PT105210B - Nova estirpe da espécie metschnikowia andauensis e sua utilização como agente de controlo biológico das doenças em frutos. - Google Patents

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Carla Alexandra Alves Afonso Nunes
Teresa Claudia Marchao Manso
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Univ Do Algarve
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NOVA ESTIRPE DA ESPÉCIE METSCHNIKOWIA ANDAUENSIS E SUA UTILIZAÇÃO COMO AGENTE DE CONTROLO BIOLÓGICO DAS DOENÇAS EM FRUTOS.A PRESENTE INVENÇÃO CONSISTE NA UTILIZAÇÃO DA ESPÉCIE DA LEVEDURA METSCHNIKOWIA ANDAUENSIS COMO AGENTE DE CONTROLO BIOLÓGICO DAS DOENÇAS EM FRUTOS. É DESCRITA UMA CULTURA BIOLÓGICA PURA DA ESPÉCIE DE LEVEDURA METSCHNIKOWIA ANDAUENSIS, DEPOSITADA NO NATIONAL COLLECTION OF YEAST CULTURES (NCYC) (INGLATERRA), E A SUA UTILIZAÇÃO COMO ANTAGONISTA PARA O CONTROLO BIOLÓGICO DE DOENÇAS EM FRUTOS.

Description

DESCRIÇÃO
NOVA ESTIRPE DA ESPÉCIE METSCHNIKOWIA ANDAUENSIS E SUA UTILIZAÇÃO COMO AGENTE DE CONTROLO BIOLÓGICO DAS DOENÇAS EM FRUTOS
A presente invenção refere-se à utilização da levedura da espécie Metschnikowia andauensis como agente de controlo biológico das doenças em frutos com o objetivo de prevenir a podridão da mesma.
Antecedentes da invenção
Domínio da técnica
A presente invenção está relacionada com o controlo biológico de doenças de pós-colheita em frutos, usando a espécie Metschnikowia andauensis.
Descrição da técnica existente
As doenças de pós-colheita dos frutos produzem perdas anuais na agricultura que se estimam, a nível mundial, na ordem dos 15% a 20% do total das colheitas. Na atualidade, o sistema mais utilizado para combater os fungos responsáveis da podridão dos frutos é o controlo químico, mediante tratamento dos mesmos com produtos fungicidas. 0 uso de fungicidas está bastante estendido a nível mundial e estima-se que seja até 26% dos pesticidas dos mercados europeu e asiático e, até 6% no caso do mercado norteamericano .
A utilização intensiva dos referidos produtos fungicidas gerou uma série de problemas, tais como o aparecimento de estirpes patogénicas resistentes, o risco para i
saúde humana pelo incremento de resíduos de fungicidas nos frutos que provoca problemas de tipo sanitário e dificulta as exportações aos países que possuem uma legislação sanitária restritiva sobre o tema, e risco para o ambiente.
Perante esta problemática começou-se a desenvolver, há alguns anos, investigação no sentido de encontrar novos métodos alternativos para o controlo das doenças dos frutos, sendo uma das alternativas mais prometedoras o controlo biológico dos fungos responsáveis das podridões mediante o uso de microrganismos. O referido controlo biológico fundamenta-se na ação inibidora de alguns microrganismos sobre o crescimento e ação dos fungos patogénicos.
Nas duas últimas décadas tem sido descrito o uso de bactérias e leveduras como agentes de controlo biológico de doenças de pós-colheita de frutos. Como bactérias apresentam-se alguns exemplos: Janisiewicz e Marchi, Plant Dis. 76:555 (1992), descrevem a utilização de Pseudomonas syringae como agente de biocontrolo de pós-colheita para combater a podridão das peras; Nunes et al., Int. J. Food Microbiol. 70:53 (2001), Nunes et al. , J. Appl. Microbiol. 92:247 (2002) e Teixidó et al., J. Plant Pathol. 107:685 (2001), descrevem a utilização de Pantoea agglomerans CPA-2 no combate das principias doenças de pós-colheita de peras, maçãs e laranjas, respetivamente, com o registo de a patente n° 2149131 em Espanha (2001) e com o n° 1174030 em França (2004). Manso et al., World J. Microbiol. Biotechno. 26:725 (2010) descrevem também o uso de Pantoea agglomerans PBC-1 no combate das principiais doenças de pós-colheita de peras, maçãs e laranjas.
Em relação ao uso de leveduras existem diversas descrições tais como: Vinas et al., Int. J. Food Microbiol. 40:9 (1998), descreveram a utilização de Candida sake como agente de controlo biológico dos principais fungos patogé rticos cm pós-colheita de maçãs, com o registo de patente n° 2089981 em Espanha ¢1997), e o registo EP 0 781 843 B1 na European Patent Office (1997). Nos últimos anos descreveram-se o uso de espécies do género Metschnikowia como: Janisiewicz et al., Phytopathology 91:1098 (2001), o uso de Metschnikowia pulcherrima para o controlo de Penicillium expansum em maçãs; Kurtzman e Droby, Syst. Appl. Microbiol. 24:395 (2001), o uso de Metschnikowia fructicola, no controlo de Botrytis na conservação de uva, e Zhang et al., Postharvest Biol, Tec. 55:174 (2010) entre outros microrganismos o uso de Metschnikowia sp. no controlo de Monilinia laxa em pêssegos.
Em Taxonomia, a ciência que classifica os seres vivos, um género agrupa espécies que partilham um conjunto muito alargado de caracteristicas morfológicas e funcionais, refletida pela existência de ancestrais comuns muito próximos, e uma espécie, que designa a unidade básica do sistema taxonómico, corresponde a cada um dos grupos em que se dividem os géneros, e que são compostos de indivíduos que, para além dos caracteres genéricos, têm em comum outros caracteres pelos quais se assemelham entre si e se distinguem das demais espécies. Uma subespécie é uma subdivisão da espécie. Normalmente uma subespécie surge quando duas ou mais populações de uma mesma espécie se separam por barreiras geográficas por muitas gerações e as populações evoluem de maneiras distintas, dando origem a subespécies diferentes. A nomenclatura binomial é o método atribuição do nome científico das espécies formado pela combinação do nome do género seguido do nome restritivo específico, e as subespécies têm um nome composto por três nomes, o nome da espécie seguido do nome restritivo subespecífico.
