PT106046A

PT106046A - DEVICE AND SIMPLIFIED METHOD FOR THE GENERATION OF STRETCHED TUBULAR TISSUE SUBSTITUTES

Info

Publication number: PT106046A
Application number: PT10604611A
Authority: PT
Inventors: Rui Luis Goncalves Dos Reis; Pedro Ferreira Da Costa; Maria Manuela Estima Gomes; Nuno Joao Meleiro Alves Das Neves; Albino Manuel Pereira Martins; Cedryck Vaquette; Dietmar Werner Hutmacher
Original assignee: A4Tec Ass For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies & Therapies
Priority date: 2011-12-07
Filing date: 2011-12-07
Publication date: 2013-06-07
Also published as: WO2013085404A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM DISPOSITIVO QUE PERMITE A CULTURA SIMULTÂNEA DE TIPOS CELULARES DISTINTOS EM MEMBRANAS POROSAS, ASSIM COMO TAMBÉM A UM MÉTODO DE FABRICO DE ESTRUTURAS TUBULARES ESTRATIFICADAS ORIGINADORAS DE SUBSTITUTOS TECIDULARES TUBULARES ESTRATIFICADOS. O DISPOSITIVO CONSISTE NUMA PEÇA RECTANGULAR INFERIOR (3) SOBRE A QUAL É CENTRALMENTE COLOCADA UMA MEMBRANA POROSA (4), UMA PEÇA MALEÁVEL DO TIPO FECHADO (5) OU ABERTO (6) DOTADA DE ESTRUTURAS TUBULARES (9) E QUE DEFINE PELO MENOS DUAS CAVIDADES CONTÍGUAS NA SUA SUPERFÍCIE INFERIOR COLOCADA SOBRE A PEÇA RECTANGULAR INFERIOR (3) E SOBRE ZONAS ESPECÍFICAS DA MEMBRANA POROSA (4), E POR UMA TERCEIRA PEÇA (7) COM PARAFUSOS (8), QUE COMPRIME A PEÇA MALEÁVEL UTILIZADA (5 OU 6) CONTRA A PEÇA RECTANGULAR INFERIOR (3) E EM PARTICULAR CONTRA A MEMBRANA POROSA (4). O MÉTODO AQUI DESCRITO CONSISTE NO ENROLAMENTO DA MEMBRANA COLONIZADA POR DISTINTOS TIPOS CELULARES EM TORNO DE UMA ESTRUTURA DE ENROLAMENTO QUE, APÓS REMOÇÃO DA ESTRUTURA DE ENROLAMENTO DO INTERIOR DA ESTRUTURA TUBULAR ESTRATIFICADA RADIALMENTE ORGANIZADA, ORIGINA UM SUBSTITUTO TECIDULAR TUBULAR ESTRATIFICADO PARA SUBSTITUIÇÃO DE TECIDOS TUBULARES ESTRATIFICADOS ANIMAIS OU HUMANOS DANIFICADOS POR TRAUMA OU DOENÇA.The present invention relates to a device that allows the simultaneous culturing of different cell types in porous membranes, as well as to a method of manufacturing streaked tubular structures, which are originated from the structurated tubular tissue substitutes. The device is comprised of a lower, rectangular piece (3) on which a porous membrana (4) is placed centrally, a lockable (5) or openable (6) type kettled endowed with tubular structures (9) and defined by at least two (3) AND ON SPECIFIC AREAS OF THE POROSA MEMBRANE (4), AND THROUGH A THIRD PART (7) WITH SCREWS (8), PURCHASING THE MACHINING PART USED (5 OR 6 ) AGAINST THE LOWER RECTANGULAR PART (3) AND IN PARTICULAR AGAINST POROSA MEMBRANE (4). The method described herein consists of the winding of the colony-shaped membrane by different cell types around a winding structure which, after removal of the winding structure from the interior of the radially organized, structured tubular structure, originates an intricate tubular substitut ion for the substitution of sutured tubular tissues ANIMALS OR HUMANS DAMAGED BY TRAUMA OR DISEASE.

Description

DESCRIÇÃODESCRIPTION

DISPOSITIVO E MÉTODO SIMPLIFICADO PARA A GERAÇÃO DE SUBSTITUTOS TECIDULARES TUBULARES ESTRATIFICADOSDEVICE AND SIMPLIFIED METHOD FOR THE GENERATION OF STRETCHED TUBULAR TISSUE SUBSTITUTES

OBJECTO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada com o fabrico de substitutos tecidulares tubulares estratificados para substituição/regeneração de tecidos compostos animais ou humanos danificados por trauma ou doença. A presente invenção descreve um dispositivo que permite a cultura simultânea de múltiplos e distintos tipos celulares em membranas porosas, assim como o método de fabrico de substitutos tecidulares tubulares estratificadas, a partir dessas mesmas membranas porosas cultivadas com múltiplos e distintos tipos celulares.OBJECT OF THE INVENTION The present invention relates to the manufacture of tubular tissue substitutes for substitution / regeneration of animal or human tissue tissues damaged by trauma or disease. The present invention describes a device that allows the simultaneous cultivation of multiple and distinct cell types in porous membranes, as well as the method of manufacturing tubular tissue substitutes stratified from these same porous membranes cultured with multiple and different cell types.

