PT106220A - METHOD FOR THE PREPARATION OF THREE-DIMENSIONAL STRUCTURES BASED ON LISTS OF PLATELETS PROCESSED BY SUPERCRYTIC TECHNOLOGY - Google Patents

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PT106220A
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PT10622012A
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Inventor
Maria Manuela Estima Gomes
Joao Filipe Colardelle Da Luz Mano
Ana Rita Cruz Duarte
Rui Luis Goncalves Dos Reis
Vitor Sergio Soares Do Espirito Santo
Original Assignee
Ass For The Advancement Of Tissue Engineering Cell Based Technologies & Therapies A4Tec Associacao
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Abstract

ESTA INVENÇÃO DESCREVE UM MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA MATRIZ TRIDIMENSIONAL À BASE DE LISADOS DE PLAQUETAS PROCESSADOS POR TECNOLOGIA SUPERCRITICA COM POTENCIAL APLICAÇÃO NA REGENERAÇÃO DE TECIDOS MOLES, NA REGENERAÇÃO DE TECIDOS DUROS, COMO RESERVATÓRIOS DE LIBERTAÇÃO CONTROLADA E AGENTES BIOACTIVOS E/OU ENCHIMENTOS, NO SENTIDO DE FORNECER UMA ESTRUTURA POROSA E INTERCONECTADA, DE SUPORTE AO CRESCIMENTO DE CÉLULAS E/OU FAZER A LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE UMA(S) PROTEÍNA E/OU FACTOR(ES) DE CRESCIMENTO E/OU DE UM ADITIVO BIOACTIVO E/OU INDUZIR A MINERALIZAÇÃO DA MATRIZ. EM PARTICULAR, ESTA INVENÇÃO RELATA UM PROCESSO UNITÁRIO PARA PROMOVER A PRECIPITAÇÃO POR INVERSÃO DE FASES DE UMA MATRIZ À BASE DE LISADOS DE PLAQUETAS AO MESMO TEMPO QUE A ESTRUTURA É RETICULADA, UTILIZANDO UMA TECNOLOGIA LIMPA, NOMEADAMENTE, ATRAVÉS DO USO DE FLUIDOS COMPRIMIDOS.This invention describes a method of preparing a three-dimensional matrix based on laminates processed by supercritical technology with a potential application in the regulation of soft tissues, in the regenation of hard tissues, as controlled release and bioactive agents and / or fillers. THE SENSE OF PROVIDING A POROUS AND INTERCONNECTED STRUCTURE, SUPPORT FOR CELL GROWTH AND / OR CONTROLLED RELEASE OF A PROTEIN AND / OR GROWTH FACTOR (S) AND / OR A BIOACTIVE ADDITIVE AND / OR INDUCING MINERALIZATION OF THE MATRIX. In particular, this invention relates to a unitary process for promoting the precipitation by the inverse of phases of a matrix based on platelets, at the same time as the structure is reticulated, using a clean technology, in particular, by the use of compressed fluids.

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE ESTRUTURAS TRIDIMENSIONAIS À BASE DE USADOS DE PLAQUETAS PROCESSADOS POR TECNOLOGIA SUPERCRÍTICA"METHOD FOR PREPARING THREE-DIMENSIONAL STRUCTURES BASED ON USES OF PLATELETS PROCESSED BY SUPERCRYTIC TECHNOLOGY "

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION

Esta invenção refere-se a um novo processo unitário para a preparação de estruturas tridimensionais à base de lisados de plaquetas, com base em tecnologia supercritica.This invention relates to a novel unit process for the preparation of three-dimensional structures based on platelet lysates, based on supercritical technology.

Os lisados de plaquetas referem-se a uma alta concentração de plaquetas em um pequeno volume de plasma que, quando activadas, libertam factores de crescimento diversos que podem actuar no sentido do processo de cura e, simultaneamente, formar uma malha de micro / nanofibras, o que pode resultar numa matriz tridimensional. No entanto esta matriz tridimensional não apresenta grande estabilidade e robustez, pelo que as suas aplicações estão limitadas. Na presente invenção desenvolvemos um método de preparação de matrizes tridimensionais de lisados de plaquetas, reticulados, que podem ainda ser aditivados com polímeros e/ou agente bioactivos, com base em tecnologia supercritica.Platelet lysates refer to a high concentration of platelets in a small volume of plasma which, when activated, release various growth factors that may act towards the curing process and simultaneously form a micro / nanofiber mesh, which can result in a three-dimensional matrix. However, this three-dimensional matrix does not present great stability and robustness, reason why its applications are limited. In the present invention we have developed a method of preparing three-dimensional matrices of crosslinked platelet lysates which can be further supplemented with bioactive polymers and / or agents based on supercritical technology.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A activação de plaquetas, após o isolamento destas a partir de amostras do sangue, dá origem a um concentrado de proteínas bioactivas cujo potencial tem vindo a ser explorado em várias aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, assim como noutras aplicações biomédicas, não sendo, consequentemente, por si só uma tecnologia disruptiva e inovadora. Propriedades interessantes dos lisados de plaquetas surgem da activação das mesmas, o que leva à libertação de vários factores de crescimento, que podem actuar em direcção ao processo de cura. Os lisados de plaquetas podem ser, simultaneamente, utilizados como um sistema de encapsulamento de células, devido à sua capacidade de formar um gel na presença de determinados iões como cálcio. Os lisados de plaquetas podem ser preparados a partir de sangue do próprio paciente, o 2 que por conseguinte, eliminando preocupações de transmissão de doenças ou resposta imunológicas, devido à sua origem autóloga. A maior parte das estratégias descritas na utilização de lisados de plaquetas envolvem a criação de uma estrutura gelificada à base de reticulação iónica com iões de cálcio. No entanto, este procedimento leva a degradação rápida e instabilidade relativa da estrutura, o que se traduz numa importante desvantagem para a sua aplicação. O documento 1 (Santo, 2011) descreve o desenvolvimento de matrizes tridimensionais baseadas em ácido poliláctico preparadas por tecnologia de espumagem com recurso a fluídos supercríticos. Estes materiais foram impregnados com nanopartículas de quitosano e sulfato de condroitina para libertação controlada de proteínas. Neste trabalho, a possibilidade de introduzir melhorias na funcionalidade da estrutura tridimensional através da inclusão do sistema de libertação controlada é explorada. A tecnologia descrita neste documento, apesar de recorrer igualmente a fluidos supercríticos, é desenvolvida através de outra téncnica e não é feita qualquer referência ao uso de lisados de plaquetas. O documento 2 (Zaky, 2008) descreve o uso de lisados de plaquetas como suplemento para culturas in vitro de células estaminais humanas de medula óssea. Durante o estudo foi demonstrado que os lisados de plaquetas funcionam como um substituto efectivo do soro fetal bovino para expansão in vitro de células estaminais de medula óssea para aplicações futuras em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Neste trabalho, os lisados são apenas aplicados enquanto suplemento de meio de cultura e não existe qualquer referência à sua utilização enquanto suporte tridimensional e/ou processamento com tecnologia supercritica. O documento 3 (Salvadè 2010) revela a validação de um protocol de engenharia de tecidos para regeneração óssea através da combinação de células estaminais mesenquimais cultivadas em lisados de plaquetas com suportes tridimensionais de hidroxiapatite "CLINICAL GRADE", de modo a desenvolver uma estratégia que siga os parâmetros GMP. O desenvolvimento de uma matriz tridimensional de lisados de plaqueta não é referenciado neste trabalho assim como não é menctionado o processamento com tecnologia supercritica. 3 0 documento 4 (Santo 2010) descreve a utilização de lisados de plaquetas como concentrado de agentes bioactivos para encapsulamento em nanopartículas de quitosano/sulfato de condroitina e consequente libertação controlada dos factores encapsulados. Estas nanopartículas foram usadas como suplementos de cultura de células ou utilizadas para impregnar matrizes tridimensionais de ácido poliláctico produzidas por tecnologia supercrítica. Neste trabalho, os lisados foram apenas utilizados como fonte de proteínas e não existe qualquer referência nem quanto à sua utilização no desenvolvimento das estruturas tridimensionais descritas nem ao processamento com tecnologia supercrítica. O documento 5 (Rinki, 2010) refere a preparação de matrizes tridimensionais de quitosano reticuladas com genipina através de tecnologia supercrítica. O material foi testado para aplicações em engenharia de tecidos, em particular com análise de bioactividade e combinação com osteoblastos. Neste trabalho não existe qualquer referência à utilização de lisados de plaquetas.BACKGROUND OF THE INVENTION Activation of platelets after their isolation from blood samples gives rise to a bioactive protein concentrate whose potential has been exploited in various applications in tissue engineering and regenerative medicine as well as in other biomedical applications , and is therefore not by itself a disruptive and innovative technology. Interesting properties of platelet lysates arise from their activation, which leads to the release of various growth factors, which may act towards the healing process. Platelet lysates can be simultaneously used as a cell encapsulation system because of their ability to form a gel in the presence of certain ions such as calcium. Platelet lysates can be prepared from the patient's own blood, thereby eliminating concerns of transmission of disease or immune response, due to their autologous origin. Most of the strategies described in the use of platelet lysates involve the creation of a gel structure based on ionic crosslinking with calcium ions. However, this procedure leads to rapid degradation and relative instability of the structure, which translates into an important disadvantage for its application. Document 1 (Santo, 2011) describes the development of three-dimensional polylactic acid-based matrices prepared by supercritical fluids using foaming technology. These materials were impregnated with chitosan and chondroitin sulfate nanoparticles for controlled release of proteins. In this work, the possibility of introducing improvements in the functionality of the three-dimensional structure through the inclusion of the controlled release system is explored. The technology described herein, while also utilizing supercritical fluids, is developed by another technique and no reference is made to the use of platelet lysates. Document 2 (Zaky, 2008) describes the use of platelet lysates as a supplement for in vitro cultures of human bone marrow stem cells. During the study, platelet lysates have been shown to function as an effective substitute for fetal bovine serum for in vitro expansion of bone marrow stem cells for future tissue engineering and regenerative medicine applications. In this work, lysates are only applied as a culture medium supplement and there is no reference to their use as a three-dimensional support and / or processing with supercritical technology. Document 3 (Salvadè 2010) reveals the validation of a tissue engineering protocol for bone regeneration by combining cultured mesenchymal stem cells in platelet lysates with three-dimensional hydroxyapatite supports " CLINICAL GRADE ", in order to develop a strategy that follow the GMP parameters. The development of a three-dimensional array of platelet lysates is not referenced in this work as the processing with supercritical technology is not addressed. Document 4 (Santo 2010) describes the use of platelet lysates as a concentrate of bioactive agents for encapsulation in chitosan / chondroitin sulfate nanoparticles and consequent controlled release of the encapsulated factors. These nanoparticles were used as cell culture supplements or used to impregnate three-dimensional polylactic acid matrices produced by supercritical technology. In this work, the lysates were only used as a source of proteins and there is no reference either to their use in the development of the described three-dimensional structures or to processing with supercritical technology. Document 5 (Rinki, 2010) reports the preparation of three-dimensional matrices of chitosan crosslinked with genipine through supercritical technology. The material has been tested for tissue engineering applications, in particular with bioactivity analysis and combination with osteoblasts. In this work there is no reference to the use of platelet lysates.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Esta invenção pode ser ilustrada adicionalmente através dos desenhos que a acompanham: A Figura 1 representa um esquema ilustrativo de uma instalação laboratorial que pode ser usada na execução desta invenção. A Figura 2 representa o perfil de libertação de proteína total da estrutura preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A Figura 3 , representa as secções transversais do material produzido de acordo com a experiência descrita no Exemplo 2. A Figura 4 , representa a estrutura tridimensional a partir da experiência descrita no Exemplo 3 e analisada por microtomografia computarizada. A Figura 5 ilustra a integração e estabilidade da estrutura produzida de acordo com a experiência descrita no Exemplo 3, quando implantada subcutaneamente num rato, após três meses de implantação. 4This invention may be further illustrated by the accompanying drawings: Figure 1 is an illustrative scheme of a laboratory facility that may be used in the practice of this invention. Figure 2 depicts the total protein release profile of the structure prepared according to the procedure described in Example 1. Figure 3 shows the cross-sections of the material produced according to the experiment described in Example 2. Figure 4 represents the three-dimensional structure from the experiment described in Example 3 and analyzed by computerized microtomography. Figure 5 illustrates the integration and stability of the structure produced according to the experience described in Example 3, when implanted subcutaneously in a mouse, after three months of implantation. 4

