PT104693A - Nanopartículas lipídicas semi-sólidas contendo um agente antineoplásico e seu processo de preparação - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS ANTINEOPLÁSICAS NEBULIZÁVEIS, PARA TRATAMENTO DE NEOPLASIAS PULMONARES, PRIMÁRIAS OU RESULTANTES DA FIXAÇÃO DE METÁSTASES DE CARCINOMAS EXTRAPULMONARES, QUE COMPREENDEM PELO MENOS UMA DISPERSÃO COLOIDAL DE NANOPARTÍCULAS DE LÍPIDOS, ESTABILIZADA UTILIZANDO PELO MENOS UM TENSIOACTIVO, CONTENDO NA MATRIZ PELO MENOS UM AGENTE ANTINEOPLÁSICO, AO SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO E A COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO AS MESMAS PARA TRATAMENTO DE TRATAMENTO DE NEOPLASIAS PULMONARES, PRIMÁRIAS OU RESULTANTES DA FIXAÇÃO DE METÁSTASES DE CARCINOMAS EXTRA PULMONARES.

Description

DESCRIÇÃO

NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SEMI-SOLIDAS CONTENDO UM AGENTE ANTINEOPLÁSICO E SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO

Campo da Invenção O presente invento refere-se a uma formulação para inalação composta por nanoparticulas de lípidos sólidos contendo um ou mais agentes antineoplásicos preparadas pelo método de homogeneização após fusão e solidificação a temperatura controlada. 0 objecto desta invenção situa-se na área da nanomedicina, nomeadamente nas formas farmacêuticas em particular para inalação e é especialmente direccionado para oncologia, particularmente para tratamento da neoplasia pulmonar.

Antecedentes da Invenção

Nas últimas décadas observaram-se avanços significativos relativamente às tecnologias que envolvem os meios de diagnóstico, a elucidação das vias bioquímicas, a selecção de possíveis alvos terapêuticos e a introdução de novas moléculas. Em consequência um maior número de neoplasias podem ser combatidas sempre que sejam diagnosticados em estádios iniciais da doença. No entanto, a este grupo escapam alguns carcinomas mais agressivos, dos quais se destacam os tumores do pulmão e as metástases pulmonares resultantes de neoplasia avançada da mama, melanoma, ovário e testículos.

Entre as neoplasias pulmonares, os carcinomas situados no pulmão profundo apresentam geralmente baixas taxas de resposta à quimioterapia convencional. Os resultados clínicos confirmam a eficacia moderada da quimioterapia com Taxol , em monoterapia ou em associação, em travar a disseminação metastática, limitar a progressão da doença e aumentar o tempo de sobrevivência dos doentes. Contudo, esta eficácia é acompanhada de elevada incidência de efeitos adversos graves. 1 Às neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extrapulmonares, está associada uma elevada morbilidade e mortalidade, constituindo uma das patologias mais agressivas na área de oncologia. Os dados da OMS revelam que cerca de 1/5 da população mundial pode vir a desenvolver esta doença, dependendo não apenas do contacto directo com agentes cancerígenos, mas também do sexo, da idade e do tipo de vida do paciente. A designação de carcinoma do pulmão engloba diferentes tumores malignos pulmonares, como o adenocarcinoma, o tumor de grandes células, o carcinoma de células escamosas (epidermóide) e o tumor de pequenas células, constituindo este último cerca de 20 a 25% dos novos casos (Cersosimo 2002) . Os tumores epiteliais malignos broncopulmonares (Shimizu 2006) e a disseminação de metástases, pulmonares ou extratorácicas, apresentam um quadro de dispersão relacionado com a dinâmica da região torácica e com a proximidade dos gânglios mediastínicos (Cersosimo 2002; Shimizu 2006). Numerosos estudos evidenciaram a relação entre o sistema linfático e a progressão tumoral, o que significa que a circulação pelo sistema linfático é, porventura, a via mais representativa no transporte de micrometástases com origem em tumores primários. O carcinoma do pulmão é uma doença bastante heterogénea do ponto de vista genético, não só no que se refere aos tumores primários como também às metástases com origem em tumores extrapulmonares. Em todo o caso, quando a doença se encontra disseminada ao nivel pulmonar, o paclitaxel em combinação com a cisplatina ou carboplatina, tem sido um dos regimes anti-neoplásicos mais frequentemente utilizados, sendo parte da sua actividade atribuída à indução da apoptose. A maioria dos agentes quimioterápicos, entre os quais se inclui o paclitaxel, o docetaxel e a doxorubicina, apresenta um indice terapêutico desfavorável (=1), para o qual contribui grandemente a falta de selectividade do fármaco relativamente às células neoplásicas. Os agentes antineoplásicos convencionalmente utilizados apresentam enormes limitações que vão desde o elevado volume de distribuição à toxicidade sistémica. A acção destes fármacos em tecidos saudáveis, independentemente do seu tipo 2 histológico, da sua função e da sua integridade celular, é demonstrativa da falta de selectividade dos agentes antineoplásicos em geral e constitui um factor determinante para a necessidade de encontrar soluções inovadoras.

Estratégias que envolvem a modificação da biodistribuição destes agentes, entre as quais se incluem a conjugação de fármacos com macromoléculas ou o desenvolvimento de sistemas de veiculação selectiva, têm demonstrado ser fundamentais para uma maior eficácia terapêutica. A administração de moléculas activas incorporadas em sistemas transportadores físicos, biológicos e até mecânicos tem como finalidade alterar o perfil de biodistribuição nos vários compartimentos do organismo. 0 objectivo é o de condicionar a toxicidade do fármaco livre e, simultaneamente, concentrar a acção farmacológica no órgão alvo, alterando desta forma o respectivo valor de índice terapêutico (Hennenfent e Govindan 2006) .

Paralelamente, a capacidade dos sistemas de veiculação de fármacos diminuírem a toxicidade associada ao fármaco livre, principalmente quando há necessidade de aumentar o número de administrações, constitui um objectivo fundamental da veiculação selectiva (Couvreur e Vauthier 2006; Torchilin 2006a). É sabido que os lípidos, nomeadamente os acilgliceróis e os fosfolípidos, têm vindo a suscitar uma atenção crescente dos meios científicos, dada a sua capacidade única de atingir compartimentos biológicos, incluindo a passagem pela barreira hemato-encefálica e a sua particular afinidade para o sistema linfático. Transportadores de natureza lipídica tais como as microemulsões, os SEDDS (self-emulsifying drug delivery Systems), os lipossomas, as liposferas, os NLC (Nanostructure Lipid Carriers) e as SLN (Solid Lipid Nanoparticles), são actualmente objecto de investigação, para fazer face a desafios em áreas diversas da nanomedicina, tais como a terapêutica direccionada, a reconstituição de tecidos, a imagiologia ou a terapia genica. No início dos anos noventa foram publicadas três patentes referentes a um novo transportador coloidal - as nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) - tendo como base a 3 preparação por homogeneização por alta pressão (HPH) (Speiser 1990; Muller e Lucks 1996). A estrutura matricial dos transportadores coloidais, bem como a natureza química dos materiais que lhe dão origem, parece contribuir decisivamente para a sua capacidade de passar ao espaço intracelular e, uma vez no seu interior, permitir a libertação do agente terapêutico (Brannon-Peppas e Blanchette 2004; Torchilin 2006a). As suspensões coloidais de lípidos sólidos, aparentemente matrizes cristalinas, foram desenvolvidas com o objectivo de aprisionar o fármaco durante o arrefecimento ou evaporação de solvente e, em consequência, poder vir a controlar a sua libertação após administração (Muller et al. 1995; Westesen et al. 1997b; zur Muhlen et al. 1998).

Entre os parâmetros que permitem estabelecer a competência de um transportador encontram-se a capacidade de carga e eficiência de incorporação, a estabilidade do sistema ao longo do tempo, a capacidade de vectorização, a velocidade de difusão do fármaco, a toxicidade do excipiente e a actividade farmacológica frente a linhas celulares. A elevada eficácia terapêutica in vitro de fármacos acoplados a sistemas coloidais em modelos de carcinomas pulmonares primários ou metástases experimentais pulmonares, tem sido extensamente demonstrado, em parte devido às características anatomo-fisiológicas particulares dos tecidos onde existe neoplasia (Lopez-Barcons et al. 2005; Nie et al. 2007; Wang et al. 2005; Xu et al. 2005). Miglietta e colaboradores (2000), verificaram por exemplo, que o efeito citotóxico do paclitaxel em linhas celulares de tumores sólidos, aumentava quando estes se encontravam incorporados em SLN's (Miglietta et al. 2002; Miglietta et al. 2000).

Para a generalidade das doenças neoplásicas, a actividade hiperproliferativa está associada a uma instabilidade nos mecanismos que regulam a morte celular programada (Vermeulen et al. 2005). Pelo que é de todo o interesse, que a resposta a agentes quimioterápicos, ainda que esta possa não constituir o mecanismo de acção primário destes, corresponda também a uma activação directa ou indirecta deste mecanismo. O papel das vias apoptóticas tem sido por isso investigado em vários tumores, 4 como no caso, do tumor de não pequenas células do pulmão e do carcinoma da mama, através da avaliação da expressão de proteínas intracelulares, relacionadas com os mecanismos apoptóticos (Shivapurkar et al. 2003; Singhal et al. 2005; Sunters et al. 2003). Geralmente, a terapêutica da doença neoplásica pressupõe a vectorização celular, isto é, o transportador deve ultrapassar as barreiras biológicas, não ser fagocitado precocemente e, finalmente, ser internalizado na célula, utilizando para isso os mecanismos celulares. A interacção com os sistemas biológicos depende das propriedades de superfície da partícula coloidal, não sendo por isso estranho que a alteração das propriedades de superfície, nomeadamente em sistemas coloidais, constitua objecto de intenso estudo (Veronese & Pasut 2005; Vonarbourg et al. 2006). De facto, a estrutura matricial dos transportadores coloidais em geral bem como a natureza química dos materiais que lhe dão origem, contribui para a sua capacidade de passar ao espaço intracelular e, uma vez no seu interior, permitir a libertação do agente terapêutico (Brannon-Peppas & Blanchette 2004; Torchilin 2006a).