ESTADO DA TÉCNICASTATE OF THE TECHNIQUE

Os células células tecidos tecidos tecidos células tecidos tecidos vivos são constituídos por um conjunto de especificamente organizadas. Em alguns casos, as são estrutural e funcionalmente iguais, formando simples (como, por exemplo, a cartilagem, os adiposo e epitelial). No entanto, a maioria dos do corpo humano são constituídos por uma mistura de com funções distintas, os quais são denominados por compostos (como, por exemplo, o osso, a pele, os 1 tecidos nervoso e vascular) . As células que formam os tecidos podem ser divididas em células do parênquima, que têm como função principal a manutenção do tecido, e em células de suporte, as quais têm uma função estrutural. As células de suporte compreendem um conjunto de tipos celulares altamente desenvolvidos, com funções metabólicas complexas e produtoras de matriz extracelular (MEC), a qual em grande parte define as caracteristicas físicas de um tecido. As células de suporte, em conjunto com a MEC, organizam-se hierarquicamente de modo a poderem elaborar funções específicas e mutuamente regularem a actividade celular, recorrendo a moléculas bioactivas solúveis, a contacto directo célula-célula ou à interacção célula-MEC. Esta estrutura complexa permite a constituição de microambientes distintos, onde as células experienciam estímulos específicos e respondem em conformidade para a função do tecido. A Engenharia de Tecidos tem sido reconhecida como uma promissora alternativa ao uso de auto- ou alo-enxertos para a reconstrução e regeneração de tecidos. Esta abordagem comporta a utilização de células, biomateriais e moléculas de sinalização para a reparação de tecidos danificados por trauma ou doença. Apesar do grande progresso desta área, o desenvolvimento de substitutos tecidulares com um tamanho clinicamente relevante continua a ser um grande desafio. Esta restrição deve-se principalmente a dificuldades de fornecimento de nutrientes e oxigénio às células em cultura 2 e à disponibilidade limitada de biomateriais estruturados que possam mimetizar a arquitectura complexa dos tecidos vivos. Os biomateriais estruturados são projectados para suportar o crescimento de células, visando ser compatíveis com a carga mecânica dos tecidos e órgãos circundantes, a um nivel macroscópico, mas sem conseguirem recriar a complexidade e detalhes à escala nanométrica, observados ao nível extracelular em tecidos e órgãos. Portanto, numa abordagem de Engenharia de Tecidos, o desenvolvimento de uma MEC sintética é uma questão crítica, uma vez que precisamos de aprender com a natureza como estruturar os biomateriais que irão ajudar na recapitulação dos eventos iniciais da morfogénese, os quais regularizam a organização hierárquica da MEC e conduzem as células à construção de tecidos adultos completamente funcionais. Assim, para manter um fenótipo celular adequado é necessária a replicação da MEC natural, o cultivo e indução de infiltração das células no biomaterial estruturado e o fornecimento dos nutrientes adequados. 0 microambiente in vivo varia de tecido para tecido, e de zona para zona do mesmo tecido, proporcionando sinais específicos para as células adjacentes e transmitindo funções específicas. Assim, para além da reconhecida organização hierárquica complexa, as células dos tecidos experimentam estímulos mecânicos. Portanto, a cultura de células num ambiente bioquímico adequado e na presença de estímulos mecânicos é determinante para a recriação do 3 microambiente extracelular, melhorando, consequentemente, as interacções célula-célula e célula-MEC. Vários sistemas de cultura dinâmica - bioreactores - foram desenvolvidos para indução de fluxo convectivo de meio em células cultivadas em biomateriais estruturados tridimensionalmente como, por exemplo, frascos com meio em agitação continua, vasos rotativos ou sistemas de fluxo de perfusão. A utilização destes sistemas de bioreactores permite uma cultura homogénea de células no biomaterial estruturado, uma boa distribuição de nutrientes através desse biomaterial estruturado tridimensionalmente e uma eficiente remoção de metabolitos ao nível celular e sub-celular. Consequentemente, há um enorme interesse científico na replicação de microambientes adequados ao melhoramento da qualidade e da funcionalidade dos substitutos tecidulares gerados in vitro.The cells cells woven tissues tissues cells tissues living tissues consist of a set of specifically organized. In some cases, they are structurally and functionally alike, forming simple (such as cartilage, adipose and epithelial). However, most of the human body consists of a mixture of distinct functions, which are called by compounds (such as bone, skin, nervous and vascular tissues). The tissue forming cells can be divided into cells of the parenchyma, which have as their main function the maintenance of the tissue, and in support cells, which have a structural function. The support cells comprise a set of highly developed cell types, with complex metabolic functions and extracellular matrix (ECM) production, which largely defines the physical characteristics of a tissue. Support cells, in conjunction with ECM, are hierarchically organized so that they can elaborate specific functions and mutually regulate cellular activity, using soluble bioactive molecules, direct cell-cell contact or cell-MEC interaction. This complex structure allows the constitution of distinct microenvironments, where the cells experience specific stimuli and respond accordingly to tissue function. Tissue Engineering has been recognized as a promising alternative to the use of auto- or allografts for tissue reconstruction and regeneration. This approach involves the use of cells, biomaterials and signaling molecules for the repair of tissues damaged by trauma or disease. Despite the great progress of this area, the development of clinically relevant tissue substitutes remains a major challenge. This restriction is mainly due to difficulties in supplying nutrients and oxygen to cells in culture 2 and the limited availability of structured biomaterials that can mimic the complex architecture of living tissues. Structured biomaterials are designed to support cell growth, aiming to be compatible with the mechanical load of the surrounding tissues and organs, at a macroscopic level, but without being able to recreate the complexity and details at the nanometric scale observed at the extracellular level in tissues and organs . Therefore, in a Tissue Engineering approach, the development of a synthetic ECM is a critical issue, since we need to learn from nature how to structure the biomaterials that will aid in the recapitulation of the initial events of morphogenesis, which regularize the hierarchical organization of MEC and conduct the cells to the construction of fully functional adult tissues. Thus, in order to maintain a suitable cellular phenotype, natural MEC replication, culture and induction of cell infiltration into the structured biomaterial, and provision of the appropriate nutrients is required. The in vivo microenvironment varies from tissue to tissue, and from zone to zone of the same tissue, providing specific signals to adjacent cells and transmitting specific functions. Thus, in addition to the recognized complex hierarchical organization, tissue cells undergo mechanical stimuli. Therefore, cell culture in a suitable biochemical environment and in the presence of mechanical stimuli is determinant for the re-creation of the extracellular microenvironment, thereby improving cell-cell and cell-ECM interactions. Several dynamic culture systems - bioreactors - have been developed for inducing convective flow of medium into cultured cells in three dimensional structured biomaterials, such as flasks with continuous shaking medium, rotating vessels or perfusion flow systems. The use of these bioreactor systems allows a homogenous culture of cells in the structured biomaterial, a good distribution of nutrients through this three-dimensional structured biomaterial and an efficient removal of metabolites at the cellular and sub-cellular levels. Consequently, there is a huge scientific interest in the replication of microenvironments suitable for improving the quality and functionality of tissue substitutes generated in vitro.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um dispositivo que permite a cultura simultânea de múltiplos e distintos tipos celulares em membranas porosas, assim como ao método de fabrico de substitutos tecidulares tubulares estratificados a partir dessas mesmas membranas porosas cultivadas com múltiplos e distintos tipos celulares. 4 0 dispositivo aqui descrito permite colonizar e cultivar separadamente múltiplos e distintos tipos celulares em áreas distintas de uma mesma membrana porosa. 0 dispositivo permite delinear múltiplas áreas estanques na superfície de membranas porosas através da compressão dessas mesmas membranas em zonas específicas. Esta compressão é efectuada colocando a membrana entre uma placa rectanqular inferior e uma peça maleável que define cavidades na sua superfície inferior. Esta peça maleável é, por sua vez, comprimida contra a membrana porosa e a placa rectangular inferior através de uma terceira peça que é aparafusada à placa rectangular inferior. A peça maleável que faz parte deste dispositivo pode ser do tipo fechado, em que as cavidades por ela delimitadas são fechadas, ou do tipo aberto, em que as cavidades estão em contacto com o exterior através de aberturas superiores. De modo a ser possível a injecção/remoção de suspensões celulares e/ou meio de cultura de e para o interior das cavidades de cultura fechadas, são utilizadas estruturas tubulares que trespassam as paredes da peça maleável e que ligam cada uma das cavidades ao exterior.DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to a device that allows the simultaneous cultivation of multiple and distinct cell types in porous membranes, as well as to the method of manufacturing tubular tissue substitutes laminated from these same porous membranes grown with multiple and different types cell phones. The device described herein allows to colonize and culturally separate multiple and distinct cell types in distinct areas of the same porous membrane. The device allows delineating multiple watertight areas on the surface of porous membranes by compressing these same membranes in specific zones. This compression is effected by placing the membrane between a lower rectanch plate and a malleable piece defining cavities on its lower surface. This malleable piece is in turn pressed against the porous membrane and the lower rectangular plate through a third part which is screwed onto the lower rectangular plate. The malleable part forming part of this device may be of the closed type, in which the cavities delimited by it are closed, or of the open type, in which the cavities are in contact with the outside through upper openings. In order to be able to inject / remove cell suspensions and / or culture medium from and into the closed culture wells, tubular structures are used which pierce the walls of the malleable part and which connect each of the cavities to the outside.

Este dispositivo, em particular na sua configuração fechada, pode ser integrado num sistema de cultura celular dinâmica capaz de automaticamente colonizar as distintas 5 áreas da membrana porosa, delimitadas pelas cavidades de cultura do dispositivo, assim como também renovar o meio de cultura no interior dessas mesmas cavidades.This device, in particular in its closed configuration, may be integrated into a dynamic cell culture system capable of automatically colonizing the distinct areas of the porous membrane, delimited by the culture wells of the device, as well as renewing the culture medium therein same wells.

Devido à transparência da maioria dos materiais utilizados na sua construção, este dispositivo permite também a observação do interior das suas câmaras internas através das paredes das suas peças.Due to the transparency of most of the materials used in its construction, this device also allows the observation of the interior of its internal chambers through the walls of its parts.

Devido às características dos materiais utilizados na construção deste dispositivo, este pode também ser facilmente esterilizado por métodos químicos ou térmicos. 0 método aqui descrito permite a construção de substitutos tecidulares tubulares estratificados a partir das membranas porosas contendo zonas específicas da sua superfície colonizadas por múltiplos e distintos tipos celulares. 0 método descrito consiste no enrolamento de uma membrana porosa, colonizada por múltiplos e distintos tipos celulares, em torno de uma estrutura porosa de enrolamento. Este enrolamento é iniciado na extremidade da membrana porosa contendo o tipo celular que deverá estar situado no estrato mais interno do substituto tecidular tubular estratificado e finalizado na extremidade contendo as células que deverão estar localizadas nos estratos mais externos do substituto. 6 0 método descrito é finalizado após um período de cultura que permita a adesão das células às superfícies membranares adjacentes. Através da remoção da estrutura tubular porosa de enrolamento do interior da estrutura tubular estratificada, é originado um substituto tecidular tubular estratificado.Due to the characteristics of the materials used in the construction of this device, it can also be easily sterilized by chemical or thermal methods. The method described herein allows the construction of tubular tissue substitutes stratified from porous membranes containing specific zones of their surface colonized by multiple and distinct cell types. The described method consists of winding a porous membrane, colonized by multiple and distinct cell types, around a porous winding structure. This winding is initiated at the end of the porous membrane containing the cell type which should be situated in the innermost stratum of the stratified tubular tissue substitute and terminated at the end containing the cells which should be located in the outermost layers of the substitute. The described method is terminated after a culture period which allows the adhesion of the cells to the adjacent membrane surfaces. By removing the porous tubular winding structure from the interior of the laminated tubular structure, a tubular tubular tissue substitute is created.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra a configuração fechada em vist A Figura 2 ilustra a configuração fechada em vist A Figura 3 ilustra a configuração fechada em parcialmente seccionada. A Figura 4 ilustra dispositivo com configuração A Figura 5 ilustra dispositivo com configuração A Figura 6 ilustra a configuração aberta em vista estrutura do dispositivo com i isométrica explodida. estrutura do dispositivo com i isométrica montada. estrutura do dispositivo com vista isométrica montada e uma secção longitudinal do fechada. uma secção transversal do fechada. estrutura do dispositivo com isométrica explodida. 7 A Figura 7 ilustra a estrutura do dispositivo com configuração aberta em vista isométrica montada. A Figura 8 ilustra a estrutura do dispositivo com configuração aberta em vista isométrica montada e parcialmente seccionada. A Figura 9 ilustra uma secção longitudinal do dispositivo com configuração aberta. A Figura 10 ilustra uma secção transversal do dispositivo com configuração aberta. A Figura 11 representa o dispositivo de configuração fechada integrado num sistema de cultura dinâmico completo. A figura 12 ilustra a membrana porosa e estrutura de enrolamento antes do processo de enrolamento referente ao método de enrolamento da membrana porosa, contendo três populações celulares distintas na sua superfície, de modo a originar uma estrutura tubular estratificada. A figura 13 ilustra membrana porosa parcialmente enrolada em torno da estrutura de enrolamento referente ao método de enrolamento da membrana porosa, de modo a originar uma estrutura tubular estratificada. 8 A figura 14 ilustra a membrana porosa totalmente enrolada em torno da estrutura de enrolamento. A figura 15 ilustra a secção transversal da membrana porosa, enrolada em torno da estrutura de enrolamento e mostrando a sua estrutura estratificada interna com diferentes populações celulares localizadas em diferentes estratos. A figura 16 ilustra o substituto tecidular tubular estratificado, após remoção da estrutura de enrolamento do seu interior.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 shows the closed configuration in Figure 2 shows the closed configuration in the view. Figure 3 shows the closed configuration in partially sectioned. Figure 4 shows device with configuration Figure 5 shows device with configuration Figure 6 shows the open configuration in exploded view of the device with isometric device. structure of the isometric device mounted. structure of the device with assembled isometric view and a longitudinal section of the closed one. a cross-section of the closed. structure of the exploded isometric device. Figure 7 shows the structure of the open configuration device in assembled isometric view. Figure 8 shows the structure of the open configuration device in isometric view assembled and partially sectioned. Figure 9 shows a longitudinal section of the open configuration device. Figure 10 shows a cross-section of the open configuration device. Figure 11 shows the closed configuration device integrated into a complete dynamic cropping system. Figure 12 shows the porous membrane and winding structure prior to the winding process relating to the porous membrane winding method, containing three distinct cell populations on its surface, to give a layered tubular structure. Figure 13 shows porous membrane partially wrapped around the winding structure relating to the method of winding the porous membrane, so as to give a layered tubular structure. Figure 14 shows the porous membrane fully wound around the winding structure. Figure 15 shows the cross-section of the porous membrane, wrapped around the winding structure and showing its internal layered structure with different cell populations located in different layers. Figure 16 shows the stratified tubular tissue replacement, after removal of the winding structure from its interior.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A descrição que se segue refere-se a uma forma preferencial de realização da presente invenção que recorre às figuras anteriormente referidas de modo a permitir uma melhor compreensão da invenção. 0 dispositivo, que pode apresentar uma configuração fechada (1) ou aberta (2) é composto por uma peça rectangular inferior (3), sobre a qual é centralmente colocada uma membrana porosa (4) . Uma peça maleável, que pode ser do tipo fechado (5) ou aberto (6) e que define três cavidades contíguas na sua superfície inferior, é colocada sobre a peça rectangular inferior (3) e sobre zonas específicas da membrana porosa (4). Através do uso de 9 uma terceira peça (7) e de parafusos (8), a peça maleável utilizada (5 ou 6) é comprimida contra a peça rectangular inferior (3) e em particular contra a membrana porosa (4). Dado que a estrutura maleável (5 ou 6) define três cavidades na sua superfície inferior, apenas as extremidades e as zonas situadas entre cavidades são comprimidas. Deste modo, as superfícies sujeitas à compressão tornam-se superfícies estanques criando consequentemente também três cavidades estanques.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The following description relates to a preferred embodiment of the present invention which makes use of the afore-mentioned figures in order to enable a better understanding of the invention. The device, which may have a closed (1) or open (2) configuration, is composed of a lower rectangular part (3), on which a porous membrane (4) is centrally placed. A malleable part, which may be of the closed (5) or open type (6) and which defines three contiguous cavities on its lower surface, is placed on the lower rectangular piece (3) and on specific zones of the porous membrane (4). Through use of a third piece 7 and screws 8, the malleable piece used 5 or 6 is pressed against the lower rectangular piece 3 and in particular against the porous membrane 4. Since the malleable structure (5 or 6) defines three cavities on its lower surface, only the ends and the areas between cavities are compressed. In this way, the surfaces subjected to compression become watertight surfaces thereby also creating three sealed cavities.

