PT107125B - Nanossistema multifuncional superparamagnético como agente de contraste para imagem por ressonância magnética e seu método de produção - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM NANOSSISTEMA MULTIFUNCIONAL SUPERPARAMAGNÉTICO, E SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, PARA BIO-NANO-IMAGIOLOGIA MÉDICA, HUMANA E ANIMAL, QUE SE DESTINA À APLICAÇÃO COMO AGENTE DE CONTRASTE (AC) PARA IMAGEM POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA (IRM) E PODE ASSOCIAR-SE A TERAPIAS, COMO HIPERTERMIA, E AO TRANSPORTE E LIBERTAÇÃO DIRIGIDA DE FÁRMACOS, POR CONJUGAÇÃO COM BIOMOLÉCULAS.O NANOSSISTEMA MULTIFUNCIONAL SUPERPARAMAGNÉTICO PODE SER USADO COMO AGENTE DE CONTRASTE NEGATIVO, REDUZINDO O VALOR T2 DOS TECIDOS, EM IRM, BASEANDO-SE NO MOMENTO MAGNÉTICO MUITO ELEVADO, SOB AÇÃO DE UM CAMPO MAGNÉTICO. PODE IGUALMENTE SER USADO COMO AGENTE DE CONTRASTE POSITIVO. A SUA EFICIÊNCIA COMO AGENTE DE CONTRASTE EM IRM, PERMITIRÁ O USO DE DOSES CLÍNICAS MUITO INFERIORES ÀS ATUALMENTE MINISTRADAS EM PACIENTES SUBMETIDOS A ESTA TÉCNICA DE DIAGNÓSTICO.O NANOSSISTEMA MULTIFUNCIONAL SUPERPARAMAGNÉTICO FORNECE UMA PLATAFORMA TECNOLÓGICA PARA VÁRIAS APLICAÇÕES EM BIO-NANO-IMAGIOLOGIA MÉDICA. É BIOCOMPATÍVEL E BIODEGRADÁVEL, SENDO A SUA PRODUÇÃO LIVRE DE COMPOSTOS ORGÂNICOS E DE SURFATANTES.

Description

Nanossistema Multifuncional Superparamagnético como Agente de Contraste para Imagem por Ressonância Magnética e Seu Método de Produção

Campo da invenção

Campo técnico em que a invenção se insere

A presente invenção refere-se a um nanossistema multifuncional superparamagnético e seu método de produção, para bio-nano-imagiologia médica, humana e animal. 0 nanossistema multifuncional superparamagnético destina-se à aplicação como agente de contraste para Imagem por Ressonância Magnética (IRM), humana e animal, e poderá associar-se a terapias, como hipertermia, e ao transporte, e libertação dirigida de fármacos, por conjugação com biomoléculas.

nanossistema multifuncional superparamagnético fornece uma plataforma tecnológica para várias aplicações em bionano-imagiologia médica. É biocompatível e biodegradável, sendo a sua produção livre de compostos orgânicos e de surfatantes.

A ação de investigação acima identificada inscreve-se no domínio técnico de Nanotecnologias para aplicação médica, tendo em vista a obtenção de uma solução integrada para teragnóstica (terapia e diagnóstico), combinando imagiologia médica por IRM, como agente de contraste negativo, com a possibilidade de associação a terapias, como hipertermia, e ao transporte, e libertação dirigida de fármacos, por conjugação com biomoléculas.

A presente invenção insere-se no domínio técnico Nanomateriais/Farmácia/Física.

Estado da técnica

A IRM é uma técnica de imagiologia não invasiva, usada em diagnóstico clínico sem recurso a radiação ionizante, quer para o doente, quer para o operador do equipamento. A resolução espacial é igual ou inferior a 1 mm, o que iguala ou supera a resolução espacial da tomografia axial computarizada (CT) com que compete, porém com uma sensibilidade 1000 vezes superior [1], o que faz de IRM uma técnica muito importante para o diagnóstico clínico atual, em particular em patologias do sistema nervoso central.

A análise anatómica e fisiólogica de tecidos por IRM utiliza o sinal de ressonância magnética nuclear (RMN) dos dois núcleos de hidrogénio presentes na água, para gerar a imagem. Para além de eventuais diferenças locais no teor em água, o contraste fundamental em IRM resulta dos diferentes tempos de relaxação intrínsecos regionais, longitudinal e transversal, TI e T2, respetivamente, os quais podem ser selecionados independentemente, para controlar o contraste da imagem [1]. Quando o contraste entre tecidos adjacentes não permite o diagnóstico, o uso de agentes de contraste pode ser recomendado, o que coloca algumas restrições ao carácter não invasivo da técnica IRM. A dosagem típica é de 0.1 a 0.3 mmol de Gadolínio/Kg e de 15 μιηοΐ Fe/Kg de paciente. De entre os 27,5 milhões de exames de IRM realizados durante 2008, nos USA, 43% recorreram ao uso de agentes de contraste como parte do procedimento de diagnóstico [2].

Os materiais magnéticos mais utilizados como agentes de contraste têm sido os compostos paramagnéticos de gadolínio (Gd) [3, 4], usados sem grandes restrições até à sua associação com a fibrose nefrogénica sistémica (NSF) [5-8], um efeito co-lateral raro mas grave em doentes com problemas renais. 0 estudo de outros metais, como por exemplo, não terras raras, tem-se dirigido para o manganês (Mn) [9], pela intensificação no contraste positivo de imagem, e para as nanopartícuias superparamagnéticas de óxidos de ferro (Fe) (SPIONs) [10-12] .

A utilização de SPIONs como agentes de contraste negativos, reduzindo o valor T2 dos tecidos, em IRM baseia-se no momento magnético permanente muito elevado destas nanopartícuias, sob ação de um campo magnético, relativamente a quelatos de gadolínio [13] . SPIONs têm também sido usados com sucesso como agentes de contraste positivos [14].

O intenso trabalho de I&D que tem vindo a ser desenvolvido nesta área, permitiu colocar no mercado um número razoável de agentes de contraste para IRM. Porém, as doses relativamente elevadas a administrar ao paciente Primovist 12.5 a 25 pmol/Kg, Endorem 15 pmol Fe/Kg, Resovist, de concentração 0.5 mol Fe/L, 0.9mL (para pacientes de peso d 60 Kg) e 1.4 mL (para pacientes de peso > 60 Kg) - associadas às desvantagens bioquímicas dos mesmos, abrem-nos uma ampla janela de oportunidade no mercado do nanossistema multifuncional superparamagnético, fornecendo uma plataforma tecnológica para várias aplicações em bio-nano-imagiologia médica, humana e animal.

Os agentes de contraste já desenvolvidos e comercializados foram as pedras basilares sobre as quais acentou o desenvolvimento do nanossistema multifuncional superparamagnético - formado por uma nanoestrutura núcleocoroa, onde o núcleo é formado por uma ou mais nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIONs) ou de outras espinelas mistas, como CoFe2C>4, MnFe2C>4, ou outras e a coroa compreende sílica ou sílica híbrida. Para além da elevada biocompatibilidade e carácter hidrofílico, a coroa de sílica apresenta uma elevada versatilidade para conjugação, química e/ou física, permitindo elevada carga e aumentando o tempo de circulação na corrente sanguínea, permitindo ainda uma diversificada gama de conjugação com biomoléculas e polímeros adequada para aplicações em medicina e farmácia [15-20].