Pelo atrás explicado, o facto de microrganismos de um género apresentarem atividade antagonista frente a outros, não implica que todos os microrganismos pertencentes a esse género apresentem essas caracteristicas, e o mesmo se observa para microrganismos da mesma espécie, caso pertençam a subespécies diferentes. De facto, pelo contrário pode ocorrer que para microrganismos do mesmo género, um seja patogénico para plantas e outro seja o seu antagonista. Isto ocorre com a bactéria patogénica Erwinia amylovora responsável do fogo bacteriano em pomóideas que é controlada pelo agente de controlo biológico do mesmo género Erwinia herbicola, como relatam diversos artigos (Vanneste et al., J. Bacteriol. 174:2785 (1992), Wodzinski et al., J. Appl.
Bacteriol. 76:22 (1994), Kearns e Hale, J. Appl. Bacteriol. 81:369 (1996)). Outros trabalhos indicam que para o mesmo género umas espécies podem ser agentes de biocontrolo e outras agentes patogénicos. Por exemplo existem espécies do género Pseudomonas eficazes agentes de controlo biológico em frutos e vegetais, como é Pseudomonas cepacia (Janisiewicz e Roitman, Phytopathology 78:1697, 1988),
Pseudomonas syringae (Janisiewicz e Marchi, Plant Dis. 76:555, 1992; Nunes et al., Agr. Food Sei.16:56, 2007) e
Pseudomonas fluorescenses (Etebarian et al., Can. J. Microbiol. 51:591, 2005) e outras são responsáveis pela sua deterioração (Nguyenthe e Carlin, Crit Rev Food Sei 34:371, 1994). Estas características antagónicas podem também ser observadas dentro da mesma espécie. Como já se referiu a espécie Pseudomonas syringae possui estirpes agentes de controlo biológico, alguma já comercializada, Bio-save™ (Jet Harvest Solutions, EUA), mas esta espécie também tem estirpes fitopatogénicas para diversos frutos. Bultreys e Gheysen (Appl. Environm. Microbiol. 65:1904, 1999) indicam que esta espécie possui 57 subespécies patogénicas, umas patogénicas para plantas, frutos, vegetais e outras para microrganismos. Esta patogenicidade deve-se à produção de diversos metabolitos, como são os antibióticos. Este fenómeno também se observa em fungos. 0 género Penicillium é conhecido por ter diversas espécies patogénicas e algumas consideradas como as responsáveis pelas podridões mais importantes na pós-colheita de frutos, como é o caso de Penicillium expansum para diversos frutos (maça, pera, pêssego...), Penicillium digitatum e Penicillium italicum os responsáveis pelas severas perdas em citrinos, sendo o primeiro capaz de produzir podridão apenas em citrinos. Mas este género possui também espécies agentes de controlo biológico, como é Penicillium frequentans que controla a podridão causada por Monilia laxa em pêssegos (Guijarro et al., Biol. Control 42:86, 2007).
Microrganismos da mesma espécie podem apresentar diferente atividade antagonista, podendo esta em alguns casos ser nula ou de controlo total, por isso existem estirpes de uma espécie que são agentes de controlo biológico e outras estirpes da mesma espécie não tem atividade antagonista. A atividade antagonista de um microrganismo está dependente de vários fatores: os modos de ação dos agentes de biocontrol estão descritos como um complexo mecanismo de interação entre o hospedeiro, o agente patogénico, o antagonista e o ambiente. Este mecanismos compreende um ou mais dos seguintes processos: competição por nutrientes e/ou espaço, antibiose, indução de resistência ao hospedeiro, parasitismo ou produção de enzimas. A interação que ocorre neste complexo, que está dependente muitas vezes da estirpe do microrganismo, variedade do fruto e o ambiente é que vai determinar a capacidade de controlar o agente patogénico, e é o seu conhecimento profundo que permitirá potenciar essa atividade de controlo.
controlo biológico pode ser melhorado na sua atividade inibidora mediante combinação de diversos agentes de biocontrolo, da combinação do agente de biocontrolo com outros sistemas alternativos aos fungicidas, da alteração do ambiente onde os agentes de biocontrolo têm que atuar, da adaptação dos agentes a diversas condições ou melhoramento genético Nunes et al., J. Food Protec. 65:178 (2002); Nunes et al. Phytopathology 92:281 (2002); Torres et al., Eur. J. Plant Pathol. 118:73 (2007); Canamás et al., J. Appl. Microbiol. 104:767(2008).
No momento apenas 4 produtos estão disponíveis no mercado para uso na pós-colheita, Biosave (Pseudomonas syringae) registado nos EUA e usado principalmente no controlo de doenças de batata, “Shemer” (Metschnikowia fructicola) registado em Israel e usado principalmente no controlo de doenças de batata-doce e cenoura, e registados em Espanha Candif ruit” (Candida sake) e “Pantovital” (Pantoea agglomerans) para o controlo de doenças de pós-colheita de pomóideas e citrinos, respetivamente.
Desconhece-se, que até ao momento se tenha proposto a utilização da espécie Metschnikowia andauensis, como agente de controlo biológico das doenças fúngicas dos frutos, nem para outros usos,
Na patente WO 02/072777 A2 (2002) descreve-se uma nova espécie de Metschnikowia fruticola no controlo de microrganismos patogénicos em plantas. Na patente US-6991930 (2006) descreve-se o controlo biológico de doenças de póscolheita usando estirpes da espécie Metschnikowia, no entanto a patente refere-se apenas a estirpes da espécie Metschnikowia pulcherrima no controlo de Penicillium expansum em maçãs em pós-colheita. Na patente WO 2009/040862 Al descreve-se uma nova estirpe também da espécie Metschnikowia pulcherrima eficaz no controlo de doenças causadas por Penicillium expansum, Alternaria alternata e Botrytis cinerea em pós-colheita. Estas são espécies separadas e dife rentes de Metschnikowia andauensis. Existem muitas espécies do género Metschnikowia, mais de 40, no entanto apenas as espécies Metschnikowia frutícola e Metschnikowia pulcherrima são referidas por terem capacidade antagonista frente aos patogénios de pós-colheita.
