PT103410A - Proteínas modificadas compreendendo um péptido/proteína bioactivo(a) ligado(a) a uma sequência de aminoácidos que contém um módulo humano de ligação a carbohidratos (cbm), e desenvolvimento de um sistema de administração de proteínas terapeuticamente - Google Patents

Abstract

FOI DESENVOLVIDA UMA ESTRATÉGIA PARA SIMULTANEAMENTE MELHORAR AS PROPRIEDADES DE BIOMATERIAIS À BASE DE AMIDO, PARA APLICAÇÕES BIOMÉDICAS, E A EFICIÊNCIA DE PROTEÍNAS TERAPÊUTICAS. ESTA NOVA ESTRATÉGIA, QUE É REVELADA NA PRESENTE INVENÇÃO, CONSISTE NA FUSÃO DE UM MÓDULO HUMANO DE LIGAÇÃO A CARBOHÍDRATOS (CBM) COM PÉPTIDOS BIOACTIVOS. O CBM HUMANO USADO NESTE TRABALHO TEM AFINIDADE POR AMIDO (SBM) . ESTE SBM FOI IDENTIFICADO COMO UM MÓDULO DA ENZIMA LAFORINA, UMA FOSFATASE, TENDO POR FUNÇÃO CONFERIR A ESTA ENZIMA AFINIDADE POR GLICOGÉNIO. CONFORME FOI DEMONSTRADO, O SBM POSSUI AFINIDADE TAMBÉM POR AMIDO. ESTE É UM POLISSACARÍDEO DE BAIXO CUSTO, DISPONÍVEL EM GRANDES QUANTIDADES E COM DIFERENTES PROPRIEDADES, QUE TEM CRESCENTEMENTE DESPERTADO INTERESSE PARA O DESENVOLVIMENTO DE APLICAÇÕES BIOMÉDICAS. A BIOCOMPATIBILIDADE, VERSATILIDADE E BIODEGRADABILIDADE, SÃO CARACTERÍSTICAS DO AMIDO RELEVANTES PARA O DESENVOLVIMENTO DE APLICAÇÕES COMO A LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE DROGAS E A ENGENHARIA DE TECIDOS.

Description

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DESCRIÇÃO

"PROTEÍNAS MODIFICADAS COMPREENDENDO UM PÉPTIDO/PROTEÍNA BIOACTIVO (A) LIGADO (A) A UMA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS QUE CONTÉM UM MÓDULO HUMANO DE LIGAÇÃO A CARBOHIDRATOS (CBM), E DESENVOLVIMENTO DE UM SISTEMA DE ADMINISTRAÇÃO DE PROTEÍNAS TERAPEUTICAMENTE ACTIVAS E RESPECTIVAS UTILIZAÇÕES PARA FINS BIOMÉDICOS"

Campo da Invenção

Esta invenção relaciona-se com proteínas quiméricas multifuncionais, e o método de as produzir. Estas proteínas incluem um domínio humano de ligação a hidratos de carbono (CBM), especificamente ao amido (SBM). Esta invenção relaciona-se também com o uso destas proteínas quiméricas para aplicações biomédicas, nomeadamente em engenharia de tecidos e libertação controlada de proteínas terapêuticas.