Na peça maleável do tipo fechado (5) são adicionadas estruturas tubulares (9) que trespassam as suas paredes laterais e que servem para a injecção, remoção e circulação de fluidos tais como suspensões celulares e meios de cultura de/para o interior das cavidades previamente delimitadas pelo dispositivo. Nesta configuração, cada cavidade do dispositivo deve ser ligada ao exterior por, pelo menos, duas destas estruturas tubulares (9), de modo a que uma permita a entrada de fluidos e gases e a outra permita simultaneamente a saída de qualquer excesso de fluidos ou gases. Caso desejado, através do controlo simultâneo da entrada e saída de fluidos e gases, é igualmente possível exercer pressões positivas ou negativas no interior de cada uma das cavidades.In the malleable piece of the closed type (5) there are added tubular structures (9) which pass through its side walls and serve for the injection, removal and circulation of fluids such as cell suspensions and culture media to / from the cavities previously delimited by the device. In this configuration, each cavity of the device must be connected to the exterior by at least two of these tubular structures (9), so that one allows the entry of fluids and gases and the other simultaneously allows the exit of any excess of fluids or gases. If desired, by simultaneous control of the inlet and outlet of fluids and gases, it is also possible to exert positive or negative pressures within each of the cavities.

No caso de utilização da peça maleável do tipo aberto (6), as suspensões celulares e meios de cultura são 10 simplesmente colocados, removidos ou circulados nas cavidades através das suas aberturas superiores. A peça rectangular inferior (3) é preferencialmente fabricada a partir de policarbonato ou vidro. 0 uso preferencial destes materiais na construção desta peça relaciona-se com as suas propriedades químicas, mecânicas e ópticas já que são biologicamente inertes, extremamente resistentes a solventes e possuem grande estabilidade dimensional e resistência a altas temperaturas. A resistência a solventes e altas temperaturas permite uma grande versatilidade quanto ao processo de esterilização utilizado, já que é possível uma esterilização tanto por exposição a solventes assim como também por exposição a altas temperaturas (autoclavagem). Adicionalmente, estes materiais possuem a vantagem de serem transparentes, permitindo assim que o conteúdo de cada cavidade seja observável através da parte inferior e superior do dispositivo.In the case of use of the malleable piece of the open type (6), the cell suspensions and culture media are simply placed, removed or circulated in the cavities through their upper apertures. The lower rectangular piece (3) is preferably fabricated from polycarbonate or glass. The preferred use of these materials in the construction of this part relates to its chemical, mechanical and optical properties since they are biologically inert, extremely solvent resistant and have great dimensional stability and high temperature resistance. Resistance to solvents and high temperatures allows a great versatility regarding the sterilization process used, since it is possible to sterilize both by exposure to solvents as well as by exposure to high temperatures (autoclaving). In addition, these materials have the advantage of being transparent, thus allowing the contents of each cavity to be observable through the lower and upper part of the device.

As peças maleáveis (5 e 6) são fabricadas por um processo de moldação preferencialmente a partir de silicone. Tal como o policarbonato ou vidro, o silicone é biologicamente inerte, resistentes a solventes e a altas temperaturas. Deste modo estas peças podem igualmente ser esterilizadas tanto por exposição a solventes assim como também por exposição a altas temperaturas (autoclavagem). Devido à transparência do silicone, estas peças permitem 11 assim que o conteúdo de cada cavidade seja observável através das suas paredes lateriais assim como, no caso da peça maleável fechada (5), através da parede superior. Adicionalmente, o silicone apresenta permeabilidade a gases, possibilitando assim a troca de gases entre as cavidades de cultura e o exterior. Esta caracteristica tem particular importância no caso dos dispositivos de configuração fechada (1).The malleable parts (5 and 6) are manufactured by a molding process preferably from silicone. Like polycarbonate or glass, the silicone is biologically inert, solvent resistant and at high temperatures. In this way these parts can also be sterilized both by exposure to solvents as well as by exposure to high temperatures (autoclaving). Due to the transparency of the silicone, these pieces allow 11 as the contents of each cavity are observable through its side walls as well as, in the case of the closed malleable piece 5, through the top wall. Additionally, the silicone presents gas permeability, thus allowing the exchange of gases between the culture and exterior cavities. This feature is of particular importance in the case of the closed configuration devices (1).

Em relação à peça de compressão (7) e aos parafusos utilizados (8), dado que não necessitam de ser transparentes ou inertes pois não entram em contacto directo com o interior das cavidades de cultura ou com a membrana porosa (4), podem ser fabricados a partir de uma maior variedade de materiais, desde que sejam dimensionalmente estáveis e resistentes a solventes e a altas temperaturas. A membrana porosa (4) deve preferencialmente ser fabricada a partir de um material ou de uma combinação de materiais biocompativeis e biodegradáveis, podendo estes ser processados por variados métodos, como por exemplo electrospinning. 0 tamanho dos poros da membrana deve também preferencialmente ser inferior ao diâmetro das células a serem cultivadas na superfície dessa membrana, de modo a que haja uma retenção mais eficiente de cada tipo celular específico em estratos específicos da estrutura tubular a fabricar. 12With respect to the compression part (7) and the screws used (8), since they do not need to be transparent or inert because they do not come into direct contact with the interior of the culture wells or with the porous membrane (4), they can be made from a greater variety of materials, as long as they are dimensionally stable and resistant to solvents and high temperatures. The porous membrane 4 should preferably be fabricated from a material or a combination of biocompatible and biodegradable materials, which can be processed by various methods, such as electrospinning. The pore size of the membrane should also preferably be less than the diameter of the cells to be cultured on the surface of that membrane, so that there is more efficient retention of each specific cell type in specific strata of the tubular structure to be fabricated. 12

Apesar de os dispositivos aqui descritos possuírem três cavidades, estas podem variar tanto em número como em dimensão, de acordo com a aplicação pretendida.Although the devices described herein have three cavities, they may vary in number and size depending on the intended application.

Nos dispositivos aqui descritos podem ser efectuadas três culturas distintas simultaneamente (uma em cada cavidade) , as quais podem variar em múltiplas características tais como, por exemplo, o tipo e a densidade de células em cultura e o tipo de meio utilizado.In the devices described herein, three distinct cultures can be made simultaneously (one in each well), which may vary in multiple characteristics such as, for example, the type and density of cells in culture and the type of medium used.

Na configuração fechada (1), o dispositivo pode ser integrado num sistema de cultura ilustrado na figura 11. Este sistema é composto pelo dispositivo (1) ligado a um reservatório de meio de cultura (10) por tubos ligados às suas estruturas tubulares (9) . Além de duas ligações para entrada/saída de meio, o reservatório (10) possui também uma ligação adicional para entrada e saída de gases, os quais são purificados por um filtro de ar (11).In the closed configuration (1) the device can be integrated into a culture system shown in Figure 11. This system is composed of the device (1) connected to a culture medium reservoir (10) by tubes connected to its tubular structures (9). ). In addition to two medium inlet / outlet connections, the reservoir 10 also has an additional gas inlet and outlet connection, which is purified by an air filter 11.