Metschnikowia andauensis separa-se de Metschnikowia pulcherrima com base na análise da sequência da região D1/D2 da subunidade rDNA, e nos testes fisiológicos pela ausência de formação de pseudomicélio. Ambas espécies apresentam a formação de células de pulcherrim o que indica uma dependência forte do ferro. 0 mecanismo de ação de Metschnikowia pulcherrima na inibição do patogénio está indicado como sendo a competição pelo ferro, elemento importante ao desenvolvimento de microrganismos, pois quando Metschnikowia pulcherrima e o patogénio se encontram num meio com pouca quantidade de ferro, Metschnikowia pulcherrima assimila o ferro disponível impedindo o desenvolvimento do patogénio. Este efeito de inibição vai diminuindo à medida que a concentração de ferro aumenta, ou seja deixa de ser um fator limitante para o patogénio (Saravanakumar et al., Postharvest Biol. Tec. 49:121 (2008). Este fator limitante não se verifica na presença de Metschnikowia andauensis. A presença de Metschnikowia andauensis e do patogénio em meio com pouca quantidade de ferro não provoca a inibição do desenvolvimento do patogénio, o que indica que a competição por este elemento não é o mecanismo de ação responsável da capacidade antagonista de Metschnikowia andauensis, sendo esta uma das razões pelo qual o efeito antagonista da espécie Metschnikowia andauensis ser inesperado. Em relação a Metschnikowia fructicola, a espécie Metschnikowia andauensis separa-se desta também com base na análise da sequência da região D1/D2 da subunidade rDNA, e nos testes fisiológicos, pela produção do pigmento de cor castanha, conhecido como pulcherrimin ou pulcherimo, ausente na espécie Metschnikowia fructicola, só por si característica suficiente para que apresentem atividades diferentes .
Nos ensaios realizados na procura de agentes de controlo biológico isolamos diversas estirpes do género Metschnikowia sem potencial para serem usadas como agentes de controlo biológico uma vez que não apresentaram atividade antagonista dos patogénios de pós-colheita, outra razão pelo que a elevada capacidade antagonista de Metschnikowia andauensis e o seu potencial para ser usado como agente de biocontrolo mostrou-se surpreendente. Ainda com o objetivo de confirmar que capacidade antagonista de Metschnikowia andauensis não é característica do género Metschnikowia mas sim da espécie, diferentes espécies deste género foram ensaiadas para testar a eficácia no controlo de P. expansum em maçãs. Testaram-se estirpes das espécies Metschnikowia aberdeeniae, Metschnikowia bicuspida, Metschnikowia boroa lis, Metschnikowia colocasiae, Metschnikowia gruessi, Metschnikowia hibisci, Metschnikowia orientalis, Metschnikowia zobellíi. Nenhum dos microrganismos testados apresentou a capacidade antagonista altamente eficaz de Metschnikowia andauensis no controlo da podridão azul em maçãs.
Sumário da invenção
A presente invenção visa proporcionar uma cultura biológica substancialmente pura da espécie da levedura Metschnikowia andauensis capaz de atuar como antagonista altamente eficaz para o controlo biológico dos fungos patogénicos responsáveis da podridão da fruta na pré e póscolheita e que mantém, a sua efetividade em condições de baixa temperatura.
A presente invenção consiste na utilização de pelo menos uma estirpe da espécie Metschnikowia andauensis, por si só ou junto a outros agentes anti-fúngicos e/ou adjuvantes, principalmente ceras, aditivos alimentares e substâncias de baixa toxicidade, para prevenir a podridão da fruta colhida.
A presente invenção consiste em proporcionar um método de controlo biológico para a melhor conservação da fruta colhida em diferentes condições de armazenamento, no que respeita à temperatura, atmosfera de oxigénio e dióxido de carbono, e outros conservantes.
Breve descrição dos desenhos
Anexa-se à presente descrição, para uma melhor compreensão da mesma, mas sem efeitos limitativos, desenhos que à continuação, expõe-se uma breve descrição.
A figura 1 é uma representação gráfica das curvas de crescimento de Metschnikowia andauensis NCYC 3728, em meio YPS e LICY a 25 °C.
A figura 2 é uma representação gráfica de evolução da população de Metschnikowia andauensis NCYC 3728,
aplicado em maçãs 'Golden Delicious' , em condições de con-
servação a 1 °C, durante 95 dias, seguidos de 7 dias a
25 °C.
A figura 3 é uma representação gráfica de evolu-
ção da população de Metschnikowia andauensis NCYC 3728
aplicado em pera 'Rocha', em condições de conservação a
°C, durante 95 dias, seguidos de 7 dias a 25 °C.
A figura 4 é uma representação gráfica em forma de diagrama de barras das percentagem de feridas podres e o do diâmetro de podridão em maçãs 'Golden Delicious'', inoculadas com Penicillium expansum IO4 ufc/ml, causadas por inoculação de diferentes concentrações do antagonista de Metschnikowia andauensis NCYC 3728. Dados obtidos após 7 dias de incubação a 20 °C.
A figura 5 é uma representação gráfica em forma de diagrama de barras das percentagens de feridas podres em diferentes variedades de maçã inoculadas com Botrytis cinerea 104 ufc/ml, causados por inoculação do antagonista de Metschnikowia andauensis NCYC 3728. Dados obtidos após 7 dias de incubação a 20 °C.
A figura 6 é uma representação gráfica em forma de diagrama de barras das percentagens de feridas podres em diferentes variedades de maçã inoculadas com Penicillium expansum 104 ufc/ml, causados por inoculação do antagonista de Metschnikowia andauensis NCYC 3728. Dados obtidos após 7 dias de incubação a 20 °C.
A figura 7 é uma representação gráfica em forma de diagrama de barras das percentagens de feridas podres em diferentes variedades de maçã inoculadas com Rhizopus stolonifer 104 ufc/ml, causados por inoculação do antagonista de Metschnikowia andauensis NCYC 3728. Dados obtidos após 7 dias de incubação a 20 °C.
A figura 8 é uma representação em forma de diagrama de barras das percentagens de frutos podres em laranjas, inoculadas com Penicillium digita tum ou Penicillium italicum 106 ufc/ml, causados por inoculação do antagonista Metschnikowia andauensis NCYC 3728. Dados obtidos após 7 dias de incubação a 20 °C,
A figura 9 é uma representação em forma de diagrama de barras das percentagens de frutos podres em Clementinas, inoculadas com Penicillium digitatum ou Penicillium italicum 106 ufc/ml, causados por inoculação do anta gonista Metschnikowia andauensis NCYC 3728. Dados obtidos após 7 dias de incubação a 20 °C.