Antecedentes da Invenção

Os Domínios de Ligação a Carbohidratos (CBMs), são módulos funcionalmente independentes, frequentemente encontrados na natureza em proteínas associadas à degradação de biomassa. Estes módulos são definidos como sequências de aminoácidos, presentes em enzimas que actuam sobre carbohidratos, exibindo estrutura tridimensional e possuindo actividade de ligação a carbohidratos. Os primeiros CBMs a serem descobertos possuem afinidade por celulose: Domínios de Ligação a Celulose (CBDs). Entretanto, novos módulos, presentes em enzimas com actividade sobre carbohidratos, diferentes da celulose, têm vindo a ser encontrados. Os CBMs estão presentes também em organismos superiores. Inicialmente, a classificação dos CBMs foi efectuada com base na homologia da sequência de aminoácidos. Actualmente, a classificação das enzimas glicosilo hidrolases está na 2 origem das famílias de CBMs (actualmente 42), classificadas e descritas por Coutinho e Henrrissat (http://afmb.cnrs-mrs. f r/CAZY/index. html) . Dependendo do tipo de CBM e das características do substrato, a adsorção pode ser reversível ou irreversível. 0 potencial dos CBMs em várias áreas da biotecnologia tem sido demonstrado. Uma dessas aplicações, relevante para o presente trabalho, relaciona-se com a purificação de proteínas. Foi já efectuada, com sucesso, a expressão de proteínas fundidas com CBDs, retendo a sua função característica e actividade específica. Como estes estudos demonstraram, os CBDs podem ser usados como sondas com elevada afinidade por celulose, permitindo o isolamento de péptidos bioactivos. A fusão de domínios de ligação com o factor de células estaminais (SCF) permitiu a ligação desta proteína, por adsorção, a celulose cristalina, retendo o seu potencial de interacção com as células alvo (Doheny et al., 1999). Os autores deste estudo concluíram que o SCF-CBD ligado a celulose é mais efectiva do que o SCF solúvel, para apresentação às células alvo. Noutro estudo, demonstrou-se que a imobilização de células na superfície de celulose é favorecida pela presença de CBMs de C. fími recombinantes, exibindo a sequência RGD. Estes resultados suportam o conceito de que os CBMs possuem elevado potencial enquanto ferramentas para activar a superfície de biomateriais (Levy and Shoseyov, 2002).

Os biomateriais usados para engenharia de tecidos devem possuir a capacidade para induzir a regeneração de tecidos, e a sua funcionalidade. Até à data, as estruturas matriciais disponíveis não permitem a rápida e satisfatória regeneração de tecidos. Apesar da disponibilidade actual de factores de crescimento e de sistemas para libertação 3 controlada de proteínas, permanece a busca de sistemas que favoreçam a migração celular e crescimento em profundidade, através do uso de factores de adesão e crescimento. A engenharia de tecidos é um campo em rápido crescimento, dentro da engenharia biomédica. Requer a colaboração entre as áreas em rápido crescimento da biologia celular e molecular, as ciências dos materiais, as engenharias mecânica e química. A ligação de células a biomateriais, e a sua subsequente propagação superficial, é mediada pela matriz das glicoproteínas extracelulares (ECM). Estas contêm sequências que possuem a propriedade de favorecer a adesão celular. Estas sequências interagem com receptores da superfície das células, da família das integrinas. A matriz ideal na mimetização da ECM, deverá possuir todos os sinais necessários às células para crescer, diferenciar-se e interagir, simultaneamente constituindo um molde para a produção da estrutura pretendida, ao mesmo tempo sendo degradada à medida que é colonizada pelas células. A integração de moléculas bioactivas nesta matriz é uma questão central e do maior interesse (Hillery, 2001). O material presente na superfície das células controla e influencia aspectos da fisiologia celular, tais como a adesão, proliferação, activação, recrutamento, migração e diferenciação. A activação da superfície (interna e externa) da matriz usada na cultura de células, usando péptidos fortemente adsorvidos para evitar a sua rápida perda por difusão, deverá permitir uma mais rápida adesão celular e propagação. A matriz que suporta o crescimento celular poderá incorporar os factores de crescimento, ou ser implantada com uma outra estrutura com funções de libertação controlada de drogas. O tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD) é um sinal ubíquo, presente em muitas proteínas 4 responsáveis pela adesão celular (Hersel efc al., 2003). A imobilização de diferentes péptidos com propriedades adesivas, resulta numa resposta celular selectiva. Os CBMs proporcionam uma forma simples e eficiente de dirigir péptidos bioactivos para a superfície do biomaterial, dispensando o recurso a métodos químicos para o enxerto dos péptidos. De acordo com Wetzel (1999), estão em desenvolvimento mais de 100 proteínas recombinantes com actividade terapêutica. Exemplos de proteínas bioactivas que poderão ser recombinadas com CBM, inclui as interleuquinas e as Proteínas Morfogenéticas do Osso (BMP). As citoquinas são mensageiros moleculares que actuam localmente, transmitindo informação entre as células, com impacto ao nível da regulação do crescimento, divisão, diferenciação, inflamação e imunidade. In vivo, as citoquinas são rapidamente metabolizadas, pelo fígado ou pelos rins, ou após internalização por receptores. Esta rápida remoção limita o alcance e duração da sua acção. As interleuquinas promovem a sua acção fisiológica ligando-se a receptores específicos na superfície das células, o que siginifica que, à excepção de casos onde a sua internalização possa ser necessária, a imobilização de uma interleuquina na superfície de um biomaterial não deveria constituir um impedimento da sua acção. De facto, a rápida remoção das citoquinas da circulação é reconhecida como uma das razões para o sucesso limitado no desenvolvimento de aplicações terapêuticas de proteínas recombinantes (Asadullah efc ai., 2003). 0 desenvolvimento de moléculas de fusão CBM-citoquina, em conjugação com biomateriais à base amido, pode constituir uma forma de contornar esta dificuldade. O mesmo se aplica a proteínas da família das BMP, com elevado potencial na regeneração/remodelação de tecido ósseo. Estas proteínas estão envolvidas na regulação 5 do crescimento e função de osteoblastos, na formação de tecido ósseo, possuindo óbvias aplicações no tratamento de osteoporose, osteoartrite e fracturas. A administração de BMP em solução nem sempre induz a esperada eficácia na regeneração de osso, provavelmente devido à reduzida retenção da BMP. Em consequência, é necessário desenvolver uma forma de administração que proporcione a libertação gradual e controlada de BMP, de preferência por um período de tempo longo (Tanya, 1997). A libertação controlada de proteínas pode ser conseguido através da inclusão do material utilizado (nanopartícuias, hidrogel, etc), usando um CBM fundido com a proteína bioactiva. Os hidrogeis têm vindo a ser testados para a libertação de proteínas bioactivas, por exemplo em ensaios de estimulação de crescimento de tecido ósseo (Yamamoto efc al.r 2003) com resultados encorajadores: a libertação controlada de BMP-2 a partir de hidrogeis de gelatina, implantados subcutaneamente, revelou-se bem sucedida na indução de formação de osso, ao passo que a administração por injecção da proteína não foi eficaz. Nestes ensaios, mostrou-se que características como a porosidade do gel, o conteúdo em água, a carga da droga e do transportador, todos esses aspectos influenciam a cinética da libertação da proteína. Utilizando CBMs, o sistema é simplificado, na medida em que a proteína está retida na superfície do biomaterial, adsorvida através do CBM. Neste sistema, a libertação da proteína é controlada essencialmente através da degradação/erosão, e só parcialmente por difusão, mecanismo dependente da porosidade e tortuosidade do suporte. Este sistema pode ser muito interessante, pois frequentemente os materiais, por exemplo hidrogeis usados em engenharia de tecidos, possuem elevada porosidade e 6 interconectividade. Esta característica é essencial para que seja viável o crescimento celular intracelular.

