PT101064A - PROTEINS AND PREPRO CHEMICALS, NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CODE THEM, AND PRODUCTION PROCESS OF A NEUROTROFIN - Google Patents
PROTEINS AND PREPRO CHEMICALS, NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CODE THEM, AND PRODUCTION PROCESS OF A NEUROTROFIN Download PDFInfo
- Publication number
- PT101064A PT101064A PT101064A PT10106492A PT101064A PT 101064 A PT101064 A PT 101064A PT 101064 A PT101064 A PT 101064A PT 10106492 A PT10106492 A PT 10106492A PT 101064 A PT101064 A PT 101064A
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- prepro
- neurotrophin
- chimeric
- peptide
- protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
74 586 6526-056-11874 586 6526-056-118
MEMÓRIA DESCRITIVA 1.INTRODUÇÃO O presente invento refere-se à construção e expressão em células hospedeiras eucariotas de novas proteínas prepro ou de novos péptidos prepro, quiméricos, que expressam factores neurotróficos bioactivos. O invento baseia-se, em parte substancial, na verificação de que as proteínas prepro ou os péptidos prepro, quiméricos, compreendendo a região prepro de um primeiro factor neurotrófico fundido com a proteína madura ou uma sua porção, de um segundo factor neurotrófico diferente, ãoffem processamento pós-tradução eficaz resultando num nível de expressão aumentado da proteína bioactiva do segundo factor neurotrófico.The present invention relates to the construction and expression in eukaryotic host cells of novel prepro proteins or novel chimeric prepro peptides expressing bioactive neurotrophic factors. The invention is based, in substantial part, on the finding that chimeric prepro proteins or prepro peptides comprising the prepro region of a first neurotrophic factor fused to the mature protein or a portion thereof of a second different neurotrophic factor, do not result in efficient post-translational processing resulting in an increased expression level of the second neurotrophic factor bioactive protein.
2.ANTECEDENTES DO INVENTO 2.1.FACTORES NEUROTRÓFICOS 1990, Science 0 desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso depende de proteínas conhecidas como factores neurotróficos. Um factor neurotrófico é uma citoquina, uma proteína que actua como um mensageiro e que comunica com outras células na coordenação e regulação corrente das funções biológicas. Os factores neurotróficos promovem a sobrevivência e/ou diferenciação de componentes do sistema nervoso. A morte generalizada das células neuronais acompanha o desenvolvimento normal dos sistemas nervoso central e periférico e, aparentemente, desempenha um papel crucial na regulação do número de neurónios que se projectam para um dado campo alvo. (Berg, D. K. 1982, Neuronal Developement 297--331). Estudos de ablação e transplante de tecidos alvo periféricos durante o desenvolvimento mostraram que a morte de células neuronais resulta da competição entre o neurónios por quantidades limitantes de factores de sobrevivência ("factores neurotróficos") produzidos nos seus campos de projecção. Factores neurotróficos importantes identificados até agora incluem o factor de crescimento do nervo (NGF; Levi-Montalcini e Angeletti, 1968, Phys. Rev. 48.:534); neurotrofina-3 (NT-3; Hohn et al. . 1990, Nature 344:339 ? Maisonpierre et al.. 74 586 6526-056-118 -2-BACKGROUND OF THE INVENTION 2.1. NEUROTROPHIC FACTORS 1990, Science The development and maintenance of the nervous system depends on proteins known as neurotrophic factors. A neurotrophic factor is a cytokine, a protein that acts as a messenger and communicates with other cells in the coordination and regulation of biological functions. Neurotrophic factors promote the survival and / or differentiation of components of the nervous system. The generalized death of neuronal cells accompanies the normal development of the central and peripheral nervous systems and apparently plays a crucial role in regulating the number of neurons projecting to a given target field. (Berg, D. K. 1982, Neuronal Development 297-331). Studies of ablation and transplantation of peripheral target tissues during development have shown that the death of neuronal cells results from competition between neurons for limiting amounts of survival factors (" neurotrophic factors ") produced in their fields of projection. Important neurotrophic factors identified so far include nerve growth factor (NGF; Levi-Montalcini and Angeletti, 1968, Phys Rev. 48: 534); (N-3, Hohn et al., 1990, Nature 344: 339, Maisonpierre et al., 74 586 6526-056-118-2-
247:1446), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; Barde et al. , 1982, EMBO J. 1.:549), neurotrofina-4 (NT-4; Hallbook et al.. 1991, Neuron 6.:845-858) e factor neurotróf ico ciliar (CNTF; Lin et al». 1979, Science 246:1023).247: 1446), brain-derived neurotrophic factor (BDNF; Barde et al., 1982, EMBO J. 1.:549), neurotrophin-4 (NT-4; Hallbook et al., 1991, Neuron 6: 845- 858) and ciliary neurotrophic factor (CNTF; Lin et al., 1979, Science 246: 1023).
As neurotrofinas são geralmente sintetizadas in vivo como proteínas precursoras "prepro". A região "prepro" refere-se ao terminal NH2 do precursor que é removido proteoliticamente durante a biossíntese da forma madura, biologicamente activa, da proteína. A região "pre" refere-se à sequência de sinal removida normalmente por processamento proteolítico durante a translòcáção através da membrana celular para originar a proteína "pro"; a região "pro" é então removida por processamento proteolítico para originar a forma madura (ver e.g. Darnell et al.. 1990, Molecular Cell Biology 2a Edição, Scientific American Books, pag. 650-657).Neurotrophins are generally synthesized in vivo as " prepro " precursor proteins. The " prepro " refers to the NH 2 terminus of the precursor which is proteolytically removed during biosynthesis of the mature, biologically active form of the protein. The region " pre " refers to the signal sequence normally removed by proteolytic processing during translation through the cell membrane to give the " pro "; the " pro " is then removed by proteolytic processing to give the mature form (see e.g. Darnell et al., 1990, Molecular Cell Biology 2nd Edition, Scientific American Books, page 650-657).
2.1.1. FACTOR DE CRESCIMENTO DO NERVO 0 factor de crescimento do nervo (NGF) é, de longe, a melhor caracterizada destas moléculas neurotróficas e verificou--se, in vitro e in vivo. ser essencial para a sobrevivência dos neurónios sensoriais simpáticos e derivados da cristã neuronal, durante o desenvolvimento precoce da galinha e da ratazana (Levi--Montalcini e Angeletti, 1963, Develop. Biol. 2! 653-659; Levi--Montalcini et al. . 1968, Physiol. Rev. 48.:524-569. Até há pouco tempo quase todos os estudos sobre o NGF tinham-se focado no seu papel no sistema nervoso periférico, mas, agora, parece que o NGF também influencia o desenvolvimento e manutenção de populações específicas de neurónios no sistema nervoso central (Thoenen et al. . 1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109:145-178; Whittemore e Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439-464). A abundância de proteína NGF na glândula submaxilar do ratinho permitiu a determinação da sequência de aminoácidos primária por química de proteínas relativamente convencional (Angeletti e Bradshaw, 1971, Proc. Natl. Acad. Sei. 68:2417--2420). O gene do NGF já foi clonado a partir de muitas espécies, incluindo o ratinho (Scott et al.. 1983, Nature, 302:538-540 , £. <u2.1.1. NERVE GROWTH FACTOR Nerve growth factor (NGF) is by far the best characterized of these neurotrophic molecules and was found, in vitro and in vivo. be essential for the survival of sympathetic sensory neurons and neuronal Christian derivatives, during the early development of chicken and rat (Levi-Montalcini and Angeletti, 1963, Develop Biol., 653-659; Levi-Montalcini et al. Until recently, almost all studies on NGF had focused on their role in the peripheral nervous system, but now it seems that NGF also influences development and maintenance of specific populations of neurons in the central nervous system (Thoenen et al., 1987, Rev. Physiol Biochem Pharmacol 109: 145-178, Whittemore and Seiger 1987, Brain Res. Rev. 12: 439-464) The abundance of NGF protein in the mouse submaxillary gland allowed the determination of the primary amino acid sequence by relatively conventional protein chemistry (Angeletti and Bradshaw, 1971, Proc Natl Acad Sci 68: 2417-2442) of NGF has already been cloned from many species, i including the mouse (Scott et al., 1983, Nature, 302: 538-540, <u
74 586 6526-056-118 -3-homem (Uilrich et al. . 1983, Nature, 303;821-825)f vaca e galinha (Meier et al. . 1986, EMBO J. 5.:1489-1493) e ratazana (Whittemore, et al.f 1988, J. Neurosci. Res., 20.: 402-410) usando técnicas convencionais de biologia molecular baseadas na disponibilidade da sequência da proteína do NGF de ratinho para conceber sondas oligonucleotídicas adequadas. 0 gene de NGF de ratinho abarca aproximadamente 45 kb, contendo vários exões 5' pequenos, resultando a junção ("splicing") alternada em quatro espécies distintas de ARNm (Serby, et al. . 1987, Mol. Cell. Biol. 7.:3057-3064). Dóis transcritos principais resultam em péptidos prepro de NGF "comprido·1 e "curto" (Edwards, et al.. 1986, Nature, 319:784-787: Serby, et al. . 1987, Mol. Cell. Biol., 7.:3057-3064). O precursor "curto" contém uma sequência de sinal convencional (região pré) no terminal NH2 que flanqueia a região pro. 0 precursor comprido contém uma "região pro" adicional no seu terminal NH2 (ver e.q. . Suter et al.. 1991, EMBO J. 10.:2395-2400, Figura 1). Até à data não foi elucidada qualquer distinção funcional entre o precursor prepro de NGF "comprido" e "curto". Contudo, o transcrito de ARNm mais curto é mais abundante na maior parte dos tecidos (Edwards et al.. 1986 J. Biol. Chem. 263:6810-6815). A forma biologicamente activa do NGF de ratinho é um complexo 7S, compreendendo um dímero de uma forma madura completamente processada de /3-NGF em conjunto com dois membros da família da calicreína das serina-proteases, a subunidade a e a subunidade )fdo NGF (Varon et al. . Biochemistry 7.: 1296-1303)? Mason et al.f 1983 , Nature, 303:300-307) . A tradução, processamento e secreção do precursor de NGF para formar uma forma-biologicamente activa do NGF está bem documentada. Darling, et al. (1983, Cold Spring Harbor Symp. Quan. Biol. 48:427-433) . com base na força da sequência relatada de ADNc que codifica o NGF de ratinho (scott, et al.. 1983, Nature 302:538-540) . utilizaram um sistema de tradução in vitro isento de células para identificarem intermediários chave na biossíntese do complexo 7S do NGF. A sequência de sinal do precursor prepro do NGF é removida através de processamento proteolítico para originar uma 74 586 6526-056-118 4(Meier, et al., 1986, EMBO J. 5: 1489-1493), and the presence of a protein in the cell. rat (Whittemore, et al., 1988, J. Neurosci. Res., 20: 402-410) using standard molecular biology techniques based on the availability of the mouse NGF protein sequence to design suitable oligonucleotide probes. The mouse NGF gene encompasses approximately 45 kb, containing several small 5 'exons, resulting in alternating (" splicing ") splitting in four distinct mRNA species (Serby, et al., 1987, Mol. Cell Biol. .: 3057-3064). The major transcripts result in prepro peptides of NGF " long " 1 " short " (Edwards, et al., 1986, Nature, 319: 784-787: Serby, et al., 1987, Mol. Cell Biol., 7: 3057-3064). The precursor " short " contains a conventional signal sequence (pre-region) at the NH2 terminus flanking the pro region. The long precursor contains a " pro region " additional at its NH 2 terminus (see, e.g., Suter et al., 1991, EMBO J. 10: 2395-2400, Figure 1). To date no functional distinction has been elucidated between the prepro precursor of NGF " long " and " short ". However, the shorter mRNA transcript is more abundant in most tissues (Edwards et al., 1986 J. Biol. Chem. 263: 6810-6815). The biologically active form of the mouse NGF is a 7S complex, comprising a fully processed mature form dimer of β-NGF together with two members of the kallikrein family of the serine proteases, subunit a and subunit) of NGF (Varon et al., Biochemistry 7: 1296-1303). Mason et al., 1983, Nature, 303: 300-307). Translation, processing and secretion of the NGF precursor to form a biologically active form of NGF is well documented. Darling, et al. (1983, Cold Spring Harbor Symp., Quot; Biol., 48: 427-433). based on the strength of the reported sequence of cDNA encoding mouse NGF (scott, et al., 1983, Nature 302: 538-540). used an in vitro cell free translation system to identify key intermediates in the biosynthesis of the NGF 7S complex. The signal sequence of the NGF prepro precursor is removed by proteolytic processing to give a NGF precursor signal sequence.