A figura 10 é uma representação em forma de diagrama de barras das percentagens de feridas podres e de linhas do diâmetro de podridão das feridas em maçãs 'Golden Delicious', inoculadas com Penicillium expansum 104 ufc/ml, causados por inoculação de água (controlo), do antagonista Metschnikowia andauensis NCYC 3728 a 107 ufc/ml, e do fungicida Imazalil a dose comercial. Dados obtidos após 4 meses de conservação a 0±l °C.
A figura 11 é uma representação em forma de diagrama de barras das percentagens de frutos podres em peras 'Rocha', inoculadas com Penicillium expansum 104 ufc/ml, causados por inoculação do antagonista Metschnikowia andauensis NCYC 3728. Dados obtidos após 1, 2 e 3 meses de conservação a 0±l °C.
A figura 12 é uma representação em forma de diagrama de barras tridimensional das percentagens de frutos podres em laranjas 'Valência Late' , inoculadas com Penicillium digitatum 106 ufc/ml, causados por inoculação do antagonista Metschnikowia andauensis NCYC 3728 em combinação com sorbato de potássio. Dados obtidos após 7 dias de incubação a 20 °C.
Descrição detalhada da invenção
Os autores da presente invenção isolaram uma estirpe da levedura da espécie Metschnikowia andauensis. Esta espécie mostra uma eficácia muito elevada como antagonista das espécies de fungos responsáveis das doenças dos frutos antes e depois da sua colheita (pré e pós-colheita) , numa ampla gama de temperaturas e atmosferas de oxigénio, o que permite a sua utilização industrial para o controlo bioló gico das referidas espécies fúngicas e prevenir a podridão dos frutos de, que incluem, mas não se limitam, pomóideas, citrinos, prunóideas e frutos vermelhos pequenos. Esta espécie está separada e é distinta de outras do mesmo género, usadas como agentes de controlo biológico, como Metschnikowia frutícola (Kurtzman e Droby, Syst. Appl. Microbiol. 24: 395, 2001) e Metschnikowia pulcherrima (Janisiewicz et al., Phytopathology 91:1098, 2001; Spadaro et al. Postharvest Biol. Tec. 24:123, 2002).
O microrganismo da presente invenção isolou-se da superfície de maçãs da variedade 'Bravo de Esmolfe', mediante lavagem com água estéril seguida de um banho em ultrassons com tampão fosfato, e realizou-se um depósito seguro de uma cultura da mesma, no National Collection of Yeast Cultures (NCYC) do Institute for Food Research (IFR) (Norwich, Inglaterra). A NCYC autoridade internacional de depósito a 01/03/2010 transformou o anterior num depósito com o número NCYC 3728 de acordo com as provisões do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento do depósito de microrganismos para o propósito do procedimento de patentes.
Após o seu isolamento cultivou-se em meio sólido NYDA consistente em caldo nutritivo, extrato de levedura, glucose e agar, e em meio líquido YPD consistente em peptona, extrato de levedura e dextrose.
Segundo NCYC morfologicamente, Metschnikowia andauensis NCYC 3728 forma colónias de cor bege, bem definidas, reproduz-se por gemulação multipolar. Em meio YM liquido consistente em extrato de levedura, extrato de malte, peptona e glucose após dois dias as células têm forma oval, dimensão de (3-6)x(5-8) pm, apresentando-se tanto em células isoladas, aos pares ou em grupo. Em meio YM Agar (igual YM liquido com agar) após dois dias as células têm forma redonda para oval, dimensão de (3-9)χ(5-9) pm, apresentan12 do-se tanto em células isoladas, aos pares ou em grupos. Não produz pseudomicélio, nem micélio verdadeiro. Tem crescimento em meio com 50 e 60% de glucose e apresenta as caracteristicas bioquímicas que se detalham nas tabelas I, II 5 e III:
Tabela I.- Resultados testes bioquímicos relativos à fermentação usando o Programa de identificação de leveduras 10 Versão 5, de J A Barnett, R W Payne & D Yarrow
TESTES DE FERMENTAÇÃO
Glucose
Sacarose
Maltose
Galactose
Lactose
Celobiose
Trealose
Melibiose
Melezitose
Rafinose
Metil-a-D-glucósido
Inulina
Amido
Resultados + aos 2 dias + às 3 semanas
Xilos + crescimento positivo em 1-2 semana,
- sem crescimento exceto para outra indicação
Tabela II.- Resultados dos testes bioquímicos relativo a utilização de fontes de carbono usando o Programa de iden15 tificaçao de leveduras - Versão 5, de J A Barnett, R W
Payne & D Yarrow
Substratos Resul- Substratos Resul13 tados tados
Glucose 4- Etanol +
Galactose 4- Glicerol +
Sorbose + Eritritol -
Sacarose + Ribitol +
Maltose + Galactitol -
Celobiose + D-Manítol
Trealose + D-Glucitol +
Lactose - Metil-a-D-glucósido +
Melibiose - Salacino +
Rafinose - DL- Ácido lático -
Melezitose + Ácido succinico 4-
Inulina - Ácido cítrico -
Amido - Inositol -
D-Xiiose + 3 sema- Glucono-D-lactona 4-
L~Arabinose nas D-Glucosamina —
D-Arabinose - Metanol -
D-Ribose - Xilitol +
L-Ramnose + crescimento positivo em 1-2 semana, exceto para outra i ndícação
sem crescimento
Tabela III.- Resultados dos testes bioquímicos relativo a utilização de fontes de azoto usando o Programa de identi5 ficação de leveduras - Versão 5, de J A Barnett, R W Payne & D Yarrow
Substratos Resul- tados Substratos Resul- tados
Lisina + Cloreto de hidrogel de etilamina 4-
Cadaverina Nitrato de potássio -
Sulfato de amónio 4-
+ crescimento positivo em 1-2 semana, exceto para outra indicação
- sem crescimento
Metschnikowia andauensis NCYC 3728 cresce in vitro em condições aeróbias a temperaturas de incubação de 1 a 37 °C, mas preferencialmente a 25 °C, e a diferentes condições de agitação, por exemplo, entre 100 a 175 rpm, mas preferencialmente a 150 rpm, em diversos meios, por exemplo, YPD, YPS (peptona, extrato de levedura e sacarose), NYDB (igual a NYDA sem agar), YM, PDB (extrato de batata e glucose), LICY (Subproduto indústria sumo laranja e extrato de levedura), mas preferencialmente em YPS ou LICY. O pH inicial está próximo do neutro, entre 6,8 e 7,2 mas também cresce a pH de 4,5. O tempo de incubação para que o microrganismo alcance a fase estacionária varia com a temperatura, agitação e meio de cultura e deverá ser determinada para cada condição de trabalho.