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

Esta invenção descreve um método de preparação de uma matriz tridimensional à base de lisados de plaquetas processados por tecnologia supercritica com potencial aplicação na regeneração de tecidos moles, na regeneração de tecidos duros, como reservatórios de libertação controlada e agentes bioactivos e/ou enchimentos, no sentido de fornecer uma estrutura porosa e interconectada, de suporte ao crescimento de células e/ou fazer a libertação controlada de uma(s) proteína e/ou factor(es) de crescimento e/ou de um aditivo bioactivo e/ou induzir a mineralização da matriz. Em particular, esta invenção relata um processo unitário para promover a precipitação por inversão de fases de uma matriz à base de lisados de plaquetas ao mesmo tempo que a estrutura é reticulada, utilizando uma tecnologia limpa, nomeadamente, através do uso de fluidos comprimidos.This invention describes a method of preparing a three-dimensional matrix based on platelet lysates processed by supercritical technology with potential application in soft tissue regeneration, regeneration of hard tissues, as controlled release reservoirs and bioactive agents and / or fillers, in the in order to provide a porous and interconnected structure to support the growth of cells and / or to release controlled growth protein (s) and / or growth factor (s) and / or a bioactive additive and / or induce mineralization of the matrix. In particular, this invention relates to a unitary process for promoting phase inversion precipitation of a matrix based on platelet lysates at the same time as the structure is cross-linked using a clean technology, namely through the use of compressed fluids.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A preparação de matrizes tridimensionais à base de lisados de plaquetas com potencial aplicação na regeneração de tecidos moles, na regeneração de tecidos duros, como reservatórios de libertação controlada e agentes bioactivos e/ou enchimentos, que permite fornecer uma estrutura porosa e interconectada de suporte ao crescimento de células e/ou fazer a libertação controlada de uma(a) proteína(a) e/ou factor(es) de crescimentou e/ou de um aditivo e/ou induzir a mineralização da matriz. É então, muito vantajoso possuir um método de preparação das matrizes tridimensionais à base de lisados de plaquetas que não altere e/ou danifique as suas propriedades físicas e mecânicas e que não degrade os seus constituintes. Isto permitirá que, por exemplo, seja possível ter matrizes impregnadas com o aditivo, ou conjunto de aditivos pretendidos de acordo com o fim a que se destina a matriz.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The preparation of three-dimensional matrixes based on platelet lysates with potential application in soft tissue regeneration, regeneration of hard tissues, as controlled release reservoirs and bioactive agents and / or fillers, which allows to provide a porous structure and (a) protein and / or growth factor (s) and / or an additive and / or induce mineralization of the matrix. It is therefore very advantageous to have a method of preparing three-dimensional matrices based on platelet lysates which does not alter and / or damage its physical and mechanical properties and does not degrade its constituents. This will enable, for example, it is possible to have matrices impregnated with the additive, or set of desired additives according to the purpose for which the matrix is intended.

Nenhum outro método permite obter as estruturas tridimensionais obtidas com o método descrito, que apresente as caracteristicas morfológicas, biológicas, topográficas, mecânicas e fisico-quimicas adequadas às aplicações previstas na presente invenção. As matrizes tridimensionais processadas são constituídas por lisados de plaquetas e podem 5 ainda ser constituídas por um polímero, ou um conjunto de polímeros biocompatíveis que podem ser ou não biodegradáveis. Podem ainda ser dispersos na matriz um aditivo bioactivo, e/ou um conjunto de aditivos bioactivos. A presente invenção descreve um processo unitário para promover a precipitação por inversão de fases de uma matriz à base de lisados de plaquetas ao mesmo tempo que a estrutura é reticulada, utlizando uma tecnologia limpa, nomeadamente, através do uso de fluidos comprimidos.No other method makes it possible to obtain the three-dimensional structures obtained with the described method, which presents the morphological, biological, topographical, mechanical and physico-chemical characteristics suitable for the applications contemplated in the present invention. The processed three-dimensional matrices are comprised of platelet lysates and may further comprise a polymer, or a set of biocompatible polymers which may or may not be biodegradable. A bioactive additive, and / or a set of bioactive additives, may also be dispersed in the matrix. The present invention describes a unitary process for promoting phase reversal precipitation of a matrix based on platelet lysates at the same time as the structure is cross-linked using a clean technology, namely through the use of compressed fluids.

Mais concretamente, constitui objecto da presente invenção um método de preparação de uma matriz tridimensional à base de lisados de plaquetas processados por tecnologia supercritica com potencial aplicação na regeneração de tecidos moles, na regeneração de tecidos duros, como reservatórios de libertação controlada e agentes bioactivos e/ou enchimentos, no sentido de fornecer uma estrutura porosa e interconectada, de suporte ao crescimento de células e/ou fazer a libertação controlada de uma(s) proteína e/ou factores de crescimento e/ou de um aditivo e/ou induzir a mineralização da matriz. O modelo de realização a que se refere a presente invenção compreende os seguintes passos (instalação representada na figura 1): - introduzir um fluido comprimido 1, ou mistura de fluidos comprimidos 2, através de um compressor/bomba de líquidos 3, num reactor de alta pressão selado A, colocado num banho, ou forno, de temperatura controlada B, contendo a matriz de lisados de plaquetas, o agente reticulante e o aditivo, ou conjunto de aditivos, a processar. Um co-solvente inerte e, de preferência, não tóxico 7 pode ser adicionado através de um compressor/bomba de líquidos 8; - fechar a válvula 9 e manter o fluido comprimido, num estado líquido, líquido sub-crítico ou supercrítico, no interior do reactor A, em condições preestabelecidas de temperatura e pressão, num modo estático ou agitado, durante um período de tempo pré-determinado. Desta forma é promovida a precipitação das proteínas presentes, ao mesmo tempo que a estrutura é reticulada, criando assim uma matriz tridimensional. - abrir a válvula 4 (e a válvula 5, no caso da utilização de um co-solvente) e pressurizar todo o sistema até se atingir uma nova pressão pré-estabelecida e abrir lentamente a válvula 9 e a válvula de expansão micrométrica 10, a um caudal muito baixo; 6 - manter constante este baixo caudal (o caudal é verificado através de um caudalímetro FM) de fluido comprimido, ou de mistura de fluidos comprimidos, ou de mistura de fluido comprimido e co-solvente, através de todo o sistema, em condições preestabelecidas de temperatura e de pressão, e num modo estático ou agitados no reactor selado de alta pressão A, durante um período de tempo pré-determinado, de forma a promover a remoção da água constituinte da solução de lisados de plaquetas; A quantidade do co-solvente ulitizada no processo, é recuperada numa armadilha de recolha arrefecida (ou não arrefecida) T, podendo este ser purificado e reutilizado; - após este período de tempo pré-determinado, no caso da utilização de co-solvente, fechar a válvula 5 e manter abertas as válvulas 9 e 10, fazendo passar uma corrente de fluido comprimido, ou de mistura de fluidos comprimidos a um baixo caudal, por forma a promover a secagem da estrutura. - remover completamente o fluido comprimido, ou a mistura de fluidos comprimidos, ou a mistura de fluido comprimido e co-solvente, através de uma expansão lenta do reactor de pressão, de forma a não alterar/danificar a matriz tridimensional produzida. - abrir o reactor selado A e recuperar a matriz tridimensional.More particularly, the object of the present invention is a method of preparing a three-dimensional matrix based on platelet lysates processed by supercritical technology with potential application in soft tissue regeneration, regeneration of hard tissues, such as controlled release reservoirs and bioactive agents and or fillers in order to provide a porous and interconnected structure for supporting the growth of cells and / or to cause controlled release of a protein (s) and / or growth factors and / or an additive and / or inducing mineralization of the matrix. The embodiment according to the present invention comprises the following steps (the installation shown in figure 1): - introducing a compressed fluid 1, or mixture of compressed fluids 2, through a liquid pump / compressor 3 into a reaction vessel high pressure sealed A, placed in a bath or oven, temperature controlled B, containing the array of platelet lysates, the crosslinking agent and the additive, or set of additives, to be processed. An inert, and preferably non-toxic co-solvent 7 may be added through a liquid pump / compressor 8; - closing the valve 9 and keeping the fluid compressed, in a liquid, subcritical or supercritical liquid state, inside the reactor A, under pre-set conditions of temperature and pressure, in a static or agitated mode, for a predetermined period of time . In this way the precipitation of the present proteins is promoted, at the same time that the structure is reticulated, thus creating a three-dimensional matrix. - opening the valve 4 (and valve 5 in the case of using a co-solvent) and pressurizing the entire system until a new set pressure is reached and slowly opening the valve 9 and the micrometric expansion valve 10, a very low flow rate; 6 - keeping this low flow constant (the flow rate checked through an FM flowmeter) of compressed fluid, or mixing of compressed fluids, or mixing of compressed fluid and co-solvent, throughout the system under pre-set conditions of temperature and pressure and in a static or agitated mode in the sealed high-pressure reactor A for a predetermined period of time in order to promote removal of the constituent water from the platelet lysate solution; The amount of the co-solvent used in the process is recovered in a cooled (or uncooled) T trap, which can be purified and reused; - after this predetermined time period, in the case of the use of co-solvent, closing the valve 5 and keeping the valves 9 and 10 open, passing a stream of compressed fluid, or mixing of compressed fluids at a low flow rate , in order to promote the drying of the structure. - completely removing the compressed fluid, or the mixture of compressed fluids, or the mixture of compressed fluid and cosolvent, by slow expansion of the pressure reactor, so as not to alter / damage the three-dimensional matrix produced. - opening the sealed reactor A and recovering the three-dimensional matrix.