espécie pro-NGF de aproximadamente 31 kD. A região pro do intermediário pro-NGF contém um par de resíduos arginina que se sabe serem sítios de processamento endoproteolítico. O processamento proteolítico em qualquer um destes resíduos resulta num espécie intermediária principal (21 kD) e secundária (18/5 kD) adicionais. A forma madura do NGF pode ser derivada proteoliticamente a partir de qualquer uma das espécies intermediárias acima mencionadas. Num ponto qualquer da biossíntese da forma madura do NGF, liberta-se proteoliticamente um dipéptido do terminal COOH (arg-gly).pro-NGF species of approximately 31 kD. The pro-NGF intermediate pro region contains a pair of arginine residues known to be endoproteolytic processing sites. Proteolytic processing in any of these residues results in a major intermediate (21 kD) and secondary (18/5 kD) intermediate species. The mature form of NGF can be derived proteolytically from any of the aforementioned intermediary species. At any point in the biosynthesis of the mature form of NGF, a COOH-terminal dipeptide (arg-gly) is proteolytically released.
Mostrou-se in vivo que a subunidade^”"cliva proteoliticamente o precursor pro-NGF na forma madura do NGF (Edwards, et al. . 1988, J. Biol. Chem. 263:6810-6815). Tentativas para mimetizarem 0 processo in vitro não tiveram sucesso, resultando em processamento infiel do precursor pro-NGF, presumivelmente devido ao dobramento aberrante do produto de tradução in vitro. Silen e Agard (1989, Nature 341:462-464) demonstraram que a região pro pode facilitar a dobragem adequada do precursor da protease a--lítica. Consequentemente, a região pro do precursor de NGF pode, também, ser necessária para a dobragem adequada antes do processamento endoproteolítico no forma madura e associação no complexo 7S de NGF biologicamente activa. Evidência para esta hipótese está documentada em Suter et al. (1991, EMBO J. 10.:2395--2400), que atribuíram funções a dois dos domínios parcialmente conservados dentro da região pro do NGF. Mostrou-se que o domínio 1 era essencial para a expressão do NGF em células COS. Adicionalmente, verificou-se que o Domínio II, localizado na região pro do NGF próxima da região de codificação madura, estava envolvido no processamento proteolítico.It has been shown in vivo that the subunit proteolytically cleaves the pro-NGF precursor in the mature form of NGF (Edwards, et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 6810-6815). Attempts to mimic the in vitro process were unsuccessful, resulting in unprocessed processing of the pro-NGF precursor, presumably due to the aberrant folding of the in vitro translation product. Silen and Agard (1989, Nature 341: 462-464) have demonstrated that the pro region may facilitate adequate folding of the lytic protease precursor. Accordingly, the NGF precursor pro region may also be required for proper folding prior to endoproteolytic processing in the mature form and association in the 7S biologically active NGF complex. Evidence for this hypothesis is documented in Suter et al. (1991, EMBO J. 10: 2395-2400), which assigned functions to two of the partially conserved domains within the NGF pro region. Domain 1 was shown to be essential for the expression of NGF in COS cells. In addition, Domain II, located in the pro region of NGF near the mature coding region, was found to be involved in proteolytic processing.
Mostrou-se recentemente que o processamento proteolítico do pro-NGF, in vivo. é controlado pelo produto do gene fur humano, uma endoprotease associada à membrana que partilha homologia estrutural com o gene KEX2, que codifica uma endoprotease de levedura (Bresnahan, et al.. 1990, J. Cell Biol. 111:2851-2859).Recently, proteolytic processing of pro-NGF has been shown in vivo. is controlled by the human fur gene product, a membrane-associated endoprotease that shares structural homology with the KEX2 gene, which encodes a yeast endoprotease (Bresnahan, et al., 1990, J. Cell Biol., 111: 2851-2859).
Consequentemente, a iniciação da biossíntese da forma activaAccordingly, the initiation of the biosynthesis of the active form
74 586 6526-056-118 -5-do NGF de ratinho envolve a transcrição do gene de NGF e a possível junção alternativa do produto de transcrição para gerar ARNm capazes de tradução do precursor prepro comprido ou curto de NGF. O precursor prepro do NGF comprido ou curto é subsequentemente submetido a uma série de acontecimentos de processamento endoproteolítico, possivelmente induzido por dobragem adequada do precursor através das características estruturais da região pro, resultando na forma madura do NGF.Mouse NGF involves transcription of the NGF gene and possible alternative junction of the transcription product to generate mRNAs capable of translation of the long or short prepro precursor of NGF. The prepro precursor of the long or short NGF is subsequently subjected to a series of endoproteolytic processing events, possibly induced by proper folding of the precursor through the structural characteristics of the pro region, resulting in the mature form of NGF.
2.1.2. FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DO CÉREBRO2.1.2. NEUROTROPHIC FACTOR DERIVED FROM THE BRAIN
Usando cérebro de porco como material de partida, Barde et al. (1982, EMBO J. 1.:549-553), relataram um factor, agora denominado factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), que parecia promover a sobrevivência dos neurónios do gânglio da raiz dorsal de embriões E10/E11 de pinto. Verificou-se que a actividade neurotrófica residia numa proteína altamente básica (ponto isoeléctrico, pi 10,1) que migrava durante a electroforese em gel com dodecilsulfato de sódio (SDS) como uma banda única de 12,3 kD. Referiu-se que a natureza altamente básica e o tamanho molecular do BDNF eram muito semelhantes aos do monómero de NGF. A clonagem do gene do BDNF foi primeiro realizada como se descreve na no Pedido de Patente U.S., co-pendente, Número de Série 07/400 591, apresentado em 30 de Agosto de 1989, que é aqui incorporada para referência na sua totalidade (ver também a Publicação Internacional PCT Na WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991). Clonaram-se ADNc e/ou genes de BDNF genómico, completos a partir de uma variedade de espécies, incluindo o Homem, porco, ratazana e ratinho e foram determinadas as sequências destes genes. A expressão de BDNF recombinante foi conseguida em células COS. A primeira demonstração de especificidade neuronal do BDNF diferente da do NGF consistiu na demonstração in vitro de que o BDNF purificado suporta a sobrevivência de 40-50% dos neurónios sensoriais dissociados do gânglio nodoso derivado do placodo neural do embrião de pinto em E6, E9 ou E12 (Lindsay et al.. 1985 74 586Using pig brain as a starting material, Barde et al. (1982, EMBO J., 1: 495-553) reported a factor, now called brain derived neurotrophic factor (BDNF), which appeared to promote the survival of dorsal root ganglion neurons of chick E10 / E11 embryos. The neurotrophic activity was found to reside in a highly basic protein (isoelectric point, 10.1) migrating during sodium dodecylsulfate (SDS) gel electrophoresis as a single band of 12.3 kD. It was reported that the highly basic nature and molecular size of BDNF were very similar to those of the NGF monomer. Cloning of the BDNF gene was first performed as described in co-pending U.S. Patent Application Serial No. 07 / 400,591, filed Aug. 30, 1989, which is hereby incorporated by reference in its entirety (see also PCT International Publication No. WO 91/03568, published March 21, 1991). Genomic BDNF cDNAs and / or genes were cloned complete from a variety of species, including man, pig, rat and mouse, and the sequences of these genes were determined. Recombinant BDNF expression was achieved in COS cells. The first demonstration of neuronal specificity of BDNF different from that of NGF consisted of the in vitro demonstration that purified BDNF supports the 40-50% survival of cleaved nodes of the nodal ganglion derived from the chick embryo neural placent at E6, E9 or E12 (Lindsay et al .. 1985 74 586
/·' .^.y-çr fv 6526-056-118 -6- J. Cell Sei. Supp. 3.:115-129). O NGF não tinha qualquer efeito aparente sobre estes neurónios por si próprio ou em conjunto com o BDNF. Mostrou-se, mais tarde, em estudos de culturas de explantes que o BDNF parecia suportar a sobrevivência e o crescimento para o exterior de neurites ("neurite outgrowth") a partir de outros gânglios sensoriais derivados de placodo neural, incluindo os gânglios petrosal, geniculado e venterolateral trigeminal (Davies et al.. 1986, J. Neurosci. 6: 1897-1904), nenhum dos quais se tinha considerado sensível ao NGF. Para além dos seus efeitos em neurónios de gânglios periféricos cultivados, verificou-se que o BDNF estimulava a sobrevivência e a diferenciação neuronal de células cultivadas da cristã neuronal de codorniz (Kalcheim e Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41: 79-86)./ RTI > < / RTI > 6526-056-118 -6- J. Cell Sci. Supp. 3: 115-129). NGF had no apparent effect on these neurons by itself or in conjunction with BDNF. It has later been shown in explant culture studies that BDNF appeared to support the survival and outward growth of neurite (" neuritis outgrowth ") from other sensory ganglia derived from neural placodes, including petrosal ganglia , geniculate and trigeminal venterolateral (Davies et al., 1986, J. Neurosci. 6: 1897-1904), none of which were considered to be sensitive to NGF. In addition to their effects on cultured peripheral ganglia neurons, BDNF was found to stimulate the survival and neuronal differentiation of cultured cells of quail neuronal Christian (Kalcheim and Gendreau, 1988, Develop.Research 41: 79-86 ).
Dois estudos recentes com BDNF (Kalcheim et al. . 1987, EMBO J. 6.: 2871-2873; Hofer e Barde, 1988, Nature 331:261-262 Ϊ indicaram, contudo um papel fisiológico do BDNF no desenvolvimento do SNP em aves. Para além do seu efeito nos neurónios sensorais periféricos com origem na cristã neuronal e no placodo neuronal, verificou-se que o BDNF suporta a sobrevivência dos neurónios do SNC em desenvolvimento; Johnson et al. (1986, J. Neurosci. 6.:3031-3938) apresentaram dados indicando que o BDNF suporta a sobrevivência de células do gânglio retinal cultivadas a partir de embriões de ratazana E17.Two recent BDNF studies (Kalcheim et al., 1987, EMBO J. 6: 2871-2873; Hofer and Barde, 1988, Nature 331: 261-262) have, however, indicated a physiological role of BDNF in the development of SNP in birds In addition to its effect on peripheral sensory neurons originating from neuronal Christian and neuronal placode, BDNF has been found to support the survival of developing CNS neurons: Johnson et al (1986, J. Neurosci. 3031-3938) showed data indicating that BDNF supports the survival of retinal ganglion cells cultured from E17 rat embryos.