Metschnikowia andauensis NCYC 3728 pode crescer em frascos Erlenmeyers convencionais ou em bioreactores, com controlo de agitação e arejamento. A recuperação das células pode fazer-se por sedimentação convencional, como por exemplo centrifugação ou filtração. As culturas podem conservar-se a 4 °C até serem usadas. Como se observa na figura 1 o microrganismo em meio de cultura YPS e LICY a 25 °C apresenta um perfil de crescimento similar nos dois meios de cultura, e alcança a fase estacionária após 38 horas de incubação, sendo o máximo populacional superior no meio YPS.
As estirpes da espécie Metschnikowia andauensis NCYC 3728 podem-se aplicar na superfície dos frutos mediante qualquer técnica convencional. Por exemplo, pode-se preparar uma dispersão da cultura em água e proceder à pulverização ou duche do fruto no campo, antes da colheita, ou efetuar o tratamento durante o processo de manipulação dos frutos colhidos, antes de proceder ao armazenamento, caso em que o tratamento se pode realizar também por imersão.
As concentrações eficazes de Metschnikowia andauensis NCYC 3728 em dispersão de aplicação para o tratamento dos frutos podem ser variáveis, em função de fatores tais como o tipo de fruto, o estado de maturação do mesmo, a concentração do fungo patogénico no fruto, a temperatura e humidade de conservação, etc. Habitualmente o intervalo de concentrações eficazes é de 106-108 ufc/ml (unidades formadoras de colónias por mililitro) , mas esta margem não deve ser considerada como limitativa do objeto da presente invenção.
O antagonista é muito eficaz no controlo biológico de diferentes espécies de fungos patogénicos dos frutos que incluem, mas não se limitam, a Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum e Rhizopus stolonifer. A sua eficácia na prevenção da podridão dos frutos não se limita ao armazenamento dos mesmos em condições de temperatura e concentração de oxigénio ambientais mas, devido às características do microrganismo já comentadas anteriormente, o seu uso permite também bons resultados em condições de armazenamento de frigoconservação e atmosfera controlada, muito utilizadas pelas centrais hortofrutícolas. Um critério útil para avaliar o potencial de um microrganismo em controlar doenças de pós-colheita de frutos armazenados em frio, e o estudo da capacidade dos antagonistas colonizarem as superfícies e feridas dos frutos. Na figura 2 e 3 mostra-se o crescimento de Metschnikowia andauensis NCYC 3728 a 1 °C em feridas de peras e maçãs, que é onde o antagonista tem que atuar, pois a maioria dos fungos patogénicos necessitam uma ferida para iniciar o processo de infeção. Observa-se o elevado crescimento de Metschnikowia andauensis NCYC 3728 a temperaturas de conservação de maçãs e peras, alcançando o máximo populacional quando colonizou as peras.
As estirpes de Metschnikowia andauensis, compreendendo uma ou mais, podem ser aplicadas nos frutos como a substância ativa de um produto em cuja composição além dos microrganismos podem estar presentes excipientes autorizados para o consumo humano. A composição podem também incluir aditivos convencionais como surfatantes ou/e molhantes que aumentem a eficácia das estirpes de Metschnikowia andauensis. O antagonista pode-se aplicar junto com substâncias usadas habitualmente nas linhas de tratamento em centrais hortofruticolas, como por exemplo ceras, revestimentos e outros para melhor conservação do fruto colhido, e/ou também pode ser utilizado numa estratégia integrada, sendo aplicado conjuntamente com aditivos de uso alimentar, por exemplo o bicarbonato de sódio ou mesmo substâncias alternativas de baixa toxicidade ou fungicidas a baixa concentração .
Metschnikowia andauensis pode ser utilizada só, como agente de controlo biológico dos fungos patogénicos dos frutos, ou pode ser em combinação conjuntamente com ou~ tros antagonistas biológicos, por exemplo com bactérias da espécie Pantoea agglomeranst tais como as descritas na patente espanhola ES-2149131 ou descrita por Manso T., Nunes C., Raposo S. , Costa M.E., World Journal of Microbiology and Biotechnology (2010), anteriormente citadas.
Metschnikowia andauensis pode ser utilizada com eficácia para combater a podridão de todo o tipo de frutos, tanto pomóideas, tais como maçãs, peras e marmelos, em qualquer das suas variedades, como os citrinos, tais como laranjas, limões, tangerinas e clementinas, em qualquer das suas variedades, também as prunóideas, tais como pêssegos, damascos, cerejas e ameixas, em qualquer das suas variedades, e também frutos pequenos, como morangos, amoras, fram17 boesas, mirtilos ou groselhas em qualquer das suas variedades .
Exemplos
Os exemplos que se expõem â continuação devem ser interpretados como um meio auxiliar para uma melhor compreensão da invenção e não como limitações ao objeto da mesma.
Exemplo 1.Obtenção de uma dispersão aquosa de Metschnikowia andauensis.
Semeou-se Metschnikowia andauensis NCYC 3728 em tubo de ensaio com meio NYDA e incubou-se a 25 °C durante 48 horas. Seguidamente, a partir do referido tubo de ensaio, semeou-se em um frasco Erlenmeyer com 50 ml de meio YPS, que se incubou em um agitador orbital a 150 rpm e a 25 °C durante 38 horas. À continuação centrifugou-se o conteúdo do frasco Erlenmeyer a 7.500 rpm durante 10 minutos e rejeitou-se o sobrenadante. 0 sedimento dispersou-se em ml de água destilada estéril e, a partir da referida dispersão prepararam-se as concentrações desejadas do antagonista mediante o cálculo da transmitância da suspensão microbiana no espectofotómetro, como medida indireta da concentração do antagonista. A equivalência entre a transmitância e a concentração do microrganismo efetuou-se mediante contagem de células viáveis em placa Petri em meio NYDA. Para cada caso, as concentrações expressam-se em ufc/ml (unidades formadoras de colónias por mililitro) .