No caso de uma substância pura um fluido diz-se estar num estado supercrítico quando os valores de temperatura e pressão em que se encontra são superiores à sua temperatura e pressão crítica.In the case of a pure substance a fluid is said to be in a supercritical state when the values of temperature and pressure in which it is present are higher than its temperature and critical pressure.

Neste documento consideramos que um fluido comprimido é um fluido puro, a pressões suficientemente elevadas, que pode existir num estado líquido, líquido subcrítico ou supercrítico. Consideramos ainda que uma mistura de fluidos comprimidos é uma mistura de dois ou mais fluidos, a pressões relativamente elevadas, que pode existir num estado líquido, líquido sub-crítico ou supercrítico.In this document we consider that a compressed fluid is a pure fluid at sufficiently high pressures, which may exist in a liquid, subcritical or supercritical liquid state. We further envisage that a mixture of compressed fluids is a mixture of two or more fluids, at relatively high pressures, which may exist in a liquid, subcritical or supercritical liquid state.

Na Tabela 1 apresentam-se vários exemplos, não limitativos, de fluidos que podem ser úteis para o método apresentado nesta invenção, e os seus valores de temperatura e pressão crítica. Outros fluidos podem igualmente ser úteis no método descrito nesta invenção tais como, por exemplo: azoto, óxido nítrico, etanol, metanol, hexafluoreto de enxofre, ciclo-hexano, metano, tolueno, pxileno, tetrafluormetano, perfluoretano, 7 tetrafluoretileno, 1,1-difluoretileno. Adicionalmente, podem ser usadas misturas de dois ou mais dos fluidos indicados acima e na Tabela 1.Several non-limiting examples of fluids that may be useful for the method disclosed in this invention and their temperature and critical pressure values are set forth in Table 1. Other fluids may also be useful in the method described in this invention such as, for example, nitrogen, nitric oxide, ethanol, methanol, sulfur hexafluoride, cyclohexane, methane, toluene, pxylene, tetrafluoromethane, perfluoroethane, tetrafluoroethylene, 1,1 -difluoroethylene. In addition, mixtures of two or more of the fluids indicated above and in Table 1 may be used.

Tabela 1 - Pontos críticos de vários fluidos purosTable 1 - Critical points of various pure fluids

Fluido Tc/K Pc/ bar Dióxido de carbono 304.1 73.8 Etano 305.4 48.8 Etileno 282.4 50.4 Propano 369.8 42.5 Propileno 364.9 46.0 Trifluormetano 299.3 48.6 Clorotrifluometano 302.0 38.7 T riclorofluormetano 471.2 44.1 n-Pentano 469.7 33.7 Água 647.3 221.2 Amoníaco 405.5 113.5Fluid Tc / K Pc / bar Carbon dioxide 304.1 73.8 Ethane 305.4 48.8 Ethylene 282.4 50.4 Propane 369.8 42.5 Propylene 364.9 46.0 Trifluoromethane 299.3 48.6 Chlorotrifluoromethane 302.0 38.7 Triclorofluoromethane 471.2 44.1 n-Pentane 469.7 33.7 Water 647.3 221.2 Ammonia 405.5 113.5

Em produtos para consumo humano, a presença residual de solventes orgânicos, perigosos e/ou tóxicos, é rigorosamente estabelecida e controlada por organizações e regulamentos de segurança internacionais. Assim, é necessário garantir a completa remoção e a ausência destas substâncias sem, no entanto, expor as substâncias presentes (proteínas, aditivos bioactivos e/ou polímeros) a temperaturas elevadas, as quais podem eventualmente degradar termicamente. Neste sentido, alguns fluidos comprimidos são, sem sombra de dúvida, solventes alternativos muito interessantes e úteis.In products for human consumption, the residual presence of organic, hazardous and / or toxic solvents is strictly established and controlled by international safety organizations and regulations. Thus, it is necessary to ensure the complete removal and absence of these substances without exposing the substances present (proteins, bioactive additives and / or polymers) to elevated temperatures, which may eventually thermally degrade. In this sense, some compressed fluids are undoubtedly very interesting and useful alternative solvents.

Além disto, os fluidos comprimidos, e em particular os fluidos supercríticos, possuem algumas propriedades semelhantes às dos líquidos (densidade, capacidade de dissolução) e outras propriedades semelhantes às dos gases (propriedades de transporte). Assim sendo, e simplificando um pouco, isto pode significar que um fluido supercrítico pode penetrar com facilidade no interior de matrizes sólidas e extrair, ou precipitar, substâncias 8 nessas mesmas matrizes. Isto pode ser feito através de uma simples manipulação da pressão. Finalmente, uma outra vantagem muito importante resulta da fácil eliminação dos solventes usados, com a consequente recuperação dos produtos finais de uma forma fácil e barata, quando comparados com os processos tradicionais de impregnação, e sem quaisquer vestígios residuais de solventes.In addition, compressed fluids, and in particular supercritical fluids, have some properties similar to liquids (density, dissolving ability) and other properties similar to gases (transport properties). Thus, and somewhat simplifying, this may mean that a supercritical fluid can easily penetrate inside solid arrays and extract, or precipitate, substances in these same arrays. This can be done by simply manipulating the pressure. Finally, another very important advantage results from the easy elimination of the solvents used, with the consequent recovery of the end products easily and inexpensively compared to the traditional impregnation processes, and without any residual trace amounts of solvents.

Deve escolher-se preferencialmente um fluido comprimido, ou mistura deles, que seja inerte e não-reactivo com os aditivos, ou conjunto de aditivos bioactivos, e com as proteínas, os polímeros e copolímeros usados no método desta invenção. Preferencialmente, o fluido comprimido, ou a mistura destes fluidos, deve ser muito volátil ou estar num estado gasoso, às condições atmosféricas, de forma a facilitar a sua remoção por expansão e/ou evaporação, após o processo ter lugar. Por motivos de segurança, o fluido comprimido, ou a mistura destes fluidos, deve ainda ser não-tóxico e não-inflamável e deve poder ser reciclável para uso futuro. A utilização de um co-solvente poderá mehorar as propriedades do fluidos comprimido, ou mistura de fluidos e deverá ser bastante volátil e pouco ou mesmo não tóxico. Alguns exemplos mais comuns, embora não limitativos, de co-solventes úteis para o método desta invenção são os alcoóis de baixo peso molecular, como o etanol, e embora menos usado o metanol.A compressed fluid, or mixture thereof, which is inert and non-reactive with the additives, or set of bioactive additives, and the proteins, polymers and copolymers used in the method of this invention should preferably be chosen. Preferably, the compressed fluid, or the mixture of these fluids, must be very volatile or in a gaseous state, at atmospheric conditions, so as to facilitate their removal by expansion and / or evaporation, after the process takes place. For safety reasons, the compressed fluid, or the mixture of these fluids, must still be non-toxic and non-flammable and must be recyclable for future use. The use of a cosolvent may enhance the properties of the compressed, fluid or fluid fluids and should be very volatile and poorly or non-toxic. Some common but non-limiting examples of cosolvents useful for the method of this invention are low molecular alcohols, such as ethanol, and although less commonly used methanol.

Para o desenvolvimento deste método, o fluido comprimido, ou a mistura de fluidos comprimidos, ou a mistura de fluido comprimido e co-solvente, não devem conseguir dissolver a matriz tridimensional usadas no método descrito nesta invenção. No entanto, devem ter nela alguma solubilidade e a capacidade de penetrar e inchar em certo grau. Este fenómeno irá permitir a remoção da totalidade dos solventes garantindo as normas de presença de solventes residuais estabelecidas nas directivas legais.For the development of this method, the compressed fluid, or the mixture of compressed fluids, or the mixture of compressed fluid and cosolvent, should not be able to dissolve the three-dimensional matrix used in the method described in this invention. However, they must have some solubility and the ability to penetrate and swell to some degree. This phenomenon will allow the removal of all solvents, ensuring the presence of residual solvents established in the legal directives.

Finalmente, é ainda de extrema importância que o fluido comprimido, ou mistura de fluidos comprimidos, ou mistura de fluido comprimido e co-solvente, não altere e/ou danifique as propriedades das matrizes usadas no método desta invenção.Finally, it is still of extreme importance that the compressed fluid, or mixture of compressed fluids, or mixture of compressed fluid and cosolvent, does not alter and / or damage the properties of the matrices used in the method of this invention.

Assim, e para o método da presente invenção, as condições operacionais de temperatura e de pressão poderão variar muito e deverão ser escolhidas tendo como critérios principais: o ponto crítico do fluido comprimido (ou da mistura de fluidos comprimidos), a 9 solubilidade do aditivo (ou do conjunto de aditivos bioactivos) no fluido comprimido (ou na mistura de fluidos comprimidos), e a solubilidade do fluido comprimido (ou da mistura de fluidos comprimidos) nas matriz. Por várias razões, o dióxido de carbono (C02) é um fluido vantajoso e útil para ser usado no método da presente invenção. Tem um ponto crítico relativamente fácil de atingir (Tc = 304,1 K e pc = 73,8 bar), o qual pode evitar a degradação de substâncias termicamente lábeis, é não-tóxico e não-inflamável, tem um carácter não poluente, tem um custo relativamente baixo e é abundante na natureza. Além disto, é relativamente inerte com a maioria das espécies químicas. Desta forma, e sempre que possível e vantajoso, recomenda-se o uso de dióxido de carbono para o método descrito nesta invenção.Thus, for the method of the present invention, the operating conditions of temperature and pressure may vary widely and should be chosen having as main criteria: the critical point of the compressed fluid (or the mixture of compressed fluids), the solubility of the additive (or set of bioactive additives) in the compressed fluid (or in the mixture of compressed fluids), and the solubility of the compressed fluid (or the mixture of compressed fluids) in the matrix. For various reasons, carbon dioxide (CO2) is an advantageous and useful fluid for use in the method of the present invention. It has a relatively easy to reach critical point (Tc = 304.1 K and pc = 73.8 bar), which can prevent the degradation of thermally labile substances, is non-toxic and non-flammable, non-polluting, has a relatively low cost and is abundant in nature. In addition, it is relatively inert with most chemical species. In this manner, and wherever possible and advantageous, the use of carbon dioxide is recommended for the method described in this invention.

Os lisados de plaquetas são um concentrado de proteínas bioactivas obtidas a partir da activação das plaquetas, após o isolamento destas a partir de amostras de sangue. Este processamento pode ser efectuado através de ciclos de centrifugação de modo a remover os restantes componentes celulares presentes no sangue, tais como glóbulos vermelhos, ou através de equipamentos próprios equipados com sensores de densidade e absorvância. Existem vários termos na literatura para definir produtos derivados do sangue e caracterizados por um volume enriquecido de plaquetas, nomeadamente "plasma rico em plaquetas", "concentrado de plaquetas", "fibrina rica em plaquetas", entre outros.Platelet lysates are a concentrate of bioactive proteins obtained from the activation of platelets after their isolation from blood samples. This processing may be effected by centrifugation cycles in order to remove the remaining cellular components present in the blood, such as red blood cells, or through proprietary equipment equipped with density and absorbance sensors. There are various terms in the literature for defining blood products and characterized by an enriched platelet volume, namely " platelet rich plasma ", " platelet concentrate " " platelet rich fibrin ", among others.

