sistemas e formulações de fármacos.WO 2005/123114 of December 29, 2005 relates to different silk-based drug delivery systems. The invention extends to methods for the production of such systems and drug formulations.
Patente WO 2004/060424 de 22 julho de 2004 descreve stents contendo seda compreendendo um stent endoluminal e um enxerto. A invenção estende-se a métodos para a produção de enxertos, em que a seda é destinada a promover a adesão in vivo da endoprótese às paredes dos vasos, ou, caso contrário, induz ou acelera uma reacção fibrótica in vivo levando a endoprótese a aderir à parede do vaso.WO 2004/060424 of July 22, 2004 describes silk-containing stents comprising an endoluminal stent and a graft. The invention extends to methods for the production of grafts, wherein the silk is intended to promote in vivo adhesion of the stent to the vessel walls, or otherwise induces or accelerates a fibrotic reaction in vivo leading to the stent graft to adhere to the wall of the vessel.
Patente WO 2004/041845 de 21 de maio de 2004 descreve um método de preparação de um hidrogel de proteína fibrosa por meio de método de solvente. O método consiste em verter uma 17 solução aquosa de proteína fibrosa num recipiente que compreende um solvente que não seja miscível com áqua; o recipiente é vedado o envelhecimento à temperatura ambiente, e recolhendo o hidrogel proteína fibrosa resultante e deixando-o secar. A invenção estende-se a um hidrogel esmético obtido pelo método de solvente.WO 2004/041845 of May 21, 2004 describes a method of preparing a fibrous protein hydrogel by means of a solvent method. The method comprises pouring an aqueous solution of fibrous protein into a vessel which comprises a solvent which is not water miscible; the vessel is aged for aging at ambient temperature, and collecting the resulting fibrous protein hydrogel and allowing it to dry. The invention extends to a hydrogel obtained by the solvent method.
Patente WO 2003/022909 de 20 de Março de 2003 e patente de invenção EP 2004/1436346 de 14 de julho de 2004 descrevem um processo para a produção de hidrogéis fibroína de seda, por meio de tratamento de uma solução de fibroína com polímeros solúveis em água e/ou com soluções de ácido com um pH inferior que 4 e/ou solventes polares e/ou com compostos de reticulação, seguido por lavagem do resultante. A invenção aqui descrita para desenvolver hidrogéis reticulados fibroína de seda e suas composições, que sofreram reticulação mediada por peroxidase, são completamente diferentes das patentes acima mencionadas. Por exemplo, a Patente dos EUA 2011/0171239, de 14 de Julho de 2011 e Patente WO 2010/036992 abril 2010 descreve métodos para a preparação de hidrogéis de seda que utilizam a aplicação directa de corrente electrica. Nessa patente (WO Patent 2010/036992), (1) a fibra de seda foi desengomada por 20 minutos, (2) a fibroína de seda purificada dissolvida em brometo de lítio a 60 ° C durante 4 horas, (3) a fibroína de seda foi dialisada em cassetes (peso molecular (MWCO) 3500), (4) a solução de fibroína de seda não continha qualquer tampão salino, (5) o hidrogel de fibroína de seda foi formado usando campo eléctrico, (6) o hidrogel de fibroína de seda formado tem conformação de seda-I; (7) os hidrogéis formados fibroína de seda eram 18 semelhantes a uma cola. Há muitas diferenças entre a patente acima mencionada (Patente WO 2010/036992) e a presente invenção, a saber: (1) a fibroina de seda foi desengomada por 1 hora. Um maior tempo de desgomagem pode melhorar a pureza da fibroina de seda para permitir a que a solução de seda seja mais estável no estado aquoso, (2) a fibroina de seda purificada foi dissolvid em brometo de litio a 70°C durante 1 hora, ou seja, a temperatura mais alta pode acelerar a dissolução de fibroina de seda, e o menor tempo de aquecimento pode diminuir a degradação fibroina de seda, (3) a fibroina de seda foi dialisado a num tubo de diálise benzoilado (MWCO 2000) , de peso molecular inferior (MWCO). Uma tubagem de diálise pode manter mais quantidade de proteína no interior do tubo e diminuir os possíveis contaminações, (4) um tampão de iões salinos foi introduzido na fibroina de seda, durante a diálise, isto permite o ajuste do valor de pH da solução de fibroina de seda perto de 7,4, o que permite a incorporação de células e/ou agentes bioactivos, (5) o hidrogel de fibroina de seda é formado por reticulação química mediada pela peroxidase (reação enzimática) , (6) o hidrogel de fibroina de seda formado mediado pela peroxidase de conformação é amorfo (espiral aleatória), (7) os hidrogéis formados são estáveis e podem ser processados em diferentes formas e modulada a sua biodegradabilidade.WO 2003/022909 of March 20, 2003 and EP-A-2004/1436346 of July 14, 2004 disclose a process for the production of silk fibroin hydrogels by treatment of a solution of fibroin with water and / or acid solutions having a pH lower than 4 and / or polar solvents and / or cross-linking compounds, followed by washing the resultant. The invention described herein for developing silicon fibroin cross-linked hydrogels and compositions thereof, which underwent peroxidase-mediated cross-linking, are completely different from the above-mentioned patents. For example, U.S. Patent 2011/0171239, issued July 14, 2011 and WO 2010/036992 April 2010 describes methods for the preparation of silk hydrogels using the direct application of electric current. In that patent (WO Patent 2010/036992), (1) silk fiber was degummed for 20 minutes, (2) purified silk fibroin dissolved in lithium bromide at 60 ° C for 4 hours, (3) silk was dialyzed in cassettes (MWCO) 3500), (4) the silk fibroin solution did not contain any saline buffer, (5) the silk fibroin hydrogel was formed using electric field, (6) the hydrogel of shaped silk fibroin has I-silk conformation; (7) the silk fibroin-formed hydrogels were glue-like. There are many differences between the above-mentioned patent (WO 2010/036992) and the present invention, namely: (1) silk fibroin has been degummed for 1 hour. Further degumming time may improve the purity of the silk fibroin to allow the silk solution to be more stable in the aqueous state, (2) the purified silk fibroin was dissolved in lithium bromide at 70 ° C for 1 hour, ie the higher temperature may accelerate the dissolution of silk fibroin, and the shorter heating time may decrease the degradation of silk fibroin, (3) the silk fibroin was dialyzed into a benzoylated dialysis tube (MWCO 2000), lower molecular weight (MWCO). A dialysis tubing can maintain more protein inside the tube and decrease possible contaminations, (4) a saline ion buffer was introduced into the silk fibroin during dialysis, this allows adjustment of the pH value of the solution of saline. (5) the silk fibroin hydrogel is formed by peroxidase-mediated chemical crosslinking (enzymatic reaction), (6) the silicon fibroin is formed by a silicon fibroin close to 7.4, which allows the incorporation of cells and / or bioactive agents; (7) the formed hydrogels are stable and can be processed in different forms and modulated their biodegradability.
Numa outra patente WO Patent 2003/022909 de 20 de Março de 2003 e patente de invenção EP 2004/1436346 de 14 de julho de 2004 descrevem-se métodos para preparar um hidrogel de seda por tratamento de uma solução de fibroina com polímeros solúveis em água e/ou com soluções de ácido com um pH inferior a 4 e/ou os solventes polares e/ou com os compostos reticulados. Nessa patente (Patente 2003/022909), 19 referiu-se que (1) a fibroina de seda foi dissolvida em solventes de 20-60°C, (2) a concentração da solução dialisada de fibroina de seda foi entre 1-20% em peso; (3) a solução de polietilenoglicol é de 50% e de peso molecular de 1.000 e (4) o hidrogel foi preparado por diálise contra solução de fibroina de seda solução ácida (pH inferior a 4), ou polímeros solúveis em água, ou solventes polares, ou soluções que contêm agentes de reticulação, (5) o pH da solução de fibroina de seda, não foi controlada antes da formação do hidrogel, (6) quando se utiliza um agente de reticulação para formar hidrogéis, dá-se reticulção dos grupos hidroxilo e amina, (7) os hidrogéis de fibroina de seda preparados por diferentes métodos foram todos formados no interior do tubo de diálise, (8), os hidrogéis devem ser lavados antes de usar, (9) o espectro de FTIR revelou que os hidrogéis preparados por todos os métodos mencionados nesta patente foram de conformação beta, como indicado pela forte absorvância à volta de 1620 cm-1 (Figura 6) . Existem grandes diferenças entre a patente acima mencionada (Patente 2003/022909) e a presente invenção, a saber: (1) a fibroina de seda purificada foi dissolvida em brometo de litio a 7 0 °C durante 1 hora, a temperatura mais alta pode acelerar a dissolução do fibroina de seda, e o menor tempo de aquecimento pode diminuir a degradação de fibroina de seda, (2) a concentração da solução dialisada de fibroina de seda foi entre 2-30%, em peso, a elevada concentração da solução de fibroina de seda permite a formação de hidrogéis de seda rígidos, (3), a solução de polietilenoglicol para a concentração da solução de fibroina de seda foi de 20% e de peso molecular foi de 20.000, a menor concentração de PEG tornou a solução mais estável, e o PEG de peso molecular superior não penetrou na membrana de diálise para contaminar a solução de fibroina de seda, (4) os hidrogéis 20 foram preparadas por mistura directa da peroxidase/peróxido de hidrogénio e uma solução de fibroina de seda, e este passo permitiu a incorporação de células e/ou agentes bioactivos, (5) o valor do pH da solução de fibroina de seda estava sob controlo antes da gelificação, entre 7,0-7,4 (pH fisiológico), (6) os mecanismos de reticulação mediados pela peroxidase actuaram nos grupos de tirosina na fibroina de seda, (7) o hidrogel pode ser formado no local de aplicação, tal como o preenchimento de tecido, (8), os hidrogéis podem ser utilizados directamente depois da gelificação ou durante a gelificação, e (9) a conformação do hidrogel fibroina de seda desta invenção é amorfa, confirmada por espectros de FTIR com os principais picos a 1620 cm-1 (Figura 3b). A presente invenção proporciona métodos para a produção de hidrogéis reticulados fibroina de seda mediada por peroxidase. A gelificação ocorre independentemente da presença de meios de cultura e de células ou fluidos corporais, sendo assim clinicamente relevante, uma vez que permite que a homogeneização das células antes da formação do hidrogel e em seguida a gelificação in situ. A capacidade de controlar o tempo de gelificação, as propriedades mecânicas e estruturais dos hidrogéis, a bioadesividade e taxa de degradação são aspectos relevantes em aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, bioadesivos, e sistemas de libertação de fármacos. A presente invenção também apresenta propriedades de memória de forma dos hidrogéis reticulados fibroina de seda mediados por peroxidase, que são estimulados pela força iónica. Por exemplo, após a preparação, os hidrogéis de fibroina de seda pode manter a sua forma (forma inicial) em 21 solução tampão fosfato salino (PBS). 0 hidrogel vai inchar com a diminuição da força iónica da solução. A razão máxima inchamento em água ultrapura é alcançada. Posteriormente, a forma dos hidrogéis irá ser recuperada, até certo ponto à sua forma inicial, por imersão dos hidrogéis em soluções de força iónica diferente. Isto potência a sua aplicação como um biomaterial bioadesivo, agente de preenchimento, e revestimento para melhorar o funcionamento de um dispositivo médico, ou outras aplicações farmacêuticas ou médicas. 0 hidrogel de fibroina de seda preparado por reticulação mediada por peroxidase possui conformação amorfa. Esta invenção proporciona métodos para a preparação de hidrogéis de fibroina de seda com conformações espaciais ajustáveis. Por exemplo, os hidrogéis de fibroina de seda em camadas podem ser formados por imersão em solventes orgânicos. 0 hidrogel formado em camadas possui conformação beta na camada externa e conformação amorfa dominante na camada interna. Outras combinações de conformação podem também ser formadas por outros tratamentos que, possibilitam a sua aplicação como um sistema estruturado (camadas de transporte) para aplicação em dispositivos electrónicos e optoelectrónicos.In another WO patent 2003/022909 of March 20, 2003 and patent EP 2004/1436346 of July 14, 2004 there are described methods for preparing a silk hydrogel by treatment of a solution of fibroin with water-soluble polymers and / or acid solutions having a pH of less than 4 and / or the polar solvents and / or the crosslinked compounds. In that patent (Patent 2003/022909), 19 it was reported that (1) silk fibroin was dissolved in solvents of 20-60 ° C, (2) the concentration of dialysed silk fibroin solution was between 1-20% by weight; (3) the polyethylene glycol solution is 50% and molecular weight 1000, and (4) the hydrogel was prepared by dialysis against acid fibroin solution solution (pH less than 4), or water soluble polymers or solvents (5) the pH of the silk fibroin solution was not controlled prior to the formation of the hydrogel, (6) when a crosslinking agent is used to form hydrogels, crosslinking of the (7) the silk fibroin hydrogels prepared by different methods were all formed within the dialysis tube, (8) the hydrogels should be washed prior to use, (9) the FTIR spectrum revealed that the hydrogels prepared by all methods mentioned in this patent were of beta conformation, as indicated by the strong absorbance around 1620 cm -1 (Figure 6). There are large differences between the above-mentioned patent (Patent 2003/022909) and the present invention, namely: (1) purified silk fibroin was dissolved in lithium bromide at 70 ° C for 1 hour, the higher temperature can accelerating the dissolution of the silk fibroin, and the shorter heating time may decrease the degradation of silk fibroin, (2) the concentration of the dialysed solution of silk fibroin was between 2-30% by weight, the high concentration of the solution of silk fibroin allows the formation of rigid silk hydrogels, (3) the polyethylene glycol solution for the concentration of silk fibroin solution was 20% and molecular weight was 20,000, the lower PEG concentration made the solution and the higher molecular weight PEG did not penetrate the dialysis membrane to contaminate the silk fibroin solution, (4) the hydrogels 20 were prepared by direct mixing of the peroxidase / hydrogen peroxide and a solution (5) the pH value of the silk fibroin solution was under control prior to gelation, between 7.0-7.4 (pH physiological), (6) the peroxidase-mediated crosslinking mechanisms acted on the tyrosine groups in silk fibroin, (7) the hydrogel may be formed at the site of application, such as tissue filling, (8), the hydrogels may be used directly after gelation or during gelation, and (9) the conformation of the silk fibroin hydrogel of this invention is amorphous, confirmed by FTIR spectra with the major peaks at 1620 cm -1 (Figure 3b). The present invention provides methods for the production of peroxidase-mediated silk fibroin crosslinked hydrogels. Gelling occurs independently of the presence of culture media and cells or body fluids and is thus clinically relevant as it allows the homogenization of the cells prior to formation of the hydrogel and then gelation in situ. The ability to control gelation time, mechanical and structural properties of hydrogels, bioadhesiveness and degradation rate are relevant aspects in tissue engineering and regenerative medicine, bioadhesive applications, and drug delivery systems. The present invention also features shape memory properties of peroxidase-mediated silk fibroin crosslinked hydrogels, which are stimulated by ionic strength. For example, after preparation, the silk fibroin hydrogels may retain their shape (initial form) in phosphate buffered saline (PBS) solution. The hydrogel will swell with the decrease in the ionic strength of the solution. The maximum swelling ratio in ultrapure water is attained. Subsequently, the shape of the hydrogels will be recovered to some extent to their initial shape by immersing the hydrogels in solutions of different ionic strength. This potentiates its application as a bioadhesive biomaterial, filler, and coating to improve the functioning of a medical device, or other pharmaceutical or medical applications. Silk fibroin hydrogel prepared by peroxidase-mediated cross-linking has amorphous conformation. This invention provides methods for the preparation of silk fibroin hydrogels with adjustable spatial conformations. For example, layered silk fibroin hydrogels may be formed by immersion in organic solvents. The layered hydrogel has beta conformation in the outer layer and dominant amorphous conformation in the inner layer. Other combinations of conformation can also be formed by other treatments that allow its application as a structured system (transport layers) for application in electronic and optoelectronic devices.