Em termos farmacotécnicos um aerossol nebulizável é definido como uma dispersão coloidal de partículas, no estado sólido ou líquido, no seio de uma fase gasosa contínua, absorvidas por inalação e incorporadas num certo volume de ar (Aulton & Collett 2002). A inalação de um fármaco gera uma acção terapêutica local rápida, mesmo por administração de doses inferiores às que seriam necessárias no caso da administração intravenosa ou pelo tracto gastrointestinal (Aulton & Collett 2002; Pison et al. 2006) . A elevada deposição pulmonar de nanopartículas, mesmo tendo em conta os fenómenos de eliminação, determina a disponibilidade de doses de fármaco, superiores ou iguais ao valor de IC50 para as células neoplásicas, após múltiplas administrações. A concentração de fármaco nas células neoplásicas tende ainda a ser incrementada por um mecanismo que assenta na subsequente extravasão passiva dos sistemas transportadores, do sistema circulatório para o interstício do tumor, com base no efeito EPR (Dreher et al. 2006; Iyer et al. 2006; Maeda et al. 2000). 5 A administração de fármacos, ou de um seu transportador, para o pulmão pode ser efectuada por processos distintos. Entre estes, destacam-se a inalação de um aerossol obtido por nebulização e a inalação de um aerossol por um dispositivo de inalação de pós secos ou DPI (dry powder inhaler).

Em "Formulation and cytotoxicity of doxorubicin nanoparticles carried by dry powder aerosol particles" (Int J Pharm, 319, 155-161, 2006) Azarmi, S., Tao, X., Chen, H., Wang, Z., Finlay, W.H., Lõbenberg, R., Roa, W., afirmam que os sistemas de distribuição de fármacos a uma zona via inaladores de pós secos oferecem muitas vantagens na utilização de compostos químicos para prevenção e tratamento de doenças respiratórias. No mencionado estudo, nanoparticulas carregadas com doxorubicina (DOX) foram desenvolvidas como sistema de libertação coloidal de fármacos em partículas de transportador inalável usando uma técnica de spray-freeze-drying. Segundo os autores, os resultados obtidos naquele ensaio suportam a abordagem do tratamento do cancro do pulmão usando nanoparticulas na forma de aerossol em pó seco. os inaladores de pós secos contêm partículas sólidas, administráveis por meio de dispositivos que forçam a mistura, neste caso partículas sólidas com ar, para dentro das vias respiratórias. Por outro lado sabe-se que os solventes orgânicos utilizados no método de spray-freeze-drying são responsáveis pela toxicidade das partículas assim produzidas. O produto resultante é um sólido seco, isto é, partículas secas com diâmetros médios da ordem dos micrómetros dispersas em ar. Diferentemente, a presente invenção refere-se a uma preparação isenta de solventes orgânicos ("organic solvent free"), preparada por agitação mecânica e cujas as partículas resultantes são partículas semi-sólidas com diâmetros médios da ordem dos nanometros dispersas num líquido aquoso. A nebulização é feita na presença de um líquido, normalmente aquoso. A dispersão de moléculas ou nanoparticulas lipídicas, é sujeita a ultra-sons e nebuliza por um mecanismo de cavitação no seio do líquido, que origina gotículas dispersas em ar. A mistura resultante inspirada, gotículas líquidas e ar, é húmida e deposita-se na superfície pulmonar de forma radicalmente diferente da observada para partículas sólidas objecto do referido documento. 6

Na presente invenção os fármacos estão nanoincorporados num transportador lipídico: a biocompatibilidade e afinidade para serem endocitados destas partículas promovem uma rápida internalização celular, ou seja, o fármaco está disponível em concentrações farmacológicas num tempo relativamente curto quando comparado com outros nanotransportadores. Logo, quanto maior for a concentração de nanotransportador no pulmão maior é também a sua acumulação junto dos tecidos lesados e mais eficaz a libertação in situ do fármaco.

Rainer H. Muller, Karsten Mader, Sven Gohla em "Solid lipid nanoparticles(SLN) for controlled drug delivery - a review of the State of the art" (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Volume 50, Número 1, 3 Julho 2000, páginas 161-177, ISSN 0939-6411, DOI: 10.1016/S0939-6411(00)00087-4) referem que as nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) representam um sistema transportador alternativo aos tradicionais transportadores coloidais. Este artigo faz a revisão do estado da arte em relação às técnicas de produção de SLN, de incorporação de fármaco, da capacidade de carregamento e da libertação do fármaco, focando especialmente os mecanismos de libertação do fármaco. o processo utilizado é um processo HPH (high pressure homogenization), distinto do processo de fusão/emulsificação da presente invenção e as nanopartículas obtidas apresentam características diferentes mesmo quando a composição lipídica seja semelhante.

Shirzad Azarmi, Wilson H. Roa, Raimar Lobenberg em "Targeted delivery of nanoparticles for the treatment of lung diseases" (Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 60, número 8, Clinicai Developments in Drug Delivery Nanotechnology, 22 Maio 2008, páginas 863-875, ISSN 0169-409X) referem que as nanopartículas com as suas características especiais, tais como dimensão de partícula pequena, grande área superficial e a capacidade de mudar as suas propriedades de superfície tem inúmeras vantagens em comparação com outros sistemas de distribuição. Este artigo revê a investigação realizada sobre a aplicação de nanopartículas administradas por diferentes vias de administração para fins de tratamento ou de diagnóstico. Aspectos da nanotoxicologia na distribuição pulmonar também são discutidos. 7

El-Gendy N, Berkland C. em "Combination chemotherapeutic dry powder aerosols via controlled nanoparticle agglomeration" (Pharm Res . 2009 Jul;26(7):1752-63 . Epub 5 Maio 2009. PubMed PMID: 19415471)) referem que nanopartículas de paclitaxel foram aglomeradas de forma controlada para formar microparticulas de baixa densidade directamente após a preparação de nanopartículas de paclitaxel e a formação de um aerossol por aglomeração das nanopartículas de paclitaxel na presença de cisplatina em solução, sendo os pós freeze-dried adequados para inalação, sendo sugerido que os aglomerados de nanopartículas de paclitaxel isolado ou em combinação com cisplatina, podem servir como aerossoles quimioterapêuticos de pó seco para permitir o tratamento regional de certos cancros do pulmão. O sistema farmacêutico descrito é constituído por microparticulas que consistem num aglomerado de fármaco, ao passo que a presente invenção tem por objecto um sistema composto por nanopartículas. No referido documento não refere, quanto à estrutura das microparticulas, a utilização de polímeros ou lípidos, excipientes tipicamente utilizados em sistemas coloidais. O objecto da presente invenção compreende uma estrutura lipídica onde o fármaco está incorporado. Também o processo de preparação é integralmente diferente e o origina um pó seco.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se ao processo de preparação de nanopartículas lipídicas sólidas antineoplásicas nebulizáveis, às nanopartículas assim obtidas, correspondentes composições farmacêuticas e ao respectivo processo de nebulização.

Os tumores sólidos correspondem a cerca de 90% das neoplasias malignas. Durante a progressão da doença a grande maioria destes tumores desenvolve a capacidade de evoluir fenotipicamente, de invadir tecidos adjacentes e disseminar-se para regiões distantes por metastização. Estes factos evidenciam a necessidade de encontrar soluções terapêuticas mais eficazes. O processo de preparação de composição de nanopartículas lipídicas sólidas nebulizáveis objecto da presente invenção, para tratamento de neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extrapulmonares ou de doenças crónicas caracterizado compreende: 8 (i) preparação e aquecimento de uma solução aquosa de um agente tensioactivo; (ii) fusão de pelo menos um lípido sólido a uma temperatura 5 a 20°C superior ao ponto de fusão do referido lípido, de modo a obter uma fase lipídica; (iii) preparação de uma solução alcoólica de pelo menos um agente terapeuticamente activo e dissolução da solução obtida na referida fase lipidica obtida no passo (ii); (iv) mistura e homogeneização, entre 10 000 a 20 000 r.p.m, a quente, da mistura de fases obtidas no passo (iii) durante 5 a 20 minutos; (v) solidificação controlada a cerca de 25° C, de modo a obter nanopartícuias com um diâmetro compreendido entre 50 e 300 nm. O agente terapeuticamente activo é preferivelmente um agente antineoplásico seleccionado de entre o paclitaxel, o docetaxel ou a doxorubicina. O tensioactivo utilizado é um agente tensioactivo não iónico que é de preferência seleccionado de entre o grupo dos monoestearatos de sorbitano (polisorbato 60 ou 80) .

Como lipido sólido utiliza-se, de preferência, pelo menos um acilglicerol, seleccionado de entre um mono, um di ou um triacilglicerol de cadeia carbonada entre C16 e C22 ou uma sua mistura, em especial um palmitoestearato de glicerido com cadeia carbonada de C16, composto por cerca de 80% de ácido palmítico mono, di e triesterifiçado.

Num outro aspecto a presente invenção tem por objecto nanopartículas lipídicas sólidas, para tratamento de neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extrapulmonares ou de doenças crónicas, que compreendem pelo menos uma dispersão coloidal de nanopartículas de lípidos, estabilizada utilizando pelo menos um tensioactivo, contendo na matriz das nanopartículas pelo menos um agente terapeuticamente activo, preparadas pelo de acima definido, nas quais preferivelmente o agente terapeuticamente activo é um agente antineoplásico seleccionado de entre o paclitaxel, o docetaxel ou a doxorubicina e que apresentam estados metastáveis distintos do lipido inicial. As nanopartículas compreendem pelo 9 menos entre 3 e 8% (m/mtotal) de lípido sólido, pelo menos 25 a 75 % (m/mlipldo) de agente tensioactivo e 80 a 150 μΐ de paclitaxel por mg de composição final e são adequadas para qualquer via de administração, incluindo tópica, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal. As nanopartículas objecto da presente invenção são nebulizáveis por cavitação no seio do líquido através de ultrassons, originando uma mistura de gotículas líquidas dispersas em ar.