Estes concentrados de proteínas são constituídos por uma série de agentes bioactivos conhecidos por promover a proliferação e diferenciação de culturas de células primárias e estaminais, bem como a estimulação de processos de regeneração de tecidos após implante.These protein concentrates consist of a number of bioactive agents known to promote proliferation and differentiation of primary and stem cell cultures, as well as stimulation of tissue regeneration processes after implantation.

Os lisados de plaquetas apresentam uma série de vantagens, nomeadamente, o seu acesso rápido, a possibilidade de utilização autóloga, a utilização de concentrações de proteínas ao nível fisiológico, a acção sinergística das várias moléculas constituintes e o seu baixo custo. Os lisados de plaquetas são constituídos por uma série de factores de crescimento e citocinas envolvidas em diferentes cascatas de regulação, nomeadamente 10 ao nível da resposta inflamatória e processos de regeneração de tecidos moles e tecidos duros. A activação das plaquetas pode ser efectuada por diversas metodologias, incluindo ciclos de temperatura (congelamento, descongelamento), acção mecânica, trombina e cloreto de cálcio. Todos estas metodologias promovem uma lise das plaquetas e consequente libertação dos factores bioactivos armazenados nos grânulos presentes nas plaquetas. O método de activação pode levar a diferentes percentagens de sucesso neste processo de desgranulação mas todos eles levam à formação do concentrado de proteínas. O concentrado de plaquetas pode estar disperso em plasma derivado do sangue ou numa solução tamponada própria para promover a estabilidade das plaquetas.Platelet lysates have a number of advantages, namely their rapid access, the possibility of autologous use, the use of physiological concentrations of proteins, the synergistic action of the various constituent molecules and their low cost. Platelet lysates consist of a series of growth factors and cytokines involved in different regulation cascades, namely 10 at the level of the inflammatory response and regeneration processes of soft tissues and hard tissues. Activation of platelets can be effected by various methodologies, including cycles of temperature (freezing, thawing), mechanical action, thrombin, and calcium chloride. All these methodologies promote platelet lysis and consequent release of the bioactive factors stored in the granules present in the platelets. The activation method may lead to different percentages of success in this degranulation process but all of them lead to the formation of the protein concentrate. The platelet concentrate may be dispersed in blood derived plasma or in a buffered solution itself to promote platelet stability.

Os lisados de plaquetas oferecem a possibilidade de serem utilizados como suplemento de culturas celulares in vitro ou como método de substituição da utilização de soro de origem animal. Por outro lado, os lisados apresentam ainda a vantagem de poderem ser processados em estruturas tridimensionais, tais como hidrogéis e suportes sólidos. No entanto, tipicamente estes materiais apresentam taxas de degradação consideravelmente rápidas, uma vez que o processo se assemelha ao verificado no processo de coagulação no ser humano. Estas taxas de degradação conduzem a uma redução significativa das dimensões iniciais do material preparado à base de lisados, o que se traduz num elevado grau de ineficácia ao nível da estabilidade de implantes e de uma ineficácia em suportar a regeneração de tecidos em diferentes cenários clínicos no ser humano. A metodologia desenvolvida e descrita nesta invenção promove a formação de matrizes tridimensionais autólogas, porosas, interconectadas e bioactivas com um elevado grau de estabilidade a longo termo. As estruturas podem ser obtidas através da utilização de lisados de plaquetas activadas por diferentes metodologias acima enumeradas.Platelet lysates offer the possibility of being used as a supplement for in vitro cell cultures or as a substitution method for the use of animal serum. On the other hand, the lysates also have the advantage that they can be processed in three-dimensional structures, such as hydrogels and solid supports. However, typically these materials exhibit considerably rapid degradation rates, since the process resembles that seen in the coagulation process in humans. These degradation rates lead to a significant reduction of the initial dimensions of the prepared lysate-based material, which translates into a high degree of ineffectiveness in implant stability and an ineffectiveness in supporting tissue regeneration in different clinical settings in the human being. The methodology developed and described in this invention promotes the formation of autologous, porous, interconnected and bioactive tridimensional matrices with a high degree of long term stability. Structures can be obtained through the use of activated platelet lysates by the different methodologies enumerated above.

Os aditivos considerados na presente invenção classificam-se em quatro categorias: agentes reticulantes, materiais poliméricos, agentes com acção farmacológica e materiais cerâmicos bioactivos.The additives contemplated in the present invention fall into four categories: crosslinking agents, polymeric materials, pharmacological agents and bioactive ceramic materials.

Os agentes reticulantes são moléculas que contêm duas ou mais extremidades quimicamente reactivas capazes de ligar grupos funcionais específicos. Os agentes 11 reticulantes que podem ser utilizados no método da presente invenção incluem, agentes reticulantes com um grupo funcional especifico que reagirá com aminas, grupos sulfídricos, carboxílicos, carbonilos e hidroxilos; agentes reticulantes com duas extremidades reactivas, idênticas ou diferentes; agentes reticulantes hidrofílicos ou hidrofóbicos; agentes reticulantes que incluam elementos cliváveis; agentes reticulantes com diferentes extensões moleculares. Exemplos não limitativos dos agentes reticulantes que podem ser utilizados no método descrito na presente invenção inlcuem: p-Azidobenzoil hidrazida, A/-(a-Maleimidoacetoxi)-succinimida éster; N- 5-Azido-2-nitrobenziloxi-succinimida; A/-(4-[p-Azidosalicilamido]butil)- 3’-(2'-piridilditio) propionamida; 4-(p-Azidosalicilamido)-butilamina; Bis (P-[4-azidosalicilamido]etil) disulfida; l,4-S/s-Maleimidobutano; β/s-Maleimidohexano; β/s-Maleimidoethano; Λ/-(β-acido maleimidopropiónico)hydrazida.TFA; A/-(P-Maleimidopropiloxi)succinimida éster; l,8-S/s-Maleimidodietilene-glicol; Ι,ΙΙ-β/s-Maleimidotrietileneglicol; Bis (sulfosuccinimidil)glutarato-do; Bis (sulfosuccinimidil)2,2,4,4-glutarato-d4 Bis (sulfosuccinimidil)suberato; Bis (NHS)PEG5; Bis (NHS)PEG9; Bis(2-[succinimidoxicarboniloxi]etil)sulfona; C6-Succinimidil 4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona; C6-Succinimidil 4-formilbenzoato; ty/V-Diciclohexilcarbodiimida; 1-5-Difluoro-2,4-dinitrobenzeno; Dimetil adipimidato.2HCI; Dimetil pimelimidato.2HCI; Dimetil suberimidato.2HCI; l,4-Di-(3'-[2'piridilditio]propionamido) butano; Disuccinimidil glutarato; Ditiobis(succimidilpropionato); Disuccinimidil suberato; Disuccinimidil tartarato; Dimetil 3,3'-ditiobispropionimidato.2HCI; Ditiobis-maleimidoetano; 3,3'-Ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato); l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida hidroclorido; Etileno glicol fa/s(succinimidilsuccinato); ácido /V-s-maleimidocapróico; A/-(e-ácido maleimidocapróico)hidrazida; A/-(s-maleimidocaproíloxi)succinimida éster; Λ/-(γ-maleimidobutiriloxi)succinimida éster; ácido A/-K-maleimidoundecanóico; N-(k- ácido maleimidoundecanóico)hidrazida; NHS-LC-Diazirina; Succinimidil 4-(A/-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxi-(6-amidocaproato); Succinimidil 6-(3'-[2- piridilditio]propionamido)hexanoato; AT7-maleimidobenzoíl-/\/-hidroxisuccinimida ester; 4-(4-N-Maleimidofenil)-ácido butírico hidrazida.HCI; 2-[/\/2-(4-Azido-2,3,5,6- 12 tetrafluorobenzoil)-A/6-(6-biotinamidocaproil)-L-lisinil]etilmetanetiosulfato; 2-{Λ/2-[Ν6-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-/\/6-(6-biotinamidocaproil)-L-lisinil; /V-Hidroxisuccinimidil-4- ácido azidosalicilico; 3-(2-Piridilditio)propionilhidrazida; A/-(p-Maleimidofenil)isocianato; Succinimidil 4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona; /V-Succinimidil6-(4,-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato; Succinimidil-3-(bromoacetamido)propionato; NHS-Diazirina; NHS-SS-Diazirina; Succinimidil-4-formilbenzoato; Succinimidil4-hidrazidotereftalato hidroclorato; /V-succinimidil iodoacetato; A/-Succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato; Succinimidil4-(/V-maleimido-metil)ciclohexano-l- carboxilato; NHS-PEG2-Maliemida; NHS-PEG4-Maliemida; NHS-PEG6-Maleimida; NHS-PEG8-Maliemida; NHS-PEG12-Maliemida; NHS-PEG24-Maleimida; Succinimidil-4-(p-maleimido-fenil)butirato; Succinimidil-6-(P-maleimidopropionamido)hexanoato; 4-Succinimidiloxicarbonil-metil-a-(2- piridilditio)tolueno; Succinimidil-(4-psoralen-8-iloxi)butirato; /V-Succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato; Etileno glicol bis (sulfo-succinimidil succinato); Λ/-(ε-maleimidocaproíloxi)sulfosuccinimida éster; /V-(Y-Maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster; /V-Hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato; N-( k-Crosslinking agents are molecules which contain two or more chemically reactive ends capable of binding specific functional groups. Crosslinking agents which may be used in the method of the present invention include crosslinking agents having a specific functional group which will react with amines, sulfuric, carboxylic, carbonyl and hydroxyl groups; crosslinking agents having two identical or different reactive ends; hydrophilic or hydrophobic crosslinking agents; crosslinking agents including cleavable elements; crosslinking agents with different molecular extensions. Non-limiting examples of the crosslinking agents that may be used in the method described in the present invention include: p-Azidobenzoyl hydrazide, N - (α-Maleimidoacetoxy) -succinimide ester; N-5-Azido-2-nitrobenzyloxy-succinimide; N - (4- [p-Azidosalicylamido] butyl) -3 '- (2'-pyridyldithio) propionamide; 4- (p-Azidosalicylamido) butylamine; Bis (P- [4-azidosalicylamido] ethyl) disulfide; 1,4-S / s-Maleimidobutane; β / s-Maleimidohexane; β / s-Maleimidoethane; Λ / - (β-maleimidopropionic acid) hydrazide.TFA; A / - (P-Maleimidopropyloxy) succinimide ester; 1,8-S / s-Maleimidodiethylene glycol; Ι, ΙΙ-β / s-Maleimidotriethylene glycol; Bis (sulfosuccinimidyl) glutarate-do; Bis (sulfosuccinimidyl) 2,2,4,4-glutarate-d4 Bis (sulfosuccinimidyl) suberate; Bis (NHS) PEG5; Bis (NHS) PEG9; Bis (2- [succinimidoxycarbonyloxy] ethyl) sulfone; C6-Succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone; C6-Succinimidyl 4-formylbenzoate; ty / V-Dicyclohexylcarbodiimide; 1-5-Difluoro-2,4-dinitrobenzene; Dimethyl adipimidate.2HCl; Dimethyl pimelimidate.2HCl; Dimethyl suberimidate.2HCl; 1,4-Di- (3 '- [2'-pyridyldithio] propionamido) butane; Disuccinimidyl glutarate; Dithiobis (succinimidylpropionate); Disuccinimidyl suberate; Disuccinimidyl tartrate; Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate.2HCl; Dithiobis-maleimidoethane; 3,3'-Dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate); 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride; Ethylene glycol fa / s (succinimidylsuccinate); β-maleimidocaproic acid; A / - (e-maleimidocaproic acid) hydrazide; Î ± - (β-maleimidocaproyloxy) succinimide ester; Γ / - (γ-maleimidobutyryloxy) succinimide ester; Î ± -K-maleimidoundecanoic acid; N- (k-maleimidoundecanoic acid) hydrazide; NHS-LC-Diazirine; Succinimidyl 4- (N -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxy (6-amidocaproate); Succinimidyl 6- (3 '- [2-pyridyldithio] propionamido) hexanoate; AT7-maleimidobenzoyl- [1-hydroxysuccinimide ester; 4- (4-N-Maleimidophenyl) -butyric acid hydrazide.HCl; 2- [4- [2- (4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl) -A- 6- (6-biotinamidocaproyl) -L-lysinyl] ethyl methanesulfate; 2- {[2- [6- (4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl) - [6- (6-biotinamidocaproyl) -L-lysinyl; / V-Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicyclic acid; 3- (2-Pyridyldithio) propionylhydrazide; Î ± - (β-Maleimidophenyl) isocyanate; Succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone; N-Succinimidyl- (4, -azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate; Succinimidyl-3- (bromoacetamido) propionate; NHS-Diazirine; NHS-SS-Diazirine; Succinimidyl-4-formylbenzoate; Succinimidyl 4 hydrazidoterephthalate hydrochlorate; / V-succinimidyl iodoacetate; N-Succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate; Succinimidyl 4- (N -maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate; NHS-PEG2-Maliemide; NHS-PEG4-Maliemide; NHS-PEG6-Maleimide; NHS-PEG8-Maliemide; NHS-PEG12-Maliemide; NHS-PEG24-Maleimide; Succinimidyl-4- (p-maleimido-phenyl) butyrate; Succinimidyl-6- (P-maleimidopropionamido) hexanoate; 4-Succinimidyloxycarbonylmethyl-α- (2-pyridyldithio) toluene; Succinimidyl- (4-psoralen-8-yloxy) butyrate; / V-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate; Ethylene glycol bis (sulfo-succinimidyl succinate); Λ / - (ε-maleimidocaproyloxy) sulfosuccinimide ester; / V- (Y-Maleimidobutryloxy) sulfosuccinimide ester; / V-Hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate; N- (4-