Descrição breve das figuras:Brief description of the figures:
Para uma melhor compreensão da presente invenção, as figuras são apresentados em anexo, mas não se limitam à presente, uma vez que: 22 A Figura 1 representa a ilustração esquemática da reticulação da fibroina de seda mediada pela enzima HRP. (1) HRP/H202, (2) PBS, (A) Fibroina de seda, (B) Hidrogel fibroina de seda. A Figura 2 representa a formação dos hidrogéis de fibroina de seda dos hidrogéis desenvolvidos por reticulação mediada pela HRP e as propriedades de transparência. Fibroina de seda solução de 16% em peso, solução de HRP a 0,84 mg/ml em PBS, e 0,18% em peso de H202 em PBS foram usados (HRP/seda em peso 0,26 °sí, H202/Seda 1,10 wtV») (a): solução de fibroina de seda pura sem PBS, (b) : Solução de fibroina de seda em PBS, (a) e (b) : o peróxido de hidrogénio foi utilizado como agente oxidante, (c) : o peróxido de cálcio foi utilizado como agente oxidante. A Figura 3 representa os resultados obtidos na análise de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) da solução de fibroina de seda, com ou sem PBS, e misturas de seda/HRP/ H202, antes e após a gelificação. As amostras hidratadas foram testadas por reflectância total atenuada (ATR). (a) Uma solução de fibroina de seda, com ou sem PBS: 1. Solução de fibroina de seda sem PBS, 2. Solução de fibroina de seda com PBS. (b) solução de fibroina de seda com PBS foi usada para obter os 3 espectros: 1. Seda/HRP/ H202 : Após gelificação, 2. Seda/HRP/ H202 : Antes da gelificação, 3.Seda/HRP/ H202 : Após gelificação. A Figura 4 representa a absorvância da solução de fibroina de seda obtida a 550 nm, e mistura seda/HRP/ H202, antes e após a gelificação. Solução de fibroina da seda 16 wt%, 0,84 mg/ml de solução de HRP em PBS, e 0,18 wt% de H202 em 23 PBS foram usados (HRP/seda 0,26 wtsi, H2<D2/seda 1,10 wtV») . Para cada grupo, 50 ul de solução foi colocada numa placa de TCPS de 96 poços e medida num leitor de microplacas a 550 nm. A absorvância foi determinada antes e após a gelificação, utilizando a mesma amostra no poço. (A) Antes da gelificação, (B) Após gelificação, 1. Solução seda, 2. Seda/HRP/ H202, 3. Branco. A Figura 5 representa a microestrutura do hidrogel reticulado de fibroina de seda por aceção da HRP e liofilizado. Solução de fibroina da seda 16 wt%, 0,84 mg/ml de solução de HRP em PBS, e 0,18 wt% de H2O2 em PBS foram usados (HRP /seda 0,26wth, H202/seda 1,10 wt™) . A Figura 6 representa as influências da HRP e H202 sobre o tempo de gelificação do hidrogel fibroina da seda reticulado por acção da HRP, determinada a 37°C. Seda-10, Seda-12, Seda-16 corresponde aos hidrogéis de seda preparadas a partir de soluões de fibroina de seda com 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt%, respectivamente. (a) ^Ch/seda: 1,10 wtVo, (b) HRP/seda: 0,26 wtsi. O tempo de gelificação foi determinado utilizando um método de inclinação do frasco. Cada condição foi testada em triplicado. (A) Seda-10, (B) Seda-12, (C) Seda-16. A Figura 7 representa as influências da HRP e H202 no módulo de armazenamento do hidrogel peroxidase fibroina de seda mediada reticulado, medida por um reómetro de uma rotação (estirpe: 0,1%, frequência: 0,5 Hz) modelo, a 37°C. Seda-10, Seda-12, Seda-16 corresponde aos hidrogéis de seda preparadas a partir de soluões de fibroina de seda com 10 24 wt%, 12 wt%, e 16 wt%, respectivamente. (a) H202/seda: 1,10 wth, (b) HRP/seda: 0,26 wth. Os valores foram determinados após o módulo atingir um valor linear e tornar-se estável durante 1 minuto. Cada condição foi testada em triplicado. (A) Seda-10, (B) Seda-12, (C) Seda-16. A Figura 8 representa a influência da HRP sobre as propriedades mecânicas dos hidrogéis de fibroina de seda reticulado por acção da HRP, nomeadamente sobre o módulo. O módulo foi determinado num reómetro de modelo de rotação a 37°C. Seda-10, Seda-12, Seda-16 corresponde aos hidrogéis de seda preparados a partir de soluções de fibroina de seda com 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt%, respectivamente. HRP/Seda (wt.h): 0.13, 0.26, 0.39, 0.52. H202/seda foi fixado em 1,1 wtVo para todas as formulações, (a) Seda-10, (b) Seda-12 e (c) Seda-16: A frequência de análise foi fixada a 1 Hz. (d) Seda-10, (e) Seda-12, e (f) Seda-16: A frequência de análise foi fixada com tensão a 0,1%. Cada análise foi medida após o módulo do hidrogel fibroina de seda atingir um patamar durante 5 minutos. A Figura 9 representa a influência de H202 sobre as propriedades mecânicas dos hidrogéis de fibroina de seda reticulado por acção da HRP, nomeadamente sobre o módulo. O módulo foi determinado num reómetro de modelo de rotação a 37°C. Seda-10, Seda-12, Seda-16 corresponde aos hidrogéis de seda preparados a partir de soluções de fibroina de seda com 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt%, respectivamente. H202/seda (wt.ho): 0.80, 0.95, 1.10, 1.25, 1.45. HRP/seda foi fixo em 0,26 wtVo por todas as formulações, (a) Seda-10, (b) Seda-12 e (c)Seda-16: A frequência de análise foi fixada a 1 Hz . (d)Seda-10, (e) Seda-12, e (f) Seda-16: A frequência de análise foi fixada com tensão a 0,1%. Cada análise foi 25 medida após o módulo do hidrogel fibroína de seda atingir um patamar durante 5 minutos. A Figura 10 representa a percentagem de inchamento do hidrogel de fibroína da seda reticulado por acção da HRP em água destilada (a), e de PBS (b) . (A) HRP/Seda: 0.26 wt.V; H202/Seda: 1.10 wt.V (B) HRP/Seda: 0.52 wt.V; H202/Seda: 1.10 wt.V (C) HRP/Seda: 0.26 wt.l; H202/Seda: 1.45 wt.V. A Figura 11 representa os perfis de degradação enzimática do hidrogel fibroína de seda reticulado por acção da HRP, a 37°C. Seda-10, Seda-12, Seda-16. Seda-10, Seda-12, Seda-16 corresponde aos hidrogéis de seda preparados a partir de soluções de fibroína de seda com 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt%, respectivamente. Para cada teste, cerca de 500 mg de hidrogel de fibroína da seda foi imerso em 5 ml de PBS contendo 0,025 U Protease XIV obtida da Streptomyces griseus (0.005 U/ml) . (a) HRP/Seda: 0.26 wt.V»; H202/Seda: 1.10 wt.V (b) HRP/Seda: 0.52 wt.V; H202/Seda: 1.10 wt.V (c) HRP/Seda: 0.2 6 wt.V; H202/Seda: 1.45 wt.Vo. A Figura 12 representa as propriedades de memória de forma do hidrogel fibroína de seda reticulado por acção da HRP. A concentração da fibroína da seda foi 16 wt%, HRP/seda foi de 0,2 6 wtV, H202/seda foi de 1,1 wtV. O hidrogel de fibroína de seda foi preparado primeiramente num molde (a), e, em seguida, o hidrogel foi removido do molde (b). Hidrogel de fibroína de seda após imersão em água destilada durante 12 horas (c). O diâmetro do hidrodel de fibroína da seda foi recuperado, após a imersão em PBS durante o período de 12 horas (d). 26 A Figura 13 representa a variação do diâmetro do hidrogel fibroina de seda reticulado por acção da HRP quando imerso alternadamente em água destilada e PBS. Seda-10, Seda-12, Seda-16. Seda-10, Seda-12, Seda-16 corresponde aos hidrogéis de seda preparados a partir de soluções de fibroina de seda com 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt%, respectivamente. (a) HRP/seda é de 0,2 6 wtV», f^Cb/seda é de 1,1 wtVo, (b) HRP/seda é de 0,26 wtV», H202/seda é de 1,45 wtbo. (A) 12 horas em água destilada destilada, (B) 12 horas em PBS. A Figura 14 representa as fotografias do hidrogel fibroina de seda reticulado por acção da HRP, antes de (a) , e após (b) imersão em metanol durante 5 minutos. A Figura 15 representa as imagens transversais do hidrogel fibroina de seda reticulado por acção da HRP, após imersão em metanol pelo período de: (a) 0, (b) 1, (c) 3, (d) 5, e (e) 10 minutos. A concentração de fibroina da seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,26 wth», ^Ch/seda é de 1,1 wth». Podem observar-se as multicamadas do hidrogel de fibroina de seda preparado através da imersão do hidrogel em metanol. A Figura 16 representa a espessura da camada externa do hidrogel de fibroina da seda, preparado por imersão do hidrogel em metanol durante diferentes períodos de tempo. A concentração de fibroina da seda é de 16 wt%. (A) HRP/seda é de 0,2 6 wtVo, H202/seda é de 1,4 5 wtV», (B) HRP/seda é de 0,2 6 wtVo, H202/seda é de 1,1 wtVo. * Indica diferença significativa entre as duas formulações do hidrogel de fibroina da seda imersas em metanol durante o mesmo período de tempo. 27 A Figura 17 representa os espectros ATR das multicamdas do hidrogel de fibroína de seda reticulado por acção da HRP e imerso em metanol durante 5 minutos. A concentração de fibroina da seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,26 wtVo, tbCb/seda é de 1,1 wth. (1) Camada exterior, (2) Solução de seda, (3) Camada interna. A Figura 18 representa o perfil de degradação enzimática da camada exterior "pele" do hidrogel de fibroina da seda reticulado por acção da HRP, após imersão em metanol durante diferentes períodos de tempo. (1) 3 min, (2) 5 min, (3) 10 min. O teste foi realizado a 37°C. A concentração de fibroína da seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,26 wtV», H202/seda é de 1,1 wth. Em cada teste, cerca de 100 mg exterior camada de hidrogel fibroína de seda foi imerso em 5 ml de PBS contendo 1 U Protease XIV obtida da Streptomyces griseus (0,2 U/ml). A Figura 19 representa o perfil de degradação enzimática da porção "interna" do hidrogel de fibroína da seda reticulado por acção da HRP, após imersão em metanol durante 5 minutos. O teste foi realizado a 37°C. A concentração de fibroína da seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,2 6 wtsi, H202/seda é de 1,1 wtVo. Em cada teste, a cerca de 300 mg de camada interna de hidrogel foi imerso em 5 ml de PBS contendo 0,025 U Protease XIV obtida da Streptomyces griseus (0.005 U/ml). A Figura 20 representa a viabilidade celular (ensaio MTS). Células ATDC-5 foram encapsuladas no hidrogel in vitro. A concentração de fibroína da seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 28BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS For a better understanding of the present invention, the figures are shown in the annex, but are not limited to the present, since: Figure 1 shows the schematic illustration of HRP enzyme-mediated silk fibrotic crosslinking. (1) HRP / H202, (2) PBS, (A) Silk Fibroin, (B) Silk Fiber Hydrogel. Figure 2 depicts the formation of the silk fibroin hydrogels of the hydrogels developed by HRP-mediated cross-linking and the transparency properties. 16% by weight silk solution solution, HRP solution at 0.84 mg / ml in PBS, and 0.18% by weight H202 in PBS were used (HRP / silk in weight 0.26 °, H202 / Silk 1.10 wtV): (a): pure silk fibroin solution without PBS, (b): Silk fibroin solution in PBS, (a) and (b): hydrogen peroxide was used as an oxidizing agent, (c): calcium peroxide was used as oxidizing agent. Figure 3 depicts the results obtained in the Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) analysis of the silk fibroin solution, with or without PBS, and silk / HRP / H202 mixtures, before and after gelation. The hydrated samples were tested by attenuated total reflectance (ATR). (a) A silk fibroin solution, with or without PBS: 1. Silk fibroin solution without PBS, 2. Silk fibroin solution with PBS. (b) silk fibroin solution with PBS was used to obtain the 3 spectra: 1. Silk / HRP / H202: After gelation, 2. Silk / HRP / H202: Before gelation, 3.Seda / HRP / H2O2: After gelation. Figure 4 shows the absorbance of the silk fibroin solution obtained at 550 nm, and silk / HRP / H202 mixture, before and after gelation. Silk fibroin solution 16 wt%, 0.84 mg / ml HRP solution in PBS, and 0.18 wt% H202 in 23 PBS were used (HRP / silk 0.26 wt.%, H2 <D2 / silk 1 , 10%). For each group, 50 ul of solution was placed on a 96-well TCPS plate and measured on a microplate reader at 550 nm. Absorbance was determined before and after gelation using the same sample in the well. (A) Before gelation, (B) After gelation, 1. Silk solution, 2. Silk / HRP / H202, 3. White. Figure 5 shows the microstructure of the crosslinked hydrogel of silk fibroin by HRP and lyophilized. 