Na patente US 5 340 731 (1994), Kilburn e colaboradores revelaram o conceito da utilização de CBDs para purificação de proteínas. Esta estratégia consiste na fusão da proteína de interesse com um domínio de ligação a celulose, unidos por uma sequência peptídica que inclui um local de corte de uma protease. 0 contacto da proteína de fusão com uma fase estacionária pouco dispendiosa, a celulose, permite assim uma imobilização e purificação rápidas. A proteína de interesse pode em seguida ser recolhida, usando uma protease. Os mesmos autores revelaram um método que permite a expansão in vitro de células que requerem factores de crescimento para a sua expansão (patente US 5,874,308). Esse método consiste na utilização de factores de crescimento conjugados a um CBM. Estes conjugados são imobilizados por ligação à matriz de polissacarídeo, através do CBM, e são adicionados ao meio de cultura. A produção de proteínas bioactivas recombinantes, fundidas com CBMs, foi demonstrada no trabalho de Doheny e colegas (1999). Concretamente, foi demonstrada a bioactividade de proteínas recombinantes como o CBD-SCF e o CBD-RGD. Nestes estudos foi usado o gene do CBD da Endoglucanase A (Cen A), da bactéria Cellulomonas fímí. A proteína de fusão CBD-RGD possui um peso molecular de 17 kDa (Wierzba, et al., 1995).