A introdução de grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis durante a síntese coloidal in situ da coroa conduz a coroas de de sílica híbrida, conhecidas também por ORMOSIL (da nomenclatura anglo-saxónica ORganically MOdified SILica), onde grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis como metil-, vinil-, amina-, glicidoxipropil-metildietil, ou outros estão presentes e ligados à matriz tridimensional de sílica através de ligação covalente entre o silício e o carbono (-Si-C-), o silício e o azoto (-Si-N-), ou outras. Estas coroas de sílica híbrida apresentam ainda maior versatilidade para conjugação com biomoléculas relativamente à coroa de sílica: a presença de grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis facilita a conjugação de biomoléculas, o carregamento em maior concentração de fármacos, hidrofílicos ou hidrófobos, para além da possibilidade de controlo fino da molhabilidade da superfície, pela escolha criteriosa dos monómeros de síntese. Sílica e sílica híbrida são produtos amigos do ambiente, de notar que a sílica faz parte da dieta humana.

O documento WO2011/156895A2 apresenta um agente de contraste nanoestruturado, em que um ou mais núcleos superparamagnéticos de Fe₃O₄, estabilizados quimicamente, são revestidos por sílica. Este revestimento ocorre numa segunda etapa de síntese, num processo por micro-emulsão inversa, com a presença de surfatantes. Algumas horas após o início das reações de polimerização de sílica, são adicionados precursores alcóxidos com grupos amina não hidrolisáveis, pelo que os grupos amina ficam unicamente presentes e disponíveis à superfície do agente de contraste nanoestruturado.

A patente US 6,203,777 BI propõe um agente de contraste negativo para IRM, com SPIONs revestidos por carbohidratos ou compostos carbohidratados.

No trabalho Int J Mol Epidemiol Genet 2011; 2 (4) :367-390 é feita uma referência a SPIONs, estabilizados quimicamente e revestidos por sílica.

O documento WO 2010/060209 AI propõe um intensificador de sinal para espetroscopia de Raman, com uma estrutura núcleo-coroa, onde SPIONs são revestidos por sílica, utilizada para deteção de agentes patogénicos.

A patente WO 2009/038659A2 propõe um nanossistema formado por nanopartícuias de sílica organicamente modificada e complexadas na sua superfície da nanopartícuia com moléculas fotoativas para terapia fotodinâmica (PDT). A patente refere ainda a possibilidade de complexar à superfície da nanopartícuia outros agentes para imagiologia médica, como ressonância magnética, radionuclidos ou fluorescência. A localização de moléculas fotoactivas e de agentes para imagiologia à superfície das nanopartícuias de sílica organicamente modificada visa tornar mais eficiente os processos de terapia fotodinâmica e imagiologia médica. As nanopartícuias de sílica organicamente modificadas são sintetizadas num meio reacional da micro-emulsão inversa na presença do surfatante Tween80.

nanossistema multifuncional superparamagnético, objeto da presente invenção, fornece uma plataforma tecnológica para várias aplicações em bio-nano-imagiologia médica, humana e animal, e apresenta uma solução integrada para teragnóstica (terapia e diagnóstico), combinando imagiologia médica por IRM, como agente de contraste negativo, com a possibilidade de associação a terapia clínica, como hipertermia, e ao transporte, e libertação dirigida de fármacos, por conjugação com biomoléculas. 0 nanossistema multifuncional superparamagnético, objeto da presente invenção, protege as nanopartícuias superparamagnéticas que constituem o núcleo de um contacto direto com fluidos biológicos após introdução em organismos humanos ou animais. A presente invenção é ainda biocompatível e biodegradável, sendo a sua produção livre de compostos orgânicos e de surfatantes.

nanossistema multifuncional superparamagnético, objeto da presente invenção, é formado por uma nanoestrutura núcleocoroa, onde o núcleo é constituído por uma ou mais nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIONs), ou de outras espinelas mistas, como como Co_xFe2_XC>4, Mn_xFe2-_xC>4, (Co, Mn) _xFe2-_xC>4 ou outras e compreende uma coroa de sílica ou sílica híbrida.

Na síntese da coroa de sílica/sílica híbrida, por química coloidal, SPIONs ou outras nanopartícuias de espinelas mistas, como Co_xFe₂-_x04, Mn_xFe₂-_xO₄, (Co, Mn) _xFe₂-_xO₄, ou outras, não quimicamente estabilizadas, comportam-se como agentes nucleantes para o crescimento das coroas de sílica/sílica híbrida. Todos os precursores alcóxidos, inorgânicos (ex: tetraetil ortosilicato (TEOS) , Si(OC₂H₅)4) e/ou híbridos (ex: metiltrietoxisilano, (MTES) , Si (OCH₂CH₃) ₃CH_3f viniltrietoxisilano, (VTES) , Si (OC₂H₅) ₃CH=CH₂;

aminatrietoxisilano (APTES) , Si (OC₃H₇) ₃NH₂;

glicidoxipropil-metildietil, (GPTMS) , Si (OCH₃) 2CgH₁₈O₂; entre outros) são adicionados num único passo, in situ, a temperatura controlada, tornando o processo eficiente, reprodutível e livre de solventes orgânicos e surfatantes, obrigatórios na síntese de sílica/sílica híbrida pelo método de micro-emulsão inversa. As coroas obtidas apresentam uma geometria esférica e uma distribuição unimodal de espessura linear entre 5 e 500 nm.

Na síntese por micro-emulsão inversa o processo de eliminação de solventes orgânicos/surfatantes não é 100% eficiente, pelo que em aplicações biológicas não está livre de riscos, comportando para além disso riscos ambientais. A coroa de sílica híbrida é química e estruturalmente homogénea.

A possibilidade de combinar vários grupos orgânicos não hidrolisáveis em proporções variáveis numa mesma coroa acrescenta novas possibilidades ao nanossistema multifuncional superparamagnético.

Na presente invenção propõe-se um nanossistema multifuncional superparamagnético com uma nanoestrutura núcleo-coroa, onde o núcleo é constituído por uma ou mais nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIONs) , ou de outras espinelas mistas, como Co_xFe₂__xC>4, Mn_xFe₂__xC>4, (Co, Mn) _xFe₂-_xC>4, ou outras e compreende uma coroa de sílica ou sílica híbrida. A coroa agora proposta permite o ajuste do contraste da imagem em IRM pela combinação da composição, diversidade e proporcionalidade de diferentes grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis, com a espessura da coroa de silica/sílica híbrida.

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se a um nanossistema multifuncional superparamagnético como agente de contraste para IRM e seu método de produção. A presente invenção pode ser usada como plataforma para bio-nano-imagiologia médica, humana e animal, e apresenta uma solução integrada para teragnóstica (terapia e diagnóstico), combinando imagiologia médica por IRM, como agente de contraste negativo, com a possibilidade de associação a terapias, como hipertermia, e ao transporte, e libertação dirigida de fármacos, por conjugação com biomoléculas.

nanossistema multifuncional superparamagnético pode ser usado como agente de contraste negativo, reduzindo o valor T2 dos tecidos, em IRM, baseando-se no momento magnético muito elevado, sob ação de um campo magnético. Pode igualmente ser usado como agente de contraste positivo. A sua eficiência como agente de contraste, permitirá o uso de doses clínicas muito inferiores às atualmente ministradas em pacientes submetidos a esta técnica de diagnóstico.

nanossistema multifuncional superparamagnético é formado por uma estrutura núcleo-coroa em que os núcleos são formados por nanoparticulas de óxido de ferro ou espinelas mistas, caracterizado por serem revestidos por uma coroa de silica/silica híbrida, cuja espessura linear varia entre 5 e 500 nm, com poros interligados de tamanho variável, formando uma rede tridimensional, permeável a moléculas de água, sendo condicionada pela razão entre os grupos orgânicos funcionais não hidrolisáceis e grupos inorgânicos, no seu interior e na sua superfície, apresentando valores da razão r2/rl superiores a 100.