Exemplo 2.Efetividade de Metschnikowia andauensis em frutos de pomóideas 'Golden Delicious' armazenados a temperatura ambiente.
O ensaio realizou-se na variedade de maçã 'Golden Delicious', sãs que foram lavadas com água e deixadas secar e onde se realizaram duas feridas por fruto, de dimensões 2 mm de profundidade e 1 mm de largura aproximadamente. As duas incisões (feridas) situaram-se na mesma cara do fruto, localizadas uma na parte superior e outra na parte inferior. A unidade de amostragem estava formada por cinco maçãs e por cada tratamento realizaram-se três repetições.
A espécie fúngica ensaiada foi Penicillium expansw e a titulação da suspensão de esporos da mesma realizou-se a partir de cultura jovem de 7 dias, semeados em meio PDA, e incubada a 25 °C de temperatura, mediante o raspado das colónias em água estéril com Tween 80. À continuação procedeu-se à contagem’ de esporos em câmara Thoma, preparando a concentração desejada, expressa em ufc/ml.
Lotes de cinco maçãs preparadas como se explicou anteriormente inocularam-se com 20 pl da suspensão do antagonista NCYC 3728, às concentrações de 1 x 106 ufc/ml, 5 x 106 ufc/ml e 1 x 107 ufc/ml. Uma vez secos os frutos procedeu-se à inoculação de 15 pl da suspensão titulada de Penicillium expansum à concentração de 104 ufc/ml. Paralelamente preparou-se a prova controlo onde se substituiu a suspensão do antagonista por água destilada estéril.
Todos os frutos tratados estavam em caixas com alvéolos, deixaram-se secar e colocaram-se em câmara de incubação a 20 ° C, com 80% de humidade relativa, durante 7 dias. O período de incubação teve como base o tempo necessário para que as maçãs controlo apresentem diâmetros de podridão grandes. Após o referido período de incubação, procedeu-se à leitura dos resultados, contabilizando o número de feridas que apodreceram e medindo o seu diâmetro.
Os dados de leitura do diâmetro de podridão das diferentes repetições submeteram-se a uma análise estatis19 tica consistente em efetuar uma análise da variância e, uma vez comprovado que a referida análise de variância resultava significativa (oc<0,01 a a<0,05), efetuou-se uma separação de médias de acordo com a Prova de Intervalo Múltiplo 5 de Duncan, cujos resultados se expressam com as letras do alfabeto minúsculas (a, b, c, d, .. . ) , de maneira que tratamentos com a mesma letra são estatisticamente iguais e tratamentos com letras diferentes são estatisticamente diferentes .
Na tabela IV estão os resultados obtidos no caso do controlo biológico de Penicillium expansm em maçã da variedade 'Golden Delicious'.
Tabela IV. Controlo de Metschnikowia andauensis sobre P.
expansum em maçã 'Golden Delicious'
FUNGO PATOGÉNICO (ufa/ml) MEDIDA DOSE Metschnikowia andauensis ufc/ml
Controlo 0 1 x 106 5 x 106 1 x 107
Peniaillium expansum 104 Diâmetro da podridão (cm) 4,5 a 2 b 1,2 c 0,2 d
% redução diâmetro podridão - 55 26 96
% feridas podres 100 a 60 b 35 c 8 d
% redução da podridão - 40 65 92
A expressão gráfica dos resultados das referidas tabelas encontram-se na figura 4. Observa-se a elevada eficácia do antagonista, e que o aumento da concentração deste 20 aumenta a redução da podridão.
Exemplo 3.Efetividade de Metschnikowia andauensis em frutos de pomóideas armazenados a temperatura ambiente .
O ensaio realizou-se em 6 variedades de maçãs ( 'Goiden Delicious', 'Royal Gala', 'Fuji', 'Starking', 'Granny Smith' e 'Bravo de Esmolfe') seguindo o método de trabalho explicado no exemplo 2. A unidade de amostragem estava formada por cinco maçãs e por cada tratamento realizaram-se quatro repetições. As três espécies fúngicas ensaiadas foram Botrytis cinerea, Penicillium expansum e Rhizopus stolonifer e a titulação das suspensões de esporos das mesmas realizou-se a partir de culturas jovens de 5-7 dias, semeados em meio PDA preparando a concentração de 104 ufc/ml. A concentração do antagonista aplicada foi de IxlO7 ufc/ml.
Uma vez tratados colocaram-se os frutos em câmara de incubação a 20 °C, com 80% de humidade relativa, durante 7 dias. Após o referido período de incubação, procedeu-se à leitura dos resultados, contabilizando o número de feridas que apodreceram.
Na tabela V estão os resultados obtidos no caso do controlo biológico de Botrytis cinerea, Penicillium expansum e Rhizopus stolonifer em diferentes variedades de maçãs.
Os dados recolhidos na tabela V assim como a sua representação gráfica dos resultados encontram-se nas figuras 5, 6 e 7, mostram em 5 variedades de maçã elevada eficácia do antagonista no controlo das três espécies de fungos patogénicos ensaiados e, em consequência na prevenção da podridão dos frutos.
Tabela V. Controlo de Metschnikowia andauensis sobre B. cinerea, P. expansum e R. stolonifer em diversas variedades de maçã
VARIEDADES DE MAÇA FUNGO PATOGÉNICO Medida Dose Metschnikowia andauensis ufc/ml
Controlo 0 1 x 107
'Fuji' Botrytis cinerea % feridas podres 20 a 0 b
% redução da podridão - 100
Penícillium expansum % feridas podres 75 a 5 b
% redução da podridão - 93
Rhizopus stolonifer % feridas podres 19 a 0 b
% redução da podridão - 100
'Starking' Botrytis cinerea % feridas podres 21 a 5
% redução da podridão - 76
Peniaillium expansum % feridas podres 70 a 0 b
% redução da podridão - 100
Rhizopus stolonifer % feridas podres 20 a 5 b
% redução da podridão - 75
'Royal Gala' Botrytis cinerea % feridas podres 23 5 b
% redução da podridão - 78
Peniaillium expansum % feridas podres 75 a 12 b
% redução da podridão - 84
Rhizopus stolonifer % feridas podres 75 10 b
% redução da podridão - 86
'Granny Smith' Botrytis cinerea % feridas podres 30 a 0 b
% redução da podridão - 100
Peniaillium expansum % feridas podres 40 a 0 b
% redução da podridão - 100
Rhizopus stolonifer % feridas podres 40 a 5 b
% redução da podridão - 88
'Bravo de Esmolfe' % feridas podres 5 a 0 b
Botrytis cinerea % redução da podridão - 100
Penicilliwn. expansum % feridas podres 22 a 0 b
% redução da podridão - 100
Rhizopus stolonifer % feridas podres 18 a 0 b
% redução da podridão - 100
Exemplo 4.Efetividade de Metschnikowia andauensis em frutos de citrinos armazenados a temperatura ambiente .