Maleimidoundecanoíloxi)sulfosuccinimida éster; Sulfo-NHS-LC-Diazirina; Sulfosuccinimidil 6-(a-metil-a-[2-piridilditio]-toluamido) hexanoato; Sulfosuccinimidil 6-(3'-[2-piridilditio] propionamido)hexanoato; m-Maleimidobenzoíl-ZV-hidroxisulfosuccinimida éster; Sulfosuccinimidil(4-azido-salicilamido) hexanoato; Sulfosuccimidil 2-[7-azido-4-metilcoumarin-3-acetamido]etil-l,3'-ditiopropionato; Sulfosuccinimidil-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)etil l,3'-ditiopropionato; Sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato; Sulfo-NHS-(2-6-[Biotinamido]-2-(p-azidobezamido); Sulfo-NHS-Diazirina; Sulfo-NHS-SS-Diazirina; Sulfosuccinimidil(perfluoroazidobenzamido) etil l,3'-ditiopropionato; Sulfosuccinimidil(4-iodo-acetil)aminobenzoato; Sulfosuccinimidil 4-(A/-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato; Sulfosuccinimidil 4-(p- maleimidofenil)butirato; β-(Τ ris[hidroximetil]fosfina) ácido propiónico; Tris-{2-Maleimidoetil)amina; 7ns-(succimimidil aminotricetato), glutaraldeído e genipina.Maleimidoundecanoyloxy) sulfosuccinimide ester; Sulfo-NHS-LC-Diazirine; Sulfosuccinimidyl 6- (Î ± -methyl-Î ± - [2-pyridyldithio] -toluamido) hexanoate; Sulfosuccinimidyl 6- (3 '- [2-pyridyldithio] propionamido) hexanoate; m-Maleimidobenzoyl-Z-hydroxysulfosuccinimide ester; Sulfosuccinimidyl (4-azido-salicylamido) hexanoate; Sulfosuccimidil 2- [7-azido-4-methylcoumarin-3-acetamido] ethyl-1,3'-dithiopropionate; Sulfosuccinimidyl-2- (m-azido-o-nitrobenzamido) ethyl 1,3-dithiopropionate; Sulfosuccinimidyl 6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate; Sulfo-NHS- (2-6- [Biotinamido] -2- (p-azidobezamido) Sulfo-NHS-Diazirine Sulfo-NHS-SS-Diazirine Sulfosuccinimidyl (perfluoroazidobenzamido) ethyl 1,3-dithiopropionate Sulfosuccinimidyl (hydroxymethyl) phosphino) propionic acid, Tris (2-hydroxyethyl) aminobenzoate, 4- (N -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, Sulfocuccinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate; Maleimidoethyl) amine; 7ns- (succinimidyl aminotricetate), glutaraldehyde and genipine.

Misturas de lisados de plaquetas com materiais poliméricos podem ser processados, de acordo com o método descrito nesta invenção, por forma a conferir maior robustez e 13 estabilidade à estrutura preparada. As matrizes poliméricas abrangidas nesta invenção podem incluir qualquer polímero biocompatível e biodegradável que seja apropriado para esta invenção específica. O termo biocompatível usado nesta invenção, descreve um material que não é substanciavelmente tóxico para o corpo humano e que não induz significativamente inflamação ou outra resposta adversa por parte do corpo humano e seus tecidos.Mixtures of platelet lysates with polymeric materials may be processed according to the method described in this invention so as to impart greater strength and stability to the prepared structure. The polymer matrices covered in this invention may include any biocompatible and biodegradable polymer which is suitable for this specific invention. The term biocompatible used in this invention describes a material which is not substantially toxic to the human body and which does not significantly induce inflammation or other adverse response by the human body and its tissues.

Entre os polímeros biocompatíveis biodegradáveis temos como exemplos não limitativos, o ácido poliláctico, poliglicólico, suas misturas e copolímeros, tais como, poli (L-ácido láctico), poli (D-L-ácido láctico) (PLA); ácido poliglicólico [poliglicosídeo (PGA)], e restantes misturas e copolímeros, poli (glicólico-co-trimetileno carbonato) (PGA/PTMC), poli (D, L-láctico-co-caprolactona) (PLA/PCL), poli (glicólico-co-caprolactona) (PGA/PCL); óxido de polietileno (PEO), polidioxanona (PDS), polipropileno fumarato, poli (etil glutamato-co-ácido glutamico), poli (tert-butiloxi-carbonilmetil glutamato), poli (carbonato-éster), policaprolactona (PCL), policaprolactona co-butilacrilato, polihidroxialcanoatos como o polihidroxibutirato (PHBT) e copolímeros de polihidroxibutirato com hidroxivalerato (PHB/HV) e, poli(fosfazeno), poli (éster fosfato), poli (ácido aminico) e poli (hidroxibutirato), polidepsipeptidos, copolímeros de acido maleico anidrido, polifosfazenos, poliiminocarbonatos, cianoacrilato, polietileno óxido, hidroxipropilmetilcelulose, polisacáridos como o ácido hialurónico, quitosano, dextrano e celulose regenerada, e proteínas como gelatina e colagénio, suas misturas e copolímeros. O termo biopolímero usado nesta invenção compreende uma larga variedade de polímeros sintetizados por organismos vivos, ou seja, polímeros de origem natural.Among the biodegradable biocompatible polymers we have non-limiting examples, polylactic, polyglycolic acid, their mixtures and copolymers, such as poly (L-lactic acid), poly (D-L-lactic acid) (PLA); polyglycolic acid (PGA), and other blends and copolymers, poly (glycol-co-trimethylene carbonate) (PGA / PTMC), poly (D, L- glycol-co-caprolactone) (PGA / PCL); polyoxyethylene (PEO), polydioxanone (PDS), polypropylene fumarate, poly (ethyl glutamate-co-glutamic acid), poly (tert-butyloxycarbonylmethyl glutamate), poly (carbonate ester), polycaprolactone (PCL), polycaprolactone (PHB / HV) and, poly (phosphazene), poly (phosphate ester), poly (aminic acid) and poly (hydroxybutyrate), polydepsipeptides, copolymers of acrylonitrile and polyhydroxybutyrate (PHBT) and polyhydroxybutyrate maleic anhydride, polyphosphazenes, polyiminocarbonates, cyanoacrylate, polyethylene oxide, hydroxypropylmethylcellulose, polysaccharides such as hyaluronic acid, chitosan, dextran and regenerated cellulose, and proteins such as gelatin and collagen, mixtures thereof and copolymers. The term biopolymer used in this invention comprises a wide variety of polymers synthesized by living organisms, i.e. polymers of natural origin.

Estes são classificados de acordo com sua estrutura em: ácidos nucleicos, poliamidas, polissacarídeos, polioxoesteres, politioesteres, polianidridos, poliisoprenoides e polifenois.These are classified according to their structure into: nucleic acids, polyamides, polysaccharides, polyoxoesters, polythioesters, polyanhydrides, polyisoprenoids and polyphenols.