Resumidamente, o meio de cultura é recolhido do reservatório de meio de cultura (10), bombeado por uma bomba peristáltica (12) para a cavidade de cultura no interior do dispositivo e finalmente bombeado pela mesma bomba peristáltica (12) de novo para o reservatório de meio de cultura (10) . Este processo e aparato repete-se para cada uma das cavidades individuais de cultura. 13Briefly, the culture medium is collected from the culture medium reservoir (10), pumped by a peristaltic pump (12) into the culture well within the device and finally pumped by the same peristaltic pump (12) back into the reservoir of culture medium (10). This process and apparatus is repeated for each of the individual culture wells. 13

Na circulação de meio de cultura, devem ser preferencialmente usadas tubagens fabricadas a partir de formulações tais como silicone, já que são altamente permeáveis a gases tais como dióxido de carbono e oxigénio, aumentando assim a troca de gases entre o meio circulante e a atmosfera circundante.In the circulation of culture medium, pipes manufactured from formulations such as silicone should preferably be used, as they are highly permeable to gases such as carbon dioxide and oxygen, thus increasing the exchange of gases between the circulating medium and the surrounding atmosphere .

De modo a manter um ambiente estéril, com uma temperatura e grau de humidade adequadas e estáveis, o sistema é colocado no interior de uma incubadora de cultura celular.In order to maintain a sterile environment, with a suitable and stable temperature and humidity, the system is placed inside a cell culture incubator.

Este sistema de cultura pode ser usado não apenas na cultura mas também na colonização de células em membranas para crescimento celular. Dada a sua pequena dimensão, este sistema requer volumes muito pequenos de meio de cultura. Por esta razão, é possível efectuar um procedimento de colonização dinâmica usando suspensões celulares altamente concentradas sem que seja necessário utilizar quantidades extremamente grandes de células. Desta forma, as células têm uma maior possibilidade de aderir às superfícies das membranas porosas (4) já que se encontram altamente concentradas e passam um maior número de vezes pelo seu interior, tornando o processo de colonização mais eficiente.This culture system can be used not only in culture but also in the colonization of cells in membranes for cell growth. Given its small size, this system requires very small volumes of culture medium. For this reason, a dynamic colonization procedure can be performed using highly concentrated cell suspensions without the need to use extremely large amounts of cells. In this way, the cells have a greater possibility to adhere to the surfaces of the porous membranes (4) since they are highly concentrated and pass a greater number of times inside, making the colonization process more efficient.

Após esterilização e montagem do dispositivo na sua forma fechada (1) ou aberta (2), contendo uma membrana 14 porosa (4) igualmente esterilizada no seu interior, devidamente comprimida nas suas extremidades e áreas inter-cavidades, o dispositivo está pronto para ser iniciado o passo de colonização celular sobre a superfície da membrana porosa (4). A colonização celular pode ser efectuada de diferentes formas dependendo da configuração do dispositivo utilizado. No caso de utilização de um dispositivo de configuração aberta (2) uma suspensão celular pode ser simplesmente transferida para o interior das cavidades através das aberturas superiores das mesmas, sobre a superfície da membrana porosa (4). Dado que existem três cavidades contíguas independentes, é possível transferir suspensões com tipos ou combinações de tipos celulares distintas para cada uma dessas cavidades. A suspensão celular deve possuir um volume suficiente para cobrir a superfície da membrana porosa delimitada por cada cavidade. Após transferência das suspensões celulares para as cavidades, uma tampa deve ser colocada sobre o dispositivo de modo a evitar evaporação.After sterilization and assembly of the device in its closed (1) or open (2) form, containing a porous membrane (4) equally sterilized therein, properly compressed at its ends and inter-cavities, the device is ready to be the cell colonization step was initiated on the surface of the porous membrane (4). Cell colonization can be effected in different ways depending on the configuration of the device used. In the case of use of an open set-up device 2 a cell suspension can simply be transferred into the cavities through the upper openings thereof on the surface of the porous membrane 4. Since there are three independent contiguous cavities, it is possible to transfer suspensions with types or combinations of distinct cell types for each of these cavities. The cell suspension must have a volume sufficient to cover the surface of the porous membrane delimited by each cavity. After transferring the cell suspensions into the wells, a cap should be placed on the device in order to avoid evaporation.

No caso de utilização de um dispositivo de configuração fechada (1), a suspensão celular é injectada para o interior das cavidades de cultura através de uma das estruturas tubulares (9) que as ligam ao exterior. A injecção pode ser feita por meio de uma seringa que é encaixada na parte externa da estrutura tubular. Neste caso a segunda estrutura tubular de cada uma das cavidades deve ser mantida aberta de modo a que o excesso de ar e 15 eventualmente de meio de cultura sejam eliminados da câmara e assim não se crie um excesso de pressão no interior das câmaras. Após este procedimento, todas as estruturas tubulares devem ser encerradas com tampas.In the case of using a closed configuration device (1), the cell suspension is injected into the culture wells through one of the tubular structures (9) which connect them to the outside. The injection can be done by means of a syringe which is fitted to the outside of the tubular structure. In this case the second tubular structure of each of the cavities must be kept open so that excess air and optionally culture medium are removed from the chamber and thus no excess pressure is created within the chambers. After this procedure, all tubular structures should be enclosed with covers.

Na configuração fechada (1) é igualmente possível efectuar uma colonização celular dinâmica por meio de perfusão utilizando o sistema de cultura descrito na figura 11.In the closed configuration (1) it is also possible to carry out a dynamic cellular colonization by perfusion using the culture system described in figure 11.

Após ligação das tubagens do sistema às estruturas tubulares (9) de cada cavidade, uma suspensão celular previamente transferida para o reservatório de meio de cultura (10) é bombeada e circulada pelo interior de cada uma das cavidades do dispositivo. 0 período de tempo necessário para efectuar cada um dos métodos de colonização celular anteriormente descritos é variável, dependendo de vários factores tais como o tipo de células utilizadas e preferências do operador.After connecting the tubing of the system to the tubular structures 9 of each cavity, a cell suspension previously transferred to the culture medium reservoir 10 is pumped and circulated within each of the wells of the device. The time period required to effect each of the above-described cell colonization methods is variable, depending on various factors such as the type of cells used and operator preferences.

Após o período de colonização celular, um volume adicional de meio de cultura é adicionado ao interior das cavidades de cultura ou, no caso do sistema de colonização/cultura dinâmica, ao reservatório de meio de cultura (10) do sistema de cultura. A partir deste ponto inicia-se o período de cultura celular. Esta pode ser de expansão e/ou diferenciação, de acordo com o tipo de 16 suplementos incluídos no meio de cultura, e pode ter uma duração variável. Durante o período de cultura, o meio de cultura deve ser regularmente renovado total ou parcialmente, de acordo com as necessidades intrínsecas de cada tipo celular em cultura e com as preferências do operador. Essa renovação é feita utilizando os mesmos procedimentos e aparatos utilizados no passo de colonização, após remoção total ou parcial, do meio de cultura contido nas cavidades de cultura e/ou circuito fluidico do sistema de cultura dinâmica.After the cell colonization period, an additional volume of culture medium is added into the culture wells or, in the case of the colonization / dynamic culture system, to the culture medium reservoir (10) of the culture system. From this point the cell culture period begins. This may be of expansion and / or differentiation, according to the type of 16 supplements included in the culture medium, and may have a variable duration. During the culturing period, the culture medium should be completely or partially re-engineered according to the intrinsic needs of each cell type in culture and with operator preferences. This renewal is done using the same procedures and apparatus used in the colonization step, after total or partial removal of the culture medium contained in the culture wells and / or fluid circuit of the dynamic culture system.

No final do período de cultura celular o meio de cultura é totalmente removido das cavidades de cultura e/ou do circuito fluidico do sistema de cultura e o dispositivo é desmontado.At the end of the cell culture period the culture medium is completely removed from the culture wells and / or fluid circuit of the culture system and the device is disassembled.

Como resultado é obtida uma membrana porosa colonizada (13) por células em três áreas distintas da sua superfície. Cada uma destas áreas contém uma única ou uma combinação distinta de células das encontradas nas outras áreas colonizadas.As a result a colonized porous membrane (13) is obtained by cells in three distinct areas of its surface. Each of these areas contains a single or a distinct combination of cells found in the other colonized areas.

Esta membrana porosa colonizada e cultivada (13) com três tipos celulares distintos em zonas distintas da sua superfície é então enrolada em torno de uma estrutura cilíndrica ou tubular de enrolamento porosa (14) de modo a gerar uma estrutura tubular estratificada (15) em torno dessa mesma estrutura de enrolamento (14) . 0 enrolamento 17 deve ser iniciado a partir da extremidade da membrana porosa mais próxima da colónia celular interna (16), ou seja, a colónia celular que deverá ficar situada nas camadas mais internas da estrutura tubular estratificada (15) gerada. De seguida, passa a ser enrolada a colónia celular intermédia (17), que ficará situada nas camadas intermédias da estrutura tubular estratificada (15), e por fim a colónia celular externa (18) que ficará situada nas camadas mais externas da estrutura tubular estratificada (18) . A estrutura tubular de enrolamento (14) deverá ser preferencialmente porosa de modo a que seja possível, de uma forma passiva ou activa, nutrir mais eficientemente as colónias celulares, interna (16) e intermédia (17) enquanto enrolada em torno da estrutura de enrolamento (14).This colonized and cultured porous membrane (13) having three distinct cell types in distinct regions of its surface is then wound around a cylindrical or tubular porous winding structure (14) so as to generate a layered tubular structure (15) of the same winding structure (14). The winding 17 should be started from the end of the porous membrane closest to the inner cell colony 16, ie the cell colony which should lie in the innermost layers of the layered tubular structure 15 generated. Thereafter, the intermediate cell colony 17 is rolled, which will be located in the intermediate layers of the layered tubular structure 15, and finally the outer cellular colony 18 which will be located in the outermost layers of the layered tubular structure (18). The tubular winding structure 14 should preferably be porous so that it is possible, in a passive or active way, to more efficiently nourish the inner, inner (16) and intermediate (17) cellular colonies while wound around the winding structure (14).