Ainda em um outro aspecto a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica de nanopartículas lipídicas sólidas, para tratamento de neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extrapulmonares ou de doenças crónicas caracterizada por compreender pelo menos nanopartículas lipídicas sólidas, tal como acima definidas. As neoplasias pulmonares compreenderem o adenocarcinoma, o tumor de grandes células, o carcinoma de células escamosas (epidermóide) e o tumor de pequenas células e os carcinomas extrapulmonares compreendem o carcinoma da mama avançado, melanoma, carcinoma do ovário avançada. Tal composição farmacêutica é nebulizável por cavitação no seio de um líquido através de ultrassons, como uma mistura de gotículas líquidas dispersas em ar. A invenção refere-se ainda ao processo de nebulização de agentes terapeuticamente activos aos pulmões por nebulização de nanopartículas lipídicas sólidas ou de composições farmacêuticas tal como anteriormente definidas, por cavitação no seio de um líquido através de ultrassons, originando uma mistura de gotículas líquidas dispersas em ar. A veiculação selectiva, associada sobretudo à administração por inalação, em conjunto com a elevada internalização celular do sistema, promove o potencial antineoplásico da composição objecto da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 corresponde ao perfil de distribuição de tamanhos em função da percentagem de lípido (palmitestearato de acilglicerol), para preparações a 3% de lípido e 50% de tensioactivo. 10 A Figura 2 é uma fotografia onde se observa o aspecto morfológico da preparação correspondente ao exemplo 1. imagens obtidas por microscopia electrónica de transmissão-TEM. A barra corresponde a 500nm.

As Figura 3A e 3B representam a superfície de resposta correspondente ao ajustamento de um modelo quadrático aos dados experimentais que contempla a interacção entre factores. As variáveis independentes são a concentração de lípido (%) e a proporção tensioactivo/lípido (T/L) . A Figura 4 são imagens das culturas de células MXT-B2. As imagens correspondem: cultura de células controlo (A), células incubadas com nsLp sem fármaco (B), células incubadas com nslp-Ptx (1 μΜ) (C) células incubadas com nslp-Ptx (2,5 μΜ) (D) a mesma amostra que C, mas com as células observadas com uma magnificência de 40x. As setas apontam estruturas que se identificam com corpos apoptóticos. A Figura 5 é o gráfico correspondente aos dados relativos ao volume médio das metástases (mm3) por grupo de animais (Protocolo 01) . A Figura 6 é o gráfico correspondente aos dados relativos ao volume médio das metástases (mm5) por grupo de animais (Protocolo 02) . A Figura 7 é uma imagem de um pulmão de animais tratados com Taxol® em fotografias obtidas através de uma câmara fotográfica acoplada a uma lupa de magnificiência (40x).

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a nanopartículas lipídicas sólidas nebulizáveis, para tratamento de neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extrapulmonares ou de doenças crónicas, que compreendem pelo menos uma dispersão coloidal de nanopartículas de lípidos, estabilizada utilizando pelo menos um tensioactivo, contendo na matriz das nanopartículas e pelo menos um agente antineoplásico seleccionado de entre o paclitaxel, o docetaxel e a doxorubicina ou outro agente terapeuticamente activo. 11 0 tensioactivo é um tensioactivo não iónico seleccionado de entre o grupo dos monoestearatos de sorbitano (polisorbato 60 ou 80) . O lípido sólido compreende pelo menos um acilglicerol, seleccionado de entre um mono, um di ou um triacilglicerol de cadeia carbonada entre C16 e C22 ou uma sua mistura. De preferência o lípido sólido é um palmitoestearato de glicerido com cadeia carbonada de C16, composto por cerca de 80% de ácido palmítico mono, di e triesterifiçado.

Em uma concretização preferida da presente invenção as nanopartículas lipídicas sólidas antineoplásicas nebulizáveis compreendem pelo menos entre 3 e 8% (m/mtotal) de lípido sólido, pelo menos 25 a 75 % (m/m do) de agente tensioactivo e 80 a 150 μΐ de paclitaxel por mg de composição final. As nanopartículas lipídicas sólidas antineoplásicas nebulizáveis apresentam estados metastáveis distintos do lípido inicial.

Em outro aspecto a presente invenção refere-se ao processo de preparação das referidas nanopartículas. Tal processo compreende as seguintes fases: (i) preparação e aquecimento de uma solução aquosa de um tensioactivo; (ii) fusão de pelo menos um lípido sólido a uma temperatura 5 a 20°C superior ao ponto de fusão do referido lípido, de modo a preparar uma fase lipídica; (iii) preparação de uma solução alcoólica de pelo menos um agente antineoplásico e dissolução da solução obtida na referida fase lipídica obtida no passo (ii); (iv) mistura e homogeneização, entre 10 000 a 20 000 r.p.m, a quente, da mistura de fases obtida no passo (iii) durante 5 a 20 minutos; (v) solidificação controlada a cerca de 25° C, de modo a obter nanopartículas com um diâmetro compreendido entre 50 e 300 nm. 12 A presente invenção têm ainda por objecto composições farmacêuticas de nanopartículas lipidicas sólidas nebulizáveis, como acima definidas, para tratamento de neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extra pulmonares. Os tumores malignos pulmonares abrangem o adenocarcinoma, o tumor de grandes células, o carcinoma de células escamosas (epidermóide) e o tumor de pequenas células e os carcinomas extra pulmonares compreendem o carcinoma da mama avançado, melanoma, carcinoma do ovário avançada. 0 conceito de dispersões de lípidos sólidos é recente e o seu desenvolvimento causou grande expectativa ao nível da nanotecnologia, não apenas para os fármacos em geral, mas sobretudo pela sua adequabilidade aos compostos bioterapêuticos.

As nanopartículas de lípidos sólidos são definidas como entidades individuais, constituídas por um reticulado compacto que forma uma matriz de estrutura e densidade variável, de diâmetro sub-micrométrico, apresentando cada entidade características de superfície particulares (Mader 2006). A presente invenção refere-se a uma formulação nebulizável composta por nanopartículas de lípidos sólidos contendo um ou mais agentes antineoplásicos preparados pelo método de homogeneização após fusão seguida de solidificação a temperatura controlada. Um dos fenómenos universalmente aceite no comportamento de sólidos após fusão é a sua tendência para permanecer sobrefundidos após arrefecimento, por períodos de tempo mais ou menos prolongados. A recristalização, a presença de polimorfos, assim como a existência de um estado de sobrefusão das dispersões lipidicas coloidais, correspondem a variações no comportamento térmico relacionadas com o diâmetro médio das partículas, com a presença de agentes tensioactivos, com a natureza do fármaco incorporado e com o processo de preparação.

Relativamente às nanopartículas de lípidos sólidos, a natureza coloidal que lhes está subjacente permite antecipar a sua estabilidade, com base em eventos electroquímicos que se desenrolam na vizinhança da superfície das partículas e que, em última análise, justificam o equilíbrio que se estabelece entre elas (Barret 2004; Petris et al. 2003). 13 0 número de lípidos disponíveis e as possíveis combinações lípido/tensioactivo reflectem-se numa enorme diversidade de formulações, mas implicam igualmente diferenças estruturais relevantes.

Embora a cristalinidade das nanopartículas de lípidos sólidos constitua o ponto sobre o qual convergem os atributos destes sistemas, esta característica está condicionada pelas propriedades da matéria durante a fusão e pelos fenómenos de polimorfismo durante o arrefecimento. 0 método de homogeneização após fusão seguida de solidificação a temperatura controlada contribui para a estabilidade das nanopartículas de lípidos sólidos.

Entre os agentes antineoplásicos, os taxanos diterpenóides constituem um grupo de agentes antimitóticos do qual fazem parte o paclitaxel, um composto natural que representa um dos mais potentes agentes antineoplásicos e o docetaxel, um análogo semi-sintético que também apresenta elevada actividade citotóxica. A incorporação de agentes anticancerígenos para terapêutica oncológica em vectores coloidais constitui uma estratégia para alterar a sua farmacocinética, modificando a biodistribuição deste quando incorporado e promovendo a sua acumulação nos tecidos lesados. 0 objecto da presente invenção é preparado pelo método de homogeneização após fusão seguida de solidificação a temperatura controlada. De uma forma geral, dois mecanismos podem estar subjacentes à incorporação de fármacos na matriz ou partícula: a interacção física ou a ligação química. Não importa aqui considerar a ligação química, covalente ou iónica, mais relacionada com o desenvolvimento de novas moléculas ou pró-fármacos. Pelo contrário, as interacções físicas são o principal mecanismo de ligação entre um fármaco e a matriz que lhe serve de suporte, quando consideramos sistemas de partículas ou conjugados de macromoléculas.

Dois aspectos fundamentais estão relacionados com a natureza lipídica das nanopartículas de lípidos sólidos: a tendência para apresentar linfotropismo e a cristalinidade da matriz. 0 linfotropismo assume um papel relevante em patologias onde há 14 envolvimento do sistema linfático. Esta característica, embora mais pronunciada para triacilgliceróis de cadeia longa, também se revela em misturas de mono, di e triacilgliceróis de cadeia média.

As caracteristicas dos acilgliceróis, especialmente no que diz respeito à sua cristalinidade, são determinadas pelos ácidos gordos que os constituem. No entanto, a formação de cristais em preparações farmacêuticas com base em lipidos está dependente da presença dos chamados agentes plastificantes, entre os quais se encontra a água e os tensioactivos adicionados, bem como das mudanças de fase que ocorrem durante a preparação. Adicionalmente, a complexidade dos sistemas nanoestruturados influencia fortemente as caracteristicas finais da matriz, exibindo estas propriedades distintas dos sistemas que, tendo a mesma composição, apresentam maiores dimensões de partícula. A interacção do fármaco com a estrutura formada e a mobilidade das moléculas no seu interior dependem de todos estes factores.