O nanossistema multifuncional superparamagnético apresenta uma razão entre os grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis e grupos inorgânicos que varia entre 0 e 1.

O nanossistema multifuncional superparamagnético é ainda conjugável com biomoléculas, como por exemplo, proteínas, péptidos, enzimas, anticorpos e polímeros, como por exemplo, cadeias de polímeros de polietilenoglicol lineares ou ramificadas.

O nanossistema multifuncional superparamagnético fornece uma plataforma tecnológica para várias aplicações em bionano-imagiologia médica. É conjugável com biomoléculas e polímeros estabelecendo ligações químicas entre os grupos inorgânicos e orgânicos funcionais não hidrolisáveis presentes nas coroas de sílica/sílica híbrida e os grupos orgânicos funcionais acessíveis nas biomoléculas e que não alterem a sua atividade biológica. O carácter hidrofílico/hidrofóbico assim como a rugosidade superficial das coroas podem ser facilmente controlados. O nanossistema multifuncional superparamagnético é biocompatível e biodegradável, sendo a sua produção livre de compostos orgânicos e de surfatantes.

Por sílica híbrida entende-se uma rede tridimensional de sílica onde estão presentes, numa concentração delineada, grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis, como, por exemplo, metil-, vinil-, amina-, glicidoxipropilmetildietil-, e suas misturas, ligados covalentemente ao silício (ex: ^Si-C^, =Si-N-, ou outros).

Por conjugação com biomoléculas entende-se a ligação covalente de um grupo reativo de uma biomolécula a um grupo funcional da sílica híbrida.

Descrição detalhada da invenção

É objetivo da presente invenção o desenvolvimento de um nanossistema multifuncional superparamagnético como agente de contraste em IRM, assim como o seu método de produção. Este nanossistema fornece uma plataforma tecnológica para várias aplicações em bio-nano-imagiologia médica e como agente de contraste em IRM. É biocompatível e biodegradável, sendo a sua produção livre de compostos orgânicos e de surfatantes.

nanossistema multifuncional superparamagnético fornece uma plataforma tecnológica para várias aplicações em bionano-imagiologia médica. É conjugável com biomoléculas e polímeros estabelecendo ligações químicas entre os grupos inorgânicos e orgânicos funcionais não hidrolisáveis presentes nas coroas de silica/sílica híbrida e os grupos orgânicos funcionais acessíveis nas biomoléculas e que não alterem a sua atividade biológica. 0 carácter hidrofílico/hidrofóbico assim como a rugosidade superficial das coroas podem ser facilmente controlados. 0 nanossistema multifuncional superparamagnético é biocompatível e biodegradável, sendo a sua produção livre de compostos orgânicos e de surfatantes.

• MÉTODO DE PRODUÇÃO DO NANOSSISTEMA MULTIFUNCIONAL SUPERPARAMAGNÉTICO A USAR COMO PLATAFORMA PARA BIO-NANOIMAGIOLOGIA MÉDICA, HUMANA E ANIMAL, UMA SOLUÇÃO INTEGRADA PARA TERAGNÓSTICA

Na presente invenção propõe-se um nanossistema multifuncional superparamagnético com uma nanoestrutura núcleo-coroa, onde o núcleo é constituído por uma ou mais nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIONs) , ou de outras espinelas mistas, como Co_xFe₂__x0₄, Mn_xFe₂__xO₄, (Co, Mn) _xFe₂__xO₄ ou outras e compreende uma coroa de silica/sílica híbrida. Um dos principais objetivos no desenvolvimento do nanossistema multifuncional superparamagnético centrou-se no desenvolvimento do processo de fabrico da nanoestrutura núcleo-coroa.

SPIONs são sintetizados via química húmida, por reduçãoprecipitação ou co-precipitação. Espinelas mistas definidas pela fórmula geral AxFe2-xO4, em que A representa catiões bivalentes, como cobalto, manganês, rutério, ou outros e suas misturas, são sintetizadas por síntese organometálica a temperatura elevada, ou por via química húmida, por coprecipitação de iões di- e trivalentes.

Relativamente à coroa de silica/sílica híbrida desenvolvida em torno dos núcleos superparamagnéticos à base de óxido de ferro, SPIONs ou de espinelas mistas, desenvolveu-se um método de síntese coloidal, que se revelou fiável e eficaz na obtenção de nanossistemas de forma esférica e distribuição de tamanho unimodal. 0 controlo da espessura das referidas coroas e, logo, a dimensão do nanossistema multifuncional superparamagnético revelou-se fiável e reprodutível.

Neste método não são utilizados solventes orgânicos ou surfatantes. Para além de amigo do ambiente, este método conduz à síntese de nanossistemas sem o risco de quaisquer resíduos químicos, o que não se verifica no método alternativo de síntese por micro-emulsão inversa.

método de produção do nanossistema multifuncional superparamagnético como agente de contraste em imagem por ressonância magnética compreende os seguintes passos:

a) Síntese de nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro, constituindo o núcleo do nanossistema, por co-precipitação de iões de ferro (II) e ferro (III), ou por redução-precipitação de iões de ferro (III), em presença de uma solução aquosa de amónia, sob agitação magnética ou em ultra-sons, ou em alternativa;

b) Síntese de nanopartícuias superparamagnéticas de espinelas mistas, como Co_xFe2__xC>4, Mn_xFe2__xC>4, (Co, Mn) _xFe2-_xC>4 ou outras, constituindo o núcleo do nanossistema, por redução-precipitação, coprecipitação de catiões divalentes e de Fe (III) em meio básico, ou por síntese organometálica, sob agitação magnética ou em ultra-sons;

c) Revestimento das nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro ou de espinelas mistas por silica/sílica híbrida, constituindo a coroa, do núcleo do nanossistema obtido nos passos a) ou b) com mistura de uma solução de etanol, amónia e água, sob forte agitação magnética, com adição de precursores organometálicos de sílica em proporções adequadas.

• UTILIZAÇÃO DO NANOSSISTEMA MULTIFUNCIONAL S UP E RP ARAMAGNÉ TICO nanossistema multifuncional superparamagnético proposto na presente invenção, permite melhorar o contraste numa imagem de RMN, quando este é obtido por ponderação em T2, de forma eficiente e economicamente vantajosa e segura.

A eficiência do agente de contraste negativo é controlado pela espessura da coroa de silica/sílica híbrida, pela natureza e concentração dos grupo(s) inorgânicos e orgânico(s) funcionais não hidrolisáveis presentes e pelo momento magnético do núcleo.

nanossistema multifuncional superparamagnético é ainda conjugável com biomoléculas, como por exemplo, proteínas, péptidos, enzimas, anticorpos e polímeros, como por exemplo, cadeias de polímeros de polietilenoglicol lineares ou ramificadas.

nanossistema multifuncional superparamagnético fornece uma plataforma tecnológica para várias aplicações em bionano-imagiologia médica, permitindo conjugar um sistema de bio-nano-imagiologia com uma terapia, como por exemplo, hipertermia, terapia genética, libertação controlada/gradual de fármacos, entre outros.