16 wt% silk fibroin solution, 0.84 mg / ml HRP solution in PBS, and 0.18 wt% H 2 O 2 in PBS were used (HRP / 0.26wt silk, H202 / 1.10 wt silk ). Figure 6 depicts the influences of HRP and H202 on the gelation time of HRP cross-linked silk fibroin hydrogel, determined at 37øC. Silk-10, Silk-12, Silk-16 corresponds to silk hydrogels prepared from 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt% silk fibroin solutions, respectively. (b) HRP / silk: 0.26 wt. The gel time was determined using a vial tilt method. Each condition was tested in triplicate. (A) Silk-10, (B) Silk-12, (C) Silk-16. Figure 7 depicts the influences of HRP and H202 on the modulus of the hydrogel peroxidase crosslinked silk mediated fibroin hydrogel, measured by a model rheometer (strain: 0.1%, frequency: 0.5 Hz) at 37 ° W. Silk-10, Silk-12, Silk-16 corresponds to silk hydrogels prepared from 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt% silk fibroin solutions, respectively. (a) H202 / silk: 1.10 wt, (b) HRP / silk: 0.26 wt. Values were determined after the module reached a linear value and became stable for 1 minute. Each condition was tested in triplicate. (A) Silk-10, (B) Silk-12, (C) Silk-16. Figure 8 shows the influence of HRP on the mechanical properties of HRP cross-linked silk fibroin hydrogels, in particular on the modulus. The modulus was determined on a rotation model rheometer at 37 ° C. Silk-10, Silk-12, Silk-16 corresponds to silk hydrogels prepared from solutions of silk fibroin with 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt%, respectively. HRP / Silk (wt.h): 0.13, 0.26, 0.39, 0.52. (A) Silk-10, (b) Silk-12 and (c) Silk-16: The analysis frequency was set at 1 Hz. (D) Silk was fixed at 1.1 wtVo for all formulations, -10, (e) Silk-12, and (f) Silk-16: The analysis frequency was set at 0.1% tension. Each analysis was measured after the module of the silk fibroin hydrogel reached a plateau for 5 minutes. Figure 9 depicts the influence of H202 on the mechanical properties of the crosslinked silk fibroin hydrogels by HRP, in particular on the modulus. The modulus was determined on a rotation model rheometer at 37 ° C. Silk-10, Silk-12, Silk-16 corresponds to silk hydrogels prepared from solutions of silk fibroin with 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt%, respectively. H202 / silk (wt.ho): 0.80, 0.95, 1.10, 1.25, 1.45. HRP / silk was fixed at 0.26 wtVo for all formulations, (a) Silk-10, (b) Silk-12 and (c) Silk-16: The analysis frequency was set at 1 Hz. (d) Silk-10, (e) Silk-12, and (f) Silk-16: The analysis frequency was set at 0.1% tension. Each analysis was measured after the module of the silk fibroin hydrogel reached a plateau for 5 minutes. Figure 10 represents the percent swelling of HRP-crosslinked silk fibroin hydrogel in distilled water (a), and PBS (b). (A) HRP / Silk: 0.26 wt.V; H202 / Silk: 1.10 wt.V (B) HRP / Silk: 0.52 wt.V; H202 / Silk: 1.10 wt.V (C) HRP / Silk: 0.26 wt.l; H202 / Silk: 1.45 wt.V. Figure 11 depicts the enzymatic degradation profiles of the HRP crosslinked silk fibroin hydrogel at 37øC. Silk-10, Silk-12, Silk-16. Silk-10, Silk-12, Silk-16 corresponds to silk hydrogels prepared from solutions of silk fibroin with 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt%, respectively. For each test, about 500 mg of silk fibroin hydrogel was immersed in 5 ml of PBS containing 0.025 U Protease XIV obtained from Streptomyces griseus (0.005 U / ml). (a) HRP / Silk: 0.26 wt.V .; H202 / Silk: 1.10 wt.V (b) HRP / Silk: 0.52 wt.V; H202 / Silk: 1.10 wt.V (c) HRP / Silk: 0.2 6 wt.V; H202 / Silk: 1.45 wt.Vo. Figure 12 depicts the shape memory properties of the crosslinked silk fibroin hydrogel by HRP. The concentration of silk fibroin was 16 wt%, HRP / silk was 0.26 wt V, H202 / silk was 1.1 wt V. The silk fibroin hydrogel was first prepared in a template (a), and then the hydrogel was removed from the template (b). Silk fibroin hydrogel after immersion in distilled water for 12 hours (c). The diameter of the silk fibroin hydrodel was recovered after immersion in PBS over the 12 hour period (d). Figure 13 depicts the variation of the diameter of the hydrogel crosslinked silk fibroin by HRP when alternately immersed in distilled water and PBS. Silk-10, Silk-12, Silk-16. Silk-10, Silk-12, Silk-16 corresponds to silk hydrogels prepared from solutions of silk fibroin with 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt%, respectively. (a) HRP / silk is 0.2 wt%, silk is 1.1 wt%, (b) HRP / silk is 0.26 wt%, H202 / silk is 1.45 wtbo . (A) 12 hours in distilled distilled water, (B) 12 hours in PBS. Figure 14 depicts the photographs of HRP crosslinked silk fibroin hydrogel prior to (a), and after (b) immersion in methanol for 5 minutes. Figure 15 shows the cross-sectional images of HRP-crosslinked silk fibroin hydrogel after immersion in methanol for the period of: (a) 0, (b) 1, (c) 3, (d), and (e) 10 minutes. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt%, Silk is 1.1 wt%. The multilayers of the silk fibroin hydrogel prepared by immersing the hydrogel in methanol can be seen. Figure 16 depicts the thickness of the outer layer of the silk fibroin hydrogel, prepared by immersing the hydrogel in methanol for different periods of time. The concentration of silk fibroin is 16 wt%. (A) HRP / silk is 0.2 wt%, H202 / silk is 1.4 wt%, (B) HRP / silk is 0.26 wtVo, H220 / silk is 1.1 wtVo. * Indicates significant difference between the two formulations of the silk fibroin hydrogel immersed in methanol over the same period of time. Figure 17 depicts the multi-layer ATR spectra of the HRP cross-linked silk fibroin hydrogel and immersed in methanol for 5 minutes. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wtVo, tbCb / silk is 1.1 wt. (1) Outer layer, (2) Silk solution, (3) Inner layer. Figure 18 depicts the enzymatic degradation profile of the outer layer " skin " of HRP-crosslinked silk fibroin hydrogel after immersion in methanol for different periods of time. (1) 3 min, (2) 5 min, (3) 10 min. The test was performed at 37 ° C. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt%, H202 / silk is 1.1 wt. In each test, about 100 mg outer layer of silk fibroin hydrogel was immersed in 5 ml of PBS containing 1 U Protease XIV obtained from Streptomyces griseus (0.2 U / ml). Figure 19 depicts the enzymatic degradation profile of the " inner portion " of HRP-crosslinked silk fibroin hydrogel after immersion in methanol for 5 minutes. The test was performed at 37 ° C. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt%, H202 / silk is 1.1 wtVo. In each test, about 300 mg of the inner layer of hydrogel was immersed in 5 ml of PBS containing 0.025 U Protease XIV obtained from Streptomyces griseus (0.005 U / ml). Figure 20 represents cell viability (MTS assay). ATDC-5 cells were encapsulated in the hydrogel in vitro. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 28
0,2 6 wtsi, (A) H202/seda é de 1,1 wtsi ou (B) 1,45 wtsi. A densidade celular usada é de 1 milhão de células/ml de hidrogel. As células foram encapsuladas no gel de sida contendo HRP e H202, e em seguida 50 ul mistura foi colocada sobre uma lamela de TCPS até formação de gel, em condições de esterilidade. As células/hidrogel de fibroina de seda foram cultivadas em meio alfa-MEM e a viabilidade celular foi testada recorrendo ao ensaio de MTS, após diferentes períodos de tempo. A Figura 21 revela as células ATDC-5 encapsuladas no hidrogel de fibroina de seda após imersão em meio contendo MTS, durante 3 horas. A concentração de fibroina da seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,2 6 wtsi, H202/seda é de 1,1 wtsi. As células ATDC-5 foram cultivadas no hidrogel fibroina de seda, durante 1 dia. A Figura 22 representa as imagens de microscópia de fluorescência das células ATDC-5 encapsuladas no hidrogel de fibroina da seda após 11 dias em cultura. (A) 1 dia, (B) 3 dias, (C) 7 dias, e (D) 11 dias. A concentração de fibroina da seda é de 16 wt% . (1) HRP/seda é : de 0,26 wtsi, H202/seda é de 1, 1 wt si, 5X; (2) HRP/seda é de 0,26 wtsi, H202/seda é de 1, 1 wt si, 2 0x; (3 ) HRP/seda é de 0,26 wtsi, H202/seda é de 1,45 wtsi, 5X; (4 ) HRP/seda é de 0,26 wtsi, H202/seda é de 1,4 5wt si. Ensaio de calcein AM (coloração verde mostra as células vivas) e iodeto de propídio (coloração vermelho mostra as células mortas). HRP/seda é de 0,2 6 wtsi, H202/seda é de 1,1 wtsi.0.26 wt., (A) H202 / silk is 1.1 wt. Or (B) 1.45 wt. The cell density used is 1 million cells / ml of hydrogel. Cells were encapsulated in the AIDS gel containing HRP and H202, and then 50 ul of the mixture was placed on a TCPS coverslip until gel formation under sterile conditions. Silk fibroin cells / hydrogels were cultured in alpha-MEM medium and cell viability was tested using the MTS assay, after different time periods. Figure 21 shows the ATDC-5 cells encapsulated in the silk fibroin hydrogel after immersion in medium containing MTS for 3 hours. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt., H202 / silk is 1.1 wt. ATDC-5 cells were cultured in the silk fibroin hydrogel for 1 day. Figure 22 depicts the fluorescence microscopy images of the ATDC-5 cells encapsulated in the silk fibroin hydrogel after 11 days in culture. (A) 1 day, (B) 3 days, (C) 7 days, and (D) 11 days. The concentration of silk fibroin is 16 wt%. (1) HRP / silk is: 0.26 wtsi, H202 / silk is 1, 1 wt si, 5X; (2) HRP / silk is 0.26 wtsi, H202 / silk is 1, 1 wt si, 2 0x; (3) HRP / silk is 0.26 wt., H202 / silk is 1.45 wt., 5X; (4) HRP / silk is 0.26 wt., H202 / silk is 1.4 wt. Calcein AM test (green color shows live cells) and propidium iodide (red color shows dead cells). HRP / silk is 0.2 wt.%, H202 / silk is 1.1 wt.
Descrição Detalhada da InvençãoDetailed Description of the Invention
Deve ser entendido que esta invenção não está limitada aos protocolos específicos, método(s), reagente (s) etc., aqui 29 descritos e, como tal, podem haver alterações. A terminologia utilizada aqui tem o propósito de descrever apenas formas de realização particulares, e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção, que é definido exclusivamente nas reivindicações.It is to be understood that this invention is not limited to the specific protocols, method (s), reagent (s) etc. described herein and, as such, there may be changes. The terminology used herein is for the purpose of describing only particular embodiments, and is not intended to limit the scope of the present invention, which is defined solely in the claims.
Todas as patentes e outras publicações identificadas são aqui expressamente incorporadas como referência com a finalidade de descrever e divulgar. Por exemplo, o(s) método(s) descrito(s) em tais publicações e relatórios podem ser relacionados com a presente invenção. Estes trabalhos são publicados antes da data de submissão da presente invenção. Nada neste contexto deve ser entendido como uma admissão de que os inventores não têm direito a antedatar tal divulgação em virtude de uma anterior invenção ou por qualquer outra razão. A menos que definido em contrário, todos os termos aqui utilizados têm o mesmo significado que os geralmente compreendidos por um especialista na técnica à qual esta invenção diz respeito.All patents and other publications identified herein are expressly incorporated by reference for the purpose of disclosure and disclosure. For example, the method (s) described in such publications and reports may be related to the present invention. These papers are published prior to the submission date of the present invention. Nothing in this context shall be construed as an admission that inventors are not entitled to antedate such disclosure by virtue of a previous invention or for any other reason. Unless defined otherwise, all terms used herein have the same meaning as those generally understood by one skilled in the art to which this invention relates.
Esta invenção proporciona métodos para a preparação de hidrogéis de fibroina de seda reticulados por peroxidase e a sua utilização no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, como material bioadesivo ou libertação controlada de agentes bioactivos. Esta invenção propõe um novo hidrogel e suas formulações que podem ser usadas como um sistema minimamente invasivo para a regeneração de tecidos. Este sistema pode ser utilizado em conjunto ou carregado com células e/ou outras combinações para restaurar, manter ou melhorar as funções dos tecidos. Além disso, este sistema permite a conjugação com outras 30 moléculas, e podem ser utilizado para libertação controlada de moléculas bioactivas. Os hidrogéis de fibroina de seda enzimaticamente reticulados permitem a incorporação de material genético, agentes bioactivos, a detecção e a segmentação agentes, moléculas condutoras e materiais inorgânicos, proporcionando sistemas versáteis e em camadas que podem ser usados como material de preenchimento, bem como em revestimentos para melhorar a função de um dispositivo médico, ou em eletrónica ou optoeletrónica ou outras aplicações farmacêuticas e médicas.This invention provides methods for the preparation of peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogels and their use in the field of tissue engineering and regenerative medicine as bioadhesive material or controlled release of bioactive agents. This invention proposes a novel hydrogel and its formulations which can be used as a minimally invasive system for tissue regeneration. This system can be used in conjunction with or loaded with cells and / or other combinations to restore, maintain or enhance tissue functions. In addition, this system allows conjugation with another 30 molecules, and can be used for controlled release of bioactive molecules. Enzymatically crosslinked silk fibroin hydrogels allow the incorporation of genetic material, bioactive agents, the detection and targeting agents, conductive molecules and inorganic materials, providing versatile and layered systems that can be used as fillers as well as in coatings to improve the function of a medical device, or in electronics or optoelectronics or other pharmaceutical and medical applications.