Adicionalmente, nestas suspensões o movimento Browniano, característico das partículas submicrométricas, retarda o processo de sedimentação, contribuindo também para a elevada estabilidade das nanopartículas de lipidos sólidos.

Tendo em conta as caracteristicas fisiológicas do tecido neoplásico e tendo em conta as possíveis alterações das caracteristicas de permeabilidade e retenção dos tecidos as nsLp-Ptx apresentam uma tendência para se acumularem nessa região.

Deste modo, a deposição do aerosol inalado sobre a superfície pulmonar constitui um importante contributo para a veiculação selectiva do sistema, permitindo a interacção das nanopartículas lipídicas contendo um agente antineoplásico com o epitélio bronco-alveolar, com a população celular alveolar, com o espaço intersticial e, consequentemente, com o sistema linfático associado ao pulmão (Sharma et al. 2001; Vyas et al. 2004). O efeito atingido pelo objecto da presente invenção é possivelmente o resultado de factores sinérgicos como a veiculação selectiva, a facilidade de entrada na célula, a 15 possível digestão rápida com libertação do fármaco no citosol e, porventura, a estimulação de vias apoptóticas. A veiculação para o espaço pulmonar é de extrema importância, quer ao nível oncológico, quando existem neoplasias circunscritas ou em estádio avançado, quer em termos de diagnóstico, uma vez que abre caminho à possibilidade de utilizar as nanopartículas lipídicas como radiofármacos em linfocintigrafia. Mais ainda, os progressos da medicina, nomeadamente novas técnicas de radiologia e imageologia, bem como o conhecimento de mecanismos subjacentes à especialização morfológica e funcional da célula neoplásica, ampliam a diversidade de alvos terapêuticos, o que associado à administração regional de fármacos, pode tornar-se uma estratégia de elevado potencial. Em função da molécula retida por interacções físicas, no seu reticulado ou à superfície da partícula, estes sistemas podem ainda ser utilizados como agentes imagiológicos, como suporte de agentes de vacinação, em produtos veterinários, na indústria de cosméticos, entre outros.

Em suma, o potencial de um transportador coloidal está relacionado com a organização da matriz que o constitui e com a capacidade deste em: - não ser reconhecido pelo sistema imunológico; - atingir selectivamente a região lesada; - estar disponível durante um período de tempo adequado; - libertar no tempo uma concentração terapêutica de fármaco; - alterar o índice terapêutico dos fármacos a ele associados; - proteger o fármaco da degradação enzimática. A incorporação de agentes anticancerígenos para terapêutica oncológica em vectores coloidais é uma das formas propostas para prolongar a sua eficácia, concentrando o fármaco no local de acção e diminuindo, nomeadamente nos órgãos saudáveis, a toxicidade característica destes agentes.

Através da administração pulmonar espera-se atingir todo o pulmão, especialmente a região alveolar, aumentando marcadamente a exposição ao fármaco (Ally et al. 2005; Koshkina & Kleinerman 2005; Koshkina et al. 2003; Rao et al. 2003). Esta via de 16 administração apresenta ainda, quando comparada com a via endovenosa, a vantagem de evitar o efeito de primeira passagem hepática, o que permite reduzir a dose administrada, uma vez que o fármaco inalado pode ser absorvido na sua totalidade em consequência da superfície do epitélio pulmonar. A conjugação desta hipótese com a administração pulmonar e o linfotropismo associado às nanopartículas lipídicas contribui para diminuir a concentração de fármaco a administrar, ao optimizar quer a selectividade para tumores sólidos, quer a concentração local de fármaco. A acumulação de nanopartículas lipídicas foi confirmada pelos dados farmacocinéticos obtidos por cintigrafia em estudos anteriores (Videira et al. 2002).

Por ser uma técnica não invasiva, o que favorece uma maior adesão terapêutica, a inalação poderá constituir a via de eleição alternativa aos métodos convencionais, adequada inclusive ao tratamento ambulatório, no caso de tratamentos prolongados.

As nanopartículas lipídicas nebulizáveis, objecto da presente invenção, permitem obter um padrão de deposição e eliminação pulmonar, onde a concentração de nanopartículas nos espaços alveolar e intersticial, contribui ainda para: - inibir a progressão das micrometástases pulmonares, - impedir a fixação de micrometástases de tumores primários residentes em outros órgãos. A incorporação de agentes antineoplásicos em nanopartículas lipídicas estáveis, assim como a administração pulmonar, modifica as características farmacocinéticas obtidas com o fármaco livre por perfusão. A veiculação selectiva de fármacos permite a administração de doses terapêuticas, adequadas e direccionadas ao órgão alvo, contribuindo para atingir um objectivo perseguido nas últimas décadas. Por outro lado, a redução da toxicidade e a utilização de vias de administração alternativas permite o desenvolvimento de novos esquemas terapêuticos. 17

Deste modo, a terapia selectiva, no que diz respeito à interacção de formulações de nanopartículas para veiculação de fármacos com os mecanismos moleculares, constitui uma abordagem capaz de anular o fenótipo de agressividade das células neoplásicas. A composição do presente invento corresponde a uma suspensão de partículas lipídicas, com paclitaxel incorporado, dispersas numa fase aquosa denominado de forma abreviada por nsLp-PTX. A composição de nanopartículas lipídicas objecto do presente invento desenvolvidas por um processo de homogeneização após fusão seguida de solidificação a temperatura controlada, representam um sistema de partículas inovador. A formulação nsLp-PTX para inalação objecto desta patente abre novas perspectivas para a terapêutica selectiva. Está em causa um conjunto de valências que, constitui uma mais valia na área da nanomedicina.

Os sistemas de lípidos sólidos podem constituir a resposta às limitações relativas à baixa selectividade e aos efeitos adversos relacionados com a terapêutica oncológica. A incorporação de paclitaxel em formulações de nanopartículas de lípidos sólidos dispensa a utilização de agente solubilizante e contribui para alterar a biodistribuição do fármaco. Subsequente a esta estratégia está também o objectivo de maximizar a eficiência terapêutica ao fazer depender a biodistribuição do fármaco das características físico-químicas do transportador e não apenas das propriedades da molécula farmacologicamente activa. 0 facto de a matriz ser aparentemente sólida concorre para uma maior capacidade de reter o fármaco. Por último, considera-se que o fármaco incorporado apresenta tendência para a acumulação nos tecidos onde existe neoplasia e, deste modo, tornar possível a alteração do seu índice terapêutico. A nível microscópico, trata-se de um sistema coloidal de partículas carregadas negativamente, de dimensões nanométricas e estrutura compacta, aparentemente sólidas, que formam uma população polidispersa de entidades bem individualizadas. Esta percepção da co-existência de uma estrutura mista dá origem a um novo conceito: veículos coloidais que, nas condições de armazenagem, se apresentam num estado metaestável, diferente das formas apresentadas pelo lípido livre, denominados por nano semi- 18 sólidas partículas lipídicas, de agora em diante abreviado como nsLp. A invenção será agora descrita com referência aos exemplos seguintes de preparação e caracterização das nanopartículas lipídicas objecto da presente invenção.

Exemplo 1

Preparação de nanopartículas lipídicas contendo paclitaxel

Preparou-se a composição objecto da presente invenção, as nanopartículas lipídicas contendo um agente antineoplásico, a partir de um método de homogeneização a quente após fusão seguida de solidificação a 25°C. A composição objecto do presente exemplo consiste em nanopartículas lipídicas a 3% (m/m) em dispersão com a seguinte composição, preparadas por homogeneização após fusão seguida de solidificação a temperatura controlada

Componentes Quantidade Palmitoestearato de acilglicerol 3 mg Polisorbato 80 1,5 mg Paclitaxel 825 μg Etanol 1 mg Água para injectáveis q. b.p. 100 mg 0 processo consiste na dispersão de fases através da agitação vigorosa da mistura, por intermédio de um rotor hidráulico (Silverson Machines Ltd, Waterside, Inglaterra). 0 processo é dividido em três etapas: (i) aquecimento das fases orgânica e aquosa separadamente, (ii) homogeneização após mistura das fases em reactor, (iii) solidificação controlada à temperatura ambiente após acondicionamento do sistema disperso em frascos rolhados e encapsulados. 19 0 processo de acordo com a presente invenção compreende as fases seguintes: (a) preparação da solução aquosa de tensioactivo; (b) fusão da fase lipídica a uma temperatura superior em 5 a 20°C à descrita como necessária para fundir o lipido e aquecimento da solução aquosa de tensioactivo à mesma temperatura; (c) preparação da solução alcoólica do fármaco anticancerigeno seguido da dissolução desta na fase lipídica; (d) mistura das fases a quente, seguida de homogeneização por homogeneização (Silverson Machine, Inglaterra), em reactor de vidro tipo I desenhado especialmente para o efeito com as seguintes condições; - intensidade de agitação - entre 10 000 a 20 000 r.p.m.. - tempo de homogeneização - entre 5 e 20 minutos (min). - temperatura - 5o a 20° superior à temperatura de fusão do lipido. (e) embalagem e arrefecimento da preparação de nanopartículas sem agitação e sob temperatura controlada, cerca de 25°C; (f) caracterização físico-química: diâmetro médio - dm (nm); potencial Zeta - ξ (mV); absorvência - abs; microscopia electrónica - TEM). (g) tratamento dos dados experimentais. Determinação da eficiência de incorporação do fármaco na matriz lipídica -EI%(m/v). (h) diluição da formulação obtida no ponto (e) em água para injectáveis de acordo com a dose de fármaco a administrar. (i) nebulização da suspensão coloidal obtida em (h).

Para preparar o aerossol de partículas coloidais utilizou-se um nebulizador ultrassónico (OMRON NE U07. Omron Healthcare Europe, Portugal, 3,5μπι MMD-Mass Median Diameter). Neste nebulizador a amostra líquida é atomizada, após ruptura das forças de coesão 20 no líquido, através da energia ultra-sónica (2,4MHz) produzida por vibração de um cristal piezoeléctrico. 0 aerossol produzido por este mecanismo é vaporizado a uma taxa constante e independente do fluxo respiratório.