Após o processo de enrolamento, a estrutura tubular estratificada (15) deverá preferencialmente ser mantida por um determinado período de tempo enrolada em torno da estrutura de enrolamento (14) e submergida em meio de cultura de modo a permitir a adesão das células contidas nos vários estratos às superfícies da membrana nos estratos adjacentes. Adicionalmente, poderá ser aplicado algum tipo de elemento adesivo biocompatível, tal como por exemplo selantes à base de fibrina, nas extremidades superficiais da membrana de modo a reforçar a estabilidade da estrutura tubular estratificada (15) formada. 18After the winding process, the layered tubular structure 15 should preferably be held for a certain period of time wrapped around the winding structure 14 and submerged in culture medium so as to allow adhesion of the cells contained in the various strata to the membrane surfaces in adjacent strata. Additionally, some type of biocompatible adhesive element, such as fibrin-based sealants, may be applied to the surface ends of the membrane in order to enhance the stability of the formed layered tubular structure (15). 18

Finalmente, após um período de cultura suficiente para que seja formada uma matriz celular consistente na estrutura tubular estratificada (15), a estrutura tubular de enrolamento (14) é removida do interior da estrutura tubular estratificada (15). Sendo assim obtido um substituto tecidular tubular estratificado pronto para ser utilizado (19). A estrutura de enrolamento porosa (14) deverá preferencialmente ser fabricada a partir de politetrafluoretileno (PTFE). A utilização de PTFE no fabrico desta estrutura justifica-se pelo seu reduzido coeficiente de fricção, o que facilita o processo de remoção desta estrutura do interior da estrutura tubular estratificada (15) e sem que se produza qualquer dano nesta última. Além disso, o PTFE caracteriza-se pela sua excelente estabilidade dimensional, propriedades mecânicas constantes e pelo facto de ser um material inerte e biocompatível. Além disso apresenta grande resistência a solventes e a altas temperaturas sendo assim facilmente esterilizável por meio de uso de solventes ou autoclavagem.Finally, after a sufficient culture period for forming a cell matrix consistent with the layered tubular structure 15, the tubular winding structure 14 is withdrawn from the interior of the layered tubular structure 15. Thus, a stratified tubular tissue substitute is obtained ready to be used (19). The porous winding structure 14 should preferably be fabricated from polytetrafluoroethylene (PTFE). The use of PTFE in the manufacture of this structure is justified by its low coefficient of friction, which facilitates the process of removing this structure from the interior of the layered tubular structure (15) and without any damage to the latter. In addition, PTFE is characterized by its excellent dimensional stability, constant mechanical properties and the fact that it is an inert and biocompatible material. In addition, it exhibits high resistance to solvents and high temperatures and is thus easily sterilizable through the use of solvents or autoclaving.

Lisboa, 20 de Janeiro de 2012 19 tecidos nervoso e vascular). As células que formam os tecidos podem ser divididas em células do parênquima, que têm como função principal a manutenção do tecido, e em células de suporte, as quais têm uma função estrutural. As células de suporte compreendem um conjunto de tipos celulares altamente desenvolvidos, com funções metabólicas complexas e produtoras de matriz extracelular (MEC), a qual em grande parte define as caracteristicas fisicas de um tecido. As células de suporte, em conjunto com a MEC, organizam-se hierarquicamente de modo a poderem elaborar funções especificas e mutuamente regularem a actividade celular, recorrendo a moléculas bioactivas solúveis, a contacto directo célula-célula ou à interacção célula-MEC. Esta estrutura complexa permite a constituição de microambientes distintos, onde as células experienciam estímulos específicos e respondem em conformidade para a função do tecido. A Engenharia de Tecidos tem sido reconhecida como uma promissora alternativa ao uso de auto- ou alo-enxertos para a reconstrução e regeneração de tecidos. Esta abordagem comporta a utilização de células, biomateriais e moléculas de sinalização para a reparação de tecidos danificados por trauma ou doença. Apesar do grande progresso desta área, o desenvolvimento de substitutos tecidulares com um tamanho clinicamente relevante continua a ser um grande desafio. Esta restrição deve-se principalmente a dificuldades de fornecimento de nutrientes e oxigénio às células em cultura 2 e à disponibilidade limitada de biomateriais estruturados que possam mimetizar a arquitectura complexa dos tecidos vivos. Os biomateriais estruturados são projectados para suportar o crescimento de células, visando ser compatíveis com a carga mecânica dos tecidos e órgãos circundantes, a um nível macroscópico, mas sem conseguirem recriar a complexidade e detalhes à escala nanométrica, observados ao nível extracelular em tecidos e órgãos. Portanto, numa abordagem de Engenharia de Tecidos, o desenvolvimento de uma MEC sintética é uma questão crítica, uma vez que precisamos de aprender com a natureza como estruturar os biomateriais que irão ajudar na recapitulação dos eventos iniciais da morfogénese, os quais regularizam a organização hierárquica da MEC e conduzem as células à construção de tecidos adultos completamente funcionais. Assim, para manter um fenótipo celular adequado é necessária a replicação da MEC natural, o cultivo e indução de infiltração das células no biomaterial estruturado e o fornecimento dos nutrientes adequados. 0 microambiente in vivo varia de tecido para tecido, e de zona para zona do mesmo tecido, proporcionando sinais específicos para as células adjacentes e transmitindo funções específicas. Assim, para além da reconhecida organização hierárquica complexa, as células dos tecidos experimentam estímulos mecânicos. Portanto, a cultura de células num ambiente bioquímico adequado e na presença de estímulos mecânicos é determinante para a recriação do 3 microambiente extracelular, melhorando, consequentemente, as interacções célula-célula e célula-MEC. Vários sistemas de cultura dinâmica - bioreactores - foram desenvolvidos para indução de fluxo convectivo de meio em células cultivadas em biomateriais estruturados tridimensionalmente como, por exemplo, frascos com meio em agitação continua, vasos rotativos ou sistemas de fluxo de perfusão. A utilização destes sistemas de bioreactores permite uma cultura homogénea de células no biomaterial estruturado, uma boa distribuição de nutrientes através desse biomaterial estruturado tridimensionalmente e uma eficiente remoção de metabolitos ao nível celular e sub-celular. Consequentemente, há um enorme interesse científico na replicação de microambientes adequados ao melhoramento da qualidade e da funcionalidade dos substitutos tecidulares gerados in vitro.Lisbon, 20 January 2012 19 nervous and vascular tissues). The tissue forming cells can be divided into cells of the parenchyma, which have as their main function the maintenance of the tissue, and in support cells, which have a structural function. The support cells comprise a set of highly developed cell types, with complex metabolic functions and extracellular matrix (ECM) production, which largely defines the physical characteristics of a tissue. Supporting cells, together with the MEC, are hierarchically organized so that they can elaborate specific functions and mutually regulate cell activity, using soluble bioactive molecules, direct cell-cell contact or cell-MEC interaction. This complex structure allows the constitution of distinct microenvironments, where the cells experience specific stimuli and respond accordingly to tissue function. Tissue Engineering has been recognized as a promising alternative to the use of auto- or allografts for tissue reconstruction and regeneration. This approach involves the use of cells, biomaterials and signaling molecules for the repair of tissues damaged by trauma or disease. Despite the great progress of this area, the development of clinically relevant tissue substitutes remains a major challenge. This restriction is mainly due to difficulties in supplying nutrients and oxygen to cells in culture 2 and the limited availability of structured biomaterials that can mimic the complex architecture of living tissues. Structured biomaterials are designed to support cell growth to be compatible with the mechanical load of surrounding tissues and organs at a macroscopic level but fail to recreate the complexity and details at the nanometric scale observed at the extracellular level in tissues and organs . Therefore, in a Tissue Engineering approach, the development of a synthetic ECM is a critical issue, since we need to learn from nature how to structure the biomaterials that will aid in the recapitulation of the initial events of morphogenesis, which regularize the hierarchical organization of MEC and conduct the cells to the construction of fully functional adult tissues. Thus, in order to maintain a suitable cellular phenotype, natural MEC replication, culture and induction of cell infiltration into the structured biomaterial, and provision of the appropriate nutrients is required. The in vivo microenvironment varies from tissue to tissue, and from zone to zone of the same tissue, providing specific signals to adjacent cells and transmitting specific functions. Thus, in addition to the recognized complex hierarchical organization, tissue cells undergo mechanical stimuli. Therefore, cell culture in a suitable biochemical environment and in the presence of mechanical stimuli is determinant for the re-creation of the extracellular microenvironment, thereby improving cell-cell and cell-ECM interactions. Several dynamic culture systems - bioreactors - have been developed for inducing convective flow of medium into cultured cells in three dimensional structured biomaterials, such as flasks with continuous shaking medium, rotating vessels or perfusion flow systems. The use of these bioreactor systems allows a homogenous culture of cells in the structured biomaterial, a good distribution of nutrients through this three-dimensional structured biomaterial and an efficient removal of metabolites at the cellular and sub-cellular levels. Consequently, there is a huge scientific interest in the replication of microenvironments suitable for improving the quality and functionality of tissue substitutes generated in vitro.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um dispositivo que permite a cultura simultânea de múltiplos e distintos tipos celulares em membranas porosas, assim como ao método de fabrico de substitutos tecidulares tubulares estratificados a partir dessas mesmas membranas porosas cultivadas com múltiplos e distintos tipos celulares. 4 O dispositivo aqui descrito permite colonizar e cultivar separadamente múltiplos e distintos tipos celulares em áreas distintas de uma mesma membrana porosa. 0 dispositivo permite delinear múltiplas áreas estanques na superfície de membranas porosas através da compressão dessas mesmas membranas em zonas específicas. Esta compressão é efectuada colocando a membrana entre uma placa rectanqular inferior e uma peça maleável que define cavidades na sua superfície inferior. Esta peça maleável é, por sua vez, comprimida contra a membrana porosa e a placa rectanqular inferior através de uma terceira peça que é aparafusada à placa rectangular inferior. A peça maleável que faz parte deste dispositivo pode ser do tipo fechado, em que as cavidades por ela delimitadas são fechadas, ou do tipo aberto, em que as cavidades estão em contacto com o exterior através de aberturas superiores. De modo a ser possível a injecção/remoção de suspensões celulares e/ou meio de cultura de e para o interior das cavidades de cultura fechadas, são utilizadas estruturas tubulares que trespassam as paredes da peça maleável e que ligam cada uma das cavidades ao exterior.DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to a device that allows the simultaneous cultivation of multiple and distinct cell types in porous membranes, as well as to the method of manufacturing tubular tissue substitutes laminated from these same porous membranes grown with multiple and different types cell phones. The device described herein allows separate colonization and cultivation of multiple and distinct cell types in distinct areas of the same porous membrane. The device allows delineating multiple watertight areas on the surface of porous membranes by compressing these same membranes in specific zones. This compression is effected by placing the membrane between a lower rectanch plate and a malleable piece defining cavities on its lower surface. This malleable piece is in turn pressed against the porous membrane and the lower rectanch plate through a third part which is screwed onto the lower rectangular plate. The malleable part forming part of this device may be of the closed type, in which the cavities delimited by it are closed, or of the open type, in which the cavities are in contact with the outside through upper openings. In order to be able to inject / remove cell suspensions and / or culture medium from and into the closed culture wells, tubular structures are used which pierce the walls of the malleable part and which connect each of the cavities to the outside.