Os biopolímeros usados nesta invenção podem incluir carrageno, pectina, alginatos (incluindo por exemplo, alginato de sódio, alginato de cálcio e suas misturas), xilanos, quitosano, quitina, colagénio (tipo I e II, modificados, e seus derivados), carboximetilcelulose, polissacarídeos, polipropileno glicóis, polietileno glicóis, 14 poliacetatos, liposomas, ácidos gordos complexos, ciclodextrinas, cicloamiloses, cicloalquilo amilases, polixilose, gomas de gelano e ácidos polilácticos. Os biopolímeros preferidos são os alginatos, carragenos, pectinas e suas misturas. O biopolímero pode também ser seleccionado de um grupo de, proteínas estruturais (queratina, laminina, fibrina, fibronectina e/ou outras, e suas misturas), derivados de celulose, derivados de amido, glicosaminoglicanos e suas misturas; queratina, laminina, fibrina ou fibronectina. Às matrizes tridimensionais à base de lisados de plaquetas podem ser adicionados agentes bioactivos, com acção farmacológica que podem ser dispersos durante o método de processamento descrito na presente invenção. De acordo com a presente invenção, podemos apresentar os seguintes exemplos, não limitativos: anti-inflamatórios esteroidais e corticosteroidais (prednisolona, metilprednisolona, fluorometolona, dexametasona, betametasona, hidrocortisona, medrysona, loteprednol, rimexolona, triamcinolona), anti-inflamatórios não esteroidais e anti-alergénicos (diclofenac, ketorolac, flurbiprofeno, indometacina, suprofeno, ibuprofeno, ketorolac trometamina, emedastina, levocabastina, azelastina, olopatadina, ketotifeno, cromolina, lodoxamida), análogos da prostaglandina (latanoproste, travoproste, bimatoproste), vitaminas e suplementos minerais (vitamina A (beta-caroteno), vitamina C (ácido ascorbico), vitamina E (dl-alfa-tocoferil acetato), zinco (óxido de zinco), cobre (óxido cúrpico), aminoglicosidas (gentamicina, tobramicina, neomicina), macrolidas (eritromicina, azitromicina, claritromicina), fluoroquinolonas (ofloxacine, ciprofloxacine, norfloxacine, levofloxacin), antivirais (aciclovir, valaciclovir, famciclovir), analgésicos (diclofenac, acetaminofeno, ácido acetilsaliciclico, ibuprofeno, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, tramadol), anti-histaminicos (difenhidramina, clorfeniramina, cetirizina, loratadina, desloratadina, fexofenadina), e misturas de duas ou mais das referidas drogas.The biopolymers used in this invention may include carrageenan, pectin, alginates (including, for example, sodium alginate, calcium alginate and mixtures thereof), xylanes, chitosan, chitin, collagen (type I and II, modified, and derivatives thereof), carboxymethylcellulose , polysaccharides, polypropylene glycols, polyethylene glycols, polyacetates, liposomes, complex fatty acids, cyclodextrins, cycloamyls, cycloalkyl amylases, polyxylose, gellan gums and polylactic acids. Preferred biopolymers are alginates, carrageenans, pectins and mixtures thereof. The biopolymer may also be selected from a group of structural proteins (keratin, laminin, fibrin, fibronectin and / or others, and mixtures thereof), cellulose derivatives, starch derivatives, glycosaminoglycans and mixtures thereof; keratin, laminin, fibrin or fibronectin. Three-dimensional matrixes based on platelet lysates may be added bioactive agents with pharmacological action which may be dispersed during the processing method described in the present invention. According to the present invention, the following non-limiting examples can be presented: steroidal and corticosteroidal anti-inflammatory drugs (prednisolone, methylprednisolone, fluorometholone, dexamethasone, betamethasone, hydrocortisone, medrysone, loteprednol, rimexolone, triamcinolone), nonsteroidal anti- anti-allergenic (diclofenac, ketorolac, flurbiprofen, indomethacin, suprofen, ibuprofen, ketorolac tromethamine, emedastine, levocabastine, azelastine, olopatadine, ketotifen, cromolyn, lodoxamide), prostaglandin analogues (latanoprost, travoprost, bimatoproste), vitamins and mineral supplements ( vitamin A (beta carotene), vitamin C (ascorbic acid), vitamin E (dl-alpha-tocopheryl acetate), zinc (zinc oxide), copper (cynic oxide), aminoglycosides (gentamicin, tobramycin, neomycin), macrolides ( erythromycin, azithromycin, clarithromycin), fluoroquinolones (ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, levofloxacin), antiviral drugs (acyclovir r, valaciclovir, famciclovir), analgesics (diclofenac, acetaminophen, acetylsalicylic acid, ibuprofen, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, tramadol), antihistamines (diphenhydramine, chlorpheniramine, cetirizine, loratadine, desloratadine, fexofenadine), and mixtures of two or more of such drugs.

Os agentes anti-microbianos podem ser quaisquer aditivos que sejam eficazes contra bactérias, algas, fungos, bolores, que possam causar odor, textura alterada, perda ou deterioração de qualquer propriedade física e/ou química. 15 "Agente anti-microbiano" como usado na presente invenção, refere-se essencialmente a qualquer antibiótico, antiséptico, desinfectante, etc., ou suas combinações, eficazes na inibição da viabilidade e/ou proliferação de um ou mais microorganismos.The antimicrobial agents may be any additives which are effective against bacteria, algae, fungi, molds, which may cause odor, altered texture, loss or deterioration of any physical and / or chemical property. &Quot; Anti-microbial agent " as used in the present invention, relates essentially to any antibiotic, antiseptic, disinfectant, etc., or combinations thereof, effective in inhibiting the viability and / or proliferation of one or more microorganisms.

Inúmeras classes de antibióticos são conhecidas e podem ser usadas no campo desta invenção. Tais antibióticos podem incluir, mas não necessariamente limitados, tetraciclinas (e.g., minociclina), rifamicinas (e.g., rifampicina), macrolidas (e.g., eritromicina), penicilinas (e.g., nafcilina), cefalosporinas (e.g., cefazolina), outros antibióticos beta-lactâmicos (e.g., imipenemo e aztreonamo), aminoglicosideos (e.g., gentamicina), cloramfenicol, sulfonamidas (e.g., sulfametoxazol), glicopéptidos (e.g., vancomicina), quinolonas (e.g., ciprofloxacina), ácido fusidico, trimetoprima, metronidazol, clindamicina, mupirocina, polienes (e.g., amfotericina B), inibidores de beta-lactamo, etc.Numerous classes of antibiotics are known and can be used in the field of this invention. Such antibiotics may include, but are not necessarily limited to, tetracyclines (eg, minocycline), rifamycins (eg, rifampicin), macrolides (eg, erythromycin), penicillins (eg, nafcillin), cephalosporins (eg, cefazolin), other beta-lactam antibiotics (eg, imipenem and aztreonam), aminoglycosides (eg, gentamicin), chloramphenicol, sulfonamides (eg, sulfamethoxazole), glycopeptides (eg vancomycin), quinolones (eg, ciprofloxacin), fusidic acid, trimethoprim, metronidazole, clindamycin, mupirocin, (eg, amphotericin B), beta-lactam inhibitors, etc.

Antisépticos e desinfectantes para aplicação nesta invenção podem incluir, por exemplo, hexaclorofeno, bisiguanidas catiónicas (e.g., clorohexidina, etc.), iodo and iodofores (e.g., iodo-povidona), para-cloro-meta-xilenol, preparações médicas de furano (e.g., nitrofurantoina, nitrofurazona), metenamina, aldeídos (glutaraldeído, formaldeído, etc.), álcoois, e outros conhecidos desinfectantes e antisépticos.Antiseptics and disinfectants for use in this invention may include, for example, hexachlorophene, cationic bisiguanides (eg, chlorohexidine, etc.), iodine and iodophores (eg, povidone iodine), para-chloro-meta-xylenol, medical preparations of furan ( eg, nitrofurantoin, nitrofurazone), methenamine, aldehydes (glutaraldehyde, formaldehyde, etc.), alcohols, and other known disinfectants and antiseptics.

Podem ainda ser dispersos na matriz tridimensional outros factores de crescimento e citocinas, que não aqueles presentes no concentrado de plaquetas inicial.Further growth factors and cytokines, other than those present in the initial platelet concentrate, may also be dispersed in the three-dimensional array.

Por forma a promover a mineralização das estruturas podem ser adicionados à matriz materiais inorgânicos, cerâmicos, vidros bioactivos e /ou vidros cerâmicos. São exemplos, não limitativos destes materiais bioactivos: calcite, aragonite, vaterite; silica como opalas; biovidros compostos por S1O2 (35-70 wt%), Na20 (10-40 wt%), CaO (ou MgO ou CaF2 ou Na20 com K20) (10-30 wt%), P205 (0-15 wt%), B203 (0-5wt%), Al203 (0-5 wt%); bioapatites com a fórmula geral Cai0-x+nXy(PO4)6-x(CO3)x(OH)2-x+, contando com a possibilidade de inclusão de iões (x) de C032' por P043' e a presença de óxidos e hidróxidos de ferro como a magnetite. 16 A quantidade do aditivo (ou do conjunto de aditivos) a dispersar nas matrizes a serem processados, pode ser directamente controlada através da sua concentração inicial e depende da aplicação a que a estrutura se destina. A duração do tratamento, ou tempo necessário, para o método descrito nesta invenção dependerá essencialmente da matriz de lisados de plaquetas a ser processada. Obviamente, e além disto, dependerão ainda da natureza dos polímeros e copolímeros (natureza química e física, peso molecular, grau de reticulação e ramificação, grau de cristalinidade, densidade, orientação, etc.), fluidos comprimidos (ou mistura de fluidos comprimidos), co-solventes, aditivo (ou conjunto de aditivos bioactivos) e das interacções específicas que possam ocorrer entre todas as substâncias postas em contacto, das condições operacionais aplicadas (temperatura, pressão, volume dos reactores de pressão, concentração, etc).In order to promote the mineralization of structures, inorganic materials, ceramics, bioactive glasses and / or ceramic glass may be added to the matrix. Non-limiting examples of such bioactive materials are: calcite, aragonite, vaterite; silica as opals; NaOH (10-40 wt%), CaO (or MgO or CaF2 or Na20 with K20) (10-30 wt%), P205 (0-15 wt%), B203 (0-5wt%), Al203 (0-5wt%); (x) of C032 'by P043' and the presence of oxides and (x) of C03 'in the presence of oxides and iron hydroxides such as magnetite. The amount of the additive (or set of additives) to be dispersed in the matrices to be processed, can be directly controlled by its initial concentration and depends on the application to which the structure is intended. The duration of treatment, or time required, for the method described in this invention will depend essentially on the array of platelet lysates to be processed. Obviously, and in addition, they will further depend on the nature of the polymers and copolymers (chemical and physical nature, molecular weight, degree of crosslinking and branching, degree of crystallinity, density, orientation, etc.), compressed fluids (or mixture of compressed fluids) (or bioactive additives), and the specific interactions that may occur between all the substances contacted, the operating conditions applied (temperature, pressure, volume of pressure reactors, concentration, etc.).

Como referido anteriormente, é apresentado um método genérico de implementação da presente invenção baseado num modelo semi-contínuo em relação ao fluido comprimido (ou à mistura de fluidos comprimidos). De acordo com a presente invenção os fluido supercritico preferencial é o dióxido de carbono, o co-colvente preferencial é o etanol e a razão preferencial entre os dois situa-se entre 80:20 e 60:40. Os parâmetros operacionais preferenciais situam-se entre os 303.15 K e os 313.15 K, 100 bar e 200 bar e os tempos de processamento típicos para obter o producto final desejado variam entre 30 e 600 minutos, sendo preferencialmente entre os 120 e 180 minutos, dependendo dos factores descritos acima.As noted above, there is shown a generic method of implementation of the present invention based on a semi-continuous model with respect to the compressed fluid (or the mixture of compressed fluids). According to the present invention the preferred supercritical fluid is carbon dioxide, the preferred co-solvent is ethanol and the preferred ratio between the two is between 80:20 and 60:40. Preferred operating parameters range from 303.15 K to 313.15 K, 100 bar and 200 bar and the typical processing times for obtaining the desired end product range from 30 to 600 minutes, preferably from 120 to 180 minutes, depending factors described above.