Para além dos seus efeitos na sobrevivência dos neurónios em desenvolvimento em cultura, o BDNF mostrou ter efeitos em neurónios cultivados do sistema nervoso periférico e central de adultos. A análise da estrutura primária prevista do BDNF maduro revelou uma semelhança surpreendente com o NGF; com apenas três hiatos introduzidos nas sequências do NGF para optimizar o emparelhamento, são comuns aos vários NGF 51 identidades (da cobra ao Homem) e ao BDNF. É importante verificar que estas identidades incluem seis resíduos cisteína.In addition to its effects on the survival of developing neurons in culture, BDNF has been shown to have effects on cultured neurons of the peripheral and central nervous system of adults. Analysis of the predicted primary structure of mature BDNF revealed a striking similarity to NGF; with only three gaps introduced into the NGF sequences to optimize pairing, are common to the various NGF 51 identities (from Snake to Man) and BDNF. It is important to note that these identities include six cysteine residues.
74 586 6526-056-118 -7- 2.1.3. NEUROTROFINA-374 586 6526-056-118 -7- 2.1.3. NEUROTROFIN-3
Encontrou-se outro membro da família da neurotrofina, designado neurotrofina-3, e o gene da NT-3 foi clonado a partir do ratinho, ratazana e humano (ver Pedido de Patente U.S. N® de Série 07/490 004, apresentado em 7 de Março, 1990, incorporado aqui para referência na sua totalidade? ver também Publicação Internacional de PCT Na WO 91/03569, publicada em 21 de Março, 1991). Verificou-se que a estrutura global da proteína NT-3 madura de ratinho, consistindo em 119 aminoácidos com um pi calculado de cerca de 9,5, se assemelhava à estabelecida para o NGF e para o BDNF; uma sequência de sinal putativa de 18 aminoácidos (mostrando 5 e 9 identidades de aminoácidos com o BDNF e o NGF, respectivamente) parece ser seguida por uma sequência pro de 121 aminoácidos (como comparado com uma sequência pro de 103 aminoácidos no ratinho e uma sequência pro de 112 aminoácidos no BDNF de ratinho). Uma comparação entre o NGF, BDNF e NT-3 maduros de ratinho revelou 54 identidades de aminoácidos. Todos os 6 resíduos de cisteína, que se sabe no NGF e BDNF estarem envolvidos na formação de pontes dissulfureto (Leibrock et al.. 1989, Nature 341:149-152: Angeletti, 1973, Biochem. 1^:100-115), estão entre os resíduos conservados. De modo semelhante a NT-3 madura de ratazana parece partilhar uma homologia de aminoácidos de 57% com o NGF de ratazana e 58% de homologia de aminoácidos como o BDNF de ratazana; 57 dos 120 resíduos de aminoácido (48%) parecem ser partilhados por todas as três proteínas. De novo, se verificou que os seis resíduos de cisteína do NGF e BDNF de ratazana eram absolutamente conservados na NT-3 de ratazana e as regiões de maior homologia entre as três proteínas parecem agrupar-se em torno destes resíduos de cisteína.Another member of the neurotrophin family, designated neurotrophin-3, was found, and the NT-3 gene was cloned from the mouse, rat and human (see U.S. Application Serial No. 07 / 490,004, filed 7 March 1990, incorporated herein by reference in its entirety, see also International PCT Publication WO 91/03569, published March 21, 1991). The overall structure of mature mouse NT-3 protein, consisting of 119 amino acids with an estimated pi of about 9.5, was found to be similar to that established for NGF and BDNF; a putative 18 amino acid signal sequence (showing 5 and 9 amino acid identities with BDNF and NGF, respectively) appears to be followed by a pro sequence of 121 amino acids (as compared to a pro sequence of 103 amino acids in the mouse and a sequence pro ratio of 112 amino acids in mouse BDNF). A comparison of NGF, BDNF and mature mouse NT-3 revealed 54 amino acid identities. All 6 cysteine residues, which are known in NGF and BDNF are involved in the formation of disulfide bridges (Leibrock et al., 1989, Nature 341: 149-152: Angeletti, 1973, Biochem. 1: 100-115). are among the conserved residues. Similarly, rat mature NT-3 appears to share a 57% amino acid homology with rat NGF and 58% amino acid homology such as rat BDNF; 57 of the 120 amino acid residues (48%) appear to be shared by all three proteins. Again, the six cysteine residues of rat NGF and BDNF were found to be absolutely conserved in rat NT-3 and regions of higher homology among the three proteins appear to cluster around these cysteine residues.
Para além da homologia entre a NT-3, NGF e BDNF dentro de uma espécie, foi observado um elevado grau de conservação na sequência de ácidos nucleicos entre a NT-3 de ratazana e humana dentro da região que codifica o polipéptido maduro (119 aminoácidos). As sequências de aminoácidos deduzidas da NT-3 madura de ratazana e humana (bem como da NT-3 de ratinho) parecem 74 586 6526-056-118 -8-In addition to the homology between NT-3, NGF and BDNF within a species, a high degree of conservation in the nucleic acid sequence between rat and human NT-3 was observed within the region encoding the mature polypeptide (119 amino acids ). The deduced amino acid sequences of mature NT-3 from rat and human (as well as from mouse NT-3)
ser absolutamente idênticas, o que relembra o elevado grau de conservação do BDNF, que mostra identidade completa com a sequência de aminoácidos do polipéptido maduro entre a ratazana, ratinho, humano e porco. Por contraste, as sequências de aminoácidos do NGF maduro de humano e de roedor (ratinho ou ratazana) diferem em aproximadamente 10%.be identical, which mirrors the high degree of BDNF conservation, which shows complete identity to the amino acid sequence of the mature polypeptide between rat, mouse, human and pig. In contrast, the amino acid sequences of mature human and rodent NGF (mouse or rat) differ by approximately 10%.
Estudos da activdade neurotrófica da NT-3 indicaram que a NT-3 é capaz de promover a sobrevivência e o crescimento para o exterior de neurites de neurónios do gânglio da raiz dorsal, dissociados, em cultura. Além disso observou-se que a NT-3 promovia o crescimento para o exterior de neurites a partir de explantes do gânglio nodoso e do gânglio simpático, ao passo que o BDNF promovia o crescimento para o exterior a partir do gânglio nodoso mas não do gânglio simpático e o NGF promovia o crescimento para o exterior a partir de explantes do gânglio simpático mas não a partir de explantes do gânglio nodoso. Consequentemente, parece que a NT-3 tem uma especificidade de acção mais lata do que o BDNF ou NGF. 2.1.4. NEUROTROFINA-4 A neurotrofina-4 é um novo membro da família do NGF que foi recentemente clonada e isolada (hallbook et al.. 1991, Neuron 6.:845-858). Obtiveram-se fragmentos de PCR correspondendo ao gene de NT-4 de Xenopus e víbora e isolou-se subsequentemente um clone genómico de Xenopus. A análise da sequência nucleotídica deste clone revelou uma estrutura de leitura aberta para uma proteína de 236 aminoácidos, com várias características estruturais semelhantes às do NGF, BDNF e NT-3. Estas características incluem uma sequência de sinal putativa, amino terminal, e um sítio potencial de N-glicosação próximo de um sítio de clivagem proteolítica. Tal como é verdade para o NGF, BDNF e NT-3, toda a proteína prepro-NT-4 de Xenopus é codificada por um único exão.Studies of the neurotrophic activity of NT-3 have indicated that NT-3 is capable of promoting the survival and outward growth of neurites of dissociated dorsal root ganglion neurons in culture. Furthermore, it was observed that NT-3 promoted neurite outgrowth growth from nodal ganglion and sympathetic ganglion explants, whereas BDNF promoted outward growth from the nodose but not from the ganglion ganglion and the NGF promoted growth abroad from explants of the sympathetic ganglion but not from explants of the ganglia nodosa. Accordingly, it appears that NT-3 has a broader action specificity than either BDNF or NGF. 2.1.4. Neurotrophin-4 is a new member of the NGF family that has recently been cloned and isolated (Hallbook et al., 1991, Neuron 6: 845-858). PCR fragments corresponding to the Xenopus NT-4 and viper gene were obtained and a Xenopus genomic clone was subsequently isolated. Analysis of the nucleotide sequence of this clone revealed an open reading frame for a 236 amino acid protein, with various structural characteristics similar to those of NGF, BDNF and NT-3. These features include a putative, amino terminal signal sequence, and a potential N-glycosation site near a proteolytic cleavage site. As is true for NGF, BDNF and NT-3, the entire Xenopus prepro-NT-4 protein is encoded by a single exon.
2.2. PRODUÇÃO DE NEUROTROFINAS2.2. PRODUCTION OF NEUROTHROPHINS
Foram utilizados vários vectores de expressão e hospedeirosVarious expression vectors and hosts were used
áii» y*’ai and
74 586 6526-056-118 -9-em tentativas para produzir neurotrofinas recombinantes.Attempts to produce recombinant neurotrophins.
Todos os que usaram sistemas de expressão de células animais (células de rim de mamífero), Leibrock et al. [Nature 341;149 (1989)] relataram a expressão de BDNF activo de porco, e Rosenthal et al. [Neuron 4.:767 (1990)], Maisonpierre et al. [Science 247:1446 (1990)] e Hohn et al. [Nature 344:339 (1990)] relataram separadamente a expressão de NT-3 biologicamente activa de várias espécies. Além disso, Chan et al. [Publicação EP Na 370171, publicada em Maio de 1990] relatou a expressão de BDNF humano, maduro, biologicamente activo, a partir de células de insecto através de um sistema de expressão de baculovírus.All who used animal cell expression systems (mammalian kidney cells), Leibrock et al. [Nature 341; 149 (1989)] reported the expression of active porcine BDNF, and Rosenthal et al. [Neuron 4: 767 (1990)], Maisonpierre et al. [Science 247: 1446 (1990)] and Hohn et al. [Nature 344: 339 (1990)] reported separately the biologically active NT-3 expression of several species. In addition, Chan et al. [EP Publication No. 370171, published May 1990] reported the expression of mature, biologically active human BDNF from insect cells through a baculovirus expression system.
Em relação à produção microbiana de neurotrofina, Iwai et al. [Chem. Pharm. Buli. 34.:4727 (1986)] relataram a expressão de "genes" sintéticos para o NH2 humano e a sua fusão em E. Coli. 0 produto foi apenas caracterizado pela massa molecular, após tratamento com um agente redutor e não existia qualquer informação em relação à presença de actividade biológica.In relation to microbial neurotrophin production, Iwai et al. [Chem. Pharm. Bull. 34: 4727 (1986)] reported the expression " genes " synthetic methods for human NH2 and their fusion in E. coli. The product was only characterized by the molecular mass after treatment with a reducing agent and there was no information regarding the presence of biological activity.