Devido às caracteristicas dos materiais utilizados na construção deste dispositivo, este pode também ser facilmente esterilizado por métodos químicos ou térmicos. 0 método aqui descrito permite a construção de substitutos tecidulares tubulares estratificados a partir das membranas porosas contendo zonas específicas da sua superfície colonizadas por múltiplos e distintos tipos celulares. 0 método descrito consiste no enrolamento de uma membrana porosa, colonizada por múltiplos e distintos tipos celulares, em torno de uma estrutura porosa de enrolamento. Este enrolamento é iniciado na extremidade da membrana porosa contendo o tipo celular que deverá estar situado no estrato mais interno do substituto tecidular tubular estratificado e finalizado na extremidade contendo as células que deverão estar localizadas nos estratos mais externos do substituto. 6 0 método descrito e finalizado apos um período de cultura que permita a adesão das células às superfícies membranares adjacentes. Através da remoção da estrutura tubular porosa de enrolamento do interior da estrutura tubular estratificada, é originado um substituto tecidular tubular estratificado.Due to the characteristics of the materials used in the construction of this device, it can also be easily sterilized by chemical or thermal methods. The method described herein allows the construction of tubular tissue substitutes stratified from porous membranes containing specific zones of their surface colonized by multiple and distinct cell types. The described method consists of winding a porous membrane, colonized by multiple and distinct cell types, around a porous winding structure. This winding is initiated at the end of the porous membrane containing the cell type which should be situated in the innermost stratum of the stratified tubular tissue substitute and terminated at the end containing the cells which should be located in the outermost layers of the substitute. The method is described and finalized after a culturing period allowing the adhesion of the cells to the adjacent membrane surfaces. By removing the porous tubular winding structure from the interior of the laminated tubular structure, a tubular tubular tissue substitute is created.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra a configuração fechada em vist A Figura 2 ilustra a configuração fechada em vist. A Figura 3 ilustra a configuração fechada em parcialmente seccionada. A Figura 4 ilustra dispositivo com configuração A Figura 5 ilustra dispositivo com configuração A Figura 6 ilustra a configuração aberta em vista estrutura do dispositivo com i isométrica explodida. estrutura do dispositivo com i isométrica montada. estrutura do dispositivo com vista isométrica montada e uma secção longitudinal do fechada. uma secção transversal do fechada. estrutura do dispositivo com isométrica explodida. 7 A Figura 7 ilustra a estrutura do dispositivo com configuração aberta em vista isométrica montada. A Figura 8 ilustra a estrutura do dispositivo com configuração aberta em vista isométrica montada e parcialmente seccionada. A Figura 9 ilustra uma secção longitudinal do dispositivo com configuração aberta. A Figura 10 ilustra uma secção transversal do dispositivo com configuração aberta. A Figura 11 representa o dispositivo de configuração fechada integrado num sistema de cultura dinâmico completo. A figura 12 ilustra a membrana porosa e estrutura de enrolamento antes do processo de enrolamento referente ao método de enrolamento da membrana porosa, contendo três populações celulares distintas na sua superfície, de modo a originar uma estrutura tubular estratificada. A figura 13 ilustra membrana porosa parcialmente enrolada em torno da estrutura de enrolamento referente ao método de enrolamento da membrana porosa, de modo a originar uma estrutura tubular estratificada. 8 A figura 14 ilustra a membrana porosa totalmente enrolada em torno da estrutura de enrolamento. A figura 15 ilustra a secção transversal da membrana porosa, enrolada em torno da estrutura de enrolamento e mostrando a sua estrutura estratificada interna com diferentes populações celulares localizadas em diferentes estratos. A figura 16 ilustra o substituto tecidular tubular estratificado, após remoção da estrutura de enrolamento do seu interior.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 shows the closed configuration in view. Figure 2 shows the closed configuration in view. Figure 3 shows the partially sectioned closed configuration. Figure 4 shows device with configuration Figure 5 shows device with configuration Figure 6 shows the open configuration in exploded view of the device with isometric device. structure of the isometric device mounted. structure of the device with assembled isometric view and a longitudinal section of the closed one. a cross-section of the closed. structure of the exploded isometric device. Figure 7 shows the structure of the open configuration device in assembled isometric view. Figure 8 shows the structure of the open configuration device in isometric view assembled and partially sectioned. Figure 9 shows a longitudinal section of the open configuration device. Figure 10 shows a cross-section of the open configuration device. Figure 11 shows the closed configuration device integrated into a complete dynamic cropping system. Figure 12 shows the porous membrane and winding structure prior to the winding process relating to the porous membrane winding method, containing three distinct cell populations on its surface, to give a layered tubular structure. Figure 13 shows porous membrane partially wrapped around the winding structure relating to the method of winding the porous membrane, so as to give a layered tubular structure. Figure 14 shows the porous membrane fully wound around the winding structure. Figure 15 shows the cross-section of the porous membrane, wrapped around the winding structure and showing its internal layered structure with different cell populations located in different layers. Figure 16 shows the stratified tubular tissue replacement, after removal of the winding structure from its interior.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A descrição que se segue refere-se a uma forma preferencial de realização da presente invenção que recorre às figuras anteriormente referidas de modo a permitir uma melhor compreensão da invenção. 0 dispositivo, que pode apresentar uma configuração fechada (1) ou aberta (2) é composto por uma peça rectangular inferior (3), sobre a qual é centralmente colocada uma membrana porosa (4) . Uma peça maleável, que pode ser do tipo fechado (5) ou aberto (6) e que define três cavidades contíguas na sua superfície inferior, é colocada sobre a peça rectangular inferior (3) e sobre zonas específicas da membrana porosa (4). Através do uso de 9 uma terceira peça (7) e de parafusos (8), a peça maleável utilizada (5 ou 6) é comprimida contra a peça rectangular inferior (3) e em particular contra a membrana porosa (4) . Dado que a estrutura maleável (5 ou 6) define três cavidades na sua superfície inferior, apenas as extremidades e as zonas situadas entre cavidades são comprimidas. Deste modo, as superfícies sujeitas à compressão tornam-se superfícies estanques criando consequentemente também três cavidades estanques.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The following description relates to a preferred embodiment of the present invention which makes use of the afore-mentioned figures in order to enable a better understanding of the invention. The device, which may have a closed (1) or open (2) configuration, is composed of a lower rectangular part (3), on which a porous membrane (4) is centrally placed. A malleable part, which may be of the closed (5) or open type (6) and which defines three contiguous cavities on its lower surface, is placed on the lower rectangular piece (3) and on specific zones of the porous membrane (4). Through use of a third piece 7 and screws 8, the malleable piece used 5 or 6 is pressed against the lower rectangular piece 3 and in particular against the porous membrane 4. Since the malleable structure (5 or 6) defines three cavities on its lower surface, only the ends and the areas between cavities are compressed. In this way, the surfaces subjected to compression become watertight surfaces thereby also creating three sealed cavities.

No caso de utilização da peça maleável do tipo aberto (6), as suspensões celulares e meios de cultura são 10 simplesmente colocados, removidos ou circulados nas cavidades através das suas aberturas superiores. A peça rectangular inferior (3) é preferencialmente fabricada a partir de policarbonato ou vidro. 0 uso preferencial destes materiais na construção desta peça relaciona-se com as suas propriedades químicas, mecânicas e ópticas já que são biologicamente inertes, extremamente resistentes a solventes e possuem grande estabilidade dimensional e resistência a altas temperaturas. ^ resistência a solventes e altas temperaturas permite uma grande versatilidade quanto ao processo de esterilizaçãQ utilizado, já que é possível uma esterilização tanto po^ exposição a solventes assim como também por exposição a altas temperaturas (autoclavagem). Adicionalmente, estes materiais possuem a vantagem de serem transparentes, permitindo assim que o conteúdo de cada cavidade seja observável através da parte inferior e superior do dispositivo.In the case of use of the malleable piece of the open type (6), the cell suspensions and culture media are simply placed, removed or circulated in the cavities through their upper apertures. The lower rectangular piece (3) is preferably fabricated from polycarbonate or glass. The preferred use of these materials in the construction of this part relates to its chemical, mechanical and optical properties since they are biologically inert, extremely solvent resistant and have great dimensional stability and high temperature resistance. resistance to solvents and high temperatures allows a great versatility as to the sterilization process used, since sterilization is possible both by exposure to solvents as well as by exposure to high temperatures (autoclaving). In addition, these materials have the advantage of being transparent, thus allowing the contents of each cavity to be observable through the lower and upper part of the device.