Prepararam-se formulações de nsLp-PTX objecto da presente invenção a partir de soluções mãe de 7,5 a 15 mg/ml de paclitaxel em etanol, o que corresponde a uma concentração final de paclitaxel entre 82,5 e 300 μς/ιτιΐ.

As características físico-químicas das partículas nsLp-PTX foram avaliadas e comparadas com as nsLp vazias. A espectrofotometria de correlação de fotões (PCS; Autosizer Malvern Instruments IV, Reino Unido) foi utilizada para determinar o diâmetro médio e o índice de polidispersão de cada formulação. A carga superficial, traduzida pelo valor do potencial Zeta, foi medida após diluição das amostras em água e cloreto sódio (20μΐ:1ιη1) (Malvern Zetasizer IV, Reino Unido). À célula electroforética foi aplicado um campo eléctrico de 15,24 V/cm.

Em termos macroscópicos, a formulação apresentou-se líquida, de aspecto homogéneo ligeiramente leitoso, à semelhança do que se verificou para as preparações sem fármaco. Obtiveram-se nas dispersões preparadas, em veículo isento de Cremophor™ EL, concentrações de cerca de 5 mg de paclitaxel por grama de lípido na dispersão lipídica e, até cerca de 180 μρ de paclitaxel por grama da dispersão aquosa final. A homogeneidade das preparações, foi confirmada pela presença de apenas um pico na distribuição de diâmetros (Figura-1), apresentando as formulações de nsLp-PTX um diâmetro médio aparente da ordem dos 150 nm e um índice de polidispersão entre 0,156 e 0,380 e um potencial zeta da ordem dos —15ζ tal como representado na Tabela 1 seguinte. 21

Tabela 1

Valores dos dm (nm) e IP calculados para a formulação a 3% de lípido palmitoestearato de acilglicerol (n=3), com as respectivas concentrações finais de paclitaxel em μρ/ιηΐ. Potencial zeta (ζ) (mv) das nanopartículas sem agente antineoplásico e das nsLp-PTX. nsLp nsLp-PTX 0, *0 dm IP (ζ) Ptx Dm IP (ζ) 0,230 (82. 92,6 + 6,0 0,156 + 3 138, 9 ± + — 10,0 0,04 20, 7 5) 0,03 15, 7 0 valor de diâmetro médio, estimado pelas imagens obtidas por microscopia electrónica sugeriu que as formulações eram constituídas por partículas nanométricas com aproximadamente 30 nm (Figura-2), o que representa um desvio considerável aos valores obtidos por PCS. A estabilidade de preparações nsLp-PTX foi avaliada ao longo do tempo. Os parâmetros monitorizados, alteração do diâmetro médio e indice de polidispersão, crescimento de cristais, contaminação microbiológica e formação de agregados, foram avaliados em preparações mantidas à temperatura ambiente ao abrigo da luz.

As alterações no tamanho e carga das partículas foram determinadas aos 30 dias e aos 3, 12 e 24 meses, através da leitura do diâmetro médio e potencial zeta, usando as metodologias anteriormente descritas após diluição das formulações tal como representado na Tabela 2 seguinte. 22

Tabela 2

Avaliação da estabilidade física (t=24 meses) de preparações com paclitaxel (nsLp-PTX) e sem paclitaxel (nsLp). dm-diâmetro médio, JP-índice de polidispersidade.

nsLp nsLp-PTX Lípido dm (nm) IP dm (nm) IP 138,9 ± 0,230 ± 92,6 ± 0,156 ± 0,03 10, 0 0, 04 6,0

Os valores obtidos de fármaco incorporado nas nsLp-PTX, foram compatíveis com a actividade farmacológica descrita para este fármaco. De facto, com o processo de acordo com a presente invenção, o valor observado para a incorporação de paclitaxel na formulação com menor percentagem de lípido (3%) correspondia a concentrações superiores aos valores descritos como terapeuticamente significativos, nomeadamente concentrações plasmáticas entre 0,1 a 0,6 μιηοΙ/L consideradas clinicamente relevantes (Jordan & Wilson 2004). A dependência observada entre a concentração de paclitaxel incorporado e a percentagem de lipido inicial permite a preparação de diferentes dosagens, uma vez que a concentração de fármaco pode ser aumentada (82,5 para 180 μρ/ιηΐ) por aumento da percentagem de lípido de 3 para 8% (m/m). 23

Estrutura da molécula de paclitaxel: C47H51N014 [tax-ll-en-9-ona,5β,20-epoxi-l,2a,4, 7β,10β,13a -hexa-hidroxi-4,10-diacetato-2-benzoato-13-(a-fenil-hipurato)] (PM=853.92). d,.. V V •iSmOK >< m, \ » 'i íi«: 1 •Çw.ft fj......λ •ίίϋιΗΌΚ / Y /* /^niv / /w / / " U K V. _y

λ1CrJ

Qualquer que fosse a forma em que o fármaco se encontrasse, este não sofreu degradação após ser submetido ao processo de preparação da formulação de acordo com a presente invenção, como se verificou através dos cromatogramas obtidos com as nsLp-PTX aos 7 dias e aos 24 meses, onde o pico correspondente ao paclitaxel apresentou o mesmo perfil, assim como o mesmo tempo de retenção das soluções padrão. Também o período de armazenagem não provocou degradação dos constituintes, não sendo detectáveis por HPLC picos correspondentes a metabolitos secundários ou produtos de decomposição, mesmo após 12 meses. Efectivamente não foram observadas alterações nos valores de absorvência, de diâmetro médio ou do valor de potencial Zeta, durante um período de armazenamento de 24 meses, para as formulações acima referidas. A optimização dos parâmetros de processo e a escolha adequada da composição lipido/tensioactivo permitiram preparar nsLp-PTX estáveis e farmaceuticamente adequadas a preparações para inalação. 24

Os resultados demonstram que as nanopartículas lipídicas, de acordo com a presente invenção, acumulam às vantagens descritas para as emulsões farmacêuticas, as caracteristicas que lhes são subjacentes, o diâmetro nanométrico e a cristalinidade parcial da matriz. O estudo térmico indicou a co-existência de formas metaestáveis. De igual modo, a elevada área de superfície característica dos sistemas nanoestruturados, distingue-os das moléculas que transportam, bem como dos compostos que lhes dão origem. 0 gráfico exibido na Figura 3 (A) representa os resultados das observações experimentais provenientes de um planeamento factorial realizado com três níveis e dois factores (três concentrações de tensioactivo para duas concentrações de palmitoestearato de acilglicerol). A partir destes é possível interpolar a composição do sistema que, utilizando as mesmas condições de preparação, origina uma população de partículas com determinado valor de diâmetro médio. A representação da resposta do diâmetro médio, tendo em conta os três níveis de variação, mostra claramente que é possível ajustar o diâmetro médio da preparação por manipulação dos factores que influenciam a dispersão. A composição de nsLp-PTX da presente invenção compreende uma formulação de nanopartículas lipídicas dispersível em veículos aquosos, estável ao longo do tempo e que poderá servir para colmatar as limitações até agora existentes com o fármaco livre. Os valores obtidos, em termos de diâmetro médio e carga superficial nas nsLp-PTX, revelam que o sistema de partículas desenvolvido é susceptível de ser utilizado em qualquer via de administração.

Os resultados descritos indicam que o processo da presente invenção, homogeneização após fusão seguida de solidificação da dispersão à temperatura de 25°C, permite o desenvolvimento de uma formulação de nanopartículas lipídicas para inalação com uma distribuição granulométrica adequada à veiculação de fármacos. 25

Exemplo 2

Preparação de nanopartículas lipídicas contendo paclitaxel

Preparou-se a composição da presente invenção de nanopartículas lipídicas contendo um agente antineoplásico, a partir de um método de homogeneização a quente após fusão seguida de solidificação a 25°C. Utilizou-se como lípido o palmitoestearato de acilglicerol a 6%, massa de lípido por peso total da preparação. Prepararam-se formulações de nsLp-PTX objecto da presente invenção a partir de soluções mãe de 7,5 a 15 mg/ml de paclitaxel em etanol, o que corresponde a uma concentração final de paclitaxel de 15C^g/mg de formulação. A composição de nanopartículas lipídicas em dispersão, preparadas por homogeneização após fusão seguida de solidificação a temperatura controlada tinha a seguinte composição:

Componentes Quantidade palmitoestearato de acilglicerol 6 mg Polisorbato 80 3,0 mg Paclitaxel 1500 μg Etanol 1 mg Água para injectáveis q.b.p. 100 mg

As nanopartículas lipídicas obtidas apresentaram um diâmetro médio de aproximadamente 114,8±16,4 nm com o valor de índice de polidispersão de cerca de 0,20010,102. 26

Exemplo 3

Preparação de nanopartículas lipídicas contendo paclitaxel

Preparou-se a composição objecto da presente invenção, as nanopartículas lipídicas contendo um agente antineoplásico, a partir de um método de homogeneização a quente após fusão seguida de solidificação a 25°C. Utilizou-se o lípido behenato de acilglicerol a 3% massa de lípido por peso total da preparação. Prepararam-se formulações de nsLp-PTX objecto da presente invenção a partir de soluções mãe de 7,5 a 15 mg/ml de paclitaxel em etanol, o que corresponde a uma concentração final de paclitaxel de 82,5 μg/mg de formulação. A composição objecto do presente exemplo refere-se a nanopartículas lipídicas em dispersão com a seguinte composição, preparadas por homogeneização após fusão seguida de solidificação a temperatura controlada:

Componentes Quantidade Behenato de acilglicerol 3 mg Polisorbato 80 1,5 mg Paclitaxel 825 μg Etanol 1 mg Água para injectáveis q.b.p. 100 mg

As nanopartículas lipídicas obtidas apresentam um diâmetro médio de aproximadamente 126,l+9,21nm com o valor de índice de polidispersão de cerca de 0,220+0,090. O gráfico da Figura 3 (B) mostra os resultados das observações experimentais provenientes de um planeamento factorial realizado com três níveis e dois factores (três concentrações de tensioactivo para duas concentrações de behenato de acilglicerol) . A partir destes é possível interpolar a composição do sistema que, utilizando as mesmas condições de preparação, origina uma população de partículas com determinado 27 valor de diâmetro médio. A representação da resposta do diâmetro médio, tendo em conta os três níveis de variação, mostra claramente que é possível ajustar o diâmetro médio da preparação por manipulação dos factores que influenciam a dispersão.