Fibroina de seda é um biomaterial biodegradável versátil que contém grande quantidade de sequências de repetição glicina-alanina-glicina-alanina-glicina-serina (GAGAGS), permitindo a formação de uma estrutura anti-paralela β que confere à fibroina de seda uma resistência superior. Existem também vários aminoácidos reactivos na fibroina de seda que permitem a modificação quimica para adaptar esta proteína às aplicações desejadas, tais como a serina, a treonina, os ácido aspártico e glutâmico e a tirosina. A fibroina de seda contém cerca de 5 mol% de grupos de tirosina, os quais podem ser oxidados por peroxidase/peróxido de hidrogénio e, subsequentemente, reticulados para formar uma rede tridimensional. Os hidrogéis de fibroina de seda desenvolvidos na presente invenção formam-se devido aos grupos reticulados de tirosina na fibroina de seda. A solução de fibroina de seda foi preparada como descrito anteriormente, mas com importantes modificações (Sofia et al, J. Biomed Mater Res A 2001, 54:139-148. Patente WO 2010/036992, e Patente WO 2003/022909 2003 / 022.909), de modo a controlar as propriedades finais da solução de seda, 31 tal como pH e teor de iões (s) . Foram preparadas soluções aquosas de fibroína de seda com elevada concentração (pode chegar a 30 wt.%) e contendo PBS. O PBS permitiu a regulação do valor de pH da solução de fibroína de seda. A solução de fibroína de seda concentrada foi diluída em diferentes concentrações. Os hidrogéis foram preparados através da adição de diferentes quantidades de peroxidase (por exemplo, peroxidase de rábano) e peróxido (tal como peróxido de hidrogénio) às soluções de fibroína seda (Figura 1) . O processo de reticulação pode ser efectuado numa vasta gama de temperaturas. Os hidrogéis desenvolvidos podem ser degradados pela proteólise in vivo ou in vitro. O tempo de gelificação e o desempenho mecânico dos hidrogéis formados de fibroína de seda foram investigados. A performance biológica dos hidrogéis foi avaliada in vitro.Silk Fibroin is a versatile biodegradable biomaterial that contains a large amount of glycine-alanine-glycine-alanine-glycine-serine (GAGAGS) repeat sequences, allowing the formation of an anti-parallel β structure that gives the silk fibroin superior resistance . There are also several reactive amino acids in silk fibroin that allow chemical modification to adapt this protein to desired applications, such as serine, threonine, aspartic and glutamic acid, and tyrosine. Silk fibroin contains about 5 mol% tyrosine groups, which may be oxidized by peroxidase / hydrogen peroxide and subsequently cross-linked to form a three-dimensional network. The silk fibroin hydrogels developed in the present invention are formed due to the crosslinked groups of tyrosine in silk fibroin. The silk fibroin solution was prepared as described above, but with important modifications (Sofia et al, J. Biomed Mater Res A 2001, 54: 139-148, WO 2010/036992, and WO 2003/022909 2003/022909 ), so as to control the final properties of the silk solution, such as pH and ion content (s). Aqueous solutions of silk fibroin at high concentration (up to 30 wt%) and containing PBS were prepared. PBS allowed the regulation of the pH value of the silk fibroin solution. The concentrated silk fibroin solution was diluted in different concentrations. Hydrogels were prepared by adding different amounts of peroxidase (for example, horseradish peroxidase) and peroxide (such as hydrogen peroxide) to the silk fibroin solutions (Figure 1). The crosslinking process may be carried out over a wide temperature range. The developed hydrogels can be degraded by proteolysis in vivo or in vitro. The gelation time and mechanical performance of the silica fibroin formed hydrogels were investigated. The biological performance of the hydrogels was evaluated in vitro.
Os desempenhos físico-químicos e biológicos dos hidrogéis podem ser adaptados numa ampla gama de diferentes formulações e condições de reacção. Por exemplo, o desempenho mecânico pode ser ajustado, utilizando soluções de fibroína de seda de concentrações diferentes ou utilizando diferentes quantidades de peroxidase. O tempo de gelificação das soluções aquosas de PBS contendo fibroína de seda também pode ser controlado pela concentração de fibroína de seda, do tipo e concentração do oxidante (por exemplo, peróxido), luz (por exemplo, a exposição à luz UV) , pH e temperatura. Outros desempenhos dos hidrogéis de seda, como a durabilidade, a capacidade de absorção e a taxa de degradação também podem ser modulados numa ampla gama dependendo das condições de preparação. O controlo da performance dos hidrogéis fibroína de seda produzidos na presente invenção pode satisfazer diferentes requisitos na área da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, 32 quando aplicado a eles como matriz injectável para a regeneração de tecidos ou um sistema de libertação de agentes bioactivos ou outras aplicações relevantes como acima mencionado.The physical-chemical and biological performances of the hydrogels can be adapted in a wide range of different formulations and reaction conditions. For example, mechanical performance can be adjusted by using silk fibroin solutions of different concentrations or using different amounts of peroxidase. The gelation time of the aqueous solutions of PBS containing silk fibroin can also be controlled by the concentration of silk fibroin, the type and concentration of the oxidant (e.g., peroxide), light (e.g. exposure to UV light), pH and temperature. Other performances of the silk hydrogels, such as durability, absorption capacity and degradation rate can also be modulated over a wide range depending on the preparation conditions. The performance control of the silk fibroin hydrogels produced in the present invention may satisfy different requirements in the field of tissue engineering and regenerative medicine when applied thereto as an injectable matrix for tissue regeneration or a bioactive or other applications as mentioned above.
As propriedades dos hidrogéis de fibroina de seda reticulados por peroxidase preparados podem ser modificadas por pós-tratamentos. A forma dos hidrogéis preparados pode ser ajustada por imersão em soluções com força iónica diferente. 0 tamanho dos hidrogéis vai aumentar após imersão em soluções de força iónica baixa. E o seu tamanho pode ser recuperado, até certo ponto, ao tamanho original, aumentando a força iónica das soluções. Os hidrogéis de fibroina de seda reticulados por peroxidase podem ser usados como uma plataforma para preparar uma matriz com conformações espaciais controláveis. Como exemplos, pode ser formada uma estrutura em camadas por imersão do preparado fresco ou hidrogel expandido por imersão em solventes orgânicos, misturas de solventes orgânicos, misturas de água e solventes orgânicos, ou por meio de tratamento de campo eléctrico, ou outros tratamentos, ou qualquer combinação destes. Qualquer combinação de conformação pode também ser desenvolvida usando hidrogéis de fibroina de seda reticulados por peroxidase, com outros tratamentos. A propriedade de memória de forma e/ou a estrutura em camadas dos hidrogéis de fibroina de seda reticulados por peroxidase abre possibilidades ilimitadas para a sua aplicação em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, libertação controlada de agentes bioactivos, e como material de preenchimento, bem como em revestimentos para melhorar a função de dispositivos médicos ou outras aplicações farmacêuticas ou médicas. 33The properties of prepared peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogels can be modified by post-treatments. The shape of the prepared hydrogels can be adjusted by immersion in solutions of different ionic strength. The size of the hydrogels will increase after immersion in solutions of low ionic strength. And its size can be recovered, to a certain extent, to the original size, increasing the ionic strength of the solutions. Peroxidase crosslinked silk fibroin hydrogels can be used as a platform to prepare a matrix with controllable spatial conformations. As examples, a layered structure may be formed by immersing the fresh preparation or expanded hydrogel by immersion in organic solvents, mixtures of organic solvents, mixtures of water and organic solvents, or by means of electric field treatment, or other treatments, or any combination thereof. Any combination of conformation can also be developed using peroxidase cross-linked silk fibroin hydrogels with other treatments. The shape memory property and / or the layered structure of peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogels opens up unlimited possibilities for their application in tissue engineering and regenerative medicine, controlled release of bioactive agents, and as fill material as well as as in coatings to enhance the function of medical devices or other pharmaceutical or medical applications. 33
Estes hidrogéis de fibroína de seda reticulados por peroxidase preparados de fresco ou modificados por pós-tratamento, usados sozinhos ou em combinação com moléculas inorgânicas, de detecção e materiais condutores, podem também ter potenciais aplicações em electrónica ou optoelectrónica. No que diz respeito à sua aplicação no nestes campos, estes materiais podem ser aplicados por métodos manuais ou utilizando um dispositivo de distribuição automática, sendo reticulados durante ou depois da deposição. A descrição da presente invenção é complementada por meio de exemplos que se destinam a proporcionar uma melhor compreensão da mesma, embora estes exemplos não devam ser tratados com um carácter restritivo.These freshly prepared or posttreatened modified peroxidase crosslinked silk fibroin hydrogels, used alone or in combination with inorganic detection and conducting materials, may also have potential applications in electronics or optoelectronics. With respect to their application in these fields, these materials may be applied by manual methods or by using an automatic dispensing device, being cross-linked during or after deposition. The disclosure of the present invention is supplemented by means of examples which are intended to provide a better understanding thereof, although these examples should not be treated with a restrictive character.
Exemplo 1: Preparação de solução concentrada fibroina de seda A solução de fibroína de seda foi preparada como descrito anteriormente, mas com modificações (Sofia et al, J. Biomed Mater Res A 54:139-148, 2001, WO Patent 2010/036992, e WO Patent 2003/022909 2003/022909), a fim de controlar as propriedades finais da solução de seda, tal como o valor de pH e conteúdo de iões. A fibroína de seda Bombyx Mori foi extraída por ebulição dos casulos de uma solução de carbonato de sódio (0,02 M, Sigma, EUA) durante uma hora e, em seguida, lavada abundantemente com água destilada. A fibroína de seda purificada foi dissolvida em 9,3 M solução de brometo de lítio (Sigma, EUA) a 70°C durante 1 hora. Em seguida, a solução foi dializada com água destilada utilizando um tubo de diálise benzoilado (peso molecular de corte: 2000, Sigma, EUA), para o período de 2 dias. Em 34 seguida, a solução aquosa de fibroína de seda foi dialisada contra uma solução salina diluída de fosfato tampão (PBS, Sigma, EUA), uma solução (0,2 wt% Em água destilada) durante 24 horas. Depois, a solução dialisada de fibroína de seda foi concentrada por diálise contra uma solução de polietileno glicol com concentração de 20% em peso (20.000 g/mol, Sigma, EUA), durante 9 horas. Finalmente, o tubo de diálise foi cuidadosamente lavado com água destilada e a solução de fibroína de seda foi recolhida para um frasco. O valor do pH da solução concentrada de seda fibroína pode ser ajustado, utilizando soluções de diferentes concentrações de PBS, durante o processo de diálise acima mencionada. A concentração final da fibroína de seda concentrada foi determinada através da medição do peso seco das soluções de fibroína de seda. A solução de fibroína de seda preparada foi armazenada a 4 °C até à sua utilização. O teor de PBS na solução de fibroína de seda foi testada por análise gravimétrica termal (TGA), e os resultados mostraram que o teor de PBS na solução de fibroína de seda pode ser controlado entre 1,5-2% (PBS/seda, em % de peso). E o pH da solução de fibroína de seda sem o PBS foi na gama de 5,6-6,2. Após a incorporação de PBS na solução de fibroína de seda, o pH da solução pode ser controlado na gama de 7,0-7,4, que é adequado para a incorporação de células ou factores bioactivos.The silk fibroin solution was prepared as described above, but with modifications (Sofia et al, J. Biomed Mater Res A 54: 139-148, 2001, WO Patent 2010/036992, and WO Patent 2003/022909 2003/022909) in order to control the final properties of the silk solution, such as the pH value and ion content. Bombyx Mori silk fibroin was boiled out of the cocoons of a sodium carbonate solution (0.02 M, Sigma, USA) for one hour and then washed thoroughly with distilled water. Purified silk fibroin was dissolved in 9.3 M lithium bromide solution (Sigma, USA) at 70 ° C for 1 hour. Then, the solution was dialyzed with distilled water using a benzoylated dialysis tube (cut molecular weight: 2000, Sigma, USA) for the period of 2 days. Then the aqueous solution of silk fibroin was dialyzed against a dilute saline solution of phosphate buffer (PBS, Sigma, USA), a solution (0.2 wt% in distilled water) for 24 hours. Then, the dialysed solution of silk fibroin was concentrated by dialysis against a 20 wt% (20,000 g / mol, Sigma, USA) polyethylene glycol solution for 9 hours. Finally, the dialysis tube was carefully washed with distilled water and the silk fibroin solution was collected into a vial. The pH value of the concentrated fibroin silk solution can be adjusted using solutions of different concentrations of PBS during the above-mentioned dialysis process. The final concentration of the concentrated silk fibroin was determined by measuring the dry weight of the silk fibroin solutions. The prepared silk fibroin solution was stored at 4Â ° C until use. The PBS content in the silk fibroin solution was tested by thermal gravimetric analysis (TGA), and the results showed that the PBS content in the silk fibroin solution can be controlled between 1.5-2% (PBS / silk, in% by weight). And the pH of the silk fibroin solution without the PBS was in the range of 5.6-6.2. After incorporation of PBS into the silk fibroin solution, the pH of the solution can be controlled in the range of 7.0-7.4, which is suitable for the incorporation of cells or bioactive factors.