A presente invenção compreende uma nanoestrutura núcleocoroa, cujo processo de fabrico ocorre em duas etapas: na primeira sintetizam-se por via química húmida ou por síntese organometálica a temperatura elevada os núcleos superparamagnéticos de óxido de ferro ou de espinelas mistas; numa segunda etapa, produz-se o revestimento do núcleo superparamagnético de óxido de ferro ou de espinelas mistas, promovendo o crescimento de coroas de sílica/sílica híbrida sobre os núcleos superparamagnéticos de óxido de ferro ou de espinelas mistas, in situ, a temperatura controlada, pelo que os grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis estão presentes tanto no interior da coroa, como à sua superfície.

nanossistema multifuncional superparamagnético é formado por uma estrutura núcleo-coroa em que os núcleos são formados por nanopartícuias de óxido de ferro ou espinelas mistas, caracterizado por serem revestidos por uma coroa de sílica/sílica híbrida, com uma espessura linear entre 5 e 500 nm, com poros interligados de tamanho variável, formando uma rede tridimensional, permeável a moléculas de água, sendo condicionada pela razão entre os grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis e grupos inorgânicos, no seu interior e na sua superfície, apresentando valores da razão r2/rl superiores a 100.

O nanossistema multifuncional superparamagnético apresenta uma razão entre os grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis e grupos inorgânicos que varia entre 0 e 1.

método coloidal de síntese da coroa de silica/sílica híbrida, proposto na presente invenção, evita o uso de surfatantes ou de outros químicos orgânicos usados no método de micro-emulsão inversa - pelo que o nanossistema multifuncional superparamagnético não apresenta vestígios de qualquer tipo de resíduos orgânicos. 0 processo de eliminação de surfatantes não é 100% eficaz, pelo que em aplicações biológicas/biomédicas oferece riscos de toxicidade para humanos e para animais, para além de riscos ambientais, quer durante o processo de síntese quer após excreção pelo humano ou animal, após administração como agente de contraste para IRM.

Foram testadas diferentes composições químicas para a coroa, i.e., diferentes razões entre o teor orgânico e a sílica, grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis, diferentes misturas de distintos grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis, com o objetivo de melhorar o contraste de uma imagem de IRM quando ponderada por T2, como se pode observar pelos valores das relaxividades (rl e r2) apresentados na Tabela 1.

Por rl entende-se a relaxividade longitudinal de um AC, isto é, a sua eficiência para alterar os valores de TI dos tecidos.

Por r2 entende-se a relaxividade transversal de um AC, isto é, a sua eficiência para alterar os valores de T2 dos tecidos.

Surpreendentemente, verificou-se que a presença de grupos inorgânicos, tais como, silanol, =Si-OH, =Si-O~, =Si-O-Si =, e de um ou mais grupos orgânicos funcionais não hidrolisáveis, tais como, metil-, vinil-, amina-, glicidoxipropil-metildietil-, e suas misturas, na coroa, em torno de núcleos superparamagnéticos de óxido de ferro ou de espinelas mistas, revelou elevada eficiência como agente de contraste.

Nas Figuras 5a) e b), 6a) e b) e 7a) e b) onde se apresenta o comportamento superparamagnético dos núcleos de óxido de ferro e do nanossistema multifuncional superparamagnético formado por uma nanoestrutra núcleo-coroa, é clara uma diminuição do valor da magnetização de saturação quando se passa dos núcleos para os sistemas núcleo-coroa, de 65 Am²/kg para perto de um terço deste valor. 0 que permitiu concluir que a relaxividade do nanossistema é função não só das propriedades magnéticas do núcleo superparamagnético usado mas também da coroa que o envolve. Estas duas componentes têm de ser contabilizadas para a construção de um nanossistema multifuncional superparamagnético de elevada eficiência como agente de contraste em IRM.

Existe a possibilidade de combinar vários grupos inorgânicos e vários grupos orgânicos funcionalisáveis não hidrolisáveis na mesma coroa, o que adiciona novas possibilidades ao nanossistema multifuncional superparamagnético, desenhado à medida do utilizador final (na nomenclatura anglo-saxónica tailor made}, constituindo assim uma vantagem inequívoca em termos de utilização, na medida em que, fornece uma plataforma tecnológica para várias aplicações em bio-nano-imagiologia médica.

Existe a possibilidade da conjugação da silica/silica híbrida da coroa com distintas biomoléculas no mesmo nanossistema multifuncional superparamagnético. Estão incluídos neste âmbito os nanossistemas superparamagnéticos multifuncionais em que a coroa de silica/silica híbrida possui grupos com reatividade química que possibilitem a conjugação com biomoléculas, nomeadamente a ligação de uma proteína, um péptido, um anticorpo, ou outra molécula que permita o direcionamento da nanopartícuia para locais específicos no organismo, nomeadamente para recetores celulares específicos. A conjugação com proteínas, péptidos ou anticorpos no nanossistema multifuncional superparamagnético de silica/silica híbrida é realizada por ligação covalente entre os grupos inorgânicos e orgânicos funcionais disponíveis e acessíveis à superfície e na porosidade da coroa do nanossistema multifuncional superparamagnético e os grupos reativos disponíveis e

acessíveis	à superfície das	biomoléculas a	conjugar. A
conjugação	com biomoléculas	pode	ocorrer	de forma
simultânea	ou faseada.

Existe também a possibilidade da conjugação da silica/silica híbrida da coroa com distintos polímeros, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) de diferentes tamanhos, no mesmo nanossistema multifuncional superparamagnético. Estão incluídos neste âmbito os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos em que a coroa de silica/silica híbrida possua grupos com reatividade química que possibilitem a conjugação de biomoléculas com polímeros capazes de aumentar o tempo de permanência dos nanossistemas em circulação no organismo de um animal ou de um humano.

Existe ainda a possibilidade da conjugação da sílica/sílica híbrida da coroa com distintas biomoléculas no mesmo nanossistema multifuncional superparamagnético utilizando como espaçador um polímero bifuncional. Estão incluídos neste âmbito os nanossistemas superparamagnéticos multifuncionais em que a coroa de sílica/sílica híbrida conjugada a polímeros possuidores de um grupo reativo no terminas da cadeia polimérica, para ligação de uma ou mais biomoléculas, como uma proteína, um péptido, um anticorpo, ou outra molécula, permitindo quer o direcionamento do nanossistema para locais específicos no organismo, quer o aumento do tempo de permanência dos nanossistemas em circulação no organismo de um animal ou de um humano.

De seguida, apresentam-se alguns exemplos de biomoléculas, a título ilustrativo e não limitativo, que podem ser utilizadas na conjugação com o nanossistema multifuncional superparamagnético.

Proteínas com atividade catalítica (enzimas):

L-asparaginase; ativador do plasminogéneo: tPA (tissue plasminogen activator) ; uroquinase; estreptoquinase, entre outras.

Proteínas com atividade imunomodeladora (citocinas):

Interferão-alpha, Interferão-beta, Interferão-gama,

Interleucina-2, Interleucina-11, entre outras.

Anticorpos :

Trastuzumab; Rituximab; Alemtuzumab; Cetuximab;

Bevacizumab; Panitumumab; Canakinumab; Ofatunumab;

Denosumab; Ipilimumab; Pertuzumab, entre outros.