Exemplo 4

Preparação de nanopartículas lipídicas contendo paclitaxel

Preparou-se a composição objecto da presente invenção, as nanopartículas lipídicas contendo um agente antineoplásico, a partir de um método de homogeneização a quente após fusão seguida de solidificação a 25°C. Utilizou-se o lípido behenato de acilglicerol a 6% massa de lípido por peso total da preparação. Prepararam-se formulações de nsLp-PTX objecto da presente invenção a partir de soluções mãe de 7,5 a 15 mg/ml de paclitaxel em etanol, o que corresponde a uma concentração final de paclitaxel de 150 μρ/ιηΐ. A composição objecto do presente exemplo refere-se a nanopartículas lipídicas a 3% (m/m) em dispersão com a seguinte composição, preparadas por homogeneização após fusão seguida de solidificação a temperatura controlada:

Componentes Quantidade Behenato de acilglicerol 6 mg Polisorbato 80 3, 0 mg Paclitaxel 1500 μg Etanol 1 mg Água para injectáveis q.b.p. 100 mg

As nanopartículas lipídicas obtidas apresentam um diâmetro médio de aproximadamente 274,0±19,2 nm com o valor de índice de polidispersão de cerca de 0,250±0,096. 28

Exemplo 5

Estudos de internalização celular de nanopartícuias lipídicas

Tendo em consideração o carácter lipófilo do sistema nsLp poder-se-á antecipar a sua tendência para sofrer internalização celular, ou seja, desconhecendo se há interferência de mediadores de membrana, a entrada e o transporte intracelular deverá ser modulado pelas vias endociticas.

Componentes Quantidade Palmitoestearato de glicerido 3 mg Polisorbato 80 1,5 mg 1,6-Difenil-1,5-hexatrieno (DPH) 0,01M Etanol 1 mg Água para injectáveis q.b.p. 100 mg

Este mecanismo foi confirmado por incorporação de um marcador de fluorescência (DPH) em nsLp. Após incubação das partículas nsLp-DPH na variante MXT-B2 em cultura, observou-se a rápida internalização destas, bem como a presença de numerosas vesículas no citoplasma. Utilizando uma suspensão celular de MXT-B2, em meio mínimo essencial, incubaram-se 2xl04 de células em lamelas colocadas em placas de 6 poços (Costar®; Sigma-Aldrich, UK) . Às células aderentes em monocamada, adicionaram-se 100 μΐ da suspensão de nsLp-DPH diluída em PBS, de modo a obter aproximadamente 5X106 nanopartículas por poço. As placas foram levadas ao incubador por 1 hora a 37°C em atmosfera com 95% de humidade e 5% de C02. Após este período, o meio foi removido e às células aderentes foi adicionada uma solução de glicerol a 5%, depois de lavadas duas vezes com PBS.

Para observação das células aderentes, utilizou-se um microscópio confocal de fluorescência equipado com um filtro de excitação (452nm) Axiovert 35 (LSM-510. Cari Zeiss Medi Inc., Jena, Alemanha) ligado a um sistema de imagem ApoTome Imaging 29

System (Cari Zeiss Medi Inc., Jena, Alemanha). Identificaram-se, nas linhas celulares, vesículas citoplasmáticas onde estão localizadas as nanopartículas. 0 padrão de dispersão destas estruturas no citoplasma, após internalização celular, é

atribuído a vesículas endossómicas o que envolve a activação das vias lisossomais. Este mecanismo foi confirmado mais tarde, quando aos 90 minutos de exposição, as células ao microscópio apresentaram cor verde difusa por todo o citoplasma, não sendo visíveis nesse momento estruturas do tipo vesicular. A velocidade de internalização foi rápida, dado que a totalidade das partículas tinha desaparecido do meio de cultura 30 minutos após a adição à cultura de células. A maturação dessas vesículas endossómicas para lisossomas explica o aparecimento de cor dispersa por todo o citoplasma, indicativa não apenas de internalização celular, mas também da digestão das nanopartículas e libertação do marcador. Não se detectou efeito sobre a viabilidade celular, para a concentração de partículas utilizada, nas células em contacto com a suspensão de nsLp sem fármaco (4,86xlO10partículas/ml) .

Exemplo 6

Estudo de eficácia citotóxica in vitro A citotoxicidade das nanopartículas lipídicas preparadas de acordo com o exemplo 1 foi avaliada. O paclitaxel tem sido objecto de inúmeros estudos com vista ao alargamento da sua utilização a outras linhas celulares para além daqueles tipos de cancro para os quais está indicado como tratamento de primeira linha. A actividade antineoplásica do paclitaxel está relacionada com o bloqueio da dinâmica dos microtúbulos celulares. A energia livre de ligação dos microtúbulos ao paclitaxel é fraca, o que de alguma maneira favorece a taxa de polimerização; ao mesmo tempo que a despolimerização é fortemente afectada, nomeadamente por diminuição da constante de dissociação da tubulina. Ainda que seja reversível, este mecanismo produz um complexo paclitaxel-microtúbulo extremamente estável. Subsequente a este bloqueio, que impede a célula de progredir no ciclo mitótico durante a transição da metafase para a anafase, pode estar igualmente a 30 indução da apoptose (Bhalla 2003; Huisman et al. 2002; Li et al. 2005) .

Relativamente à actividade farmacológica do paclitaxel, estão ainda descritas interacções deste fármaco com outros mecanismos a nivel celular. Sabe-se que a exposição de células neoplásicas a concentrações de paclitaxel inferiores àquelas consideradas farmacológicas (0,1-10 μΜ) estimula a actividade apoptótica e, simultaneamente, inibe a angiogénese e reduz a expressão do factor de crescimento de endotélio vascular (VEGF) (Huisman et al. 2002; Li et al. 2005; Sunters et al. 2003; Wang et al. 2003b; Wang et al. 2000). Igualmente, a estimulação da libertação pelos macrófagos de factores de necrose tumoral (TNF), a alteração da contractibilidade dos fibroblastos e a inibição da síntese de ADN são alguns dos mecanismos moleculares que podem ser activados pela presença de paclitaxel (Amos 2000; Jordan & Wilson 2004b).

Uma considerável diversidade de modelos têm sido desenvolvido para o estudo de tumores humanos, dos quais os mais comuns incluem células epiteliais hiperproliferativas. A variante MXT-B2 (Llorens et al. 1997) provém de células isoladas de tecido epitelial de carcinoma da mama de ratinho ("murine mammary adenocarcinoma" - MXT). A citotoxicidade das partículas nsLp-PTX preparadas de acordo com o Exemplo 1 foi avaliada por comparação com a solução de Taxol , após exposição das células neoplásicas MXT-B2 a concentrações crescentes de fármaco. Partindo da suspensão de nsLp, nsLp-PTX e da solução de Taxol®, prepararam-se amostras com concentrações crescentes de paclitaxel, por diluição em meio fresco da solução mãe de fármaco livre (0,5; 5,0 e 50 μρ/ηιΐ) ou encapsulado (0,1; 1,0 e 10 μρ/πιΐ) . Utilizou-se o ensaio de MTT, tal como descrito anteriormente, para determinar a viabilidade celular.

Valores de paclitaxel compreendidos entre 0,1 e 10 μΜ são geralmente reconhecidos como sendo a concentração farmacológica necessária para bloquear a dinâmica funcional de microtúbulos em culturas celulares (Kuppens 2006a). 31 A suspensão celular, com um mínimo de 90% de viabilidade celular, deve ser ajustada a uma concentração de 5000 células por 100 μΐ de meio mínimo essencial suplementado. Em placas de 96 poços, 5000 células por poço (100 μΐ) foram semeadas em meio mínimo essencial suplementado e incubadas por 24 h. Após este período, foram adicionados 100 μΐ de cada amostra (n=3), equivalentes a concentrações crescentes de fármaco livre e incorporado. A exposição às diferentes amostras, nsLp, nsLp-PTX e Taxol decorreu durante duas horas, depois das quais o meio foi substituído por meio fresco seguindo-se um período de incubação de 12 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio do corante MTT.

As nsLp-PTX, composição objecto da presente invenção, provou ser mais potente do que o fármaco livre, sendo a concentração de nsLp-PTX necessária à indução de 50% de morte celular (DL50) cerca de vinte vezes inferior 0,156 d, 69 μΜ) quando comparada com o valor de DL50 registado para o fármaco livre 3,39 μρ (39,70 μΜ) de Taxol® (p<0,001). A diferença de resposta por parte das células neoplásicas pode ser observada quando se comparam concentrações equivalentes de paclitaxel livre e incorporado. Para valores equivalentes de paclitaxel (6,0 μΜ), valor abrangido pelo intervalo de concentrações necessário à actividade farmacológica (0,1 a 10 μιηοΐ/ΐ), observou-se que a citotoxicidade das nsLp-PTX provocou uma diminuição significativa da viabilidade celular (39,43%). Pelo contrario, as amostras correspondentes a solução de Taxol apresentam para esta concentração uma actividade citotóxica reduzida que se reflecte numa elevada taxa de sobrevivência (87,85%). Esta diferença, observada para concentrações extra-celulares equivalentes, pode estar relacionada com uma menor permeabilidade ao fármaco livre e consequentemente uma concentração intracelular inferior.