O uso de proteínas recombinantes CBD-RGD foi revelado na patente US 6 407 208 (Chen, 2003), com o objectivo de substituir proteínas extracelulares, de elevado custo, na formulação de meios de cultura para células animais. As proteínas da matriz extracelulares são usadas na formulação de meios de cultura, para promover a adesão celular. A 7 maioria das células animais possui a aptidão de se ligar a glicoproteinas como a fibronectina, numa interacção que favorece o crescimento, adesão e diferenciação. 0 soro é uma fonte destas glicoproteinas (Barnes and Silnutzer, 1983), mas possui elevado custo e é difícil de isolar, o que representa uma limitação e um custo elevado na cultura de células animais (Arathoon e Birch, 1986). A obtenção de fontes alternativas dos sinais presentes naquelas proteínas, poderia, além de reduzir os custos, permitir também reduzir riscos de infecção por micróbios e virus. Assim, existe uma necessidade premente de produzir factores de ligação recombinantes.

Se as sequências de aminoácidos activas forem imobilizadas, na superfície de materiais usados na cultura de células animais, a ligação das células será favorecida. Por exemplo, a sequência RGD aparece não apenas na fibronectina mas também noutras glicoproteinas da matriz extracelular. Se a sequência RGD, capaz de promover a adesão celular, for fundida com um CBD, e imobilizada numa matriz celulósica, deverá promover a ligação de células a essa matriz. Desta forma, será possível reduzir os custos de cultura de células, mas também a probabilidade de contaminação. Uma invenção revelada por Hsu (patente US 6 579 322), baseia-se no potencial de proteínas de fusão CBD-RGD para melhorar a biocompatibilidade de materiais concebidos para a produção de dispositivos biomédicos. De facto, foi demonstrado que a adesão de células endoteliais a vasos artificiais é promovida pela presença de péptidos CBD-RGD revestindo a superfície do material. Shoseyov e colegas revelaram, no documento de patente US 5 4 96 934, um CBD da bactéria Clostrídíum cellulovorans possuidor de elevada afinidade por celulose cristalina e quitina, bem como os métodos para 8 a sua clonagem e produção. Foram também revelados os métodos para a produção de proteínas de fusão do CBD com uma segunda proteína, tendo sido reivindicadas uma vasta gama de aplicações destes CBDs e respectivos produtos de fusão, tais como libertação controlada de drogas, separação por afinidade, e técnicas de diagnóstico.

Noutro documento (US 5 719 044), Shoseyov e colegas reivindicaram o uso de produtos de fusão de CBDs para aplicações tais como libertação controlada de drogas, separação por afinidade, e técnicas de diagnóstico. Esta patente relaciona-se com o uso de CBDs que se liga a celulose insolúvel, com elevada afinidade, com o objectivo de associar moléculas com actividade biológica a celulose. Em particular, é objectivo desta invenção produzir sistemas de libertação controlada de drogas, onde a droga está associada a um CBD, que conserva a capacidade de se ligar a celulose. A ligação do CBD a drogas pode ser efectuada usando compostos químicos tais como a ciclohexilcarbodiimida, que pode ser usada para formar ligações amida ou éster.

Uma patente europeia (EP1382681) relaciona-se também com o potencial de conjugados CBD-RGD para melhorar a eficiência de ligação de células. A aplicação em perspectiva neste trabalho é o desenvolvimento de CBDs recombinantes como substitutos de soro, para cultura de células animais, reduzindo os custos e riscos de contaminação, simultaneamente facilitando a purificação das proteínas expressas no meio de cultura. Todas as patentes, atrás descritas, se relacionam com péptidos não humanos possuidores de afinidade por carbohidratos. Ao contrário, a presente invenção é baseada na utilização de um CBM humano, 9 característica que poderá aumentar substancialmente o universo de aplicações destes domínios, nomeadamente através da fusão do CBM com proteínas bioactivas. Por outro lado, a maioria destas patentes relacionam-se com a utilização de CBDs, sendo no entanto o amido um material mais versátil, no contexto de aplicações biomédicas, do que a celulose.

Num documento recente (US 6,894,022), Hubbell e colegas revelaram o uso de sondas de afinidade para a reparação e regeneração de tecidos, e para a libertação controlada de fármacos. 0 método introduzido nesta patente consiste na ligação de heparina a uma matriz (ou gel, usado para regeneração de tecidos ou para libertação controlada de drogas); a heparina é então ligada, não covalentemente, a factores de crescimento. No caso dos factores de crescimento que não se ligam espontaneamente à heparina, pode ser criada uma proteína de fusão, incluindo sequências com afinidade pela heparina. O uso alternativo, sugerido neste trabalho, de um CBM humano com afinidade por amido, oferece diversas vantagens relativamente ao uso de heparina e respectivas sondas de afinidade, porque o amido é uma material disponível a baixo custo, com diferentes características (peso molecular, grau de ramificação), isento de riscos de contaminação, e a baixo custo. Além disso, pode ser incluído na formulação e preparação de nanopartícuias, hidrogeis, etc.