Dicou et al.. fJ. Neuroscience Res. 22.:13 (1989)] relataram a expressão separada de fusões de NGF de ratinho e hNGF em E. Coli. Dicou et al. (1989, J. Neurosci. Res. 22.:13-19) fundiram a sequência de ADN completa de factor de crescimento do nervo prepro de ratinho ao terminal carboxilo do gene da beta-galactosidase de Escherichia coli e também fundiram um fragmento de ADN genómico correspondendo aos codões 11 a 106 do gene do factor de crescimento de nervo humano ao quinto codão do terminal amino da beta-galactosidades. Ambos os vectores bacterianos estavam associados com a expressão de grandes quantidades de proteínas quiméricas. Embora após a lise das células bacterianas, a maior parte do factor de crescimento do nervo prepro quimérico de ratinho parecesse ser insolúvel, a maioria do factor de crescimento do nervo beta, quimérico humano parecia existir no sobrenadante. A actividade neurotrófica não foi referida.Dicou et al. Neuroscience Res. 22:13 (1989)] reported the separate expression of fusions of mouse NGF and hNGF in E. coli. Dicou et al. (1989, J. Neurosci. Res. 22: 13-19) fused the entire mouse prepro nerve growth factor DNA sequence to the carboxyl terminus of the beta-galactosidase gene of Escherichia coli and also fused a DNA fragment genomic DNA corresponding to codons 11 to 106 of the human nerve growth factor gene to the fifth amino terminal codon of beta-galactosides. Both bacterial vectors were associated with expression of large amounts of chimeric proteins. Although after lysis of the bacterial cells, most of the mouse chimeric prepro nerve growth factor appeared to be insoluble, most of the human chimeric beta nerve growth factor appeared to exist in the supernatant. Neurotrophic activity was not reported.
Finalmente, Hu et al. [Gene 70:57 (1988); e Abstract 343.16 da 20th Ann. Meeting of the Soc. for Neuroscience (1990] relataram a expressão de NGF de ratinho em E. Coli. 74 586 6526-056-118 -10-Finally, Hu et al. [Gene 70: 57 (1988); and Abstract 343.16 of 20th Ann. Meeting of the Soc. For Neuroscience (1990) reported the expression of mouse NGF in E. coli. 74 586 6526-056-118 -10-
3. SUMÁRIO DO INVENTOSUMMARY OF THE INVENTION
0 presente invento refere-se a novas proteínas prepro ou péptidos prepro quiméricos compreendendo factores neurotróficos bioactivos e ao uso destes precursores e das suas sequências de ácido nucleico para produzir proteínas ou péptidos que têm uma ou mais actividades biológicas de uma neurotrofina. As moléculas prepro quiméricas proporcionadas pelo presente invento contêm uma região prepro heteróloga fundida com uma sequência de neurotrofina madura ou uma sua porção ou derivado biologicamente activo. As sequências de neurotrofina madura que podem ser usadas de acordo com o presente invento são as da família NGF/BDNF de moléculas homólogas incluindo mas não se limitando a NGF, BDNF, NT-3 e NT-4. De modo semelhante, as regiões prepro podem ser derivadas daquelas moléculas de neurotrofina da família NGF/BDNF incluindo mas não se limitando a NGF, BDNF, NT-3 e NT-4. 0 invento tem por base em parte substancial, a verificação de que as proteínas prepro ou péptidos prepro quiméricos, compreendendo a região prepro do factor de crescimento do nervo, fundida com a porção madura do factor neurotrófico derivado de cérebro (NGF/BDNF prepro são processadas mais eficazmente por uma célula hospedeira eucariota do que o factor neurotrófico derivado de cérebro prepro homólogo (BDNF prepro). Baseia-se ainda na verificação de que células hospedeiras eucariotas, transfectadas e amplificadas estavelmente, que expressam NGF/BDNF prepro quimérico segregam apenas a forma madura do BDNF para os meios. De acordo com o presente invento, podem ser utilizadas as regiões "comprida" ou "curta" do NGF na construção de genes neurotróficos quiméricos. 0 invento também se baseia na verificação de que proteínas prepro ou péptidos prepro, quiméricos, compreendendo a região prepro de NT-3 fundida com a região madura de codificação de factor neurotrófico derivado de cérebro (NT-3/BDNF prepro) são mais eficientemente processadas do que o factor neurotrófico derivado de cérebro prepro, homólogo, (BDNF prepro). Baseia-se ainda na verificação de que células hospedeiras eucariotas, estavelmente transfectadas e amplificadas, que expressam —11— 74 586 6526-056-118 ^ ito (j> NT-3/BDNF quimérico segregam apenas a forma madura do BDNF para os meios. O presente invento proporciona ácidos nucleicos codificando proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos, e processos para a expressão destas proteínas e péptidos neurotróficos, quiméricos, através da utilização desses ácidos nucleicos.The present invention relates to novel chimeric prepro proteins or prepro peptides comprising bioactive neurotrophic factors and the use of these precursors and their nucleic acid sequences to produce proteins or peptides having one or more biological activities of a neurotrophin. The chimeric prepro molecules provided by the present invention contain a heterologous prepro region fused to a mature neurotrophin sequence or a biologically active moiety or derivative thereof. The mature neurotrophin sequences that may be used in accordance with the present invention are those of the NGF / BDNF family of homologous molecules including but not limited to NGF, BDNF, NT-3 and NT-4. Similarly, the prepro regions may be derived from those neurotrophin molecules of the NGF / BDNF family including but not limited to NGF, BDNF, NT-3 and NT-4. The invention is based in substantial part upon the finding that chimeric prepro proteins or prepro peptides, comprising the prepro region of nerve growth factor, fused to the mature portion of brain derived neurotrophic factor (NGF / BDNF prepro) are processed more efficiently by a eukaryotic host cell than the prepro-homologous brain-derived neurotrophic factor (BDNF prepro). It is further based on the finding that stably transfected, eukaryotic and stably amplified host cells expressing chimeric prepro NGF / BDNF secrete only the form The invention also is based on the finding that the prepro proteins or peptides of the present invention may be used in the manufacture of the NGF and / or short regions of the NGF in the construction of chimeric neurotrophic genes. prepro, chimeric, comprising the prepro region of NT-3 fused to the mature coding region the brain-derived neurotrophic factor (NT-3 / prepro BDNF) are more efficiently processed than the derived neurotrophic factor prepro brain counterpart (prepro BDNF). It is further based on the finding that stably transfected and amplified eukaryotic host cells expressing chimeric NT-3 / BDNF express only the mature form of BDNF for the media The present invention provides nucleic acids encoding chimeric neurotrophic prepro proteins or prepro peptides and methods for the expression of these chimeric neurotrophic proteins and peptides through the use of such nucleic acids.
4. DESCRICÃO DAS FIGURAS4. DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1. Electroforese em gel de poliacrilamida de BDNF, NGF recombinantes e de formas precursoras quiméricas. Os sobrenadantes de células CHO-DG44, marcadas metabolicamente, transfectadas estavelmente com várias construções foram resolvidos por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS e visualizadas por auto-radiografia. Faixa 1: células CHO-DG44 de tipo selvagem, de controlo. Foram usadas as seguintes construções: vector de expressão pCDM8 contendo o gene do NGF humano (faixa 2); construção de BDNF prepro curta (faixa 3); construção quimérica de NGF/BDNF prepro comprida (faixa 4). Faixa 5: marcadores de massa molecular.Figure 1. Polyacrylamide gel electrophoresis of BDNF, recombinant NGF and chimeric precursor forms. Supernatants of metabolically labeled CHO-DG44 cells stably transfected with various constructs were resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and visualized by autoradiography. Lane 1: wild type, control CHO-DG44 cells. The following constructs were used: pCDM8 expression vector containing the human NGF gene (lane 2); short prepro BDNF construction (lane 3); chimeric construct of long prepro NGF / BDNF (lane 4). Range 5: molecular mass markers.
Figura 2. Bioactividade do BDNF recombinante. Ensaiaram-se sobrenadantes em bruto de linhas celulares CHO transfectadas com gânglios da raiz dorsal de pinto embrionário (E8) e foi registado o crescimento para o exterior de neurites. Diamantes a cheio: linha celular DGC-N/B-2.5-#23 (contendo a construção quimérica comprida de NGF/BDNF prepro). Quadrados a ponteado: linha celular DGZ1000-B-3-2.5 (contendo a construção curta de BDNF prepro).Figure 2. Bioactivity of recombinant BDNF. Crude supernatants of CHO cell lines transfected with embryonic dorsal root ganglia (E8) ganglia were tested and growth out of neurites was recorded. Filled diamonds: DGC-N / B-2.5- # 23 cell line (containing the long chimeric NGF / BDNF prepro construct). Square to dotted: cell line DGZ1000-B-3-2.5 (containing the short construction of BDNF prepro).
Figura 3. Sequência de ADNc de BDNF humano (SEQ ID Nal) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID Ne2) e comparação de sequências de ADN de porco (SEQ ID N23 e SEQ ID Na4), ratazana (SEQ ID Na5 e SEQ ID Na6) e galinha (SEQ ID Nfi7 e SEQ ID Na8). A figura mostrada é da Publicação internacional de PCT Na WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991. 74 586 6526-056-118 -12-Figure 3. Human BDNF (SEQ ID Nal) cDNA and deduced amino acid sequence (SEQ ID N02) and comparison of pig DNA sequences (SEQ ID N23 and SEQ ID NO4), rat (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: Na6) and chicken (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8). The figure shown is from PCT International Publication No. WO 91/03568, published March 21, 1991. 74 586 6526-056-118 -12-
Figura 4. Sequência de nucleótidos (SEQ ID Na9) e deduzida de aminoácidos (SEQ ID N210) do NGF humano. Os números -187 a -1 indicam a região prepro comprida. A informação para a sequência é da Publicação EP 121 338, publicada em 10 de Outubro de 1984, de Gray e Ullrich.Figure 4. Nucleotide sequence (SEQ ID Na9) and deduced from amino acids (SEQ ID N210) of human NGF. The numbers -187 to -1 indicate the long prepro region. The information for the sequence is from EP 121,338, issued October 10, 1984 to Gray and Ullrich.
Figura 5. Sequências alinhadas de ADN de genes de NT-3 de ratazana (SEQ ID Nall) e de humano (SEQ ID N213). O sítio de início de tradução previsto está indicado por "PREPRO—" e o início previsto da NT-3 madura está indicado por "MADURO—". As proteínas NT-3 madura de ratazana (SEQ ID Na12) e humana (SEQ' ID N214) têm sequências de aminoácidos idênticas, ao passo que as regiões prepro diferem em 11 posições, que estão sublinhadas. A figura mostrada é da Publicação Internacional de PCT Ns WO 91/03569, publicada em 21 de Março de 1991.Figure 5. DNA aligned sequences of rat NT-3 (SEQ ID Nall) and human (SEQ ID N213) genes. The predicted translation start site is indicated by " PREPRO- " and the expected start of the mature NT-3 is indicated by " MATURE- ". Rare rat (SEQ ID No 12) and human (SEQ ID NO: 14) NT-3 proteins have identical amino acid sequences, while the prepro regions differ in 11 positions, which are underlined. The figure shown is from PCT International Publication No. WO 91/03569, published March 21, 1991.