Exemplo 2: Formação Hydrogel-Método 1 A fim de produzir hidrogéis de fibroína de seda reticulados por peroxidade, foram preparadas soluções de fibroína de seda com diferentes concentrações (2-30 wt.%) por diluição com uma solução de PBS. A peroxidase de rábano (HRP, 260 unidade/mg, Sigma, EUA) e peróxido de hidrogénio (H2O2, 35Example 2: Hydrogel Formation-Method 1 In order to produce peroxy-crosslinked silk fibroin hydrogels, silk fibroin solutions having different concentrations (2-30 wt.%) Were prepared by diluting with a solution of PBS. Horseradish peroxidase (HRP, 260 unit / mg, Sigma, USA) and hydrogen peroxide (H2 O2, 35
Sigma, EUA), as soluções foram preparadas por dissolução em PBS. Em seguida, as soluções de HRP e H2O2 foram adicionados às soluções de fibroina de seda em diferentes concentrações, variando de 1 a 1000 ug/ml e de 0,5 a 50 mmol/ml, respectivamente. A mistura foi suavemente agitada e em seguida a gelificação foi realizada em banho-maria ou na estufa a differentes temperaturas, variando de 5 a 50 °C. O hidrogel também pode ser processado em diferentes formas, utilizando diferentes moldes e colocando-os num forno à temperatura necessária. Pode ser preparado um disco de hidrogel de fibroina de seda a partir de um molde de 7,5 mm de diâmetro (Figura 2b), utilizando solução de fibroina de seda a 16% em peso com PBS (o teor em PBS na solução de seda foi de 1,7%, e o pH igual a 7,2), juntamente com 0,84 mg/ml de HRP em PBS e 0,18 wt. % de H2O2 em PBS (HRP/seda 0,26h, H202/Silk l,10Vo) . Não só a solução de fibroina de seda com PBS pode ser usada para a preparação de hidrogéis reticulados por peroxidase, como a mesma solução sem PBS também foi capaz de formar hidrogel sob o mesmo método. Por exemplo, o hidrogel de fibroina de seda pode ser preparado num frasco utilizando 16 wt% de solução de fibroina de seda pura, juntamente com 0,84 mg de solução de HRP/ml em PBS e 0,18 wt% de H202 em PBS (HRP/seda 0,26 wtsi, H202/seda 1,10 wth) num banho a 37 °C (Figura 2a) . Nos estudos seguintes, Silk-10, Silk-12, Silk-16 eram correspondentes a hidrogéis de seda preparados com 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt% de solução de fibroina de seda, respectivamente. Além disso, se não mencionado nos exemplos a seguir, as concentrações de H2O2 e HRP foram de 0,84 mg/ml e 0,18 wt%, e a solução de fibroina de seda foi de PBS (PBS teor em solução de seda foi de 1,7%, e o pH era de 7,2. 36Sigma, USA), the solutions were prepared by dissolving in PBS. Then, solutions of HRP and H 2 O 2 were added to solutions of silk fibroin in different concentrations, ranging from 1 to 1000æg / ml and 0.5 to 50 mmol / ml, respectively. The mixture was gently shaken and then gelling was carried out in a water bath or in the oven at different temperatures, ranging from 5 to 50 ° C. The hydrogel can also be processed in different ways using different molds and placing them in a kiln at the required temperature. A silica fibroin hydrogel disk may be prepared from a 7.5 mm diameter die (Figure 2b), using 16% by weight silk fibroin solution with PBS (the PBS content in the silk solution was 1.7%, and the pH was 7.2) along with 0.84 mg / ml HRP in PBS and 0.18 wt. % H 2 O 2 in PBS (HRP / silk 0.26h, H202 / Silk 1,10Vo). Not only the silk fibroin solution with PBS can be used for the preparation of peroxidase-crosslinked hydrogels, as the same solution without PBS was also able to form hydrogel under the same method. For example, the silk fibroin hydrogel can be prepared in a flask using 16 wt% pure silk fibroin solution along with 0.84 mg HRP / ml solution in PBS and 0.18 wt% H202 in PBS (HRP / silk 0.26 wt., H202 / silk 1.10 wt) in a 37 ° C bath (Figure 2a). In the following studies, Silk-10, Silk-12, Silk-16 were matched to silkwelts prepared with 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt% silk fibroin solution, respectively. In addition, if not mentioned in the examples below, the concentrations of H 2 O 2 and HRP were 0.84 mg / ml and 0.18 wt%, and the silk fibroin solution was PBS (PBS content in silk solution was of 1.7%, and the pH was 7.2.
Exemplo 2: Método de Formação Hydrogel- método 2 A fim de produzir hidrogéis de fibroina de seda reticulados por peroxidase, foram preparadas soluções de fibroina de seda de diferentes concentrações (2 a 20 wt%) por diluição da solução de fibroina de seda concentrada com PBS. A solução de peroxidase de rábano (HRP, 260 unidade/mg, Sigma, EUA) foi preparada por dissolução em PBS. O peróxido de cálcio (pureza de 75%, Sigma, EUA) foi dissolvido em 0,1 M de HC1, e em seguida, o valor do pH da solução aumentou para 5,0. As soluções de HRP e de peróxido de cálcio foram adicionadas às soluções de fibroina de seda com diferentes concentrações, variando de 1 a 1000 ug/ml e de 0,5 a 50 mmol/ml, respectivamente. A mistura foi suavemente agitada e em seguida a gelificação foi realizada a diferentes temperaturas, variando entre 5°C a 50°C. O hidrogel pode ser processado em diferentes formas, utilizando moldes variados e colocando-os numa estufa à temperatura necessária. Aqui, o peróxido de cálcio foi utilizado como fonte de peróxido, presumindo-se que 1 mol de peróxido de cálcio dará origem a uma mol de peróxido de hidrogénio no presente estudo. De acordo com os cálculos, a concentração da solução de peróxido de cálcio de 0,51 wt% é igual a 0,18% H202 em peso em solução, neste estudo. Por exemplo, o disco de hidrogel de fibroina de seda pode ser preparado por este método que utiliza a 16 wt% de solução de fibroina de seda, com PBS (teor de PBS em solução de seda foi de 1,7%, e o pH era de 7,2), juntamente com 0,84 mg/ml de solução de HRP em PBS e 0,51 wt. Ca02% em água destilada (HRP/seda em peso 0,2 6Vo, H202/Silk 1,10 wtk) a 37°C (Figura 2c) .Example 2: Hydrogel-Method 2 Formation Method In order to produce peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogels, silk fiber solutions of different concentrations (2 to 20 wt%) were prepared by diluting the concentrated silk fibroin solution with PBS. Horseradish peroxidase solution (HRP, 260 unit / mg, Sigma, USA) was prepared by dissolving in PBS. Calcium peroxide (75% purity, Sigma, USA) was dissolved in 0.1 M HCl, and then the pH of the solution increased to 5.0. HRP and calcium peroxide solutions were added to the silk fibroin solutions at different concentrations, ranging from 1 to 1000æg / ml and 0.5 to 50 mmol / ml, respectively. The mixture was gently stirred and then gelling was carried out at different temperatures, ranging from 5 ° C to 50 ° C. The hydrogel can be processed in different forms using various molds and placed in an oven at the required temperature. Here, calcium peroxide was used as a source of peroxide, assuming that 1 mol of calcium peroxide will give rise to one mole of hydrogen peroxide in the present study. According to the calculations, the concentration of the calcium peroxide solution of 0.51 wt% is equal to 0.18% H2O2 by weight in solution in this study. For example, the silk fibroin hydrogel disk can be prepared by this method using 16 wt% silk fibroin solution with PBS (PBS content in silk solution was 1.7%, and the pH was 7.2) along with 0.84 mg / ml of HRP solution in PBS and 0.51 wt. CaO2% in distilled water (HRP / silica in weight 0.26Vo, H202 / Silk 1.10 wtk) at 37 ° C (Figure 2c).
Exemplo 3: Caracterização de hidrogéis de fibroina de seda reticulados por peroxidase 37Example 3: Characterization of silica fibroin hydrogels crosslinked by peroxidase 37
Análise por Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) A conformação estrutural da solução pura de fibroína de seda, solução de fibroína de seda com PBS, e mistura seda/HRP/H202 antes e após a gelificação foi analisada por FTIR por meio da utilização de reflectância total atenuada (ATR) em amostras molhadas. Como controle foi utilizada água ultrapura. Para a amostra de liquido, foram utilizados 50 ul de amostra para cada ensaio. Após a mistura seda/HRP/H202 formar um gel, foi retirado um pedaço pequeno de hidrogel húmido para o teste. Os espectros de infravermelhos foram registados à temperatura ambiente com uma resolução de 4 cm-1 no intervalo entre 4000-600 cm-1, com 40 leituras (Figura 3). Os espectros de FTIR mostraram que todas as amostras apresentaram o pico principal a cerca de 1650 cm-1, que é o pico caracteristico da conformação helicoidal aleatória. Não houve picos óbvios em torno de 1700 cm-1 e 1620 cm-1, os picos caracteristicos da conformação beta (Seda-II).Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) Structural conformation of the pure silk fibroin solution, silk fibroin solution with PBS, and silk / HRP / H202 mixture before and after gelation was analyzed by FTIR by means of use of attenuated total reflectance (ATR) in wet samples. Ultrapure water was used as control. For the liquid sample, 50 μl of sample was used for each assay. After the silk / HRP / H202 mixture formed a gel, a small piece of moist hydrogel was removed for the test. Infrared spectra were recorded at room temperature with a resolution of 4 cm -1 in the range of 4000-600 cm -1 with 40 readings (Figure 3). FTIR spectra showed that all samples had the main peak at about 1650 cm -1, which is the characteristic peak of the random helical conformation. There were no obvious peaks around 1700 cm -1 and 1620 cm -1, the characteristic peaks of beta conformation (Silk-II).
Estes dados indicaram que o hidrogel de fibroína de seda preparado por reticulação mediada pela peroxidase apresentava conformação amorfa (espiral aleatória), tal como a conformação apresentada pela solução aquosa de fibroína de seda (Figura 3a). A solução de fibroína de seda com PBS também manteve conformação amorfa. A maior parte dos hidrogéis de fibroína de seda previamente relatados na literatura possuem conformação beta. O hidrogéis estáveis de fibroína de seda com conformação amorfa raramente foram relatados. Aqui, apresentamos hidrogéis estáveis fibroína 38 de seda possuindo maioritáriamente conformação amorfa (aleatória). A absorvância óptica a 550 nm A absorvância óptica a 550 nm foi utilizada primáriamente para avaliar a transição de conformação da solução de fibroina de seda ou do hidrogel por Kaplan et al. Quando a solução de fibroina de seda ou de hidrogel se encontra no estado amorfo, a absorvância a 550 nm é muito baixa. Se a solução de fibroina de seda ou de hidrogel tem conformação beta, a absorvância aumenta. Para este teste, 50 ul de solução foi utilizada. A solução de seda (com PBS) e mistura de seda/HRP/H202 foram colocadas numa placa de 96 poços, e a absorvância a 550 nm foi registada por um leitor de microplacas. Seis poços foram lidas para cada grupo de amostras. Após a mistura de seda/HRP/H202 formar um gel, o mesmo poço foi lido novamente. A Figura 4 mostrou a sua absorvância a 550 nm, e verificou-se que não houve diferenças na absorvância da mistura seda/HRP/H202 antes e após a gelificação. Também não houve diferença significativa na absorvância entre a solução de seda e o hidrogel de seda.These data indicated that the silk fibroin hydrogel prepared by peroxidase-mediated cross-linking exhibited amorphous (random spiral) conformation, such as the conformation presented by the aqueous solution of silk fibroin (Figure 3a). The silk fibroin solution with PBS also maintained amorphous conformation. Most of the silk fibroin hydrogels previously reported in the literature have beta conformation. Stable hydrogels of amorphous amorphous silk fibroin have rarely been reported. Here, we present stable, silk fibroin 38 hydrogels having mostly amorphous (random) conformation. Optical absorbance at 550 nm Optical absorbance at 550 nm was used primarily to evaluate the conformation transition of the silk fibroin solution or the hydrogel by Kaplan et al. When the silk or hydrogel fibroin solution is in the amorphous state, the absorbance at 550 nm is very low. If the silk or hydrogel fibroin solution has beta conformation, the absorbance increases. For this test, 50 ul of solution was used. The silk (with PBS) and silk / HRP / H202 solution were placed in a 96-well plate, and the absorbance at 550 nm was recorded by a microplate reader. Six wells were read for each group of samples. After the silk / HRP / H202 mixture was formed into a gel, the same well was read again. Figure 4 showed its absorbance at 550 nm, and it was found that there were no differences in absorbance of the silk / HRP / H202 mixture before and after gelation. There was also no significant difference in absorbance between the silk solution and the silk hydrogel.
Combinando os dados obtidos a partir da absorvância óptica baixa (Figura 4) , o aparecimento transparência do hidrogel de seda (Figura 2), e os espectros FTIR (Figura 3), conclui-se que o hidrogel de fibroina de seda preparado por reticulação mediada por peroxidase é principalmente de conformação amorfa. Esta propriedade torna-o diferente dos hidrogéis de seda anteriormente relatados, a maioria deles apresentando conformação beta e aparência turva e opaca. As propriedades de transparência do hidrogel de fibroina de 39 seda preparado aqui extende a possibilidade da sua aplicação em oftalmologia ou dispositivos ópticos.Combining the data obtained from the low optical absorbance (Figure 4), the appearance of transparency of the silk hydrogel (Figure 2), and the FTIR spectra (Figure 3), it was concluded that the silk fibroin hydrogel prepared by mediated cross-linking by peroxidase is mainly of amorphous conformation. This property makes it different from the previously reported silk hydrogels, most of them exhibiting beta conformation and cloudy and opaque appearance. The transparency properties of the silk fibroin hydrogel prepared herein extend the possibility of its application in ophthalmology or optical devices.
Microscopia eletrónica de varrimento (MEV) A micromorfologia do hidrogel liofilizado de fibroína de seda reticulada por peroxidase foi observada por SEM. 0 hidrogel de seda foi congelado a -80°C após a gelificação, e depois liofilizou-se. A imagem transversal foi observada sob MEV após a superfície ser revestida com ouro. Por exemplo, a Figura 5 mostra a micromorfologia do hidrogel de seda preparado com 16 wt% de solução de seda, razão HRP/seda de 0,2 6%; e razão H202/seda de 1,10¾. A imagem de SEM mostra que o hidrogel de fibroína de seda apresenta estrutura porosa e poros interligados sendo o tamanho dos poros de 50 a 100 um. A estrutura porosa do hidrogel de seda pode facilitar o transporte de nutrientes para posteriores estudos de incorporação de células, ou permitir a migração de células nos hidrogéis.Scanning Electron Microscopy (SEM) The micromorphology of the lyophilized hydrogel of peroxidase-crosslinked silk fibroin was observed by SEM. The silk hydrogel was frozen at -80 ° C after gelation, and then lyophilized. The transverse image was observed under SEM after the surface was coated with gold. For example, Figure 5 shows the micromorphology of the silk hydrogel prepared with 16 wt% silk solution, HRP / silk ratio of 0.26%; and H202 / silk ratio of 1.10¾. The SEM image shows that the silk fibroin hydrogel exhibits porous structure and interconnected pores being the pore size of 50 to 100 Âμm. The porous structure of the silk hydrogel may facilitate transport of nutrients for further cell incorporation studies, or allow the migration of cells into the hydrogels.