Descrição da Invenção

De acordo com o estado da arte, as proteínas de fusão CBM- RGD possuem potencial para promover a adesão celular. O objecto da presente invenção reside na utilização de factores de adesão recombinantes SBM-RGD, ou proteínas de 10 fusão de SBM com outros péptidos/proteinas bioactivas. Diversamente do que é proposto nas tecnologias já disponíveis, é neste trabalho proposta a utilização de um domínio humano como sonda de afinidade. Por se tratar de um domínio humano, com afinidade por materiais possuidores de amido na sua formulação, novos e importantes domínios de aplicação podem ser concebidos para proteínas quiméricas, compreendendo o SBM, nomeadamente na área da engenharia de tecidos e da libertação controlada de proteínas. Por se tratar de uma proteína humana, embora expresso num hospedeiro microbiano, não é provável que possua actividade imunogénica, o que representa uma considerável vantagem comparativamente com outros CBMs (fúngicos ou bacterianos) propostos noutros documentos de patente. Por outro lado, o amido é um material com grande potencial para aplicações biomédicas, devido à sua biocompatibilidade, reduzida ou nula toxicidade, e versatilidade de apresentação. Além disso, combinado com outros materiais, pode ser obtido na forma de hidrogeis, micropartícuias, nanopartículas, etc. Assim, o sistema aqui revelado oferece uma vasta gama de aplicações de grande potencial na área biomédica. O SBM pode ser combinado virtualmente com qualquer proteína biologicamente activa, e administrada de forma controlada, para desenvolver a sua acção terapêutica, usando uma formulação conveniente, à base de amido. Especificamente, as aplicações previstas incluem o cultivo de células humanas ex-vivo, antecedendo a sua implantação no corpo humano (engenharia de tecidos). Um gel contendo adsorvidos proteínas SBM-RGD pode ser implantado no corpo humano, para promoção da rápida adsorção e proliferação celular.

Outra vantagem relacionada com esta estratégia de preparação do biomaterial é a simplicidade associada à 11 preparação dos biomateriais com a proteína ligada. A ligação da proteína ao biomaterial é efectuada rapidamente, simplesmente misturando a proteína com o biomaterial. A adesão é um processo rápido e eficiente. A proteína pode assim ser retida por períodos mais dilatados, período esse que é controlado pela cinética de degradação do biomaterial. Assim, será possível conseguir reter actividade biológica no sistema durante mais tempo do que num sistema alternativo em que a proteína é gradualmente libertada por difusão.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Vector de expressão usado para transformar a estirpe de E. coli BL21 (DE3)

Figura 2: Análise de proteínas por SDS-PAGE: linha 1- fracção solúvel resultante da lise de E. coli transformada com o vector pET25b-CBM-RGD; linha 2- fracção solúvel resultante da lise de E. coli transformada com o vector pET25b; linha 3- Precipitado resultante da lise de E. colí transformada com o vector pET25b; linha 4- Pellet resultante da lise de E. coli transformada com o vector pET25b-CBM-RGD; MW- Peso molecular (KDa).

Figura 3: Purificação de proteínas por SDS-PAGE: linha 1-CBM-RGD purificado com o sistema HisTrap™; MW - pesos moleculares (KDa).