ensaio realizou-se em laranja variedade 'Lanelate Late' e tangerina 'Clementina Fina' sãs que foram lavadas com água, e à continuação desinfetadas com uma solução de hipoclorito de sódio a uma concentração de 0,5% de cloro, enxaguadas com água e deixadas secar. Uma vez secos os frutos, colocaram-se em alvéolos que estavam em caixas. A unidade de amostra estava formada por dez frutos e por cada tratamento realizaram-se quatro repetições.
As duas espécies fúngicas ensaiadas foram Penicillium digitatum e Penicillium italicum e a titulação das suspensões de esporos das mesmas a uma concentração de 106ufc/ml realizou-se seguindo o método de trabalho explicado no exemplo 2.
Lotes de dez frutos preparados como explicado anteriormente sofreram uma incisão e ao mesmo tempo inoculação com o patogénio. Para tal utilizou-se uma agulha de inoculação que se mergulhou na suspensão do patogénio a inocular (ficando aderida uma gota nessa agulha) e em seguida realizou-se uma incisão (ferida), que perfurou e inoculou o fruto ao mesmo tempo. A incisão de dimensiones 2 mm de profundidade e 1 mm de largura aproximadamente foi realizada na zona equatorial do fruto na quantidade de uma por fruto. Paralelamente preparou-se uma prova controlo onde se substituiu a suspensão do antagonista por água destilada estéril.
Todos os frutos tratados incubaram-se a 20 °C, com 80% de humidade relativa, durante 7 dias. Após o refe5 rido periodo de incubação procedeu-se à leitura dos resultados, contando o número de frutos podres.
Os dados de leitura do número de frutos podres das diferentes repetições submeteram-se a uma análise estatística da mesma maneira que no exemplo 2 e expõe-se na ta10 bela VI.
Tabela VI. Controlo de Metschnikowia andauensis sobre P. digitatum e P. italicum em laranja e tangerina
VARIEDADES DE CITRINOS FUNGO PATOGÉNICO Medida DOSE Metschnikowia andauensis ufc/ml
Controlo 0 1 x 107
Laranja 'Lanelater Penicillium digitatum % frutos podres 100 a 22 b
% redução da podridão - 78
Penicillium italicum % frutos podres 85 a 16 b
% redução da podridão - 81
Tangerina 'Ciementina Fina' Penicillium digitatum % frutos podres 100 a 21 B
% redução da podridão - 79
Penicillium italicum % frutos podres 84 a 15 b
8 redução da podridão - 82
Os dados recolhidos na tabela VI assim como a sua representação gráfica dos resultados encontram-se nas figuras 8 e 9, mostram elevada eficácia do antagonista no controlo das duas espécies de fungos patogénicos mais importantes em citrinos e em dois tipos diferentes de citrinos.
Exemplo 5. Controlo de Penicillium expansum em ensaios a escala média e em condições de conservação frigorifica
O ensaio realizou-se sobre maçãs da variedade 'Golden Delicious' e pera da variedade 'Rocha', sãs que foram lavadas com água e deixadas secar e onde se realizaram duas feridas por fruto seguindo o método de trabalho explicado no exemplo 2. A unidade de amostragem estava formada por vinte frutos e por cada tratamento realizaram-se quatro repetições. A espécie fúngica ensaiada foi Penicillium expansum e a titulação da suspensão de esporos da mesma realizou-se seguindo o método de trabalho explicado no exemplo 2.
Lotes de vinte frutos foram submersos durante 30 segundos na suspensão do antagonista NCYC 3728, à concentração de 1 x 107 ufc/ml. Uma vez secos os frutos, procedeu-se inoculação de Penicillium expansum submergindo de novo os frutos na suspensão do patogénio durante 30 segundos. Paralelamente preparou-se a prova controlo onde se substituiu a suspensão do antagonista por água destilada estéril. Para as maçãs preparou-se outra prova controlo com onde se substituiu a suspensão do antagonista por o fungicida mais usado a nível comercial, o Imazalil à concentração recomendada (0,5%)
Todos os frutos tratados estavam em caixas com alvéolos, deixaram-se secar e colocaram-se em câmara de conservação a 1 °C, com 90% de humidade relativa. Após 90 dias e 120 dias, procedeu-se à leitura dos resultados das peras e maçãs respetivamente, contabilizando o número de feridas que apodreceram e medindo o seu diâmetro.
Os resultados obtidos estão expostos nas tabelas VII e VIII.
Tabela VII. Controlo de Metschnikowia andauensis sobre P.
expansum em maçã 'Golden Delicious' após 4 meses a 1 °C
FUNGO PATOGÉNICO (ufc/ml) MEDIDA DOSE Metschnikowia andauensis ufc/ml IMAZALIL
Controlo 0 1 x 107 0,5%
Penicillíum expansum 104 Diâmetro da podridão (cm) 2,5 a 0,5 b 0, 4 b
% redução diâmetro podridão - 80 84
% feridas podres 100 a 9 b 5 b
% redução da podridão - 91 95
Tabela VIII. Controlo de Metschnikowia andauensis sobre P.
expansum em pera 'Rocha' após 3 meses a 1 °C
FUNGO PATOGÉNICO (ufc/ml) MEDIDA DOSE Metschnikowia andauensis ufc/ml
Controlo 0 1 x 107
Penialllíum expansum 104 Diâmetro da podridão (cm) 2,1 a 0,4 b
% redução diâmetro podridão - 81
% feridas podres 93 a 20 b
% redução da podridão - 78
Os dados recolhidos nas tabelas VII e VII assim como a sua representação gráfica dos resultados encontramse nas figuras 10 e 11, mostram um elevado grau de eficácia, em condições de frigoconservação, no controlo de Penicillium expansum, em maçã e pera.