Tempo de gelificação O tempo de gelificação do hidrogel de seda foi testado por um método de inclinação do frasco. A ausência de fluxo, depois de 1 minuto após a inversão do frasco é indicativa que occoreu a gelificação. Cada condição foi testada em triplicado. Durante o ensaio, o frasco foi imerso num banho de água a 37°C e a influência da concentração de seda, HRP e H202 foram investigados. A Figura 6 apresenta os perfis de tempo de gelificação dos hidrogéis de fibroína de seda. Quando estudada a influência da HRP, a razão H202/seda foi 40 fixada em 1,10 wtú. Quando estudada a influência do Η2Ο2Λ a razão HRP/seda foi fixada em 0,26 wtl». Verificou-se que o aumento da concentração de fibroína de seda e conteúdo HRP iria encurtar o tempo de gelificação, equanto que com o aumento do teor de H2O2 o tempo de gelificação aumenta. Por exemplo, no caso de uma solução de seda 16 wt.%, quando o teor de HRP aumenta de 0,13 wtV» para 0,52 wtV», o tempo de gelificação do hidrogel fibroína de seda diminuiu de ~35 minutos para menos de 4 minutos. Constatou-se também que a gelificação de seda irá ocorrer mais rapidamente a temperaturas fisiológicos, em comparação com temperaturas abaixo de 37°C. Os dados aqui apresentados são apenas exemplos, sendo que o intervalo de tempo de gelificação não se limita aos dados aqui apresentados.Gelling Time The gelling time of the silk hydrogel was tested by a vial tilt method. The absence of flow, after 1 minute after flask inversion is indicative that gelation occurred. Each condition was tested in triplicate. During the test, the flask was immersed in a 37 ° C water bath and the influence of the concentration of silk, HRP and H202 were investigated. Figure 6 shows the gelation time profiles of the silk fibroin hydrogels. When the influence of HRP was studied, the H202 / silk ratio was set at 1.10 wt. When studied, the influence of Η2Ο2Λ on the HRP / silk ratio was set at 0.26 wt »¹. It was found that increasing the concentration of silk fibroin and HRP content would shorten the gelation time, as with increasing the H2O2 content the gelation time increases. For example, in the case of a 16 wt% silk solution, when the HRP content increases from 0.13 wt% to 0.52 wt%, the gelation time of the silk fibroin hydrogel decreased from ~ 35 minutes to less of 4 minutes. It has also been found that silk gelling will occur more rapidly at physiological temperatures, as compared to temperatures below 37 ° C. The data presented here are examples only, the gelling time interval being not limited to the data presented herein.
Estes dados indicaram que um hidrogel de seda formado rapidamente (menos de 4 minutos) pode ser preparado pelo método desenvolvido no presente documento. O tempo de gelificação aqui apresentado foi muito mais curto do que os previamente relatados para hidrogeis de seda preparados por outros métodos, tais como agitação, vortex e ultrasonicação. É de notar que no método aqui descrito a gelificação pode ocorrer em condições fisiológicas, o que permite a incorporação in-situ de células ou agentes bioactivos.These data indicated that a rapidly formed silk hydrogel (less than 4 minutes) can be prepared by the method developed herein. The gelation time presented here was much shorter than previously reported for silkworms prepared by other methods, such as stirring, vortexing and ultrasonication. It is to be noted that in the method described herein the gelation may occur under physiological conditions, which allows the in-situ incorporation of cells or bioactive agents.
Propriedades Mecânicas O módulo de energia armazenada dos hidrogéis de fibroína de seda reticulados por peroxidase foi avaliado por reómetria num modelo rotativo, a 37°C. A solução de fibroína de seda foi misturada com HPR e H2O2, e em seguida, 1 ml de mistura foi imediatamente transferida para a câmara para realizar o 41 teste. Um cilindro com uma ponta cónica foi imerso na solução de mistura, e uma gota de óleo foi colocada na parte superior da solução de seda para evitar a evaporação durante 0 teste. Para a medição do módulo de energia armazenada, foram usados 0,5 Hz de frequência e 0,1% de tensão. Os pontos de dados foram recolhidos a cada 30 segundos, até que o módulo atingiu um patamar durante 5 minutos. 0 módulo de energia armazenada foi obtido calculando a média dos pontos dos dados na zona do "plateau". Foram utilizados triplicados para cada formulação. Após o módulo de atingido o patamar por 5 minutos, um varrimento de frequência foi realizada de 0,1 a 10 Frequência Hz com 0,1% de deformação constante durante 10 minutos. Quando o varrimento de frequência terminou, um varrimento de deformação também foi realizado de 0,1% a 100% de deformação com uma frequência constante de 1 Hz durante 10 minutos. A Figura 7 apresenta a influência da concentração de seda, e conteúdo de HRP e H2O2 no módulo de energia armazenada de hidrogéis de fibroina de seda. Verificou-se que o módulo aumentou com o aumento da concentração de seda e conteúdo de H202. O conteúdo de HRP teve apenas uma influência menor no módulo. Quando o conteúdo de H202/silk foi de 1,45%, em peso, o hidrogel seda-16 atingiu um módulo de energia armazenada em torno de 5 kPa. Ao controlar o teor de H2O2, as propriedades mecânicas do hidrogel de seda podem ser ajustadas numa ampla gama. A Figura 8 apresenta a influência da HRP sobre os perfis de módulo de energia armazenada do hidrogel de fibroina de seda reticulado por peroxidase, medida por um reómetro num modelo de rotação a 37°C. Seda-10, Seda-12, Seda-16 42 correspondem a hidrogéis de seda preparados com 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt% de solução de fibroína de seda, respectivamente. A razão H202/seda foi fixada em 1,1¾. peso nesta figura. O resultado mostrou que o hidrogel de fibroína de seda preparado aqui pode manter o módulo de energia armazenada sob pressão de 40% (figura 8a, b, c) , e menos de 5 Hz de frequência (Figura 8d, e, f). A Figura 9 representa a influência de H202 nos perfis do módulo de energia armazenada do hidrogel de fibroína de seda reticulado por peroxidase, medida por um reómetro num modelo de rotação a 37°C. Silk-10, Silk-12, Silk-16 eram correspondentes a hidrogéis de seda preparadas com 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt% de solução de fibroína de seda, respectivamente. A razão HRP/seda foi fixada em 0,2 6 wtk» para todas as formulações. O resultado mostrou que os hidrogéis de fibroína de seda preparados aqui podem manter os seus módulos de energia armazenada sob pressão de 40% (figura 9a, b, c) , e menos de 5 Hz de frequência (Figura 9d, e, f) .Mechanical properties The stored energy modulus of the peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogels was evaluated by reometer in a rotary model at 37øC. The silk fibroin solution was mixed with HPR and H2O2, and then 1 ml of the mixture was immediately transferred to the chamber to perform the test. A cylinder with a conical tip was immersed in the blending solution, and a drop of oil was placed on top of the silk solution to prevent evaporation during the test. For the measurement of the stored energy module, 0.5 Hz frequency and 0.1% voltage were used. The data points were collected every 30 seconds, until the module reached a plateau for 5 minutes. The stored energy module was obtained by averaging the data points in the " plateau " zone. Triplicates were used for each formulation. After the module reached the plateau for 5 minutes, a frequency scan was performed from 0.1 to 10 Hz frequency with 0.1% constant strain for 10 minutes. When the frequency scan ended, a strain scan was also performed from 0.1% to 100% deformation at a constant frequency of 1 Hz for 10 minutes. Figure 7 shows the influence of silk concentration, and HRP and H2O2 content on the stored energy module of silk fibroin hydrogels. The modulus was found to increase with increasing silk concentration and H202 content. The HRP content had only a minor influence on the module. When the H202 / silk content was 1.45% by weight, the silk-16 hydrogel reached a stored energy modulus of about 5 kPa. By controlling the H2O2 content, the mechanical properties of the silk hydrogel can be adjusted over a wide range. Figure 8 shows the influence of HRP on the stored energy module profiles of peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogel, measured by a rheometer in a rotation model at 37øC. Silk-10, Silk-12, Silk-16 42 correspond to silk hydrogels prepared with 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt% silk fibroin solution, respectively. The H202 / silk ratio was set at 1.1. weight in this figure. The result showed that the silk fibroin hydrogel prepared herein can keep the energy module stored under pressure of 40% (Figure 8a, b, c), and less than 5 Hz of frequency (Figure 8d, e, f). Figure 9 depicts the influence of H202 on the profiles of the stored energy module of the peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogel, measured by a rheometer in a rotation model at 37øC. Silk-10, Silk-12, Silk-16 were matched to prepared silk hydrogels of 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt% silk fibroin solution, respectively. The HRP / silk ratio was set at 0.26 wt% for all formulations. The result showed that the silk fibroin hydrogels prepared here can keep their energy modules stored under pressure of 40% (Figure 9a, b, c), and less than 5 Hz of frequency (Figure 9d, e, f).
Estes resultados indicaram que as propriedades mecânicas dos hidrogéis de fibroína de seda reticulados por peroxidase podem ser ajustadas para uma ampla gama, por meio da variação dos diferentes parâmetros de reacção e proporções dos reagentes. As suas propriedades mecânicas foram bastante estáveis para uma gama variada de frequência e deformação, que é uma das suas vantagens a ser utilizada para a regeneração de tecidos in vivo.These results indicate that the mechanical properties of the peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogels can be adjusted over a wide range by varying the different reaction parameters and proportions of the reactants. Its mechanical properties have been quite stable for a varied range of frequency and deformation, which is one of its advantages to be used for tissue regeneration in vivo.
Grau de expansãoDegree of expansion
O grau de expansão destes hidrogéis em água destilada e PBS 43 foram caracterizados. Foi usada Uma mistura de seda/HRP/H202 (volume de 300 uL) para preparar hidrogéis num molde de 7,5 mm de diâmetro. Após a preparação dos hidrogéis reticulados por peroxidase, estes foram imediatamente colocados em água destilada ou PBS, num banho a 37°C, durante 12 horas, permitindo-lhes alcançar o equilíbrio. Em seguida, os hidrogéis foram removidos do líquido, o líquido foi absorvido pela superfície de um papel de filtro. O peso húmido foi registado numa balança (Mw). Em seguida, os hidrogéis foram secos numa estufa a 90 °C durante 2 dias. O peso seco foi registado (Md) . O grau de expansão foi calculada como se segue:The degree of expansion of these hydrogels in distilled water and PBS 43 were characterized. A silk / HRP / H202 (300æl volume) was used to prepare hydrogels in a 7.5 mm diameter die. After the peroxidase-crosslinked hydrogels were prepared, they were immediately placed in distilled water or PBS in a 37 ° C bath for 12 hours, allowing them to equilibrate. Then, the hydrogels were removed from the liquid, the liquid was absorbed by the surface of a filter paper. The wet weight was recorded on a scale (Mw). The hydrogels were then dried in an oven at 90 ° C for 2 days. Dry weight was recorded (Md). The degree of expansion was calculated as follows:
Grau de expansão = (Mw-Md) /Md * 100% A Figura 10 representa o grau de expansão do hidrogel de fibroína de seda reticulado por peroxidase em água destilada (a) e PBS (b). Estes resultados mostraram que a taxa de expansão aumentada com a diminuição da concentração de seda e aumentando o teor de H202. O grau de expansão foi maior em água destilada em comparação com o PBS. As diferenças na taxa de expansão observadas, induzidas pela concentração de fibroína de seda e conteúdo de H202 estão relacionadas com as propriedades mecânicas. Concentrações superiores de de solução de seda e de conteúdo de H202 induziram um aumento do módulo. Desta forma estes hidrogéis são mais estáveis e não absorvem tanto líquido. A concentração de iões também afecta a taxa de expansão. Quando o hidrogel de fibroína de seda foi imerso em água destilada (que possui uma força iónica muito baixa), as moléculas de seda vão distender-se livremente. Isto explica as diferenças nas taxas de expansão do hidrogel de seda observadas quando imerso em PBS e água destilada. 44 A degradação enzimática 0 perfil de degradação por acção enzimática dos hidrogéis de fibroina de seda foi avaliado. Diferentes formulações de Seda/HRP/H202 (V=500 ul) foram produzidas para preparar os vários hidrogéis, e recorrendo a um molde de 7,5 mm de diâmetro. Diferentes soluções de fibroina de seda com concentração de 10 wt%, 12 wt%, e 16 wt% foram usadas. Por sua vez, usou-se HRP/seda foi de 0,26 wtVo, H202/seda foi de 1,1 wtVo ou 1,45 wth. Em cada ensaio, 500 mg do hidrogel de fibroina da seda foi imerso em 5 ml de PBS contendo 0,025 U Protease XIV obitdo da Streptomyces griseus (0.005 U/ml). A massa do hidrogel no estado hidratado foi registrado como Wi. No final de cada ponto de tempo, os hidrogéis foram removidos da solução e a sua massa (Wt) determinada, após absorção do excesso de água na superfície através usando papel de filtro. E então a relação de perda de massa foi calculada da seguinte forma:Expansion Degree = (Mw-Md) / Md * 100% Figure 10 represents the degree of expansion of peroxidase-crosslinked silk fibroin hydrogel in distilled water (a) and PBS (b). These results showed that the rate of expansion increased with the decrease of the silk concentration and increasing the H2O2 content. The degree of expansion was higher in distilled water compared to PBS. The differences in the rate of expansion observed, induced by the concentration of silk fibroin and H202 content, are related to the mechanical properties. High concentrations of silk solution and H202 content induced a modulus increase. In this way these hydrogels are more stable and do not absorb as much liquid. The ion concentration also affects the rate of expansion. When the silk fibroin hydrogel was immersed in distilled water (which has a very low ionic strength), the silk molecules will spread freely. This explains the differences in the rates of expansion of the silk hydrogel observed when immersed in PBS and distilled water. Enzymatic degradation The degradation profile by enzymatic action of the silk fibroin hydrogels was evaluated. Different Silk / HRP / H202 (V = 500 μl) formulations were produced to prepare the various hydrogels, using a 7.5 mm diameter die. Different solutions of silk fibroin with concentration of 10 wt%, 12 wt%, and 16 wt% were used. In turn, HRP / silk was 0.26 wtVo, H202 / silk was 1.1 wtVo or 1.45 wt. In each assay, 500 mg of the silk fibroin hydrogel was immersed in 5 ml of PBS containing 0.025 U Protease XIV obtached from Streptomyces griseus (0.005 U / ml). The hydrogel mass in the hydrated state was recorded as Wi. At the end of each time point, the hydrogels were removed from the solution and its mass (Wt) determined, after absorption of excess water on the surface through filter paper. And then the mass loss ratio was calculated as follows:
Relação de perda de massa (%) = (Wi-Wt) / Wi * 100%Mass loss ratio (%) = (Wi-Wt) / Wi * 100%
Os resultados revelaram que os hidrogéis de fibroina de seda apresentação um perfil de degradação no período compreendido entre as 6 e 8 horas (Figura 11). Os hidrogéis que apresentam as proporiedades mecânicas superiores apresentam um perfil de perda de massa mais baixo quando comparado com os hidrogéis cujas propriedades mecânicas são inferiores. O perfil de degradação obsrvado é completamente diferente dos anteriormente reportados. Este estudo mostra que os hidrogéis de fibroina de seda reticulados por acção da HRP são amorfos, contrariando a conformação folha-beta ou outro estado cristalino tal como reportado em estudos 45 anteriores. 0 perfil de degradação dos hidrogéis de fibroina da seda reticulados por acção HRP possibilita um conjunto de novas aplicações na medicina regenerativa.The results revealed that the silk fibroin hydrogels presented a degradation profile in the period between 6 and 8 hours (Figure 11). Hydrogels with the highest mechanical proportions have a lower mass loss profile when compared to hydrogels whose mechanical properties are lower. The degradation profile is completely different from those previously reported. This study shows that HRP-crosslinked silk fibroin hydrogels are amorphous, counter to sheet-beta conformation or other crystalline state as reported in previous studies. The degradation profile of the HRP-mediated silk fibroin hydrogels provides a set of new applications in regenerative medicine.