Descrição Detalhada da Invengão

Descreve-se um método para estimular a regeneração de tecidos ou a libertação controlada de drogas, em particular proteínas terapêuticas, usando matrizes à base de amido contendo proteínas bioactivas recombinadas com um SBM com 12 afinidade por amido. Este método apresenta diversas vantagens comparativamente com os sistemas disponíveis para esta finalidade: o contacto da proteína - ligada a um SBM -com a matriz de amido resulta na sua rápida adsorção, com elevada eficiência; a proteína imobilizada desta forma tem estabilidade acrescida, e a sua libertação é controlada pela cinética de erosão do biomaterial. A sequência de DNA que codifica o CBM foi obtida por PCR, usando o vector pET21a-laforina como molde. Outras sequências, que codificam péptidos bioactivos (RGD, BMP2), foram fundidas com o CBM por PCR e/ou clonagem, usando as enzimas de restrição adequadas. As sequências do CBM, CBM-RGD e CBM-BMP2 foram clonadas no vector de expressão pET 25b (+) (Novogen), que possui a sequência N-terminal pelB, responsável pela potencial expressão periplasmática e uma sonda opcional C-terminal HSV.Tag e His.Tag, que podem ser usadas para a deteção de proteínas e sua purificação. Os vectores pET25b-CBM, pET25b-CBM-RGD e pET25b-CBM-BMP2 (figura 1) foram usadas para transformar a estirpe de Escheríchia colí BL21 (DE3).

As estirpes recombinantes foram crescidas em meio Luria-Broth (LB), suplementado com 50 pg/ml de ampicilina, a 37 °C, com agitação, até a densidade óptica, Α^οοηπη ser aproximadamente igual a 0.6. A expressão foi induzida com 1 r#I de isopropil-l-tio^-D-galactopiranosideo (IPTG), seguida por incubação 16 h a 18 °C. NO final da fermentação, as células foram recolhidas por centrifugação (15 min, 5000 rpm, 4°C) e o precipitado foi ressuspenso em tampão fosfato (10 mM Na2HP04, 2 rrM KH2P04, 137 mM NaCl, 3 rrM KC1, pH 7.4), com 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF). A lise celular foi efectuada por sonicação. O 13

lisado foi centrifugado (30 min, 15000 rpm, 4 °C). A proteína recombinante presente na fracção solúvel (figura 2) foi purificada usando o sistema HisTrap™ (figura 3) (Amersham bioscience).

Referências:

Documentos de patente US 6,407,208 US 5,496,934 US 5,340,731 US 6,579,322 US 5,719,044 US 5,874,308 US 6,894,022 EP 1382681

Chen, Jun 2002 Shoseyov, Mar 1996 Kilburn, Ago 1994 Hsu, Jun 2003 Shoseyov, Fev 1998 Kilburn, Fev 1999 Hubbell, Mai 2005 Lin, Jan 2004

Outras referências

Arathoon, W. R., Birch, J. R. 1986. Science 232:1390-1395 Asadullah, K. et al., Pharmacol. rev., 55: 241-269, 2003 Barnes, D. W. , Silnutzer, J. 1983 J. Biol. Chem. 258: 12548-12552

Doheny et al., Bíochem. J., 1999, 339, 429-434 Hersel, U. et al,, Bíomaterials, 2003, 24, 4385-4415 Hillery, A.M. in "Drug delivery and targeting", ed. By Anya M. Hillery, Andrew W. Lloyd and James

Levy and Shoseyiov, Bíotechnology Advances, 2002, 20: 191-213

Tanya et al., in "Protein delivery: physical Systems", ed. by Lynda Sanders and R. Wyne Hendren, Pharmaceutical Bíotechnology, vol. 10, p. 139-162, Plenum Press, New York, 1997

Wang, J. et al., 2002. Journal of Biological Chemístry. 277 (4): 2377-2380. 14 14 H. -J, Warren

Wetzel, A., in "Biotechnology", vol5, ed. By Rehm,

Reed, G. , 1999

Wierzba, A., U. Reichl, R. F. B. Turnner, R. A. J. and D. G. Kilburn. 1995. Biotech.

Yamamoto efc al., Biomaterials, 2003, 4375-4383

Lisboa,

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Sistema para libertação controlada de proteínas caracterizado por compreender proteínas modificadas que possuem uma proteína terapêutica bioactiva ligada a um módulo humano de ligação a carbohidratos (CBM)com afinidade por amido (SBM), e materiais derivados do amido.

2. Sistema para libertação controlada de proteínas de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por o módulo com afinidade por amido (SBM) ser obtido do genoma humano.

3. Sistema para libertação controlada de proteínas de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por o módulo com afinidade pelo amido (SBM) ser o módulo N-terminal, compreendendo 116 aminoácidos, presente na enzima laforina humana.

4. Sistema para administração controlada de proteínas, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o material derivado do amido ser uma nanopartícula, uma micropartícula ou um hidrogel. Lisboa, 19 de Março de 2009.