Contrariamente ao observado com o nsLp-PTX, o paclitaxel livre não apresentou actividade para concentrações inferiores a 0,05μρ/100μΐ no tempo em que decorreu o ensaio. A exposição das células MXT-B2 a nsLp sem fármaco, no intervalo de 4,86x10“ a 32 9,72xl07 (partículas/ml), não teve qualquer efeito na viabilidade celular. 0 estudo de citotoxicidade com o fármaco livre, para o tempo de incubação avaliado, revelou uma potência cerca de vinte vezes inferior à observada com o fármaco em suporte lipidico. Por outro lado, as imagens obtidas por microscopia confocal de fluorescência confirmam a eficácia do sistema de nanoparticulas lipidicas com paclitaxel, através da diminuição acentuada da viabilidade celular para concentrações de nsLp-PTX correspondentes a cerca de 1,0 e 2,5 μΜ de paclitaxel (Figura 4). A rápida internalização e a magnitude do efeito anti-tumoral mostra uma vez mais, um perfil de interacção nanoparticulas-células compatível com activação das vias endocíticas. Estes resultados evidenciam antes de mais uma elevada biodisponibilidade intracelular, que pode por si só justificar a maior eficácia terapêutica.

Neste contexto, além dos alvos convencionais, surgem como potenciais factores de aplicabilidade dos sistemas transportadores de fármacos a inibição dos factores promotores de angiogénese, a estimulação da síntese de p53, a interacção com receptores de membrana, a saturação da glicoproteína-P e a interacção com proteínas pró-apoptóticas, entre outros alvos moleculares.

Exemplo 7

Estudo de eficácia citotóxica in vivo

Actualmente o paclitaxel é um dos principais agentes antineoplásicos a ser utilizado quer em monoterapia quer em associação (Kuppens 2006a). Inicialmente indicado para o tratamento do carcinoma avançado do ovário e mama e, posteriormente, para o tumor de não pequenas células de pulmão e sarcoma de Kaposi é hoje em dia um agente antineoplásico de primeira linha em associação com os compostos de platina no tratamento do tumor de não pequenas células de pulmão.

As nanoparticulas lipidicas nebulizáveis, objecto da presente invenção, permitem obter um padrão de deposição e eliminação pulmonar, onde a concentração de nanoparticulas nos espaços alveolar e intersticial, contribui ainda para: 33 - inibir a progressão das micrometástases pulmonar e - impedir a fixação de micrometástases de tumores primários residentes em outros órgãos

Determinação da actividade antineoplásica in vivo da composição do exemplo 1. A completa supressão de metástases alojadas na região pulmonar foi avaliada em modelo animal, após inoculação de células neoplásicas. Uma considerável diversidade de modelos tem sido desenvolvido para o estudo de tumores humanos, dos quais os mais comuns incluem células epiteliais hiperproliferativas. A variante MXT-B2 (Llorens et al. 1997) provém de células isoladas de tecido epitelial de carcinoma da mama de ratinho ("murine mammary adenocarcinoma"-MXT), que correspondem a sub-populações celulares representativas de diferentes estádios da doença. 0 modelo, constituído por células epiteliais com elevada capacidade hiperproliferativa e elevado grau de malignidade, apresenta capacidade para induzir o aparecimento de metástases pulmonares experimentais, após administração intravenosa da suspensão celular. Seleccionou-se para este estudo a linha celular MXT-B2, devido ao padrão de reprodutibilidade que apresenta no desenvolvimento de metástases experimentais, após inoculação intravenosa em ratinhos. As células, foram mantidas em cultura aderente em meio mínimo essencial suplementado. Após inoculação das células pela veia da cauda, os animais desenvolveram metástases experimentais ao nível do pulmão, como confirmado pelo grupo controlo, aos 30 dias do ensaio. A eficácia em desenvolver metástases pulmonares experimentais ficou demonstrada, através do número de metástases pulmonares experimentais, registadas em 100% dos ratinhos do grupo controlo. Como seria de esperar, o grupo que recebeu partículas sem fármaco exibiu um resultado similar ao grupo controlo relativamente ao número de metástases.

Os animais foram divididos aleatoriamente, em grupos de 5 animais, após inoculação intravenosa de células viáveis da linha MXT-B2. Considerando o padrão de fixação e desenvolvimento destas células (Llorens et al. 1997) desenvolveram-se dois protocolos, para os quais variou a hipótese colocada. 34 A eficácia do paclitaxel após incorporação no sistema nsLp (nsLp-PTX) foi testada em modelos de disseminação neoplásica na região pulmonar e comparada com a administração intravenosa do medicamento de referência, o Taxol®. Pretendeu-se determinar a actividade terapêutica, em termos de supressão total ou diminuição do número de metástases, relativamente ao grupo controlo. Para isto, os tratamentos foram desdobrados, de modo a simular (i) uma fase de tratamento puramente preventiva (t0-t15 dias) -Protocolo 01 com quatro tratamentos por grupo e, (ii) uma fase terapêutica, onde, de acordo com as fases de progressão da doença esperadas para o modelo, já haveria metástases disseminadas a nível pulmonar (t15-t45 dias) Protocolo 02 com oito tratamentos por grupo. A ausência de toxicidade, durante o tratamento por inalação de nsLp-PTX, nomeadamente do Protocolo 02 onde o número de administrações foi superior, indica que o objectivo de diminuir a toxicidade associada ao fármaco livre foi atingido com sucesso, contrariamente ao que se verificou nos grupos aos quais se administrou o fármaco livre por via intravenosa. A presente invenção permite uma veiculação selectiva, que associada à administração por inalação, em conjunto com a elevada internalização celular do sistema, justifica o potencial antineoplásico das nsLp-PTX.

Idealmente, a actividade do agente incorporado deve ser limitada às células neoplásicas. Poder-se-á atribuir uma elevada selectividade ao sistema desenvolvido ou seja nsLp-Ptx administradas por inalação, tendo em conta dois aspectos: - o primeiro aspecto é exclusivamente mecânico. A administração pulmonar produz um efeito de "aspersão" do fármaco incorporado sobre a superfície pulmonar. Esta via de administração pode ser comparada com uma aplicação tópica, o que aumenta a selectividade para a região lesada ao concentrar o fármaco no local de administração ao mesmo tempo que a sua circulação a nível sistémico é limitada; 35 - o segundo aspecto está relacionado com a fisiologia da região lesada. 0 desenvolvimento de um tumor é acompanhado por alterações ao nivel do microambiente que envolve a região afectada. Nos tumores sólidos, os vasos resultantes do processo de angiogénese apresentam uma estrutura desordenada ao nivel da membrana de células endoteliais, o que significa que a este nivel a permeabilidade a partículas coloidais está aumentada (Gerlowski & Jain 1986; Wu et al. 1993). Geralmente, nas zonas onde há actividade hiperproliferativa, existe ainda um desequilíbrio entre a drenagem linfática e a acumulação de liquido intersticial o que provoca a acumulação de partículas coloidais nestas regiões (Fang et al. 2003; Maeda et al. 2000). O efeito de permeabilidade e retenção (EPR) resulta destes dois fenómenos, constituindo, a par com as propriedades de superfície do transportador coloidal, um dos factores determinantes na eficácia da veiculação de fármacos como estratégia terapêutica. - No modelo utilizado neste trabalho, tendo em conta que este apresenta múltiplas regiões de hiperplasia, o efeito EPR está subjacente à selectividade da veiculação coloidal. No entanto, o forte envolvimento do espaço intersticial na administração pulmonar de nsLp será porventura o efeito que mais contribui para a supressão das metástases pulmonares de carcinoma da mama, quer se trate de um modelo experimental ou de disseminação do tumor primário. A acumulação de partículas no espaço intersticial reveste-se de particular importância, se considerarmos a administração linfática em função da estrutura do espaço intersticial. No pulmão, este apresenta condições únicas, relativamente à administração intraperitoneal ou subcutânea (Harivardhan et al. 2005), sendo igualmente a maior superfície atingida por uma única administração.

Para a determinação da dose a administrar utilizaram-se os dados recolhidos nos testes In vltro. Nos estudos que envolveram a administração intravenosa da solução de Taxol® a dose administrada foi extrapolada a partir da concentração média frequentemente utilizada em tratamentos clínicos; 175 mg/m2 de superfície corporal (Bristol-Myers Squibb Company, UK. Taxol® -Resumo das características do medicamento-2005) e corrigida de acordo com o valor calculado de ICsn.

b(J 36

Os animais foram sujeitos a uma fase de aclimatação antes do inicio do trabalho experimental (Fase I) . A cada animal foram administradas, através da veia da cauda (Fase II), células MXT-B2, correspondendo este passo ao tempo zero do estudo. Relativamente ao modelo, este progrediu para o desenvolvimento de metástases experimentais em duas fases: (i) disseminação e fixação metastática (Fase III), (ii) desenvolvimento de tumores (Fase IV). "End point"- 0 tempo estimado para a recolha de dados relevantes para as hipóteses em estudo foi de 45 dias. A perda de mais de 10% de massa corporal e, ou o aparecimento de lesões exteriores, foram considerados parâmetros limite do modelo, determinantes para a continuidade do estudo. Por este motivo, a leitura do peso dos animais foi realizada semanalmente.

Pretendeu-se determinar a actividade terapêutica das diferentes formulações, em termos de supressão total ou diminuição do número de metástases, relativamente ao grupo controlo. Para isto, os tratamentos foram desdobrados, de modo a simular (iii) uma fase de tratamento puramente preventiva (t0-t15) -

Protocolo 01 e, (iv) uma fase terapêutica, onde, de acordo com as fases de progressão da doença esperadas para o modelo, já haverá metástases disseminadas a nível pulmonar (t15-t45) - Protocolo 02. O primeiro protocolo, mais abrangente, foi desenhado tendo como objectivo comparar a actividade das diferentes formulações e determinar a influência da via de administração pulmonar. Duas hipóteses foram avaliadas: a primeira pretendeu demonstrar uma maior eficácia das nsLp-PTX inaladas guando comparadas com a administração intravenosa de Taxol . A segunda hipótese, vemos que ao serem direccionadas para a circulação linfática pulmonar as nsLp-Ptx poderiam prevenir a entrada de micrometástases na região pulmonar.