Devido à elevada volatilidade do fluido comprimido, ou da mistura de fluidos comprimidos, ou da mistura de fluido comprimido e co-solvente, a sua separação das matriz tridimensional processada é facilmente conseguida apenas por redução da pressão do sistema.Due to the high volatility of the compressed fluid, or the mixture of compressed fluids, or the mixture of compressed fluid and cosolvent, their separation of the processed three-dimensional matrix is easily achieved only by reducing the pressure of the system.

Como já referido, o método permitirá preparar um material com potencial aplicação na regeneração de tecidos moles, de tecidos duros, como reservatórios de libertação controlada de agentes bioactivos e/ou enchimentos. Devido às características operacionais particulares do método da presente invenção, é um método de impregnação 17 que não altera e/ou danifica as propriedades das matrizes e que não degrada os constituintes. A recuperação dos produtos finais é um processo simples e fácil, apenas efectuado por expansão do sistema, sendo os produtos recuperados num estado final seco e isento de solvente, sem a necessidade de qualquer passo adicional de secagem/evaporação (e sem os custos energéticos e de tempo de operação associados a estes processos). É ainda possível recuperar e reutilizar, de uma forma simples e fácil, os fluidos comprimidos usados e a quantidade remanescente de aditivo que não foi impregnado. São exemplos, não limitativos de potenciais aplicações dos materiais produzidos, regeneração de tecidos moles, regeneração de tecidos duros, reservatórios de libertação controlada de agentes activos e enchimentos.As already mentioned, the method will allow to prepare a material with potential application in the regeneration of soft tissues, of hard tissues, as reservoirs of controlled release of bioactive agents and / or fillers. Due to the particular operational characteristics of the method of the present invention, it is a impregnation method which does not alter and / or damage the properties of the matrices and which does not degrade the constituents. Recovery of final products is a simple and easy process, only effected by expansion of the system, the products being recovered in a dry and solvent-free final state, without the need for any additional drying / evaporation steps (and without the energy and associated with these processes). It is still possible to recover and reuse, in a simple and easy way, the used compressed fluids and the remaining amount of additive which has not been impregnated. Non-limiting examples of potential applications of the materials produced are soft tissue regeneration, hard tissue regeneration, controlled release reservoirs of active agents and fillers.

Esta invenção será adicionalmente ilustrada e descrita pelos seguintes exemplos não limitativos.This invention will be further illustrated and described by the following non-limiting examples.

Exemplo 1Example 1

Uma matriz tridimensional à base de lisados de plaquetas reticulada com genipin (0.25 wt%) (CAS 6902-77-8; Wako Chemicals, LAP0247) foi produzida pelo método acima referido, de acordo com a invenção e de acordo com a Figura 1. A solução de lisados de plaquetas e o agente reticulante foram colocados num reactor selado de alta-pressão, o qual foi pressurizado com uma mistura dióxido de carbono (pureza de 99,998%, Air Liquide) e etanol (CAS 64-17-15, Riedel de Haèn) numa proporção 80:20. As condições operacionais foram 100 bar e 37gC. O sistema foi fechado durante uma hora, tempo após o qual uma corrente de dióxido de carbono e etanol, na mesma proporção, passou pelo reactor, durante lhora a um caudal de 15 g/min. Depois deste passo, durante uma hora fez-se passar uma corrente de dióxido de carbono por forma a garantir a total remoção de solvente e a secagem da amostra. Após o tempo de processamento (3 horas, no caso deste exemplo), o reactor foi despressurizado e o fluido comprimido (dióxido de carbono) foi removido. Então, o reactor de alta pressão foi aberto e recuperou-se a matriz produzida. A figura 2 ilustra o perfil de libertação de proteína total do sistema produzido. 18A three-dimensional matrix based on platelet lysates crosslinked with genipin (0.25 wt%) (CAS 6902-77-8; Wako Chemicals, LAP0247) was produced by the above method, according to the invention and according to Figure 1. The solution of platelet lysates and the crosslinking agent were placed in a sealed high pressure reactor, which was pressurized with a mixture of carbon dioxide (purity of 99.998%, Air Liquide) and ethanol (CAS 64-17-15, Riedel de Haene) in an 80:20 ratio. The operating conditions were 100 bar and 37gC. The system was closed for one hour, after which time a stream of carbon dioxide and ethanol, in the same ratio, passed through the reactor, during 1 hour at a flow rate of 15 g / min. After this step, a stream of carbon dioxide was passed over an hour to ensure complete removal of solvent and drying of the sample. After the processing time (3 hours, in the case of this example), the reactor was depressurised and the compressed fluid (carbon dioxide) was removed. Then, the high pressure reactor was opened and the produced matrix was recovered. Figure 2 shows the total protein release profile of the system produced. 18

Exemplo 2Example 2

Uma matriz tridimensional à base de lisados de plaquetas reticulada com genipin (0.18 wt%) (CAS 6902-77-8; Wako Chemicals, LAP0247) foi produzida pelo método acima referido, de acordo com a invenção e de acordo com a Figura 1. A solução de lisados de plaquetas e o agente reticulante foram colocados num reactor selado de alta-pressão, o qual foi pressurizado com uma mistura dióxido de carbono (pureza de 99,998%, Air Liquide) e etanol (CAS 64-17-15, Riedel de Haèn) numa proporção 80:20. As condições operacionais foram 100 bar e 375C. O sistema foi fechado durante uma hora, tempo após o qual uma corrente de dióxido de carbono e etanol, na mesma proporção, passou pelo reactor, durante 1 hora a um caudal de 15 g/min. Depois deste passo, durante uma hora fez-se passar uma corrente de dióxido de carbono por forma a garantir a total remoção de solvente e a secagem da amostra. Após o tempo de processamento (3 horas, no caso deste exemplo), o reactor foi despressurizado e o fluido comprimido (dióxido de carbono) foi removido. Por fim, o reactor de alta pressão foi aberto e recuperou-se a matriz produzida. A matriz tridimensional obtida foi analisada por microtomografia computarizada e a figura 3 apresenta as várias secções transversais da estrutura tridimensional processada.A three-dimensional matrix based on platelets lysates crosslinked with genipin (0.18 wt%) (CAS 6902-77-8; Wako Chemicals, LAP0247) was produced by the above method, according to the invention and according to Figure 1. The solution of platelet lysates and the crosslinking agent were placed in a sealed high pressure reactor, which was pressurized with a mixture of carbon dioxide (purity of 99.998%, Air Liquide) and ethanol (CAS 64-17-15, Riedel de Haene) in an 80:20 ratio. The operating conditions were 100 bar and 375C. The system was closed for one hour, after which time a stream of carbon dioxide and ethanol in the same ratio passed through the reactor for 1 hour at a flow rate of 15 g / min. After this step, a stream of carbon dioxide was passed over an hour to ensure complete removal of solvent and drying of the sample. After the processing time (3 hours, in the case of this example), the reactor was depressurised and the compressed fluid (carbon dioxide) was removed. Finally, the high pressure reactor was opened and the produced matrix was recovered. The three-dimensional matrix obtained was analyzed by computerized microtomography and figure 3 shows the various cross sections of the three-dimensional structure processed.

Exemplo 3Example 3

Uma matriz tridimensional à base de lisados de plaquetas reticulada com genipin (0.18 wt%) (CAS 6902-77-8; Wako Chemicals, LAP0247), na presença de partículas de vidro bioactivo (2.5 wt%) (Bioglass® 45S5, com uma composição de 45% Si02, 24.5% CaO, 24.5% Na20 e 6% P2Os) foi produzida pelo método acima referido, de acordo com a invenção e de acordo com a Figura 1. A solução de lisados de plaquetas e o agente reticulante foram colocados num reactor selado de alta-pressão, o qual foi pressurizado com uma mistura dióxido de carbono (pureza de 99,998%, Air Liquide) e etanol (CAS 64-17-15, Riedel de Haèn) numa proporção 80:20. As condições operacionais foram 100 bar e 37^C. O sistema foi fechado durante uma hora, tempo após o qual uma corrente de dióxido de carbono e etanol, na mesma proporção, passou pelo reactor, durante lhora a um caudal de 15 g/min. Depois deste passo, durante uma hora fez-se passar uma corrente de dióxido de 19 carbono por forma a garantir a total remoção de solvente e a secagem da amostra. Após o tempo de processamento (3 horas, no caso deste exemplo), o reactor foi despressurizado e o fluido comprimido (dióxido de carbono) foi removido. Por fim, o reactor de alta pressão foi aberto e recuperou-se a matriz produzida. A matriz tridimensional obtida foi analisada por microtomografia computarizada e a reconstrução tridimensional da estrutura é apresentada na Figura 4.A three-dimensional matrix based on platelet lysates crosslinked with genipin (0.18 wt%) (CAS 6902-77-8; Wako Chemicals, LAP0247) in the presence of bioglass glass particles (2.5 wt%) (Bioglass® 45S5, composition of 45% SiO 2, 24.5% CaO, 24.5% Na 2 O and 6% P 2 O 5) was produced by the above method according to the invention and according to Figure 1. The solution of platelet lysates and the crosslinking agent were placed in a high pressure sealed reactor, which was pressurized with a mixture of carbon dioxide (purity of 99.998%, Air Liquide) and ethanol (CAS 64-17-15, Riedel de Haen) in an 80:20 ratio. The operating conditions were 100 bar and 37 ° C. The system was closed for one hour, after which time a stream of carbon dioxide and ethanol, in the same ratio, passed through the reactor, during 1 hour at a flow rate of 15 g / min. After this step, a stream of carbon dioxide was passed over an hour to ensure complete removal of solvent and drying of the sample. After the processing time (3 hours, in the case of this example), the reactor was depressurised and the compressed fluid (carbon dioxide) was removed. Finally, the high pressure reactor was opened and the produced matrix was recovered. The three-dimensional matrix obtained was analyzed by computerized microtomography and the three-dimensional reconstruction of the structure is presented in Figure 4.

As matrizes produzidas foram implantadas subcutamente em ratos e a figura 5 ilustra a integração e estabilidade da estrutura no animal após três meses de implantação.The matrices produced were implanted subcutaneously in rats and figure 5 illustrates the integration and stability of the structure in the animal after three months of implantation.