Exemplo 6.Eficácia do tratamento combinado do antagonista Metschnikowia andauensis com substâncias químicas
de baixo risco, como sorbato de potássio no con-
trolo de podridão de citrinos armazenados a tem-
peratura ambiente.
Os frutos prepararam-se seguindo o método explicado no exemplo 4, e os ensaios se efetuaram-se com dez laranjas 'Valência Late' por repetição e três repetições por tratamento.
A substância química de baixo risco ensaiada foi o sorbato de potássio a 2%.
Nas laranjas realizaram-se feridas e inocularamse conforme descrito no exemplo 4. 0 patogénio inoculado foi Penicillium digitatum a concentração alta de 1 x 106 ufc/ml. Posteríormente os frutos inoculados submergiram-se na solução de sorbato de potássio durante 1 minuto. Uma vez secos os frutos, procedeu-se inoculação de Metschnikowia andauensis, à concentração de 1 x 107 ufc/ml.
Paralelamente, depois do inoculo do patogénio, prepararam-se as três provas controlo, que consistiram na imersão dos frutos na seguintes soluções: sorbato de potássio 2%, Metschnikowia andauensis, à concentração de 1 x 107 ufc/ml e água destilada.
Depois de secos os frutos, colocaram-se em câmara de incubação a 20 °C, com 80% de humidade relativa, durante 7 dias. Após o referido período realizou-se a leitura dos resultados como se explicou anteriormente.
Os resultados obtidos expõem-se na tabela IX e a sua representação gráfica na figura 12, onde se observa a elevada eficácia do antagonista NCYC, no controlo de Penicillium digitatum em citrinos, e como está eficácia se vê aumentada quando combinado com a aplicação de sorbato de potássio.
Tabela IX. Controlo de NCYC 3728 combinado com substância química de baixo risco sobre P. digitatum em laranja 'Valência Late'
CONCENTRAÇÃO (ufc/ml) P. digitatum MEDIDA TRATAMENTOS
Controlo (Água) M. andauensis Sorbato potássio M. andauensis + Sorbato potássio
106 % frutos 90 30 50 5
podres a c b d
Dos resultados pode-se observar a elevada eficácia de Metschnikowia andauensis, que se é significativamente melhorada quando o tratamento do antagonista se faz conjuntamente com o aditivo alimentar.
Informação sobre o depósito de Metschnikowia andauensis NCYC 3728
O depósito do microrganismo efetuou-se de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento do depósito de microrganismos para o propósito do procedimento de patentes, na autoridade internacional de depósito National Collection of Yeast Cultures, Institute of Food Research, Colney, Norwich, Inglaterra NR4 7UA. 0 depósito seguro efetuou-se a 10/07/2006 com o número R617, a 01/03/2010 este depósito transformou-se num depósito de acordo com as provisões do Tratado de Budapeste com o número NCYC 3728.
O depósito está à disposição do público, baixo as condições previstas no mencionado Tratado de Budapeste, mas a referida disponibilidade não se pode interpretar como uma licença para praticar o objeto da presente invenção infringindo os direitos do solicitante da presente patente.
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Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Uma cultura biológica substancialmente pura da estirpe da espécie Metschnikowia andauensis, caracterizada por ser utilizada como antagonista para o controlo biológico dos fungos patogénicos responsáveis da podridão nos frutos e estar depositada com o número NCYC 3728 na National Collection of Yeast Cultures.
  2. 2. A utilização da espécie Metschnikowia andauensis, descrita de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser um antagonista para o controlo biológico dos fungos patogénicos responsáveis da podridão nos frutos,
  3. 3. A utilização da espécie Metschnikowia andauensis, descrita de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por os fungos patogénicos pertencerem a qualquer das espécies Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum e Rhizopus stolonifer.
  4. 4. A utilização da espécie Metschnikowia andauensis, descrita de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser aplicada em:
    a) frutos pomóideas;
    b) frutos citrinos;
    c) frutos prunóideas;
    d) frutos vermelhos pequenos.
  5. 5. Método para prevenir a podridão pós-colheita dos frutos caracterizado por se aplicar aos referidos frutos, antes ou depois da sua colheita, com um preparado da espécie Metschnikowia andauensis da reivindicação 1.
  6. 6. Método, descrito de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o tratamento dos frutos se efetuar através de pulverização, molhado ou imersão em ou com uma dispersão aquosa da espécie Metschnikowia andauensis da reivindicação 1.
  7. 7. Método, descrito de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o tratamento dos frutos se efetuar com aditivos alimentares em conjunto com uma dispersão aquosa da espécie Metschnikowia andauensis da reivindicação 1.
  8. 8. Método, descrito de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o tratamento dos frutos se efetuar com uma mistura de uma dispersão aquosa da espécie Metschnikowia andauensis da reivindicação 1, e um ou mais microrganismos antagonistas dos fungos patogénicos responsáveis da podridão dos frutos.
  9. 9. Método, descrito de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o tratamento dos frutos se efetuar em linha de tratamentos com substâncias alternativas de baixa toxicidade em conjunto com uma dispersão aquosa da espécie Metschnikowia andauensis da reivindicação 1.
  10. 10. Método, descrito de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o tratamento dos frutos se efetuar em linhas de tratamentos das centrais fruticolas, com os produtos normalmente utilizados em conjunto com uma dispersão aquosa da espécie Metschnikowia andauensis da reivindicação 1.
  11. 11. Método, descrito de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a concentração do antagonista da espécie
    Metschnikowia andauensis da reivindicação l,na dispersão aquosa estar compreendido entre 106 e 109 ufc/ml.
  12. 12. Método, descrito de acordo com a reivindicação 4, ca-
    5 racterizado por os frutos se conservarem depois da sua colheita em condições de armazenamento a temperatura e atmosfera de oxigénio ambientais.
  13. 13. Método, descrito de acordo com a reivindicação 4, ca-
    10 racterizado por os frutos se conservarem depois da sua colheita em condições de armazenamento a temperatura inferior de frio e atmosfera controlada.
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PT10521010A PT105210B (pt) 2010-07-22 2010-07-22 Nova estirpe da espécie metschnikowia andauensis e sua utilização como agente de controlo biológico das doenças em frutos.

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