As peças maleáveis (5 e 6) são fabricadas por um processo de moldação preferencialmente a partir de silicone. Tal como o policarbonato ou vidro, o silicone é biologicamente inerte, resistentes a solventes e a altas temperaturas. Deste modo estas peças podem igualmente ser esterilizadas tanto por exposição a solventes assim como também por exposição a altas temperaturas (autoclavagem) Devido à transparência do silicone, estas peças permitem 11 assim que o conteúdo de cada cavidade seja observável através das suas paredes lateriais assim como, no caso da peça maleável fechada (5), através da parede superior. Adicionalmente, o silicone apresenta permeabilidade a gases, possibilitando assim a troca de gases entre as cavidades de cultura e o exterior. Esta caracteristica tem particular importância no caso dos dispositivos de configuração fechada (1).The malleable parts (5 and 6) are manufactured by a molding process preferably from silicone. Like polycarbonate or glass, the silicone is biologically inert, solvent resistant and at high temperatures. Thus, these parts can also be sterilized both by exposure to solvents as well as by exposure to high temperatures (autoclaving). Due to the transparency of the silicone, these pieces allow 11 as soon as the contents of each cavity are observable through its side walls as well as , in the case of the closed malleable piece (5), through the top wall. Additionally, the silicone presents gas permeability, thus allowing the exchange of gases between the culture and exterior cavities. This feature is of particular importance in the case of the closed configuration devices (1).

Em relação à peça de compressão (7) e aos parafusos utilizados (8), dado que não necessitam de ser transparentes ou inertes pois não entram em contacto directo com o interior das cavidades de cultura ou com a membrana porosa (4), podem ser fabricados a partir de uma maior variedade de materiais, desde que sejam dimensionalmente estáveis e resistentes a solventes e a altas temperaturas. A membrana porosa (4) deve preferencialmente ser fabricada a partir de um material ou de uma combinação de materiais biocompativeis e biodegradáveis, podendo estes ser processados por variados métodos, como por exemplo electrospinning. O tamanho dos poros da membrana deve também preferencialmente ser inferior ao diâmetro das células a serem cultivadas na superfície dessa membrana, de modo a que haja uma retenção mais eficiente de cada tipo celular específico em estratos específicos da estrutura tubular a fabricar. 12With respect to the compression part (7) and the screws used (8), since they do not need to be transparent or inert because they do not come into direct contact with the interior of the culture wells or with the porous membrane (4), they can be made from a greater variety of materials, as long as they are dimensionally stable and resistant to solvents and high temperatures. The porous membrane 4 should preferably be fabricated from a material or a combination of biocompatible and biodegradable materials, which can be processed by various methods, such as electrospinning. The pore size of the membrane should also preferably be less than the diameter of the cells to be cultured on the surface of that membrane, so that there is a more efficient retention of each specific cell type in specific strata of the tubular structure to be fabricated. 12

Nos dispositivos aqui descritos podem ser efectuadas três culturas distintas simultaneamente (uma em cada cavidade), as quais podem variar em múltiplas características tais como, por exemplo, o tipo e a densidade de células em cultura e o tipo de meio utilizado.In the devices described herein, three distinct cultures can be made simultaneously (one in each well), which may vary in multiple characteristics such as, for example, the type and density of cells in culture and the type of medium used.

Na configuração fechada (1) , o dispositivo pode ser integrado num sistema de cultura ilustrado na figura 11. Este sistema é composto pelo dispositivo (1) ligado a um reservatório de meio de cultura (10) por tubos ligados às suas estruturas tubulares (9) . Além de duas ligações para entrada/saída de meio, o reservatório (10) possui também uma ligação adicional para entrada e saída de gases, os quais são purificados por um filtro de ar (11).In the closed configuration (1) the device can be integrated into a culture system shown in Figure 11. This system is composed of the device (1) connected to a culture medium reservoir (10) by tubes connected to its tubular structures (9). ). In addition to two medium inlet / outlet connections, the reservoir 10 also has an additional gas inlet and outlet connection, which is purified by an air filter 11.

Após esterilização e montagem do dispositivo na sua forma fechada (1) ou aberta (2), contendo uma membrana 14 porosa (4) igualmente esterilizada no seu interior, devidamente comprimida nas suas extremidades e áreas inter-cavidades, o dispositivo está pronto para ser iniciado o passo de colonização celular sobre a superfície da membrana porosa (4). A colonização celular pode ser efectuada de diferentes formas dependendo da configuração do dispositivo utilizado. No caso de utilização de um dispositivo de configuração aberta (2) uma suspensão celular pode ser simplesmente transferida para o interior das cavidades através das aberturas superiores das mesmas, sobre a superfície da membrana porosa (4) . Dado que existem três cavidades contíguas independentes, é possível transferir suspensões com tipos ou combinações de tipos celulares distintas para cada uma dessas cavidades. A suspensão celular deve possuir um volume suficiente para cobrir a superfície da membrana porosa delimitada por cada cavidade. Após transferência das suspensões celulares para as cavidades, uma tampa deve ser colocada sobre o dispositivo de modo a evitar evaporação.After sterilization and assembly of the device in its closed (1) or open (2) form, containing a porous membrane (4) equally sterilized therein, properly compressed at its ends and inter-cavities, the device is ready to be the cell colonization step was initiated on the surface of the porous membrane (4). Cell colonization can be effected in different ways depending on the configuration of the device used. In the case of use of an open set-up device 2 a cell suspension can simply be transferred into the cavities through the upper openings thereof on the surface of the porous membrane 4. Since there are three independent contiguous cavities, it is possible to transfer suspensions with types or combinations of distinct cell types for each of these cavities. The cell suspension must have a volume sufficient to cover the surface of the porous membrane delimited by each cavity. After transferring the cell suspensions into the wells, a cap should be placed on the device in order to avoid evaporation.

Após ligação das tubagens do sistema às estruturas tubulares (9) de cada cavidade, uma suspensão celular previamente transferida para o reservatório de meio de cultura (10) é bombeada e circulada pelo interior de cada uma das cavidades do dispositivo. O período de tempo necessário para efectuar cada um dos métodos de colonização celular anteriormente descritos é variável, dependendo de vários factores tais como o tipo de células utilizadas e preferências do operador.After connecting the tubing of the system to the tubular structures 9 of each cavity, a cell suspension previously transferred to the culture medium reservoir 10 is pumped and circulated within each of the wells of the device. The time period required to effect each of the above-described cell colonization methods is variable, depending on various factors such as the type of cells used and operator preferences.

Como resultado, é obtida uma membrana porosa colonizada (13) por células em três áreas distintas da sua superfície. Cada uma destas áreas contém uma única ou uma combinação distinta de células das encontradas nas outras áreas colonizadas.As a result, a colonized porous membrane (13) is obtained by cells in three distinct areas of its surface. Each of these areas contains a single or a distinct combination of cells found in the other colonized areas.

Finalmente, após um período de cultura suficiente para que seja formada uma matriz celular consistente na estrutura tubular estratificada (15), a estrutura tubular de enrolamento (14) é removida do interior da estrutura tubular estratificada (15). Sendo assim obtido um substituto tecidular tubular estratificado pronto para ser utilizado (19). A estrutura de enrolamento porosa (14) deverá preferencialmente ser fabricada a partir de politetrafluoretileno (PTFE). A utilização de PTFE no fabrico desta estrutura justifica-se pelo seu reduzido coeficiente de fricção, o que facilita o processo de remoção desta estrutura do interior da estrutura tubular estratificada (15) e sem que se produza qualquer dano nesta última. Além disso, o PTFE caracteriza-se pela sua excelente estabilidade dimensional, propriedades mecânicas constantes e pelo facto de ser um material inerte e biocompativel. Além disso apresenta grande resistência a solventes e a altas temperaturas sendo assim facilmente esterilizavel pCr mei0 ^e uso de solventes ou autoclavagem.Finally, after a sufficient culture period for forming a cell matrix consistent with the layered tubular structure 15, the tubular winding structure 14 is withdrawn from the interior of the layered tubular structure 15. Thus, a stratified tubular tissue substitute is obtained ready to be used (19). The porous winding structure 14 should preferably be fabricated from polytetrafluoroethylene (PTFE). The use of PTFE in the manufacture of this structure is justified by its low coefficient of friction, which facilitates the process of removing this structure from the interior of the layered tubular structure (15) and without any damage to the latter. In addition, PTFE is characterized by its excellent dimensional stability, constant mechanical properties and the fact that it is an inert and biocompatible material. In addition it exhibits high resistance to solvents and high temperatures thus being easily sterilizable by use of solvents or autoclaving.

Lisboa, 29 de Junho de 2012 19Lisbon, June 29, 2012 19

REIVINDICAÇÕES 1. Dispositivo para colonização e cultivo separado de múltiplos e distintos tipos celulares em áreas distintas de uma mesma membrana porosa caracterizado por consistir numa peça rectangular inferior (3) sobre a qual é centralmente colocada uma membrana porosa (4) , numa peça maleável do tipo fechado (5) ou aberto (6) e que define pelo menos duas cavidades contíguas, estanques entre si, na sua superfície inferior colocada sobre a peça rectangular inferior (3) e sobre as zonas da membrana porosa (4) que delimitam as referidas cavidades, e numa terceira peça (7), que por intermédio da utilização de parafusos (8) , comprime a peça maleável utilizada (5 ou 6) contra a peça rectangular inferior (3) e em particular contra a membrana porosa (4). 2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por permitir uma configuração aberta ou fechada. 3. Dispositivo, de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por na peça maleável do tipo fechado (5) serem adicionadas pelo menos duas estruturas tubulares (9) que trespassam as suas paredes laterais e que servem para a injecção, remoção e circulação de fluidos tais como suspensões celulares e meios de cultura de/para o interior das cavidades previamente delimitadas pelo dispositivo. 1A device for colonization and separate culturing of multiple and distinct cell types in distinct areas of the same porous membrane characterized in that it consists of a lower rectangular part (3) on which a porous membrane (4) is centrally placed in a malleable part of the (5) or open (6) and defines at least two contiguous cavities, sealed together, on its lower surface placed on the lower rectangular piece (3) and on the zones of the porous membrane (4) defining the said and in a third part 7 which by means of screws 8 compresses the malleable piece 5 or 6 against the lower rectangular piece 3 and in particular against the porous membrane 4. Device according to claim 1, characterized in that it allows an open or closed configuration. Device according to the preceding claims, characterized in that at least two tubular structures (9) are introduced into the closure-type malleable piece (5), which pass through its side walls and serve for the injection, removal and circulation of such fluids. as cell suspensions and culture media to / from the cavities previously delimited by the device. 1

Claims

A device for colonization and separate culturing of multiple and distinct cell types in distinct areas of a same porous membrane characterized in that it comprises a lower rectangular part (3) on which a porous membrane (4) is centrally placed, a malleable part of the (5) or open (6) and defining at least two contiguous cavities on its lower surface placed on the lower rectangular piece (3) and on specific zones of the porous membrane (4), and a third part (7) , which by means of the use of screws 8 compresses the malleable piece used 5 or 6 against the lower rectangular piece 3 and in particular against the porous membrane 4.