ReferênciasReferences

Santo, V. E. et al, 2011, The Journal of Supercritical Fluids, 54, p. 320-327Santo, V. et al., 2011, The Journal of Supercritical Fluids, 54, p. 320-327

Zaky, S. H. et al, 2008, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2, p. 472- 481Zaky, S. H. et al., 2008, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2, p. 472-481

Salvadè A., et al, 2010, Tissue Engineering: Part C, 16(2), p. 201-214Salvadè A. et al., 2010, Tissue Engineering: Part C, 16 (2), p. 201-214

Santo, V. E. et al, 2010, Nanoparticle-based platelet lysate release Systems for enhanced proliferation of human adipose derived stem cells in combinatory tissue engineering strategies, Semana de Engenharia da Universidade do Minho, Guimarães, 11 a 15 deSanto, V. et al., 2010, Nanoparticle-based platelet lysate release Systems for enhanced proliferation of human adipose derived stem cells in combinatory tissue engineering strategies, Engineering Week of the University of Minho, Guimarães, 11-15

OutubroOctober

Rinki, K., Dutta, P. K., 2010, International Journal of Biological Macromolecules, 46, p. 261-266 DATA: 21 Março 2013Rinki, K., Dutta, P. K., 2010, International Journal of Biological Macromolecules, 46, p. 261-266 DATE: March 21, 2013

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de preparação de uma matriz tridimensional à base de lisados de plaquetas caracterizado por recorrer ao uso de fluidos comprimidos para promover a precipitação por inversão de fases de uma matriz à base de lisados de plaquetas e um agente reticulante e um aditivo, ou conjunto de aditivos, nomeadamente um polímero e/ou conjunto de polímeros, um composto e/ou conjunto de compostos bioactivos e/ou misturas deles, ao mesmo tempo que a estrutura é reticulada.A method of preparing a three-dimensional matrix based on platelet lysates which comprises the use of compressed fluids to promote phase inversion precipitation of a matrix based on platelet lysates and a crosslinking agent and an additive , or set of additives, namely a polymer and / or set of polymers, a compound and / or set of bioactive compounds and / or mixtures thereof, at the same time as the structure is cross-linked. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela produção de estruturas com potencial aplicação na regeneração de tecidos moles ou de tecidos duros, como reservatórios de libertação controlada de agentes bioactivos e/ou enchimentos, no sentido de fornecer uma estrutura porosa e interconectada, de suporte ao crescimento de células e/ou fornecer uma libertação controlada de uma(s) proteína e/ou factores de crescimento e/ou de um aditivo e/ou induzira mineralização da matriz.Process according to claim 1, characterized in that the structures with potential application in the regeneration of soft tissues or hard tissues as reservoirs for the controlled release of bioactive agents and / or fillers, in order to provide a porous and interconnected structure , to support the growth of cells and / or to provide a controlled release of a protein (s) and / or growth factors and / or an additive and / or induce matrix mineralization. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado por compreender os seguintes passos: - contacto da solução de lisados de plaquetas, e agente reticulante e um aditivo, ou conjunto de aditivos, nomeadamente um polímero e/ou conjunto de polímeros, um composto e/ou conjunto de compostos bioactivos e/ou misturas deles com um fluido comprimido, ou mistura de fluidos comprimidos, ou mistura de fluidos comprimidos e um co-solvente, num estado líquido, líquido sub-crítico, gasoso ou supercrítico, a uma temperatura situada entre os 303.15 K e os 373.15 K e uma pressão entre os 30 e os 400 bar, por forma a promover a precipitação das proteínas presentes, ao mesmo tempo que a estrutura é reticulada, criando assim uma matriz tridimensional; - passagem de uma corrente de fluido comprimido, ou mistura de fluidos comprimidos, ou mistura de fluidos comprimidos e co-solvente através do reactor de alta-pressão com um 2 caudal controlado, durante um período de operação pre-determinado, que se pode situar entre os 30 e os 600 min por forma a garantir a remoção da agua presente no sistema; - redução da pressão, após o tempo de contacto, que poderá variar entre os 30 e os 600 min, através da remoção do fluido comprimido, ou mistura de fluidos comprimidos, ou mistura de fluidos comprimidos e co-solvente, e a recuperação da matriz tridimensional.A process according to claim 1 and 2, characterized in that it comprises the following steps: - contacting the solution of platelet lysates, and crosslinking agent and an additive, or set of additives, in particular a polymer and / or a set of polymers, a compound and / or set of bioactive compounds and / or mixtures thereof with a compressed fluid, or mixture of compressed fluids, or mixture of compressed fluids, and a co-solvent, in a liquid, subcritical, gaseous or supercritical liquid state, at a temperature between 303.15 K and 373.15 K and a pressure between 30 and 400 bar, in order to promote the precipitation of the present proteins, at the same time as the structure is reticulated, thus creating a three-dimensional matrix; passing a stream of compressed fluid or a mixture of compressed fluids or mixing of compressed fluids and cosolvent through the high pressure reactor in a controlled flow for a predetermined operating period which can be located between 30 and 600 min to ensure the removal of water present in the system; pressure reduction, after the contact time, which may vary between 30 and 600 min, by removal of the compressed fluid, or mixture of compressed fluids, or mixture of compressed fluids and cosolvent, and recovery of the matrix three-dimensional. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo facto de as matrizes tridimensionais processadas serem constituídas por lisados de plaquetas ou outros concentrados de plaquetas activadas, plasma rico em plaquetas, concentrado de plaquetas, fibrina rica em plaquetas, entre outros.A method according to any one of claims 1, 2 and 3, wherein the processed three-dimensional matrices are comprised of platelet lysates or other activated platelet concentrates, platelet rich plasma, platelet concentrate, platelet rich fibrin , among others. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo facto de as matrizes tridimensionais processadas serem constituídas por lisados de plaquetas reticulados.A method according to any one of claims 1, 2 and 3, characterized in that the processed three-dimensional matrices are comprised of cross-linked platelet lysates. 6. Método de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo facto de o agente reticulante que pode ser utilizado no método da presente invenção incluir um grupo funcional específico que reagirá com aminas, grupos sulfídrilos, carboxílicos, carbonilos e hidroxilos; agentes reticulantes com duas extremidades reactivas, idênticas ou diferentes; agentes reticulantes hidrofílicos ou hidrofóbicos; agentes reticulantes que incluam elementos cliváveis e/ou agentes reticulantes com diferentes extensões moleculares.A method according to claim 5, wherein the crosslinking agent that may be used in the method of the present invention includes a specific functional group which will react with amines, sulfhydryl, carboxylic, carbonyl and hydroxyl groups; crosslinking agents having two identical or different reactive ends; hydrophilic or hydrophobic crosslinking agents; crosslinking agents including cleavable elements and / or crosslinking agents with different molecular extensions. 7. Método de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo facto de as matrizes tridimensionais à base de lisados de plaquetas poderem ser aditivadas, de acordo com a invenção, com um polímero e/ou conjunto de polímeros, copolímeros ou misturas deles, lineares, ramificados ou reticulados.A method according to claims 1, 2 and 3, characterized in that the three-dimensional matrices based on platelet lysates can be added according to the invention with a polymer and / or set of polymers, copolymers or mixtures linear, branched or crosslinked. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo facto de na matrix tridimensional poder ser incluído um composto e/ou uma mistura de compostos bioactivos com acção farmacológica, tais como anti-inflamatórios esteroidais e corticosteroidais, anti-inflamatórios não esteroidais e anti-alergénicos, análogos da 3 prostaglandina, vitaminas e suplementos minerais, vitamina C, vitamina E, zinco, cobre, aminoglicosidas, macrolidas, fluoroquinolonas, antivirais , analgésicos, anti-histaminicos, e misturas de duas ou mais das referidas drogas, anti-microbianos, factores de crescimento e citocinas, que não aqueles presentes no concentrado de plaquetas inicial, materiais inorgânicos, cerâmicos, vidros bioactivos e /ou vidros cerâmicos.A method according to any one of claims 1, 2 and 3, characterized in that a compound and / or a mixture of bioactive compounds with pharmacological action, such as steroidal and corticosteroidal, anti-inflammatory non-steroidal and anti-allergic inflammatories, prostaglandin analogues, vitamins and mineral supplements, vitamin C, vitamin E, zinc, copper, aminoglycosides, macrolides, fluoroquinolones, antivirals, analgesics, antihistamines, and mixtures of two or more of the said drugs, antimicrobials, growth factors and cytokines, other than those present in the initial platelet concentrate, inorganic materials, ceramics, bioactive glasses and / or ceramic glasses. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo facto do solvente ser um fluido comprimido, ou uma mistura de fluidos comprimidos, ou uma mistura de fluidos comprimidos e um co-solvente, a pressões compreendidas entre 30 e 400 bar.A method according to any one of claims 1, 2 and 3, characterized in that the solvent is a compressed fluid, or a mixture of compressed fluids, or a mixture of compressed fluids and a co-solvent, at pressures between 30 and 400 bar. 10. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o fluido comprimido poder ser seleccionados entre dióxido de carbono, etano, etileno, propano, propileno, n-pentano, metano, trifluormetano, clorotrifluormetano, triclorofluormetano, água, amoníaco, azoto, óxido nítrico, etanol, metanol, hexafluoreto de enxofre, ciclo-hexano, tolueno, p-xileno, tetrafluormetano, perfluormetano, tetrafluoretileno, 1,1-difluoretileno, etc., e quaisquer misturas de dois, ou mais, fluidos comprimidos referidos acima.A method according to claim 9 wherein the compressed fluid may be selected from carbon dioxide, ethane, ethylene, propane, propylene, n-pentane, methane, trifluoromethane, chlorotrifluoromethane, trichlorofluoromethane, water, ammonia, nitrogen, nitric oxide , ethanol, methanol, sulfur hexafluoride, cyclohexane, toluene, p-xylene, tetrafluoromethane, perfluoromethane, tetrafluoroethylene, 1,1-difluoroethylene, etc., and any mixtures of two or more compressed fluids mentioned above. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo facto de o co-solvente ser uma substância seleccionada de entre hidrocarbonetos alifáticos de baixo peso molecular, álcoois alifáticos de baixo peso molecular, cetonas alifáticas de baixo peso molecular, éteres de baixo peso molecular, ésteres de baixo peso molecular, e éteres cíclicos de baixo peso molecular.A method according to any one of claims 1, 2 and 3, wherein the cosolvent is a substance selected from low molecular weight aliphatic hydrocarbons, low molecular weight aliphatic alcohols, low molecular weight aliphatic ketones , low molecular weight ethers, low molecular weight esters, and low molecular weight cyclic ethers. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por a temperatura de operação se situar entre os 303.15 K e os 373.15 K, preferencialmente entre os 308.15 K e os 313.15 K, e por poder variar ou ser mantida constante durante o processo. 4A method according to any one of claims 1, 2 and 3, characterized in that the operating temperature is between 303.15 K and 373.15 K, preferably between 308.15 K and 313.15 K, and because it can be varied or maintained constant during the process. 4 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por a pressão de operação se situar entre 30 bar e 400 bar, preferencialmente entre os 100 bar e os 200 bar e por poder variar ou ser mantida constante durante o processo.A method according to any one of claims 1, 2 and 3, characterized in that the operating pressure is between 30 bar and 400 bar, preferably between 100 bar and 200 bar and can be varied or kept constant during process. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por a razão entre o fluido supercrítico e o co-solvente poder variar entre 100:0 e 0:100, preferencialmente entre 80:20 e 60:40.A method according to any one of claims 1, 2 and 3, characterized in that the ratio of the supercritical fluid to the cosolvent can be from 100: 0 to 0: 100, preferably from 80:20 to 60:40. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por o tempo de operação se situar entre 30 e 600 minutos, preferencialmente entre 120 e 180 minutos.A method according to any one of claims 1, 2 and 3, characterized in that the operating time is between 30 and 600 minutes, preferably between 120 and 180 minutes.
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