Propriedade de Memória de Forma A propriedade de memória de forma dos hidrogéis de fibroina de seda reticulados por acção da HRP foi avaliada in vitro. Os hidrogéis foram produzidos, imersos consecutivamente em água destilada e PBS, e o diâmetro determinado a cada período de 12 horas de imersão (Figura 12) . A concentração da fibroina de seda usada é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,26 wth, H202/seda é de 1,1 wth. O hidrogel de fibroina de seda foi preparado pela primeira vez num molde (Figura 12a), e, em seguida, o hidrogel foi removido do molde (Figura 12b). A Figura 12c mostra o hidrogel de fibroina de seda (hidratado) após imersão em água destilada durante 12 horas. Verificou-se que o diâmetro do hidrogel de seda foi recuperado, em certa medida, após a imersão em PBS durante mais 12 horas (Figura 12d) . Os hidrogéis fibroina de seda foram produzidos a partir de diferentes concentrações de fibroina de seda (e.g., 10%, 12% e 16%), tal como reportado na Figura 13. Verificou-se que todos os hidrogéis mantiveram o seu diâmetro em PBS, em diferentes períodos de imersão. No entanto, o diâmetro dos hidrogéis em PBS foi um pouco superiore ao seu diâmetro original (depois removido do molde) . E o diâmetro em água destilada (a imersão segundo) foi recuperado rapidamente após a primeira imersão em água destilada.Shape Memory Property The shape memory property of the HRP crosslinked silkworm hydrogels was evaluated in vitro. The hydrogels were produced, immersed consecutively in distilled water and PBS, and the diameter determined at each 12 hour immersion period (Figure 12). The concentration of the silk fibroin used is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt, H202 / silk is 1.1 wt. The silk fibroin hydrogel was first prepared in a mold (Figure 12a), and then the hydrogel was removed from the mold (Figure 12b). Figure 12c shows the silk fibroin hydrogel (hydrated) after immersion in distilled water for 12 hours. It was found that the diameter of the silk hydrogel was recovered to some extent after immersion in PBS for another 12 hours (Figure 12d). Silk fibroin hydrogels were produced from different concentrations of silk fibroin (eg, 10%, 12% and 16%) as reported in Figure 13. All hydrogels were found to have maintained their diameter in PBS, in different periods of immersion. However, the diameter of the hydrogels in PBS was slightly higher than its original diameter (then removed from the mold). And the diameter in distilled water (the second immersion) was recovered quickly after the first immersion in distilled water.
Estes resultados indicaram que os hidrogéis de fibroina de seda reticulados por acção da HRP respondem a estímulos físico-químicos tais como força iónica reactivo e pressão. 46These results indicated that the HRP crosslinked silk fibroin hydrogels respond to physico-chemical stimuli such as reactive ionic strength and pressure. 46
Esta propriedade nunca havia sido descrita em estudos anteriores envolvendo hidrogéis de fibroina de seda. Esta propriedade está associada à sua natureza amorfa. Estes hidrogéis podem funcionar como uma plataforma aquosa estável e adequada para estudar o efeito de diferentes iões e solventes na conformação da fibroina de seda. Estas propriedades abrem novas possibilidades para a aplicação dos hidrogéis de fibroina da seda reticulados por acção da HRP como um sistema de libertação controlada de fármacos (DDS), o qual responde a pequenas variações das condições ambientais.This property has never been described in previous studies involving silk fibroin hydrogels. This property is associated with its amorphous nature. These hydrogels can function as a stable aqueous platform and suitable for studying the effect of different ions and solvents on the conformation of silk fibroin. These properties open up new possibilities for the application of the HRP-crosslinked silk fibroin hydrogels as a controlled drug delivery system (DDS), which responds to slight variations in environmental conditions.
Hidrogel de Fibroina da Seda (Multicamadas) queSilk Fibroin Hydrogel (Multi-Layered)
Possibilitam o Controle Espacial da sua ConformaçãoEnable the Spatial Control of their Conformation
Diferentes camadas dos hidrogéis de fribroina da seda reticulados por acção da HRP foram desenvolvidas através de um processo de imersão em metanol durante diferentes períodos de tempo. A Figura 14 mostra as imagens do de fribroina da seda reticulados por acção da HRP, antes de (a) e após (b) imersão em metanol pelo período de 5 minutos. A concentração de fibroina de seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,2 6 wth, e H202/seda é dee 1,1 wtVo. Verificou-se que o hidrogel de seda tornou-se opaco após imersão em metanol durante alguns minutos. Verificou-se também que o hidrogéis imersos em metanol apresentam uma estrutura em camadas, sendo que a camada externa é mais mostra as imagens transversais do hidrogel de fribroina da seda reticulados por acção da HRP após imersão em metanol durante compreendido entre 0 e 10 minutos. A concentração de fibroina de seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,26 wt oó , e H202/seda é de 1,1 wtVo. Estes resultados mostram que a espessura da camada exterior aumenta de espessura com o 47 aumento do tempo de imersão em metanol. A Figura 16 mostra os resultados do efeito do tempo de imersão dos hidrogéis em metanol na espessura da camada exterior (opaca) . A concentração de fibroina de seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,2 6 wtsi, e H202/seda é de 1,1 wtVo ou 1,45 wtsi. Este estudo mostrou que os hidrogéis apresentando propriedades mecânicas mais elevadas (H202/seda a 1,45 wt%) apresentaram uma camada externa menos espessa quando comparados com os hidrogéis apresentando propriedades mecânicas inferiores (H202/seda a 1,10 wt%) . E a espessura das camadas pode ser facilmente controlada, possuindo uma espessura compreendida entre 200 e 1000 um. A camada exterior (opaca) apresenta uma rigidez superior à camada interna (transparente). A conformação das diferentes camadas dos hidrogéis foi investigada recorrendo à técnica de infravermelho com refletância total atenuada (FTIR-ATR), em estado hidratado. Para este ensaio, a concentração de fibroina de seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,2 6 wtVo, e H202/seda é de 1,1 wtVo. Após produção, o hidrogél foi imerso em metanol durante 5 minutos e, em seguida, lavado com água destilada. As diferentes camadas do hidrogél foram depois analizadas por FTIR-ATR. Os espectros de infravermelhos foram registados à temperatura ambiente com uma resolução de 4 cm-1 no intervalo de 4000-600 cm-1 (com 40 análises). A Figura 17 mostra os espectros de FTIR das diferentes camadas do hidrogél de seda desenvolvido. Verificou-se que a camada exterior (opaca) apresentou pico principal em volta de 1620 cm-1, e a camada interna (transparente) apresenta um pico principal a cerca de 1650 cm-1, confirmando que a conformação da parte transparente é essencialmente amorfa. Adicionalmete, verificou-se que a camada transparente do 48 hidrogel apresenta um pequeno pico a 1620 cm-1, o que é indicativo que o hidroqel apresenta alquma conformação em folha beta na camada interna, mas não dominante. Estes resultados corroboram que as conformações da fibroina de seda na camada exterior e interior são diferentes, loqo que é possivel controlar a conformação espacial dos hidrogéis de seda usando o método aqui apresentado, i.e. imersão em metanol. Outros solventes orgânicos ou soluções salinas aquosas podem também ser usados para produzir multicamadas com conformações e propriedades diferentes. O perfil de degradação das diferentes camadas dos hidrogéis de fibroina da seda foi determinado, in vitro. Para este ensaio, a concentração de fibroina de seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,2 6 wtVo, e H202/seda é de 1,1 wtV». Os hidrogéis de fibroina da seda foram imersos em metanol durante 3-10 minutos. Para cada teste, a cerca de 100 mg camada externa (opaca) do hidrogel de fibroina da seda foi imerso em 5 ml de PBS contendo 1 U Protease XIV obtido da Streptomyces griseus (0,2 U/ml) . E cerca de 300 mg de camada interna do hidrogel de fibroina da seda (amostra obtida do hidrogel imerso em metanol durante 5 minutos), foi imerso em 5 ml de PBS contendo 0,025 U Protease XIV obtido da Streptomyces griseus (0.005 U/ml). A massa inicial do hidrogel hidratado foi registrado como Wi. No final de cada tempo de degradação, os hidrogéis foram removidos da solução. A massa do hidrogel (Wt) foi registrado após absorção da água em excesso usando papel de filtro. E então a relação de perda de massa foi calculada da seguinte forma:Different layers of HRP-crosslinked silk fribroin hydrogels were developed by immersion in methanol for different periods of time. Figure 14 shows HRP crosslinked silk fribroin images prior to (a) and after (b) immersion in methanol over the 5 minute period. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt, and H202 / silk is dee 1.1 wtVo. The silica hydrogel was found to have become opaque after immersion in methanol for a few minutes. It has also been found that the methanol-immersed hydrogels have a layered structure, the outer layer being further shown cross-sectional views of HRP-crosslinked silk fribroin hydrogels after immersion in methanol for from 0 to 10 minutes. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt%, and H202 / silk is 1.1 wtVo. These results show that the thickness of the outer layer increases in thickness with increasing immersion time in methanol. Figure 16 shows the results of the immersion time effect of the hydrogels in methanol on the thickness of the outer (opaque) layer. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt%, and H202 / silk is 1.1 wtVo or 1.45 wt. This study showed that hydrogels presenting higher mechanical properties (H202 / silk at 1.45 wt%) presented a less thick outer layer when compared with hydrogels presenting lower mechanical properties (H202 / silk at 1.10 wt%). And the thickness of the layers can be easily controlled, having a thickness of between 200 and 1000 Âμm. The outer layer (opaque) has a stiffness superior to the inner layer (transparent). The conformation of the different layers of the hydrogels was investigated using the infrared technique with attenuated total reflectance (FTIR-ATR) in a hydrated state. For this assay, the concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wtVo, and H202 / silk is 1.1 wtVo. After production, the hydrogel was immersed in methanol for 5 minutes and then washed with distilled water. The different layers of the hydrogel were then analyzed by FTIR-ATR. Infrared spectra were recorded at room temperature with a resolution of 4 cm -1 in the range of 4000-600 cm -1 (with 40 analyzes). Figure 17 shows the FTIR spectra of the different layers of the developed silk hydrogel. The outer (opaque) layer was found to have a main peak around 1620 cm -1, and the inner (clear) layer exhibits a major peak at about 1650 cm -1, confirming that the conformation of the transparent part is essentially amorphous . Additionally, the transparent hydrogel layer has been found to exhibit a small peak at 1620 cm -1, which is indicative that the hydroxyl exhibits a beta sheet conformation in the inner but non-dominant layer. These results corroborate that the conformations of the silk fibroin in the outer and inner layers are different, so that it is possible to control the spatial conformation of the silk hydrogels using the method presented herein, i.e. immersion in methanol. Other organic solvents or aqueous salt solutions may also be used to produce multilayers with different conformations and properties. The degradation profile of the different layers of the silk fibroin hydrogels was determined, in vitro. For this assay, the concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.2 wt%, and H202 / silk is 1.1 wt%. The silk fibroin hydrogels were immersed in methanol for 3-10 minutes. For each test, about 100 mg (opaque) outer layer of the silk fibroin hydrogel was immersed in 5 ml of PBS containing 1 U Protease XIV obtained from Streptomyces griseus (0.2 U / ml). And about 300 mg of inner layer of the silk fibroin hydrogel (sample obtained from the hydrogel immersed in methanol for 5 minutes) was immersed in 5 ml of PBS containing 0.025 U Protease XIV obtained from Streptomyces griseus (0.005 U / ml). The initial mass of the hydrated hydrogel was recorded as Wi. At the end of each degradation time, the hydrogels were removed from the solution. The hydrogel mass (Wt) was recorded after absorption of excess water using filter paper. And then the mass loss ratio was calculated as follows:
Relação de perda de massa (%) = (Wi-Wt) / Wi * 100% 49 A Figura 18 apresenta o perfil de degradação enzimática da camada externa do hidrogel de fibroina de seda reticulado por acção da HRP, após imersão em metanol durante diferentes períodos de tempo. Os resultados mostraram que o a camada externa do hidrogel de fibroina de seda é mais resistente à degradação enzimática. A camada imersa em metanol durante 3 minutos apresenta uma perda de massa de 17%, após 4 horas de imersão na solução de degradação. A camada de fibroina de seda imersa em metanol durante 5 minutos apresenta uma perda de massa de 10%, e a camada imersa durante 10 minutos apresenta uma perda de massa de 2%. Estes resultados indicaram que a camada externa (exposta ao metanol) da fibroina de seda está no estado cristalino (folha beta), e a aumentando o período de imersão em metanol é possível aumentar a cristalinidade da fibroina da seda. A Figura 19 mostra o perfil de degradação enzimática da camada interior (transparente) do hidrogel de fibroina da seda reticulado por acção da HRP, após imersão em metanol durante 5 minutos. Verificou-se que a perda de massa da fibroina de seda é de cerca de 80%, após 6 horas em solução de degadação, sendo que a concentração da enzima utilizada na solução de degradação é de 40 vezes inferior à usada nos ensaios de degradação realizados com a camada externa do hidrogel de fibroina da seda. Estes resultados corroboram o facto de a camada interna e externa apresentarem diferentes conformações. A camada interna apresenta uma conformação essencialmente amorfa (Figura 11). Combinando os resultados na Figura 18 e Figura 19, estes resultados indicaram que os é possível controlar a conformação de diferentes camadas dos hidrogéis de fibroina da seda. 50 O desenvolvimento de hidrogéis de fibroína da seda com diferentes camadas apresentando diferentes conformações foram aqui primeiramente descritos. Esta propriedade única pode ser útil como uma nova plataforma para a libertação controlada de fármaco ou moléculas bioactivas, materiais de preenchimento, ou materiais de multicamadas para encontrarem aplicações na electrónica ou optoelectrónica.Figure 18 shows the enzymatic degradation profile of the outer layer of the HRP crosslinked silk fibroin hydrogel after immersion in methanol for different periods of time (%) (Wi-Wt) / Wi * 100%. periods of time. The results showed that the outer layer of the silk fibroin hydrogel is more resistant to enzymatic degradation. The layer immersed in methanol for 3 minutes shows a mass loss of 17% after 4 hours of immersion in the degradation solution. The silk fibroin layer immersed in methanol for 5 minutes has a mass loss of 10%, and the layer immersed for 10 minutes has a mass loss of 2%. These results indicate that the silk-exposed (methanol) outer layer of silk fibroin is in the crystalline state (beta sheet), and by increasing the immersion period in methanol it is possible to increase the crystallinity of silk fibroin. Figure 19 shows the enzymatic degradation profile of the inner (transparent) layer of HRP-crosslinked silk fibroin hydrogel after immersion in methanol for 5 minutes. It has been found that the loss of mass of the silk fibroin is about 80% after 6 hours in degassing solution, and the concentration of the enzyme used in the degradation solution is 40 times lower than that used in the degradation tests performed with the outer layer of the silk fibroin hydrogel. These results corroborate the fact that the inner and outer layers have different conformations. The inner layer exhibits essentially amorphous conformation (Figure 11). Combining the results in Figure 18 and Figure 19, these results indicated that it is possible to control the conformation of different layers of the silk fibroin hydrogels. The development of silk fibroin hydrogels with different layers exhibiting different conformations were first described herein. This unique property may be useful as a new platform for the controlled release of bioactive drug or molecules, fillers, or multilayer materials to find applications in electronics or optoelectronics.