Péptidos com afinidade para recetores celulares:

RGDSK ou (H-Arg-Gly-Asp-Ser-Lys-OH) ;

c (RGDfK) ou (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys));

c(RGDfC) ou (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys));

c(RGDfE) ou (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Glu));

c (RGDyK) ou (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys));

H-E-[c(RGDyK)]2 ou (H-Glu[cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)]2 ;

c(RGDfK(PEG-PEG)) ou (cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEGPEG)];

c[RGDfK(Ac-SCH2CO)] ou cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(AcSCH2CO)];

E-[c(RGDfK)2] ou (H-Glu[cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)]2;

c(RGDfV) ou (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val), entre outros.

Família de polímeros:

PEG funcional reativo em que n é igual a 8, 12 ou 24:

Succinimidil-([N-metil]-(n)-etilenoglicol) éster ou

NHS-PEGn-Metil;

Maleimidopropionamido-[[N-metil]-(n)-etilenoglicol ] ou

Maleimido-PEGn-Metil.

PEG homobifuncional reativo em que n é igual a 3 ou 5:

Bis(succinimidil)-(n)-(etilenoglicol) ou

BS (PEG) n

Bis(maleimido)-(n)-etilenoglicol ou BM(PEG)n.

PEG heterofuncional reativo em que n é igual a 4, 6, 8, 12 ou 24:

Succinimidil-([N-maleimidopropionamido]-(n)-etilenoglicol) ester ou NHS-PEGn-Maleimido.

método de produção do nanossistema multifuncional superparamagnético conjugado com biomoléculas compreende os seguintes passos:

a) Ativação do nanossistema multifuncional, por tratamento com anidrido succinico sob agitação suave constante;

b) Diálise do nanossistema multifuncional em água;

c) Solubilização da biomécula seguida da sua adição à suspensão contendo o nanossistema multifuncional;

d) Incubação da mistura reacional sob agitação suave;

e) Separação do nanossistema multifuncional do meio reacional.

Na Tabela 1 são apresentados os valores das relaxividades longitudinais (rl) e transversais (r2) e respetivas razões para alguns agentes de contraste comerciais SPION-dextrano TIO (citrato de sódio), SPION- CARBOXILMETIL-DEXTRANO TIO , SPION- CARBOXIDEXTRAN, SPION- CITRATO, e o nanossistema multifuncional superparamagnético agora proposto, com coroa em sílica, cujo precursor é TEOS, e com coroa de sílica híbrida, funcionalizada com grupos vinil-, cujo precursor é VTES e grupos glicidoxipropil-metildietoxisilano-, cujo precursor é GPTMS, apresentado em duas razões molares TEOS:GPTMS, de 9:1 e de 5:5.

Tabela 1: Valores das relaxividades longitudinais (rl) e transversais (r2).

Núcleo	Coroa	Campo Magnético (I)	r 1 (mM.s~ 2)	r2 (mM.s~ 2)	r2 /r 1
SPION	DEXTRANO TIO	1.5	10.7±1	144±10	13.5
7	2.2±0.1	182±20	82.7
SPION	CARBOXILMETIL- DEXTRANO TIO	1.5	30	15	5.9
SPION	CARBOXIDEXTRAN	1.5	60	9.7	19.5
SPION	CITRATO	1.5	14	33.4	2.4
SPION	SÍLICA (TEOS)	7	0.09	54.8	637 . 0
SPION	ORMOSIL (GPTMS) 9:1	7	0.16	17.04	110 . 0
SPION	ORMOSIL (GPTMS) 5:5	7	0.08	4.81	62.0
SPION	ORMOSIL (VINIL) 9:1	7	0.02	2.2	110

É possível verificar que o valor da razão r2/rl para o nanossitema multifuncional superparamagnético agora proposto é pelo menos uma ordem de grandeza superior aos dos fármacos comerciais que se propõe substituir, o que permite uma administração do agente de contraste em doses significativamente inferiores ao paciente, tendo sido obtidos valores da razão r2/rl superiores a 100, a um campo magnético de 7T.

Existe a tendência de os equipamentos clínicos funcionarem a campos mais elevados 3 e até 7T, pois assim melhora-se a razão sinal/ruído e com ela a qualidade da imagem. Já existem equipamentos comerciais a funcionarem a campos com 3T e até a 7T, daí a lógica de efetuar as nossas medias a campos elevados.

A metodologia coloidal desenvolvida revelou-se fiável e eficaz do ponto de vista do controlo da morfologia, do diâmetro e na alteração da intensidade do sinal em IRM, no nanossistema multifuncional superparamagnético proposto, como se pode observar das figuras 5a) e b) 6a) e b) e 7a) e b) das curvas de histerese isotérmicas e do comportamento da magnetização quando as amostras são arrefecidas (field cool, FC) em campo magnético e na ausência deste (zero field cool, ZFC), os núcleos e os sistemas núcleo-cora obtidos são superparamagnéticos.

Descrição das figuras

A Figura 1 representa o esquema do nanossistema multifuncional superparamagnético com coroa de sílica. No centro indica-se a polaridade magnética norte (N) e sul (S). Átomos de oxigénio (O) e silício (Si).

A Figura 2 representa o esquema do nanossistema multifuncional superparamagnético com coroa de sílica híbrida. No centro indica-se a polaridade magnética norte (N) e sul (S) . Átomos de oxigénio (0) , silício (Si) e grupos funcionais (R) , os quais podem ser metil-, vinil-, amina-, ou outros, ligados covalentemente ao silício (ex: =Si-C=, ξ3ι-Ν-, ou outros).

A Figura 3 representa o padrão de difração (a) e imagens de microscopia eletrónica de transmissão (TEM) de precipitados quasi-esféricos de óxido de ferro, correspondendo ao núcleo, (5-6 nm de diâmetro), com ampliação de *50000, (b) e com ampliação de *100000, (c).

As Figuras 4a) e 4b) representam imagens de TEM do nanossistema multifuncional superparamagnético com núcleo de óxido de ferro e coroa de sílica híbrida, com ampliação de *200000 e de *100000, respetivamente.

A Figura 5 representa resultados de estudos de magnetização referentes a nanoparticulas superparamagnéticas de óxido de ferro, núcleos no presente nanossistema multifuncional superparamagnético: a) representa a curva de histerese magnética para temperaturas distintas em que o eixo das ordenadas, identificado por M refere-se à magnetização expressa em Am²/kg e o eixo das abcissas identificado por μοΗ refere-se ao campo magnético, expresso em T; a Figura 5b) representa a curva da magnetização para um campo magnético (H) de 5mT, em que o eixo das ordenadas, identificado por M refere-se à magnetização expressa em Am²/kg e o eixo das abcissas refere-se a valores de temperatura, expressos em graus K, para situações em que a amostra foi arrefecida em campo magnético (FC) e na ausência deste (ZFC).

A Figura 6 representa resultados de estudos de magnetização referentes ao nanossistema multifuncional superparamgnético com coroa de sílica: a) representa a curva de histerese magnética para temperaturas distintas em que o eixo das ordenadas, identificado por M refere-se à magnetização expressa em Am²/kg e o eixo das abcissas identificado por μ₀Η refere-se ao campo magnético, expresso em T; a Figura 6b) representa a curva da magnetização para um campo magnético (H) de 5mT, em que o eixo das ordenadas, identificado por M refere-se à magnetização expressa em Am²/kg e o eixo das abcissas refere-se a valores de temperatura, expressos em graus K, para situações em que a amostra foi arrefecida em campo magnético {field cool, FC) e na ausência deste {zero-field cool, ZFC).