Figura 6. Fragmento 3 de ADN (SEQ ID N215 e 16) utilizado na construção de NT-3/BDNF quimérica correspondendo a 35 aminoácidos da região prepro de NT-3 (SEQ ID Na17).Figure 6. DNA fragment 3 (SEQ ID N215 and 16) used in the chimeric NT-3 / BDNF construct corresponding to 35 amino acids of the NT-3 prepro region (SEQ ID Na17).
Figura 7. Análise por transferência de Western de meios condicionados de clones de células CHO expressando o BDNF prepro original (faixa 2-11) ou o NT-3/BDNF prepro quimérico (faixa 12--19). A faixa 1 foi carregada com 450 ng de BDNF humano maduro, purificado. A faixa 20 foi carregada com marcadores de massa molecular baixa pré-corados de BRL. A faixa 8 e a faixa 16 representam clones não produtores de cada transfecção.Figure 7. Western blot analysis of conditioned media from CHO cell clones expressing the original prepro BDNF (range 2-11) or chimeric prepro NT-3 / BDNF (range 12-19). Lane 1 was loaded with 450 ng of mature, purified human BDNF. Lane 20 was loaded with pre-stained low molecular weight BRL markers. Lane 8 and Lane 16 represent non-transfecting clones of each transfection.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento refere-se a novas proteínas prepro ou péptidos prepro, quiméricos compreendendo factores neurotróficos bioactivos e ao uso destes precursores e das suas sequências de ácido nucleico para a produção de proteínas ou péptidos que têm uma ou mais actividades biológicas de uma neurotrofina. As moléculas prepro quiméricas proporcionadas pelo presente invento contêm uma região prepro heteróloga fundida com uma sequência madura de neurotrofina ou sua porção ou derivado biologicamenteDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to novel chimeric prepro or prepro peptides comprising bioactive neurotrophic factors and the use of these precursors and their nucleic acid sequences for the production of proteins or peptides having one or more activities biological properties of a neurotrophin. The chimeric prepro molecules provided by the present invention contain a heterologous prepro region fused to a mature neurotrophin sequence or portion thereof or biologically derived
74 586 6526-056-118 activos. As sequências de neurotrofina madura que podem ser usadas de acordo com o presente invento são as da família NGF/BDNF de moléculas homólogas incluindo mas não se limitando a NGF, BDNF, NT-3 e NT-4. De modo semelhante, as regiões prepro podem ser derivadas das moléculas de neurotrofina da família NGF/BDNF incluindo, mas não se limitando a NGF, BDNF NT-3 e NT-4. O invento baseia-se, em parte substancial na verificação de que proteínas prepro ou péptidos prepro, quiméricos, compreendendo a região prepro do factor de crescimento de nervo e a porção madura do factor neurotrófico derivado de cérebro (NGF/BDNF prepro) ou a região prepro da NT-3 e a porção madura do factor neurotrófico derivado do cérebro (NT-3/BDNF prepro) são processados mais eficientemente por uma célula hospedeira eucariota do que o factor neurotrófico derivado de cérebro prepro, homólogo, (BDNF prepro). Baseia-se ainda na verificação de que células hospedeiras eucariotas, amplificadas e transfectadas estavelmente, expressando o NGF/BDNF prepro ou o NT-3/BDNF prepro segregam apenas a forma madura do BDNF para os meios. O processamento pós-tradução do BDNF prepro homólogo é altamente ineficiente. Em contaste, um membro da mesma família de genes da neurotrofina, NGF, é processado eficientemente. Apenas a forma bioactiva madura do NGF é segregada para os meios das células hospedeiras a seguir a transfecção transiente. 0 problema do processamento do BDNF persistiu na geração de linhas celulares hospedeiras estáveis para a produção do BDNF maduro bioactivo. 0 presente invento proporciona uma nova solução para este problema de processamento por expressão de construções quiméricas, que numa concretização específica contém a região comprida do NGF prepro fundida no quadro ("in frame") com o BDNF maduro e noutra concretização específica contém a região prepro da NT-3 fundida na quadro com o BDNF maduro. 0 presente invento proporciona ácidos nucleicos codificando proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos e a processos para a expressão destas proteínas e péptidos neurotróficos, quiméricos, pela utilização desses ácidos nucleicos.74 586 6526-056-118. The mature neurotrophin sequences that may be used in accordance with the present invention are those of the NGF / BDNF family of homologous molecules including but not limited to NGF, BDNF, NT-3 and NT-4. Similarly, the prepro regions may be derived from the neurotrophin molecules of the NGF / BDNF family including, but not limited to, NGF, BDNF NT-3 and NT-4. The invention is based in part on the finding that chimeric prepro proteins or prepro peptides comprising the prepro region of nerve growth factor and the mature portion of brain derived neurotrophic factor (NGF / BDNF prepro) or region prepro of NT-3 and the mature portion of brain-derived neurotrophic factor (NT-3 / BDNF prepro) are processed more efficiently by a eukaryotic host cell than homologous prepro brain-derived neurotrophic factor (BDNF prepro). It is further based on the finding that stably amplified and transfected eukaryotic host cells expressing prepro NGF / BDNF or NT-3 / BDNF prepro segregate only the mature form of BDNF to the media. Post-translational processing of the prepro homologue BDNF is highly inefficient. In contaste, a member of the same neurotrophin gene family, NGF, is processed efficiently. Only the mature bioactive form of NGF is secreted into the host cell media following transient transfection. The problem of BDNF processing persisted in the generation of stable host cell lines for the production of mature bioactive BDNF. The present invention provides a novel solution to this processing problem by expression of chimeric constructs, which in a specific embodiment contains the long region of the prepro-NGF fused to the frame ("in frame") with the mature BDNF and in another specific embodiment contains the region prepro of NT-3 fused to the mature BDNF frame. The present invention provides nucleic acids encoding chimeric neurotrophic prepro proteins or prepro peptides and methods for the expression of these chimeric neurotrophic proteins and peptides by the use of such nucleic acids.
74 586 6526-056-118 -14- A expressão de ácidos nucleicos codificando as proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos, de acordo com o presente invento proporciona vantagens significativas em relação ao uso de ácidos nucleicos codificando proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, homólogos. A produção de proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos, proporciona níveis aumentados de expressão do factor neurotrófico bioactivo. Este nível aumentado de expressão deve, adicionalmente, proporcionar melhores esquemas de purificação do factor neurotrófico bioactivo, na medida em que as formas não processadas contaminantes dos factores neurotróficos expressos não estão presentes no sobrenadantes em bruto.Expression of nucleic acids encoding chimeric neurotrophic prepro proteins or prepro peptides according to the present invention provides significant advantages over the use of nucleic acids encoding prepro proteins or neurotrophic prepro peptides, homologues. The production of prepro proteins or chimeric neurotrophic prepro peptides provides enhanced levels of bioactive neurotrophic factor expression. This increased level of expression should in addition provide better purification schemes of bioactive neurotrophic factor, insofar as the contaminated unprocessed forms of the expressed neurotrophic factors are not present in the crude supernatants.
5.1. OS PRODUTOS DE EXPRESSÃO DO PRESENTE INVENTO5.1. THE EXPRESSION PRODUCTS OF THE PRESENT INVENTION
As proteínas bioactivas que podem ser obtidas de acordo com o presente invento são factores neurotróficos maduros que são membros da família de genes da neurotrofina, ou suas porções ou derivados biologicamente activos. O termo "biologicamente activo", tal como aqui usado refere-se à capacidade de expressar uma ou mais actividades biológicas da neurotrofina madura de comprimento total. Estas neurotrofinas incluem, mas não estão limitadas a BDNF, NT-3, NGF e NT-4 maduros e a outros membros que sejam identificados por processos utilizados para a determinação de membros da família de genes da neurotrofina (e.g. usando sondas moleculares, geradas por PCR, correspondentes a regiões de homologia dentro da família? ver Publicação PCT WO 91/03569).Bioactive proteins obtainable in accordance with the present invention are mature neurotrophic factors which are members of the neurotrophin gene family, or biologically active moieties or derivatives thereof. The term " biologically active " as used herein refers to the ability to express one or more biological activities of the full length mature neurotrophin. These neurotrophins include, but are not limited to, mature BDNF, NT-3, NGF and NT-4 and to other members which are identified by methods used to determine members of the neurotrophin gene family (eg using molecular probes generated by PCR, corresponding to regions of homology within the family - see PCT Publication WO 91/03569).
Estão disponíveis as sequências de ADN que codificam várias proteínas de neurotrofina que podem ser expressas usando o presente invento. Ver Ullrich et al. (Nature 303;821 (1983); Publicação E.P. 121 338, publicada em 10 de Outubro de 1984) em relação às sequências de codificação de hNGF e, e.g.. Meier et al. (EMBO J. 5.:1489 (1986)) e Schwarz et al. (J. Neurochem. 52.:1203 (1989)) em relação aos ADNc de NGF para várias outras espécies? estirpe de plasmideo ATCC phBDNF-C-1 (Na de Acesso 4068) em relação a um clone de ADNc de hBDNF e, e.g. Leibrock et al.. infra, em relação a ADNc de BDNF de porco; e estirpe de 74 586 6526-056-118 -15-DNA sequences encoding various neurotrophin proteins that can be expressed using the present invention are available. See Ullrich et al. (Nature 303, 821 (1983), Publication E.P. 121,338, issued Oct. 10, 1984) with respect to the coding sequences of hNGF and, e.g., Meier et al. (EMBO J. 5: 1489 (1986)) and Schwarz et al. (J. Neurochem., 52: 1203 (1989)) over NGF cDNAs for several other species? ATCC plasmid strain phBDNF-C-1 (Accession Na 4068) relative to a cDNA clone of hBDNF and, e.g., Leibrock et al., relative to porcine BDNF cDNA; and the strain of 74 586 6526-056-118 -15-
plasmideo ATCC pC8-hN3 (Pl) (Na de Acesso 40765) em relação a um clone de ADNc de NT-3 humana e Maisonpierre et al. (Science 247:1446 (1990)) e Hohn et al. (Nature 344:339 (1990)) em relação a sequências de codificação de várias outras espécies. Foi relatada a clonagem de genes de NT-3 humana (Rosenthal et al.. Neuron 4.:767 (1990)) bem como de ratazana (Maisonpierre et al.. infra). Além disso, as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para o BDNF são descritas na Publicação de PCT WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991 e Pedido de Patente U.S., co-pendente, Na de Série 570 657, apresentada em 20 de Agosto de 1990; as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para à NT-3 são descritas na publicação de PCT WO/03569 publicada em 21 de Março de 1991 e Pedido de Patente co-pendente N2 de Série 570 189, apresentado em 20 de Agosto de 1990). Para além disso as sequências de nuleótidos e de aminoácidos para o BDNF (SEQ ID Nal-8), para o NGF (SEQ ID Na9-10) e para a NT-3 (SEQ ID Nall-14) são apresentadas nas Figuras 3, 4 e 5, respectivamente, do presente invento.plasmid ATCC pC8-hN3 (Pl) (Access Na 40765) to a human NT-3 cDNA clone and Maisonpierre et al. (Science 247: 1446 (1990)) and Hohn et al. (Nature 344: 339 (1990)) with respect to coding sequences of several other species. Cloning of human NT-3 genes (Rosenthal et al., Neuron 4: 767 (1990)) as well as rat (Maisonpierre et al.) Has been reported. In addition, the nucleotide and amino acid sequences for BDNF are described in PCT Publication WO 91/03568, published March 21, 1991 and copending U.S. Patent Application Serial No. 570,657, filed at 20 of August 1990; the nucleotide and amino acid sequences for NT-3 are described in PCT publication WO / 03569 published March 21, 1991 and co-pending U.S. Serial No. 570,189, filed Aug. 20, 1990). In addition, the NDNA (SEQ ID Nal-8), NGF (SEQ ID NO: 9-10), and NT-3 (SEQ ID Nall-14) are shown in Figures 3, 4 and 5, respectively, of the present invention.