Verificou-se que o sistema de administração pulmonar por inalação de nsLp-PTX exibia uma elevada eficácia terapêutica. Esta eficácia, em função do tratamento administrado, resultou num decréscimo significativo (Protocolo 01) e supressão total de 37 metástases experimentais (Protocolo 02) na superfície pulmonar quando o número de administrações foi aumentado. O estudo comparativo levado a cabo no protocolo 01, demonstrou que a inalação de nsLp-PTX foi significativamente mais eficaz do que a administração intravenosa de Taxol , no tratamento de um modelo de metástases pulmonares experimentais representando na Tabela 3 seguinte.

Tabela 3

Valores determinados para o volume médio de lesão neoplásica nos dois lobos pulmonares após sacrifício dos animais (Protocolo 01). nsLp Taxol® nsLp-PTX controlo 7,1011,24 5,7012,03 1,0810,79 6,7811,06

Tal como representado na Figura 5, a diminuição do número e volume de metástases pulmonares, após inalação de nsLp-PTX durante os primeiros quinze dias subsequentes à inoculação por via intravenosa das células tumorais, MXT-B2, traduziu-se pela supressão completa em 3/4 animais e registo de apenas um animal com lesões (1/4) como mostrado na tabela 4 seguinte.

Tabela 4 (I) Percentagem de animais por grupo que apresentou lesão pulmonar. (II) Número de metástases por grupo grupo controlo nsLp-PTX Taxol® (I) 100 50 100 (II) 120 6 49 38

Os resultados obtidos demonstraram que a disseminação e, em consequência a fixação de metástases, foi bloqueada ao nível pulmonar. Este facto está relacionado com o padrão de eliminação pulmonar das nanopartícuias, com consequente acumulação no interstício e mais tarde no sistema linfático pulmonar, o que leva à interacção com as células neoplásicas fora do espaço alveolar ou mesmo em circulação no sistema linfático. Este mecanismo foi confirmado pela total supressão de metástases pulmonares tal como mostrado na Figura 6, por inalação de nsLp-PTX quinze dias após a inoculação por via intravenosa das células tumorais, MXT-B2, durante um período de três semanas (protocolo 02). O número e tamanho das metástases pulmonares, nos pulmões retirados após sacrifício, relativo aos grupos de animais tratados com Taxol , indica a ausência de mecanismos de bloqueio à disseminação e fixação de metástases (Figura 7) . O fármaco livre, administrado por via intravenosa duas vezes por semana, 6 mg/kg de peso corporal, provocou ainda efeitos adversos, dos quais se destacam letargia e perda de peso acentuada. O tratamento dos ratinhos por inalação de nsLp-PTX, no grupo de prevenção e no terapêutico, apresentou uma eficácia superior à observada com o fármaco livre como mostrado na Tabela 3. Destacando-se sobretudo a ausência de lesão pulmonar em 3 de 4 animais, bem como uma acentuada diminuição do número de metástases por animal, relativamente aos restantes grupos de animais (Tabela 3) . Não se registaram, durante o estudo com as nsLp-Ptx, fenómenos de toxicidade, como ficou demonstrado pela determinação do peso e a observação do estado geral dos animais destes grupos. A difusão do sistema nsLp-PTX no tecido lesado, ainda que aparentemente se deva a um fenómeno de extravasão passiva, está facilitada por alguns aspectos importantes que se materializam nas características fisiológicas da região lesada, nomeadamente edema da matriz extracelular e irregularidades na estrutura de vascularização do tumor (Fang et al. 2003; Iyer et al. 2006; Maeda et al. 2000; Nie et al. 2007). 39 A administração pulmonar contribuiu para uma veiculação direccionada para alvos celulares, aumentando a cedência intracelular de fármaco, potenciando desta maneira a actividade antineoplásica (Hodoshima et al. 1997; Jones et al. 2003; Vasir & Labhasetwar 2007) . A estabilidade das nanoparticulas lipidicas com agente antineoplásico objecto da presente invenção, confirmada durante a nebulização e, a sua capacidade para atingirem os pulmões e o sistema linfático pulmonar, demonstraram que o sistema desenvolvido é eficaz e que os aerossóis formados eram constituídos por partículas respiráveis. As partículas inaladas depositaram-se de forma extensa em toda a superfície pulmonar. O facto de as partículas dispersas terem migrado para os gânglios linfáticos regionais, poucos minutos após a deposição do aerossol no pulmão, sugere que a drenagem linfática, por acumulação no espaço intersticial ou por acção dos macrofagos alveolares, representa um dos mecanismos mais importantes de remoção de nsLp-PTX da região alveolar. A inalação apresenta-se aqui como uma via efectiva para administração pulmonar de nsLp-PTX.

Adicionalmente, a percentagem de partículas retida no espaço pulmonar, nomeadamente na região brônquica, proporciona uma estratégia de libertação controlada, o que torna estas partículas igualmente adequadas, para terapêutica de doenças crónicas ao nível pulmonar.

Este aspecto justifica os resultados observados em modelo animal, ou seja a supressão total de metástases pulmonares, observada após inalação de nslp-PTX, sem que tivessem sido registados fenómenos de toxicidade sistémica. A eficácia das nsLp-PTX, avaliada in vitro e ín vivo, demonstrou que o sistema de inalação de acordo com a presente invenção proporciona um aumento do tempo de exposição das células neoplásicas a concentrações farmacológicas de agente antineoplásico, maximizando o efeito antineoplásico. Os resultados demonstram que é possível variar a dose a administrar e, simultaneamente, contribuir para a diminuição ou inexistência de paclitaxel livre, o que permite prever a redução da toxicidade sistémica. 40

Em suma, os dados indicam que com a formulação para inalação composta por nanopartículas de lípidos sólidos contendo um ou mais agentes antineoplásicos preparadas pelo método de homogeneização após fusão e solidificação a temperatura controlada, objecto do presente invento, foi alcançada a conjugação entre uma maior eficácia terapêutica e uma diminuição acentuada dos efeitos tóxicos, confirmando, deste modo, que o índice terapêutico do sistema de inalação de nsLp-PTX é mais favorável relativamente àquele que se verifica para o fármaco livre.

Lisboa, 27 de Julho de 2010. 41

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Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo de preparação de composição de nanopartículas lipídicas sólidas nebulizáveis, para tratamento de neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extrapulmonares ou de doenças crónicas caracterizado por compreender: (i) preparação e aquecimento de uma solução aquosa de um agente tensioactivo; (ii) fusão de pelo menos um lipido sólido a uma temperatura 5 a 20°C superior ao ponto de fusão do referido lipido, de modo a obter uma fase lipídica; (iii) preparação de uma solução alcoólica de pelo menos um agente terapeuticamente activo e dissolução da solução obtida na referida fase lipídica obtida no passo (ii); (iv) mistura e homogeneização, entre 10 000 a 20 000 r.p.m, a quente, da mistura de fases obtidas no passo (iii) durante 5 a 20 minutos; (v) solidificação controlada a cerca de 25° C, de modo a obter nanopartículas com um diâmetro compreendido entre 50 e 300 nm.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente terapeuticamente activo ser um agente antineoplásico seleccionado de entre o paclitaxel, o docetaxel ou a doxorubicina.
3. 3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o tensioactivo utilizado ser não iónico e de preferência seleccionado de entre o grupo dos monoestearatos de sorbitano (polisorbato 60 ou 80).
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por o lipido sólido utilizado compreender pelo menos um acilglicerol, seleccionado de entre um mono, um di ou um triacilglicerol de cadeia carbonada entre C16 e C22 ou uma sua mistura. 1
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por o lipido sólido ser um palmitoestearato de glicerido com cadeia carbonada de C16, composto por cerca de 80% de ácido palmitico mono, di e triesterifiçado.
6. 6. Nanopartículas lipidicas sólidas, para tratamento de neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extrapulmonares ou de doenças crónicas, caracterizadas por compreenderem pelo menos uma dispersão coloidal de nanoparticulas de lipidos, estabilizada utilizando pelo menos um tensioactivo, contendo na matriz das nanoparticulas pelo menos um agente terapeuticamente activo, obtidas pelo processo de acordo com as reivindicações 1 a 5.
7. 7. Nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas por o agente terapeuticamente activo ser um agente antineoplásico seleccionado de entre o paclitaxel, o docetaxel ou a doxorubicina.
8. 8. Nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizadas por apresentarem estados metastáveis distintos do lipido inicial.
9. 9. Nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizadas por compreenderem pelo menos entre 3 e 8% (m/mtotal) de lipido sólido, pelo menos 25 a 75 % (m/mllpld0) de agente tensioactivo e 80 a 150 μΐ de paclitaxel por mg de composição final.
10. 10. Nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizadas por serem adequadas para qualquer via de administração, incluindo tópica, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.
11. 11. Nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo a reivindicação anterior, caracterizadas por serem nebulizáveis por cavitação no seio do liquido através de ultrassons, originando uma mistura de goticulas liquidas dispersas em ar. 2
12. 12. Composição farmacêutica de nanoparticulas lipidicas sólidas, para tratamento de neoplasias pulmonares, primárias ou resultantes da fixação de metástases de carcinomas extrapulmonares ou de doenças crónicas caracterizada por compreender pelo menos nanoparticulas lipidicas sólidas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11.
13. 13. Composição farmacêutica de nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por as neoplasias pulmonares compreenderem o adenocarcinoma, o tumor de grandes células, o carcinoma de células escamosas (epidermóide) e o tumor de pequenas células.
14. 14. Composição farmacêutica de nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por os carcinomas extrapulmonares compreendem o carcinoma da mama avançado, melanoma, carcinoma do ovário avançada.
15. 15. Composição farmacêutica de nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada por ser nebulizável por cavitação no seio de um liquido através de ultrassons, como uma mistura de goticulas liquidas dispersas em ar.
16. 16. Processo de nebulização de um agente terapeuticamente activo aos pulmões caracterizado por compreender a nebulização de nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com as reivindicações 6 a 11 ou de uma composição farmacêutica de nanoparticulas lipidicas sólidas de acordo com as reivindicações 12 a 15, por cavitação no seio de um liquido através de ultrassons, originando uma mistura de goticulas liquidas dispersas em ar. Lisboa, 27 de Julho de 2010. 3