A Figura 7 representa resultados de estudos de magnetização referentes ao nanossistema multifuncional superparamgnético com coroa de sílica híbrida com grupo vinil: a) representa a curva de histerese magnética para temperaturas distintas em que o eixo das ordenadas, identificado por M refere-se à magnetização expressa em Am²/kg e o eixo das abcissas identificado por μ₀Η refere-se ao campo magnético, expresso em T; a Figura 7b) representa a curva da magnetização para um campo magnético (H) de 5mT, em que o eixo das ordenadas, identificado por M refere-se à magnetização expressa em Am²/kg e o eixo das abcissas refere-se a valores de temperatura, expressos em graus K, para situações em que a amostra foi arrefecida em campo magnético (field cool, FC) e na ausência deste (zero-field cool, ZFC).

A Figura 8 representa micro-imagens por ressonância magnética de fantoma de gel de agar, na linha de baixo, e do fantoma de gel de agar com o nanossistema multifuncional superparamagnético com coroa de sílica híbrida, funcionalizada com 3-glicidiloxipropil-trimetoxisilano(GPTMS), na linha de cima, obtidas com tempos de eco diferentes. Tempo de eco é metade do intervalo de tempo entre uma excitação e o adquirir o sinal numa sequência de Eco-de-spin, muito usada em RMN.

A Figura 9 representa graficamente o contraste normalizado para um fantoma de gel de agar e um fantoma de gel com o nanossistema multifuncional superparamagnético com coroa de sílica híbrida, funcionalizada com 3-glicidiloxipropiltrimetoxisilano- (GPTMS), em que o eixo das ordenadas, refere-se ao contraste normalizado expresso em unidades arbitrárias e o eixo das abcissas identificado por t refere-se ao tempo, expresso em milisegundos. Por contraste entende-se a diferença entre intensidade de sinal em duas regiões distintas da imagem (conjunto de pixel). Em IRM e RMN o sinal é sempre um sinal de radio-frequência e a intensidade a que se refere é a intensidade deste.

Para uma melhor compreensão da invenção, descrevem-se de seguida, a título ilustrativo e não limitativo, exemplos de aplicação da presente invenção.

Exemplos

1.1 Síntese de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro por co-precipitação - núcleo

A síntese de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro, núcleos no presente nanossistema multifuncional superparamagnético, realiza-se por via química húmida, por um método de co-precipitação de iões ferro(II) e ferro(III).

0,3975 g de FeCl₂.4H₂O são adcicionados a 1 mL de HC1 2M, formando soluções de cloreto de ferro (II) (A) e 0,2702 g FeCl₃.6H₂O são adcicionados a 4mL de de HC1 2M, formando a solução de cloreto de ferro (III) (B) . As soluções (A) e (B) formam a solução (C) sob forte agitação magnética.

mL de uma solução aquosa de amónia (NH₄OH, 0,7 M) são adicionados gota a gota a C, mantendo a agitação magnética. A precipitação de um óxido de ferro (de cor negra) iniciase com a presença de solução aquosa de amónia. A precipitação do composto de ferro é facilitada com ajuda de um campo magnético. O líquido sobrenadante é retirado e o precipitado lavado 2-3 vezes com álcool. No final, o líquido de lavagem é eliminado por evaporação em estufa, a 40²C.

1.2 Síntese de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro por redução-precipitação - núcleo na presente invenção

A síntese de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro, núcleos no presente nanossistema multifuncional superparamagnético, realiza-se por via química húmida, por um método de redução-precipitação de iões ferro(III).

2,703 g de FeC13.6H₂O (D) são adicionados a 2,5 mL de HC1,

2M e mantidos sob forte	agitação magnética e são
adicionados a uma solução de	sulfito de sódio, em meio

aquoso (E).

8,46 mL de uma solução aquosa

de amónia (NH4OH, 0,7 M) são

adicionados gota a gota a E, mantendo a agitação magnética. A precipitação de um óxido de ferro (de cor negra) iniciase com a presença de solução aquosa de amónia. O líquido sobrenadante é retirado e o precipitado lavado 2-3 vezes com álcool. No final, o líquido de lavagem é eliminado por evaporação em estufa, a 40²C.

1.3 Síntese de nanopartículas superparamagnéticas de espinelas mistas por co-precipitação ou síntese organometálica a temperatura elevada - núcleo

A síntese de nanopartículas superparamagnéticas de

espinelas mistas, núcleos

no presente nanossistema

multifuncional superparamagnético, pode realizar-se por via química húmida, por um método de co-precipitação de iões ferro(III) e do catião divalente.

Prepararam-se 25 mL de uma solução aquosa de cloreto de ferro (III) 0,4 M e 25 mL de uma solução de cloreto de cobalto (II) 0,2 M (F) . 25 mL de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 3 M (G) são adicionados gota a gota à solução F e mantida sob forte agitação magnética. Um valor de pH de 11-12 é mantido constante pela adição de NaOH. O precipitado é mantido a 80²C sob forte agitação magnética durante Ih. O precipitado é separado por centrifugação e o líquido de lavagem é eliminado por evaporação em estufa, a

100²C. Posteriormente o precipitado de CoFe₂C>4 é tratado termicamente a 600²C, durante lOh.

A síntese organometálica a temperatura elevada nanoparticulas unimodais não agregadas da espinela mista MnFe₂O₄ ocorre pela decomposição térmica de Fe(CO)₅ e Mn₂(CO)₁₀, da qual resulta a formação de FeMn, oxidado numa segunda etapa na presença de óxido de trimetil-amina.

1.4 Revestimento de nanopartículas de óxido de ferro ou de espinelas mistas com sílica/ sílica híbrida - coroa revestimento de nanopartículas superparamagnéticas de

óxido de	ferro por	silica/silica	híbrida	é	realizado por um
processo	de química	coloidal.
Uma solução de etanol, amónia	e água	(H)	é	preparada e
mantida	sob forte	agitação magnética	a	uma	temperatura
mantida	constante	no intervalo	entre	10	e	1002C, mais

especificamente entre 0 e 60²C.

Os núcleos de óxido de ferro são adicionados à solução H, mantida sob forte agitação magnética ou em ultra-sons. Os precursores organometálicos de sílica são adicionados à solução anterior e os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos separados pela presença de um campo magnético.

2. Conjugação com proteínas, péptidos, anticorpos no nanossistema multifuncional superparamagnético

A conjugação com proteínas, péptidos ou anticorpos no nanossistema multifuncional superparamagnético de silica/silica híbrida é realizada por ligação covalente entre os grupos inorgânicos e orgânicos funcionais disponíveis e acessíveis à superfície e na porosidade da coroa do nanossistema multifuncional superparamagnético e os grupos reativos disponíveis e acessíveis à superfície das biomoléculas a conjugar.

meio reacional de conjugação é um meio aquoso ou um meio heterogéneo por presença de micelas que permitam minimizar a exposição da biomolécula a moléculas orgânicas caso sejam necesssárias à reação de conjugação, minimizando a presença de solventes que possam alterar a estrutura tridimensional das biomoléculas a conjugar.

procedimento pode incluir uma ativação prévia dos grupos funcionais disponíveis à superfície da coroa do nanossistema multifuncional, seguida de proteção dos grupos ativados, seguida de um processo de separação para remoção dos reagentes em excesso, seguida da desproteção do grupo ativado, seguida de agitação suave para homogenização.