Para além disso, pode ser identificado um gene de neurotro-fina de qualquer organismo usando as regiões de homologia partilhada por quaisquer dois membros da família de moléculas BNF/NGF/NT-3/NT-4, usando os processos apresentados acima. Por exemplo, e não como limitação, uma nova neurotrofina pode ser identificada e clonada por síntese de oligonucleótidos degenerados de BDNF/NGF/NT-3/NT-4 correspondendo a segmentos de sequências de proteínas altamente conservadas entre quaisquer duas neuro-trofinas. Estes oligonucleótidos podem ser usados como inciadores em reacções em cadeia de polimerase (PCR) com o molde de ADNc preparado a partir de células que se suspeite que expressem a neurotrofina desejada. Os produtos de PCR podem, então, ser usados como sondas para permitirem a clonagem de ADNc completo e/ou de genes genómicos, cujas sequências podem ser determinadas por métodos comuns. Podem ser identificadas novas neurotrofinas por selecção daquelas que contêm, para além das sequências homólogas a outras neurotrofinas conhecidas, sequências não homólogas a outras neurotrofinas conhecidas íe.q.. pelo menos seis nucleótidos contíguos nos quais pelo menos dois nucleótidos dife-Furthermore, a neurotrophin gene of any organism may be identified using regions of homology shared by any two members of the BNF / NGF / NT-3 / NT-4 family of molecules, using the methods set forth above. For example, and not as a limitation, a novel neurotrophin can be identified and cloned by the synthesis of BDNF / NGF / NT-3 / NT-4 degenerate oligonucleotides corresponding to highly conserved protein sequence segments between any two neurotrophins. These oligonucleotides can be used as initiators in polymerase chain reactions (PCR) with the cDNA template prepared from cells suspected to express the desired neurotrophin. The PCR products may then be used as probes to allow the cloning of complete cDNA and / or genomic genes, the sequences of which may be determined by standard methods. Novel neurotrophins may be identified by selection of those which contain, in addition to the sequences homologous to other known neurotrophins, sequences not homologous to other known neurotrophins i.e. at least six contiguous nucleotides in which at least two nucleotides differ
74 586 6526-056-118 -16-rem). De modo semelhante os oligonucleótidos correspondentes a sequências de uma neurotrofina em uma espécie podem ser usados em PCR para gerarem sondas para permitirem a clonagem do gene da neurotrofina de outras espécies. 0 NGF e o BDNF são proteínas básicas de aproximadamente 120 aminoácidos que partilham cerca de 50% de identidade da sequência de aminoácidos, incluindo a conservação absoluta de seis resíduos cisteína que se mostrou, no NGF activo, formarem três pontes dissulfureto (Bradshaw, A., 1978, Ann. Rev. Biochem. 47;191-216; Leibrock et al.. 1989, Nature 341:149-52). A comparação ‘das sequências do NGF a partir de espécies evolutivamente divergentes revelou que os aminoácidos que flanqueiam estes resíduos cisteína compreendem as regiões mais conservadas da molécula (Meier et al. . 1986 EMBO J. 5,: 1489-93; Selby et al. . 1987, J. Neurosci. Res. 18:293-8). Surpreendentemente, estas são também as regiões mais semelhantes entre o BDNF e o NGF (Leibrock et al.f 1989, Nature 341:149-52.74 586 6526-056-118 -16-rem). Similarly, oligonucleotides corresponding to sequences of a neurotrophin in one species can be used in PCR to generate probes to allow the cloning of the neurotrophin gene from other species. NGF and BDNF are basic proteins of approximately 120 amino acids sharing about 50% amino acid sequence identity, including the absolute conservation of six cysteine residues which have been shown to form three disulfide bonds in active NGF (Bradshaw, A. , 1978, Ann Rev. Biochem 47, 191-216, Leibrock et al., 1989, Nature 341: 149-52). Comparison of the NGF sequences from evolutionarily divergent species has shown that the amino acids flanking these cysteine residues comprise the more conserved regions of the molecule (Meier et al., 1986 EMBO J. 5, 1489-93, Selby et al. 1987, J. Neurosci Res 18: 293-8). Surprisingly, these are also the most similar regions between BDNF and NGF (Leibrock et al., 1989, Nature 341: 149-52.
Num aspecto preferido do presente invento, produz-se uma neurotrofina humana, madura, por expressão de uma molécula prepro quimérica de acordo com o presente invento. Numa concretização específica, a molécula prepro quimérica é codificada por um ácido nucleico contendo a região prepro comprida do NGF fundida no quadro ("in frame") com a sequência de codificação do BDNF maduro. Numa outra concretização, a molécula prepro quimérica é codificada por um ácido nucleico contendo a região prepro da NT-3 fundida no quadro com a região de codificação do BDNF maduro. Ainda noutra concretização, a região prepro comprida do NGF está fundida no quadro com a região de codificação da NT-3.In a preferred aspect of the present invention, a mature human neurotrophin is produced by expression of a chimeric prepro molecule in accordance with the present invention. In a specific embodiment, the chimeric prepro molecule is encoded by a nucleic acid containing the long prepro region of the fused NGF in the frame (" in frame ") with the mature BDNF coding sequence. In another embodiment, the chimeric prepro molecule is encoded by a nucleic acid containing the prepro region of the fused NT-3 in the frame with the mature BDNF coding region. In yet another embodiment, the long prepro region of NGF is fused in the frame with the NT-3 coding region.
Tal como foi discutido supra f não foi documentado qualquer significado biológico distinto entre a região prepro '"comprida" e "curta" do precursor do NGF. Ainda noutro aspecto específico do invento, pode ser utilizada a região prepro "comprida" ou "curta" na construção de genes neurotróficos quiméricos. Um perito na arte pode utilizar uma região prepro "curta" do NGF ou uma região prepro "comprida" do NGF na construção de fusões quiméricas doAs discussed above f was not documented any distinct biological meaning between the " long prepro region " and " short " of the NGF precursor. In yet another specific aspect of the invention, the long prepro region " or " short " in the construction of chimeric neurotrophic genes. One skilled in the art can utilize a short prepro region " of the NGF or a long prepro region " of the NGF in the construction of the
74 586 6526-056-118 -17-presente invento compreendendo uma região prepro do NGF.The present invention comprising a prepro region of NGF.
As moléculas de neurotrofina maduras que podem ser expressas como precursores prepro quiméricos de acordo com o presente invento também incluem sequências e fragmentos ou derivados, substancialmente equivalentes que são biologicamente activos.Mature neurotrophin molecules which can be expressed as chimeric prepro precursors according to the present invention also include sequences and fragments or derivatives, substantially equivalent that are biologically active.
Por exemplo, as sequências de ácido nucleico da neurotrofina podem ser alteradas por substituições, adições ou delecções que podem proporcionar moléculas funcionais. Devido à degeneração das sequências de nucleótidos de codificação, podem ser usadas na prática do presente invento outras sequências de ADN que codificam substancialmente a mesma sequência de aminoácidos da neurotrofina. Estas incluem, mas não estão limitadas a sequências de nulceótidos compreendendo todas as porções dos genes da neurotrofina que são alterados pela substituição de diferentes codões que codificam um resíduo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro da sequência, produzindo assim um mudança silenciosa. Do mesmo modo, as proteínas de neurotrofina ou seus fragmentos ou derivados, do invento incluem, mas não estão limitados àqueles que contêm, como parte da sua sequência de aminoácidos primária, sequências alteradas nas quais se substituem resíduos dentro da sequência por resíduos de aminoácido funcionalmente equivalentes, resultando numa mudança silenciosa. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido, dentro da sequência, pode ser substituído por outro aminoácido de polaridade semelhante que actua como um equivalente funcional, resultando numa alteração silenciosa. Substitutos para um aminoácido dentro da sequência podem ser seleccionados de entre outros membros da classe a que o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Estão também incluídas no âmbito do invento proteínas ou fti). S/· " diFor example, neurotrophin nucleic acid sequences may be altered by substitutions, additions or deletions that can provide functional molecules. Due to the degeneracy of the coding nucleotide sequences, other DNA sequences encoding substantially the same neurotrophin amino acid sequence may be used in the practice of the present invention. These include but are not limited to null-ocetide sequences comprising all portions of the neurotrophin genes that are altered by substituting different codons that encode a functionally equivalent amino acid residue within the sequence, thereby producing a silent shift. Likewise, the neurotrophin proteins or fragments or derivatives thereof of the invention include, but are not limited to, those that contain, as part of their primary amino acid sequence, altered sequences in which residues within the sequence are replaced by functionally amino acid residues resulting in a silent change. For example, one or more amino acid residues within the sequence may be replaced by another amino acid of similar polarity which acts as a functional equivalent, resulting in a silent alteration. Substitutes for an amino acid within the sequence may be selected from among other members of the class to which the amino acid belongs. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, and methionine. Neutral polar amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Positively (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine. The negatively charged amino acids (acids) include aspartic acid and glutamic acid. Also included within the scope of the invention are proteins or (fti). S / · " di
74 586 6526-056-118 -18-fragmentos de neurotrofina ou seus derivados que são obtidos através de modificação durante ou após a tradução, e.q.. por glicosação, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular, acetilação, fosforilação, redução clivagem, etc.Fragments of neurotrophin or derivatives thereof which are obtained by modification during or after translation, eg by glycosylation, proteolytic cleavage, binding to an antibody molecule or other cellular ligand, acetylation, phosphorylation , cleavage reduction, etc.
Adicionalmente, uma dada sequência de neurotrofina pode sofrer mutação in vitro ou in vivo. para criar e/ou destruir sequências de tradução, iniciação e/ou terminação ou para criar variações nas regiões de codificação e/ou formar novos sítios de endonuclease de restrição ou destruir outros já existentes, p'àra facilitar ainda mais a modificação in vitro. Pode ser usada qualquer técnica de mutagénese conhecida na arte, incluindo mas não se limitando a mutagénese dirigida ao sítio in vitro (Hutchinson, et al.. 1978, J. Biol. Chem. 253:6551). uso de ligadores TAB ® (Pharmacia), etc. O presente invento também se refere à expressão dos ácidos nucleicos que codificam moléculas de neurotrofina prepro, quiméricas e à recuperação do produto neurotrofina madura.In addition, a given neurotrophin sequence may undergo mutation in vitro or in vivo. to create and / or destroy translation, initiation and / or termination sequences or to create variations in the coding regions and / or to form new restriction endonuclease sites or to destroy other existing ones, to further facilitate the in vitro modification. Any mutagenesis technique known in the art, including but not limited to in vitro site-directed mutagenesis (Hutchinson, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551) may be used. use of TAB ® (Pharmacia) connectors, etc. The present invention also relates to the expression of nucleic acids encoding chimeric prepro neurotrophin molecules and to the recovery of the mature neurotrophin product.