Exemplo 4; Avaliação da in vitro da citotoxicidade de hidrogéis de fibroína de seda reticulados por acçâo da HRP A citotoxicidade do hidrogel de fibroína de seda foi avaliada recorrendo ao encapsulamento e cultura de células ATDC-5 (linha celular condrogénica) no hidrogel (contacto directo). A viabilidade celular foi avaliada através do ensaio de MTS e usando o reagente (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5(3-carboximetoxifenil)-2(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio). Este que é um método padrão para a avaliação da citotoxicidade, in vitro. Os hidrogéis de fibroína de seda foram preparados a partir de soluções a 16 wt%, HRP/seda a 0,26 wth, e H202/seda a 1,10 wtVo ou 1,45 wth. As células ATDC-5 foram cultivadas em monocamada em Meio Essencial Mínimo (α-MEM) , com 10% de soro fetal bovino e 1% de uma mistura de antibiótico-antimicótico contendo 10.000 unidades/ml de sal de sódio de penicilina G, 10.000 pg/ml de sulfato estreptomicina e 25 pg/ml de anfotericina B como Fungizone®, em solução salina antimicótica a 0,85%. As células ATDC-5 foram incubadas a 37°C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2, e o meio de cultura renovado a cada três dias. A solução de fibroína de seda com concentração a 16 wt% foi esterilizada por raios ultravioletas. As células confluentes foram destacadas dos 51 frascos de cultura de poli-estireno utilizando uma solução contendo a enzima tripsina (0,25% de solução de tripsina/EDTA). Uma suspensão celular contendo 1 milhão de células por ml foi preparada. A suspensão de células (1 ml) foi centrifugada e o sobrenadante removido, tendo-se adicionando posteriormente 1 ml da mistura da solução de fibroína de seda e a solução de HRP contendo H202 (HRP/seda a 0,26 wtsi, H202/seda a 1,10 wtVo ou 1,45 wtsi) . Após a homogeneização, 50 ul de solução de fibroina de seda contendo as células ATDC-5 foram transferidos para uma lamela. Posteriormente as lamelas foram colocadas no fundo dos poços de uma placa de cultura de poli-estireno (24 poços). Por forma a promover a reticulação, a placa contendo a mistura de gel e células foi incubada a 37°C durante alguns minutos. E, em seguida, 1,5 ml de meio foi transferido para cada poço. O meio de cultura foi renovado a cada três dias. Após cada período de cultura, isto é 24 horas, 4 e 7 dias, os hidrogéis contendo as células encapsuladas foram removidos do meio. Procedeu-se à lavagem com uma solução tamponada de fosfato (PBS) e, em seguida, adicionou-se 500 ul de solução de MTS (Kit CellTiter 96-Ensaio de Proliferação) . De seguida, incubou-se a 37°C solução de MTS com hidrogel/ATDC-5 a 37°C, pelo período de três horas. Depois, transferiu-se 100 uL da solução para o respectivo poço de uma placa de cultura de poli-estireno (96 poços). A absorbância (OD) a 490 nm foi determinada recorrendo a um leitor de microplacas. Todos os testes foram realizados em triplicado. Os resultados da viablidade celular estão apresentados na Figura 20. Verificou-se que a viabilidade de células em ambos os grupos de hidrogéis aumentou desde o dia 1 ao dia 4, e manteve a sua viabilidade até ao dia 7. Estes resultados demonstraram que os hidrogéis de fibroína de seda permitem encapsular e 52 manter viáveis as células ATDC-5, in vitro. Podemos concluir que os hidrogéis desenvolvidos são não-citotóxicos, e suportam a viabilidade das células. A Figura 21 mostra as imagens obtidas por microscopia de fluorescência das células ATDC-5 encapsuladas nos hidrogéis de fibroina da seda cultivados em meio de cultura pelo período de 3 horas. A concentração de fibroina da seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,2 6 wtsi, H202/seda é de 1,1 wt °sí. Após 1 dia de cultura é possível verificar uma distribuição homogénea de células e que estas se encontram viáveis no interior do hidrogel. A viabilidade, a distribuição e morfologia das células foi também avaliada recorrendo ao método de coloração "Live/Dead" recorrendo à calceína AM (coloração verde representa células vivas) e iodeto de propídio (células vermelha representa células mortas). Nos dias 1, 3, 7, e 11, os hidrogéis de seda contendo as células ATDC-5 encapsuladas foram removidos do meio de cultura. Procedeu-se à lavagem dos mesmos com PBS. Em seguida, os hidrogéis foram imersos em 1 ml de PBS contendo 1 mg de calceína AM e 1 ug de iodeto de propídio. Os hidrogéis foram incubados durante 15 minutos a 37°C e em seguida lavados em PBS antes da observação no microscópio de fluorescência. Figura 22 mostra as imagens das células vivas/mortas quando cultivadas no hidrogel. A concentração de fibroina da seda é de 16 wt%, HRP/seda é de 0,2 6 wtVo, H202/seda é de 1,1 wtsi. Os resultados mostram que a maior parte das células estão viáveis depois de encapsuladas no hidrogel de fibroina de seda até 11 dias de cultura. È possível observar também a distribuição homogenea das células no interior dos hidrogéis.Example 4; In vitro evaluation of the cytotoxicity of HRP-mediated silk fibroin hydrogels The cytotoxicity of the silk fibroin hydrogel was evaluated by encapsulation and culture of ATDC-5 cells (chondrogenic cell line) in the hydrogel (direct contact). Cell viability was assessed by the MTS assay and using the reagent (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2 (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium). This is a standard method for evaluating cytotoxicity in vitro. Silk fibroin hydrogels were prepared from 16 wt% solutions, HRP / silk at 0.26 wt, and H202 / silk at 1.10 wt V o or 1.45 wt. ATDC-5 cells were grown in Minimum Essential Medium (α-MEM) monolayer, 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic-antimycotic mixture containing 10,000 units / ml penicillin G sodium salt, 10,000 pg / ml streptomycin sulfate and 25 pg / ml amphotericin B as Fungizone® in 0.85% antimycotic saline. The ATDC-5 cells were incubated at 37øC in a humidified atmosphere with 5% CO 2, and the culture medium renewed every three days. The 16 wt% concentration of silk fibroin was sterilized by ultraviolet rays. Confluent cells were detached from the 51 polystyrene culture flasks using a solution containing the enzyme trypsin (0.25% trypsin / EDTA solution). A cell suspension containing 1 million cells per ml was prepared. The cell suspension (1 ml) was centrifuged and the supernatant removed, then 1 ml of the silk fibroin solution mixture and HR20 solution containing H202 (HRP / 0.26 wt% silk, H202 / silk at 1.10 wtVo or 1.45 wt. After homogenization, 50 ul of silk fibroin solution containing the ATDC-5 cells were transferred to a coverslip. The slides were then placed in the bottom of the wells of a polystyrene (24-well) culture dish. In order to promote cross-linking, the plate containing the gel-cell mixture was incubated at 37øC for a few minutes. And then 1.5 ml of medium was transferred to each well. The culture medium was renewed every three days. After each culture period, ie 24 hours, 4 and 7 days, the hydrogels containing the encapsulated cells were removed from the medium. Washing was carried out with a phosphate buffered solution (PBS) and then 500 ul of MTS solution (CellTiter Kit 96 Proliferation Assay) was added. Then, 37 ° C MTS solution was incubated with hydrogel / ATCC-5 at 37 ° C for a period of three hours. Then, 100æl of the solution was transferred to the respective well of a polystyrene (96 wells) culture dish. The absorbance (OD) at 490 nm was determined using a microplate reader. All tests were performed in triplicate. The cell viability results are shown in Figure 20. Cell viability in both groups of hydrogels was shown to increase from day 1 to day 4, and remained viable until day 7. These results demonstrated that hydrogels of silk fibroin allow to encapsulate and maintain viable ATDC-5 cells in vitro. We can conclude that the developed hydrogels are non-cytotoxic, and support the viability of the cells. Figure 21 shows the fluorescence microscopy images of the ATDC-5 cells encapsulated in the silk fibroin hydrogels grown in culture medium for a period of 3 hours. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wt., H202 / silk is 1.1 wt. After 1 day of culture it is possible to verify a homogeneous distribution of cells and that these are viable within the hydrogel. The viability, distribution and morphology of the cells were also evaluated using the " Live / Dead " using calcein AM (green staining represents living cells) and propidium iodide (red cells representing dead cells). On days 1, 3, 7, and 11, the silk hydrogels containing the encapsulated ATDC-5 cells were removed from the culture medium. They were washed with PBS. The hydrogels were then immersed in 1 ml of PBS containing 1 mg of calcein AM and 1æg of propidium iodide. The hydrogels were incubated for 15 minutes at 37 ° C and then washed in PBS prior to observation under fluorescence microscopy. Figure 22 shows the images of the living / dead cells when cultured in the hydrogel. The concentration of silk fibroin is 16 wt%, HRP / silk is 0.26 wtVo, H220 / silk is 1.1 wt. The results show that most cells are viable after being encapsulated in the silk fibroin hydrogel for up to 11 days of culture. It is also possible to observe the homogeneous distribution of the cells inside the hydrogels.
Tendo em conta os resultados de avaliação biológica in 53 vitro, e comparando com os hidrogéis de fibroína de seda descritos em estudos anteriores, é possível afirmar que o hidrogel de fibroína de seda reticulado por acção da HRP apresenta várias vantagens, tais como o permitirem encapsular células in situ, apresentarem uma gelificação rápida (dentro de alguns minutos) e em condições fisiológicas, e suportarem a viabilidade célular. 0 método para encapsular células é rápido e de fácil operação.Taking into account the results of biological evaluation in vitro and comparing with the silk fibroin hydrogels described in previous studies, it is possible to state that the HRP-crosslinked silk fibroin hydrogel has several advantages, such as allowing it to encapsulate cells in situ, exhibit rapid gelation (within a few minutes) and under physiological conditions, and support cell viability. The method for encapsulating cells is quick and easy to operate.
Qualquer pessoa com as qualificações adequadas no campo é capaz de modificar e introduzir variações não descritas neste pedido sem se afastar do âmbito da presente invenção. É, portanto, entendido que a presente invenção não está limitada as formas de realização descritas, mas destina-se a cobrir as modificações que estão dentro do seu conceito inventivo, conforme definido pelas reivindicações em anexo.Anyone with the appropriate qualifications in the field is capable of modifying and introducing variations not described in this application without departing from the scope of the present invention. It is therefore understood that the present invention is not limited to the described embodiments but is intended to cover the modifications which are within its inventive concept, as defined by the appended claims.
Lisboa, 11 de Abril de 2014Lisbon, April 11, 2014
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