Device according to claim 1, characterized in that it allows an open or closed configuration.

Device according to the preceding claims, characterized in that at least two tubular structures (9) are introduced into the closure-type malleable piece (5), which pass through its side walls and serve for the injection, removal and circulation of such fluids. as cell suspensions and culture media to / from the cavities previously delimited by the device. 1

Device according to the preceding claims, characterized in that the malleable structure of the closed (5) or open configuration (6) defining at least two cavities on its lower surface causes only the porous membrane areas (4) located beneath its ends and cavity zones are compressed by being compressed against the porous membrane 4 and the lower rectangular part 3, causing the surfaces to be subjected to compression and sealing surfaces creating at least two sealed cavities.

A device according to the preceding claims, characterized in that it allows the use of all cell types, of animal or human origin being primary cultures or cell lines, used in colonization and cell adhesion and / or culture maintenance procedures. Claims (4) are of membrane materials to be cells to be

Device according to the foregoing, characterized in that the membrane is preferably made from biocompatible and pore size is preferably less than the diameter of those grown on the surface of that membrane.

Device according to the preceding claims, characterized in that the lower rectangular part 2 (3), the malleable parts (5 and 6), the compression part (7) and the screws used (8) are manufactured from extremely strong materials (3) is made from a biologically inert material, preferably polycarbonate or glass, and the malleable parts (5 and 6) are also made from a biologically inert material, preferably manufactured by a molding process from silicone.

Device according to the preceding claims, characterized in that it allows the observation of the interior of its internal chambers through the walls of its parts due to the transparency of most of the materials used in its construction and to be sterilized by chemical or thermal methods.

A dynamic culture system using a device for colonization and separate culturing of multiple and distinct cell types in distinct areas of the same porous membrane of the closed type characterized by comprising a closed configuration device (1) connected to a reservoir of culture medium (10) by tubes connected to its tubular structures (9), the reservoir (10) having two medium inlet / outlet and gas inlet / outlet ports which are purified by an air filter (11), the culture medium being collected from the culture medium reservoir (10), preferably pumped by a peristaltic pump (12) into the culture well within the device and finally pumped by the same peristaltic pump (12) back into the reservoir of culture medium (10); this apparatus being repeated for each of the individual culture wells within the closed configuration device (1).

Dynamic culture system according to claim 9, characterized in that the circulation of colonizing cell suspensions or expansion or differentiation medium is continuous or discontinuous and is performed both unidirectionally and bidirectionally.

Dynamic culture system according to claims 9 and 10, characterized in that the pipes are manufactured from materials permeable to gases such as carbon dioxide and oxygen, such as silicone, in order to provide the exchange of gases between the circulating medium and the surrounding atmosphere.

A method of generating tubular tissue substitutes characterized in that it consists of a first phase of cell colonization of specific areas of the surface of a porous membrane (4) located inside and delimited by internal cavities of a closed configuration device (5) or open (6), followed by a second culture step of expanding and / or differentiating these same cells on the surface of the porous membrane (4), followed by a third phase of rolling the colonized porous membrane (13) around a (4), followed by a fourth post-culture phase and removal of the winding structure (14) from the inside of the layered tubular structure (15) produced by the winding process and thus yielding a layered tubular tissue substitute (19) .

A method of generating tubular tissue substitutes according to claim 12, characterized by a winding step in which, after disassembly of the closed (1) or open (2) configuration culture device used in the culture phase, the colonized membrane 13 generated within this device is wound around a tubular or cylindrical winding structure 14 beginning at the end of the porous membrane closest to the inner cell type 16, i.e., the cell type which should is located in the innermost layers of the layered tubular structure 15, and terminating at the end containing the outer cellular type 18, which will be located in the outermost layers of the layered tubular structure 18, in which, and if necessary , a biocompatible adhesive element may be applied so as to enhance the stability of the layered tubular structure. 5

A method of generating tubular tissue substitutes according to claims 12 and 13, characterized by a post-culture phase, wherein the layered tubular structure (15) is kept submerged in culture medium to allow the adhesion of the cells contained in the various layers to the membrane surfaces in the adjacent layers, and removal of the winding structure 14 from the interior of the layered tubular structure 15 and thus yielding a layered tubular tissue substitute 19.

A method for generating tubular tissue substitutes according to claims 12 to 14, characterized in that the porous coil structure (14) is manufactured from a material having a low coefficient of friction, good dimensional stability, constant mechanical properties , inert, biocompatible, and with high resistance to solvents and at high temperatures, preferably polytetrafluoroethylene (PTFE). Device according to the preceding claims, characterized in that the malleable structure of closed or open configuration (6) defining at least two cavities on its lower surface causes only areas of the porous membrane (4) located below its ends and zones between cavities are compressed by being compressed against the porous membrane (4) and the lower rectangular part (3), rendering the surfaces subject to compression watertight surfaces and creating at least two watertight cavities. A device according to the preceding claims, characterized in that it allows the use of all cell types, of animal or human origin being primary cultures or cell lines, used in colonization and cell adhesion and / or culture maintenance procedures. The device according to the preceding claims, characterized in that the membrane is preferably made from biocompatible and pore size is preferably less than the diameter of those grown on the surface of that membrane. Device according to the preceding claims, characterized in that the lower rectangular part 2 (3), the malleable parts (5 and 6), the compression part (7) and the screws used (8) are manufactured from materials resistant to (3) is made of a biologically inert material, preferably polycarbonate or glass, and the malleable parts (5 and 6) are also made of a polyamide, glass, and silicone material and have a high stability and high temperature resistance, preferably polycarbonate, glass and silicone. made from a biologically inert material preferably made by a molding process from silicone. Device according to the preceding claims, characterized in that it is made of transparent materials, preferably polycarbonate, glass and silicone and can be sterilized by chemical or thermal methods. A dynamic culture system using a device for colonization and separate culturing of multiple and distinct cell types in distinct areas of the same porous membrane of the closed type characterized in that it consists of a closed configuration device (1) connected to a reservoir of culture medium (10) by tubes connected to its tubular structures (9), the reservoir (10) having two medium inlet / outlet and gas inlet / outlet ports which are purified by an air filter (11), the culture medium being collected from the culture medium reservoir (10), preferably pumped by a peristaltic pump (12) into the culture well within the device and finally pumped by the same peristaltic pump (12) back into the reservoir of culture medium (10); this apparatus being repeated for each of the individual culture wells within the closed configuration device (1). Dynamic culture system according to claim 9, characterized in that the circulation of colonizing cell suspensions or expansion or differentiation means is continuous or discontinuous and is performed both unidirectionally and bidirectionally. Dynamic culture system according to claims 9 and 10, characterized in that the pipes are manufactured from materials permeable to gases such as carbon dioxide and oxygen, such as silicone, in order to provide the exchange of gases between the circulating medium and the surrounding atmosphere. A method of generating tubular tissue substitutes characterized in that it consists of a first phase of cell colonization of specific areas of the surface of a porous membrane (4) located inside and delimited by internal cavities of a closed configuration device (5) or open (6), followed by a second stage of expansion culture and / or differentiation of these same cells on the surface of the porous membrane (4), followed by a third phase of rolling the colonized porous membrane (13) around a (4), followed by a fourth post-culture phase and removal of the winding structure (14) from the inside of the layered tubular structure (15) produced by the winding process and thus yielding a layered tubular tissue substitute (19) . A method of generating tubular tissue substitutes according to claim 12, characterized by a winding step in which, after disassembly of the closed (1) or open (2) configuration culture device used in the culture phase, the colonized membrane 13 generated within this device is wound around a tubular or cylindrical winding structure 14 beginning at the end of the porous membrane closest to the inner cell type 16, i.e., the cell type which should is located in the innermost layers of the layered tubular structure 15, and terminating at the end containing the outer cellular type 18, which will be located in the outermost layers of the layered tubular structure 18, in which, and if necessary , a biocompatible adhesive element may be applied so as to enhance the stability of the layered tubular structure. A method of generating tubular tissue substitutes according to claims 12 and 13, characterized by a post-culture phase, wherein the layered tubular structure (15) is kept submerged in culture medium in order to allow adhesion of the cells contained in the various layers to the membrane surfaces in the adjacent layers, and removal of the winding structure 14 from the interior of the layered tubular structure 15 and thus yielding a layered tubular tissue substitute 19.

A method for generating tubular tissue substitutes according to claims 12 to 14, characterized in that the porous coil structure (14) is manufactured from a material having a low coefficient of friction, good dimensional stability, constant mechanical properties , inert, biocompatible, and with high resistance to solvents and at high temperatures, preferably polytetrafluoroethylene (PTFE). Lisbon, June 29, 2012 6 FIGURES

Figure 1