5.2. CONSTRUÇÃO DAS PROTEÍNAS PREPRO OU PÉPTIDOS PREPRO. NEUROTRÓFICOS. QUIMÉRICOS5.2. CONSTRUCTION OF PREPRO OR PEPTID PROTEINS PREPRO. NEUROTROPHICS. CHEMISTRY
Os ácidos nucleicos que codificam proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos quiméricos podem ser construídos usando tecnologia comum de ADN recombinante, por exemplo, por digestão por enzima de restrição e ligação das sequências de ácido nucleico que codificam as regiões prepro e maduras desejadas. Alternativamente, as sequências de ácido nucleico podem ser construídas usando síntese química, como tecnologia de fosforamideto em fase sólida. Em concretizações preferidas do invento, pode ser usada reacção em cadeia de polimerase (PCR; Saiki et al.. 1985, Science 230:1350-1354) para conseguir a união ("splicing") de sequências de ácido nucleico por extensão de sobreposição (Horton et al. . 1989, Gene 77.:61-68) e, assim, produzir ácidos nucleicos codificando as proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos do invento (ver.e.q..Nucleic acids encoding chimeric neurotrophic prepro proteins or prepro peptides may be constructed using standard recombinant DNA technology, for example, by restriction enzyme digestion and ligation of the nucleic acid sequences encoding the desired prepro and mature regions. Alternatively, nucleic acid sequences may be constructed using chemical synthesis, such as solid phase phosphoramidite technology. In preferred embodiments of the invention, polymerase chain reaction (PCR; Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1354) can be used to achieve " splicing " of nucleic acid sequences by overlap extension (Horton et al., 1989, Gene 77: 61-68) and thus produce nucleic acids encoding the chimeric neurotrophic prepro proteins or prepro peptides of the invention (see e.g.
74 586 6526-056-11874 586 6526-056-118
Secção 6, infra).Section 6, below).
Num aspecto preferido, os ácidos nulceicos do invento são produzidos pela utilização de duas reacções de PCR em separado, cada uma com um molde diferente. Como ilustração, se é desejada uma quimera X-Y, realiza-se primeiro a PCR com um molde, por exemplo X, usando uma sonda completamente homóloga com X e uma sonda com uma região homóloga com X e uma região homóloga com Y. 0 produto de reacção PCR é, depois, isolado e usado como uma sonda numa segunda reacção de PCR, com Y como um molde e uma segunda sonda completamente homóloga com Y.In a preferred aspect, the novelty acids of the invention are produced by the use of two separate PCR reactions, each with a different template. As an illustration, if an XY chimera is desired, one first template PCR, for example X, is first performed using a fully homologous probe with X and a probe with an X homologous region and a Y homologous region. The PCR reaction is then isolated and used as a probe in a second PCR reaction, with Y as a template and a second probe fully homologous with Y.
Pode ser ainda desejável incorporar nos iniciadores sítios de endonuclease de restrição úteis.It may further be desirable to incorporate useful restriction endonuclease sites into the primers.
Para além disto, os factores neurotróficos quiméricos podem ser produzidos por PCR num só passo utilizando três iniciadores oligonucleotídicos. Por exemplo, pode ligar-se um ácido nucleico codificando pelo menos uma porção da região prepro desejada (X) a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ou péptido neurotrófico, maduro, (Y) criando três iniciadores oligonucleotídicos, um dos quais corresponde a uma porção da sequência X (o "iniciador X"), um outro corresponde a uma porção da sequência Y ( o "iniciador Y") e um terceiro que contém uma porção das sequências X e Y ("o iniciador XY"). Estes três oligonucleótidos podem ser combinados numa PCR em um passo, sendo desejável que os iniciadores X e Y estejam presentes em quantidades maiores do que o iniciador XY, por exemplo numa razão de X:Y:XY de cerca de 100:1:100. [o molde utilizado na PCR pode ser uma mistura de ácidos nucleicos codificando a região prepro desejada e a proteína ou péptido neurotrófico maduro]. A posição dos sítio de união é determinada pelo nucleótido em ponte (e.g. o iniciador XY).In addition, chimeric neurotrophic factors can be produced by PCR in a single step using three oligonucleotide primers. For example, a nucleic acid encoding at least a portion of the desired prepro region (X) may be ligated to a nucleic acid sequence encoding a mature, neurotrophic protein or peptide (Y) creating three oligonucleotide primers, one of which corresponds to a portion of the sequence X (the " X-primer "), another corresponds to a portion of the Y sequence (the " Y-primer ") and a third containing a portion of the sequences X and Y (";). These three oligonucleotides can be combined in one step PCR, it being desirable for primers X and Y to be present in greater amounts than the XY primer, for example at an X: Y: XY ratio of about 100: 1: 100. [The template used in the PCR may be a mixture of nucleic acids encoding the desired prepro region and the mature neurotrophic protein or peptide]. The position of the binding sites is determined by the bridged nucleotide (e.g. the XY primer).
Podem ser usadas as condições de amplificação comummente usadas na arte, por exemplo, 1 minuto a cerca de 94°C, 2 minutos a cerca de 43°C e 3 minutos a cerca de 72°C durante 35 ciclos, usando soluções e métodos padrão de PCR. O fragmento de PCRThe amplification conditions commonly used in the art, for example, 1 minute at about 94 ° C, 2 minutes at about 43 ° C and 3 minutes at about 72 ° C for 35 cycles, using standard solutions and methods of PCR. The PCR fragment
74 586 6526-056-118 -20- resultante pode, depois, ser purificado em ^ electroforese em gel, digerido com a endonuclease de restrição adequada e ligado num vector de clonagem adequado.The resultant can then be purified on gel electrophoresis, digested with the appropriate restriction endonuclease and ligated into a suitable cloning vector.
Processos adicionais de construção das quimeras do presente invento serão prontamente aparentes aos peritos na arte.Additional processes for constructing the chimeras of the present invention will be readily apparent to those skilled in the art.
Os produtos de reacção de ADN podem ser clonados usando qualquer processo conhecido na arte. Pode ser usado qualquer número de sistemas vector-hospedeiro conhecidos na arte. Vectores possíveis incluem, mas não estão limitados a cosmídeos plasmideos ou vírus modificados, mas os sistemas de vectores devem ser compatíveis com a célula hospedeira usada. Estes vectores incluem mas não estão limitados a bacteriófagos como derivados lambda ou plasmideos como pBR322, pUC ou derivados plasmídicos de Bluescript@ (Stratagene). Podem ser introduzidas moléculas recombinantes nas células hospedeiras através de transformação, transfecção, infecção, electroporação, etc.The DNA reaction products can be cloned using any method known in the art. Any number of vector-host systems known in the art may be used. Possible vectors include, but are not limited to, plasmid cosmids or modified viruses, but the vector systems must be compatible with the host cell used. These vectors include but are not limited to bacteriophages such as lambda derivatives or plasmids such as pBR322, pUC or Bluescriptâ "¢ (Stratagene) plasmid derivatives. Recombinant molecules can be introduced into the host cells by transformation, transfection, infection, electroporation, etc.
5.3.EXPRESSÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANDO PROTEÍNAS PREPRO OU PÉPTIDOS PREPRO. NEUROTRÓFICOS. QUIMÉRICOS A sequência nucleotídica codificando uma proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico, pode ser ligada num vector de expressão adequado, i.e.. um vector que contém os elementos necessários para a transcrição da sequência de ADN qimérica, clonada. Os sinais de transcrição e tradução necessários podem, também, ser proporcionados por um dos genes da neurotrofina e/ou as suas regiões flanqueadoras correspondendo a proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico. Pode ser utilizada uma variedade de sistemas hospedeiro eucariota--vector para a expressão da sequência de ADN quimérica, clonada e o resultante transcrito de ARNm. Estes incluem, mas não estão limitados a sistemas de células de mamífero infectadas com vírus fe.q.. vírus vacinia, adenovírus, etc.),'transfectados com outros vectores, contendo ácidos nucleicos do invento integrados cromossomicamente, etc., mas o sistema hospedeiro usado deve ter a maquinaria celular adequada para processar a quimera prepro na5.3.EXCESSION OF NUCLEIC ACIDS ENCODING PROTEINS PREPRO OR PÉPTIDOS PREPRO. NEUROTROPHICS. The nucleotide sequence encoding a prepro, neurotrophic, chimeric, prepro protein or peptide can be ligated into a suitable expression vector, i.e. a vector containing the elements necessary for the transcription of the cloned qimeric DNA sequence. The required transcription and translation signals may also be provided by one of the neurotrophin genes and / or its flanking regions corresponding to the prepro protein or neurotrophic, chimeric, prepro peptide. A variety of eukaryotic-vector host systems may be used for expression of the chimeric, cloned DNA sequence and the resulting mRNA transcript. These include, but are not limited to mammalian cell systems infected with virus, vaccinia virus, adenovirus, etc.), transfected with other vectors, containing chromosomally integrated nucleic acids of the invention, etc., but the system used host cell must have the appropriate cellular machinery to process the prepro chimera in the
74 586 6526-056-118 -21-neurotrofina madura. Os elementos de expressão dos vectores variam nas suas potências e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro-vector utilizado, pode ser usado qualquer um de um número de elementos adequados de transcrição e tradução.Mature neurotrophin. The expression elements of the vectors vary in their potencies and specificities. Depending on the host-vector system used, any of a number of suitable transcription and translation elements may be used.