Em alternativa o procedimento pode incluir a utilização de reagentes bifuncionais adequados ao estabelecimento direto da reação química entre os grupos funcionais disponíveis à superfície e na porosidade aberta da coroa, e os grupos funcionais disponíveis à superfície da biomolécula. Neste caso procede-se à agitação suave da suspensão do nanossistema multifuncional superparamagnético em meio aquoso seguida da adição do reagente bifuncional mantendo agitação suave para homogeneização.

Em qualquer dos casos após a homogeneização, procede-se de imediato à adição da solução contendo a biomolécula a conjugar nomeadamente a ligação de uma proteína, um péptido, uma enzima, um anticorpo, ou outra biomolécula que permita o direcionamento da nanopartícuia para locais específicos no organismo, nomeadamente para recetores celulares específicos. A suspensão a um pH adequado e uma concentração de biomolécula a definir caso a caso, é seguidamente incubada em agitação suave à temperatura ambiente durante um período de 2 horas. Após este período de reação, os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos são submetidos a processos de separação convencionais para remoção de produtos da reação, de excesso de reagentes e de biomoléculas não conjugadas. A conjugação da coroa dos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos com biomoléculas é comprovada por métodos de caracterização e por métodos de avaliação de atividade biológica específicos das diferentes biomoléculas.

2.1 Conjugação com proteína (enzima) no nanossistema multifuncional superparamagnético

Considerando como exemplo a conjugação da enzima Lasparaginase ao nanossistema multifuncional superparamagnético de silica/sílica híbrida, procede-se à solubilização da enzima L-asparaginase, na concentração de l,2xlCT⁶ M numa solução de tampão carbonatos 50 mM, pH 9,4. Um volume de 1 mL desta solução é adicionado a um volume de 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparamgnético com grupos amina livres na coroa, os quais foram previamente ativados por tratamento com anidrido succínico numa solução de N,N-dimetilformamida, na gama de 5 a 12%, durante 6 horas sob agitação suave constante. Os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos são seguidamente dializados contra água durante 18 horas, tempo ao fim do qual os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos são retirados da manga de diálise. Segue-se a adição de 1 mL de uma solução O,1M de N-(3-dimetilaminopropil)-Ν'-etilcarbodiimida por cada 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparamgnético seguida de agitação suave durante 30 minutos. Após este procedimento de ativação do nanossistema multifuncional superparamgnético procede-se à adição imediata da solução contendo a enzima L-asparaginase no volume e concentração já descritos. A mistura reacional é colocada em agitação suave durante 2 horas a 4²C. Os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos obtidos são separados do meio reacional por cromatografia de exclusão de tamanhos. A percentagem de grupos funcionais conjugados à L-asparaginase nos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de silica/silica híbrida situa-se na gama de 40 a 50%. A retenção de atividade biológica da L-asparaginase nos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de sílica/sílica híbrida situa-se na gama de 60 a 80%.

2.2 Conjugação com proteína (citocina) no nanossistema multifuncional superparamagnético

Considerando como exemplo a conjugação da proteína interferão-alfa, aos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de sílica/sílica híbrida, procede-se à solubilização de interferão-alfa, na concentração de 5mg/mL numa solução de tampão borato 50 mM, pH 9. Um volume de 1 mL desta solução é adicionado a um volume de 5 mL de suspensão do nanossistema multifuncional superparamgnético com grupos amina livres na coroa, os quais foram previamente ativados por tratamento com anidrido succínico numa solução de N, N-dimetilf ormamida, na gama de 5 a 12%, durante 6 horas sob agitação suave constante. Os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos são seguidamente dializados contra água durante 18 horas, tempo ao fim do qual os nanossistemas são retirados da manga de diálise. Segue-se a adição de 1 mL de uma solução 0,1 M de N-(3-dimetilaminopropil)-Ν'-etilcarbodiimida por cada 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparamgnético seguida de agitação suave durante 30 min. Após este procedimento de ativação do nanossistema multifuncional superparamgnético procede-se à adição imediata da solução contendo o interferão-alfa no volume e concentração já descritos. A mistura reacional é colocada em agitação suave durante 2 horas a 4²C. Os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos obtidos são separados do meio reacional por cromatografia de exclusão de tamanhos. A percentagem de grupos funcionais conjugados ao interferão-alfa nos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de silica/sílica híbrida situa-se na gama de 10 a 30%. A retenção de atividade biológica da interferão-alfa nos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de sílica/sílica híbrida situa-se na gama de 30 a 40%.

2.3 Conjugação com anticorpo no nanossistema multifuncional superparamagnético

Considerando como exemplo a conjugação do anticorpo trastuzumab aos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de sílica/sílica híbrida, procede-se à solubilização do anticorpo trastuzumab, na concentração final de 5 mg/mL, em tampão bicarbonato 0.1 M, pH 8,5. Um volume de 1 mL desta solução é adicionado a um volume de 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparamgnético com grupos amina livres na coroa, os quais foram previamente ativados por tratamento com anidrido succínico numa solução de N,N-dimetilformamida, na gama de 5 a 12%, durante 6 horas sob agitação suave constante. Os nanossistemas são seguidamente dializados contra água durante 18 horas, tempo ao fim do qual os nanossistemas são retirados da manga de diálise. Segue-se a adição de 1 mL de uma solução 0,1 M de N-(3dimetilaminopropil)-Ν'-etilcarbodiimida por cada 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparamgnético seguida de agitação suave durante 30 minutos. Após este procedimento de ativação do nanossistema multifuncional superparamgnético procede-se à adição imediata da solução contendo o anticorpo trastuzumab, no volume e concentração já descritos. A mistura reacional é colocada em agitação suave durante 2 horas a 4²C. Os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos obtidos são separados do meio reacional por cromatografia de exclusão de tamanhos. A percentagem de grupos funcionais conjugados ao anticorpo trastuzumab nos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de sílica/sílica híbrida situa-se na gama de 20 a 40%. A retenção de atividade biológica do anticorpo trastuzumab nos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de sílica/sílica híbrida situa-se na gama de 50 a 80%.

2.4 Conjugação com péptido no nanossistema multifuncional superparamagnético

Considerando como exemplo a conjugação do péptido c (RGDfK) ou (cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)); aos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de sílica/sílica híbrida, procede-se à solubilização do péptido, na concentração final de 0,1 mg/mL, em tampão bicarbonato 0,1 M, pH 8,5. Um volume de 0,2 mL desta solução é adicionado a um volume de 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparamagnético com grupos amina livres na coroa, os quais foram previamente ativados por tratamento com anidrido succinico numa solução de N,Ndimetilformamida, na gama de 5 a 12%, durante 6 horas sob agitação suave constante. Os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos são seguidamente dializados contra água durante 18 horas, tempo ao fim do qual os nanossistemas são retirados da manga de diálise. Segue-se a adição de 1 mL de uma solução 0,1 M de N-(3-dimetilaminopropil)-Ν'etilcarbodiimida por cada 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparamgnético seguida de agitação suave durante 30 minutos. Após este procedimento de ativação do nanossistema multifuncional superparamgnético procede-se à adição imediata da solução contendo o péptido, no volume e concentração já descritos. A mistura reacional é colocada em agitação suave durante 2 horas a 4²C. Os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos obtidos são separados do meio reacional por cromatografia de exclusão de tamanhos. A percentagem de grupos funcionais conjugados ao péptido nos nanossistemas

multifuncionais	superparamagnéticos	de	silica/silica
híbrida situa-se	na gama de 10 a	30%.	A retenção de
atividade biológica do péptido	nos	nanossistemas
multifuncionais	superparamagnéticos	de	silica/silica
híbrida situa-se	na gama de 30 a 40%.

3. Conjugação de polímero no nanossistema multifuncional superparamagnético

Nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de silica/silica híbrida com grupos amina livres são suspendidos em solução tampão de pH na gama 8 a 9. A um determinado volume de suspensão de nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos é adicionado um volume igual de metoxi-polietilenoglicol succinimidil valerato 5 mg/mL dissolvido em tampão de pH na gama 8 a 9. Temos como exemplo a conjugação do polímero polietilenoglicol de massa molecular média 400 Dalton, possuindo uma das extremidades reativas pela presença do succinimidil valerato, como já referido. A mistura é preparada sob agitação suave à temperatura ambiente, permanecendo em agitação durante 4 horas. Os nanossistemas são separados do reagente em excesso por processos de separação adequados. Os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de silica/sílica híbrida conjugados com cadeias de polímero polietilenoglicol de massa molecular média 400 Dalton são caracterizados comparativamente com os nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos iniciais e quantificados os grupos amina que permanecem livres após a conjugação utilizando técnicas analíticas apropriadas. O comprimento de cadeia do polímero utilizado poderá variar numa gama de massa molecular média de 40 a 6000 Dalton. O polímero polietilenoglicol pode ser constituído por uma cadeia linear ou por uma cadeia ramificada com dois ou mais braços em que o comprimento das cadeias poderá variar nas gamas já referidas. A cadeia de polímero contém grupos reativos aos quais se ligam uma ou mais biomoléculas.

Também poderá ser utilizado polímero de polietilenoglicol de cadeia linear nas gamas de massa molecular média já referida contendo grupos funcionais nas duas extremidades possibilitando a ligação aos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de silica/sílica híbrida, tal como já descrito, e em que na outra extremidade existe um grupo funcional, por exemplo um grupo amina.

3.1 Conjugação com polímero com proteínas (enzimas) no nanossistema multifuncional superparamagnético

Considerando como exemplo a ligação da enzima Lasparaginase a um grupo amina situado na extremidade da cadeia de polímero que está ligado aos nanossistemas multifuncionais superparamagnético de sílica/sílica híbrida, procede-se ao tratamento destes grupos com anidrido succínico numa solução de N,N-dimetilformamida, na gama de 5 a 12%, durante 6 horas sob agitação suave constante. Os nanossistemas são seguidamente dializados contra água durante 18 horas, tempo ao fim do qual os nanossistemas são retirados da manga de diálise. Segue-se a adição de 1 mL de uma solução 0,1 M de N-(3dimetilaminopropil)-Ν'-etilcarbodiimida por cada 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparaamgnético a conjugar com a biomolécula seguida de agitação suave durante 30 minutos.

Seguidamente para proceder à conjugação da enzima Lasparaginase aos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de sílica/sílica híbrida com cadeias de polietilienoglicol com a extermidade ativada, procede-se à solubilização da enzima L-asparaginase, na concentração de 1,2χ10Γ⁶ M numa solução de tampão carbonatos 50 mM, pH 9,4. Um volume de 1 mL desta solução é adicionado a um volume de 5 mL de suspensão de nanossistema multifuncional superparamgnético previamente ativado como já descrito. A mistura reacional é colocada em agitação suave durante 2 horas a 4²C. Os nanosistemas multifuncionais superparamagnéticos obtidos são separados do meio reacional por cromatografia de exclusão de tamanhos. A percentagem de grupos funcionais conjugados à L-asparaginase na extermidade de cadeias de polietilenoglicol à superfície de nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de silica/silica híbrida situa-se na gama de 35 a 45%. A retenção de atividade biológica da L-asparaginase nos nanossistemas multifuncionais superparamagnéticos de silica/silica híbrida situa-se na gama de 60 a 80%.

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(19) Burns, A.; Ow, H.; Wiesner, U., Fluorescent core-shell sílica nanoparticles: towards Lab on a Particle architectures for nanobiotechnology. Chem. Soc. Rev. 2006, 35, 1028-1042.

(20) U.I. Tromsdorf, N. C. Bigall, M. G. Kaul, O. T. Bruns, M. S. Nikolic, B. Mollwitz, R. Sperling, R. Reimer, H. Hohenberg, W. J. Parak, S. Foster, U. Beisiegel, G. Adam,H. Weller, Size and Surface Effects on the MRI relaxivity of manganese ferrite nanoparticle contrast agents NANO LETTERS 2007 Vol. 7, No.8 2422-2427.

Claims (5)

1. Método de produção de nanossistema multifuncional superparamagnético como agente de contraste para imagem por ressonância magnética formado por uma estrutura núcleo-coroa em que os núcleos são formados por nanopartícuias de óxido de ferro ou espinelas mistas, caracterizado por compreender os seguintes passos:

a) Síntese de nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro, constituindo o núcleo do nanossistema, por co-precipitação de iões de ferro (II) e ferro (III), ou por redução-precipitação de iões de ferro (III), em presença de uma solução aquosa de amónia, sob agitação magnética ou em ultra-sons, ou em alternativa;

b) Síntese de nanopartícuias superparamagnéticas de espinelas mistas, como Co_xFe2-x04, Mn_xFe2-xO4, (Co,Mn)_xFe2x04 ou outras, constituindo o núcleo do nanossistema, por redução-precipitação, co-precipitação de catiões divalentes e de Fe (III) em meio básico, ou por síntese organometálica, sob agitação magnética ou em ultrasons ;

c) Revestimento das nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro ou de espinelas mistas por sílica híbrida, constituindo a coroa, do núcleo do nanossistema obtido nos passos a) ou b) com mistura de uma solução de 95-80 mL/100mL de etanol, de 3-1.5 mL/100 mL de amónia e de 3-1 mL/100mL de água, sob forte agitação magnética, com adição de precursores organometálicos de sílica, inorgânicos e híbridos, nomeadamente, tetraetilortosilicato (TEOS) e viniltrietoxisilano (VTES) na proporção molar 9:1; ou tetraetilortosilicato (TEOS) e glicidoxipropilmetildietoxisilano (GPTMS) nas proporções molares 9:1 e 5:5.

2. Método de produção de nanossistema multifuncional superparamagnético, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a conjugação de biomoléculas por ligação covalente entre os grupos funcionais orgânicos e inorgânicos, presentes na coroa do nanossistema multifuncional superparamagnético e os grupos reativos disponíveis e acessíveis à superfície das biomoléculas.

3. Método de produção de nanossistema multifuncional superparamagnético, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por as biomoléculas serem escolhidas de um dos seguintes grupos: proteínas, péptidos, enzimas, anticorpos.

4. Método de produção de nanossistema multifuncional superparamagnético, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por compreender os seguintes passos:

a) Ativação do nanossistema multifuncional, por tratamento com anidrido succínico sob agitação suave constante;

b) Diálise do nanossistema multifuncional em água;

c) Solubilização da biomécula seguida da sua adição à suspensão contendo o nanossistema multifuncional;

d) Incubação da mistura reacional sob agitação suave;

e) Separação do nanossistema multifuncional do meio reacional.

5. Método de produção de nanossistema multifuncional superparamagnético, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a conjugação com biomoléculas ocorrer de forma simultânea ou faseada.