Pode ser usado qualquer dos processos previamente descritos para a inserção de fragmentos de ADN num vector para construir vectores de expressão contendo uma sequência codificando uma proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico, consistindo nos sinais de controlo de transcrição/tradução adequados a montante das sequências de ADN quiméricas. Estes processos podem incluir técnicas de ADN recombinante e sintéticas in vitro e recombinações in vivo (recombinação genética). A expressão de sequências de ácido nucleico codificando proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácido nucleico de modo que a proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico, seja expresso num hospedeiro transformado com a molécula de ADN recombinante. Por exemplo, a expressão pode ser controlada por qualquer elemento promotor/intensificador conhecido na arte como sendo activo em células de mamífero. Os promotores que podem ser usados para controlar a expressão do factor neurotrófico quimérico incluem, mas não estão limitados ao promotor do citomegalovírus (CMV), à região promotora precoce de SV40 (Bernoist e chambom, 1981, Nature 290:304-310). ao promotor contido na repetição terminal longa de 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto.et al. . 1980, Cell 22.:787-797), ao promotor da timidina-cinase do herpes (Wagner et al.. 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78.:144-1445), às sequências reguladoras do gene da metalotionina (Brinster et al. . 1982, Nature 296:39-42; e às seguintes regiões animais de controlo da transcrição, que exibem especificidade tissular e foram utilizadas em animais transgénicos: região de controlo do gene da elastase I que é activa nas células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38.:639-646; Ornitz et al.. 1986, Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 5(3:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 2:425-515)? região de controlo do gene da insulina que é activa nas células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122). região de 74 586 6526-056-118 -22-Any of the previously described methods for inserting DNA fragments into a vector can be used to construct expression vectors containing a sequence encoding a chimeric, neurotrophic, prepro or prepro peptide consisting of the appropriate transcription / translation control signals upstream of the chimeric DNA sequences. These processes may include recombinant and synthetic DNA techniques in vitro and in vivo recombination (genetic recombination). Expression of nucleic acid sequences encoding chimeric, neurotrophic, prepro protein or prepro peptide can be regulated by a second nucleic acid sequence so that the chimeric, neurotrophic, prepro protein or prepro peptide is expressed in a host transformed with the molecule of recombinant DNA. For example, the expression may be controlled by any promoter / enhancer element known in the art to be active in mammalian cells. Promoters that can be used to control expression of chimeric neurotrophic factor include, but are not limited to, the cytomegalovirus (CMV) promoter, the SV40 early promoter region (Bernoist and chambom, 1981, Nature 290: 304-310). to the promoter contained in the 3 'long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), to the herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad Sci USA 78: 1414-1445), to the regulatory sequences of the metallothionine gene (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42) and to the following transcriptional control animal regions, which exhibit tissue specificity and were used in transgenic animals: control region of the elastase I gene that is active in pancreatic acinar cells (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biol. 5 (3: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 2: 425-515), an insulin gene control region that is active in pancreatic beta cells (Hanahan, 1985, Nature 315: 115 -122) region of 74 586 6526-056-118 -22-
controlo do gene da imunoglobulina que é activa nas células linfoides (Grosschedl et al.. 1984, Cell 38.: 647-658; Adames et al.. 1985, Nature 318:533-538: Alexander et al.. 1987, Mol. Cell. Biol. 7.:1436-1444) região de controlo do vírus do tumor mamário do ratinho que é activo em células testiculares, da mama, linfoides e em mastócitos (Leder et al.. 1986, Cell 45:485-495),região de controlo do gene da albumina que é activa no fígado (Pinkert et al.. 1987, Genes and Devei. 1.:268-276), região de controlo do gene da alfa-fetoproteína que é activa no fígado (Krumlauf et al.. 1985, Mol. Cell. Biol. 5.:1639-1648: Hammer et al.. 1987, Science 235:53-581: região de controlo do gene da alfa 1-antitripsina que é activa no fígado (Kelsey et al.. 1987, Genes and Devei. 1.:161-171) região de controlo do gene da beta-globina que é activa em células mielóides (Mogram et al.. 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al.. 1986, Cell 46:89-94; região de controlo do gene da proteína básica mielina que é activa em oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al. f 1987, Cell 48:703-712); região de controlo do gene da cadeia leve 2 da miosina que é activa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286) e região de controlo do gene da hormona gonadotrópica de libertação que é activa no hipotálamo (Mason et al. . 1986, Science 234:1372-1378).control of the immunoglobulin gene that is active in lymphoid cells (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538: Alexander et al., 1987, Mol. Cell: Biol. 7: 1436-1444) mouse mammary tumor virus control region which is active in testicular, breast, lymphoid and mast cell cells (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495) , albumin gene control region that is active in the liver (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. 1: 268-276), alpha-fetoprotein gene control region that is active in the liver (Krumlauf et al. al. 1985, Mol. Cell Biol. 5: 1639-1648: Hammer et al., 1987, Science 235: 53-581: alpha 1-antitrypsin gene control region that is active in the liver (Kelsey et al. al., 1987, Genes and Devei, 1: 161-171) beta globin gene control region that is active in myeloid cells (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al. 1986, Cell 46: 89-94; control region of the protein gene in the basic myelin that is active in oligodendrocytes in the brain (Readhead et al. f 1987, Cell 48: 703-712); a myosin light chain gene control region that is active in skeletal muscle (Sani, 1985, Nature 314: 283-286) and a control region of the release gonadotropic hormone gene that is active in the hypothalamus (Mason et al. 1986, Science 234: 1372-1378).
Um exemplo específico de um vector de expressão que pode ser usado é o CDM8 (Seed, 1987, Nature 329:840-842: Seed e Aruffo, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84.:3365-3369; Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84.:8573-8577); outro exemplo pode ser o pCMX (ver pedido co-pendente Na de Série 678 408, apresentado em 28 de Março de 1991).A specific example of an expression vector that can be used is CDM8 (Seed, 1987, Nature 329: 840-842: Seed and Aruffo, 1987, Proc.Natl.Ac..Sci.USA, 84: 3365-3369; Aruffo and Seed, Proc Natl Acad Sci USA 84: 8573-8577); another example may be pCMX (see co-pending application Serial No. 678,408, filed March 28, 1991).
Os vectores de expressão contendo inserções do gene de proteína prepro ou péptido prepro, neurotróficos, quiméricos, podem ser identificados por três abordagens gerais: (a) hibridação ADN-ADN, (b) presença ou ausência de funções de gene marcador e (c) expressão de sequências inseridas. Na primeira abordagem, a presença de um gene estranho inserido num vector de expressão pode ser detectada por hibridação ADN-ADN usando sondas compreendendo sequências que são homólogas a pelo menos umaExpression vectors containing chimeric neurotrophic prepro protein or prepro protein inserts can be identified by three general approaches: (a) DNA-DNA hybridization, (b) the presence or absence of marker gene functions, and (c) expression of inserted sequences. In the first approach, the presence of a foreign gene inserted into an expression vector can be detected by DNA-DNA hybridization using probes comprising sequences that are homologous to at least one
74 586 6526-056-118 -23-porção de um gene de proteína prepro ou de péptido prepro, neurotróficos, quiméricos, inserido. Na segunda abordagem, o sistema vector recombinante/hospedeiro pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou ausência de certas funções de gene "marcadores" (e.q.. actividade de timidina-cinase, transformação de fenótipo, etc.) causadas pela inserção de genes estranhos no vector. Por exemplo, se a sequência de codificação da proteína prepro ou do péptido prepro, neurotróficos, quiméricos, é inserida dentro da sequência de gene marcador do vector, os recombinantes contendo a inserção quimérica podem ser identificados pela ausência da função de gene marcador.' Na terceira abordagem, os vectores de expressão recombinantes podem ser identificados ensaiando o produto de gene estranho expresso pelo recombinante. Estes ensaios podem ser baseados, por exemplo, nas propriedades físicas ou funcionais do produto de gene do factor neurotrófico em sistemas de bioensaio tal como descritos infra. na Secção 5.4.The present invention relates to the preparation of a chimeric neurotrophic prepro protein or prepro peptide gene. In the second approach, the recombinant / host vector system can be identified and selected based on the presence or absence of certain gene functions " markers " (e.g., thymidine kinase activity, phenotype transformation, etc.) caused by the insertion of foreign genes into the vector. For example, if the coding sequence of the chimeric neurotrophic prepro protein or prepro peptide is inserted into the vector marker gene sequence, the recombinants containing the chimeric insert can be identified by the absence of the marker gene function. In the third approach, recombinant expression vectors can be identified by assaying the foreign gene product expressed by the recombinant. These assays may be based, for example, on the physical or functional properties of the neurotrophic factor gene product in bioassay systems as described infra. in Section 5.4.
Uma vez identificada e isolada uma molécula de ADN recombinante particular, podem ser usados vários métodos conhecidos na arte para as propagar. Uma vez estabelecidos sistemas de hospedeiros e condições de crescimento adequados, os vectores de expressão recombinantes podem ser propagados e preparados em quantidade. A expressão a partir de certos promotores pode ser elevada na presença de certos indutores; assim, pode ser controlada a expressão de proteína prepro ou de péptido prepro, neurotróficos, quiméricos, manipulados geneticamente. Além disso, células hospedeiras diferentes têm mecanismos específicos e característicos para a tradução e para o processamento e modificação de pós-tradução (e.q.. glicosação, clivagem) das proteínas. Devem ser escolhidas linhas celulares ou sistemas hospedeiros apropriados de modo a se assegurar o processamento necessário e.q.. a remoção por clivagem da região prepro) e para qualquer modificação desejada. São, assim, preferidas as células hospedeiras de mamífero, como as de macaco, humano ou bovino.Once a particular recombinant DNA molecule has been identified and isolated, various methods known in the art can be used to propagate them. Once appropriate host systems and growth conditions have been established, recombinant expression vectors can be propagated and prepared in quantity. Expression from certain promoters may be elevated in the presence of certain inducers; thus, the expression of genetically engineered, chimeric, neuroprophilic prepro or peptide prepro protein can be controlled. In addition, different host cells have specific and characteristic mechanisms for translation and for the processing and modification of post-translational (e .q .. glycosation, cleavage) of proteins. Appropriate cell lines or host systems should be chosen so as to ensure the necessary processing and removal of the prepro region by cleavage and for any desired modification. Mammalian host cells, such as monkey, human or bovine, are thus preferred.
74 586 6526-056-118 -24-74 586 6526-056-118 -24-
Em concretizações específicas do invento, o ADN que codifica neurotrofinas quiméricas pode ser expresso num sistema de células CHO de acordo com processos apresentados infra. Uma vez identificado um recombinante que expressa a neurotrofina quimérica, o produto de qene maduro deve ser analisado. Isto pode ser conseguido por ensaios baseados nas propriedades físicas ou funcionais do produto. Ver Secção 5.4. infra.In specific embodiments of the invention, DNA encoding chimeric neurotrophins may be expressed in a CHO cell system according to the procedures set forth below. Once a recombinant that expresses the chimeric neurotrophin is identified, the mature qene product should be analyzed. This may be achieved by tests based on the physical or functional properties of the product. See Section 5.4. below.
Uma vez identificado a proteína ou péptido do factor neurotrófico maduro, ele pode ser isolado e purificado por processos comuns, incluindo a cromatografia fe.q.. cromatogrâfia de permuta iónica, afinidade e de separação por tamanhos), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica comum para a purificação de proteínas.Once the mature neurotrophic factor protein or peptide has been identified, it can be isolated and purified by standard procedures, including chromatography (ion exchange chromatography, affinity and size separation), centrifugation, differential solubility or by any another common technique for purifying proteins.
5.4. ENSAIOS DO FACTOR NEUROTRÓFICO5.4. NEUROTROPIC FACTOR TESTS
As proteínas e péptidos de neurotrofina produzidos de acordo com o invento são capazes de exibirem uma ou mais actividades biológicas, incluindo, mas não lhes estando limitadas, actividade neurotrófica, ligação por anticorpos a neurotrofinas, ligação a receptores relacionados, etc. O termo "actividade neurotrófica", tal como aqui usado, deve ser considerado como referindo um efeito biológico sobre células do sistema nervoso, incluindo, mas lhes estando limitado, neurónios, astrócitos, células da glia, oligodendrócitos, célula da microglia e de Schwann. O efeito biológico é uma alteração na estrutura e/ou fisiologia de uma célula nervosa que não ocorre na ausência de exposição directa ou indirecta ao factor neurotrófico quimérico. Exemplos de efeitos biológicos são o prolongamento da sobrevivência, o crescimento de neurites, a manutenção do desenvolvimento de funções diferenciadas (como a expressão de uma enzima, e.q.. colina--acetiltransferase ou tirosina-hidroxilase) ou, de modo contrário, a morte ou senescência celular ou desdiferenciação. A presença de actividade neurotrófica pode ser determinada usando qualquer ensaio conhecido para essa actividade bem como sistemas que podem ser desenvolvidos no futuro. Sistemas de 74 586 6526-056-118 -25-The neurotrophin proteins and peptides produced according to the invention are capable of exhibiting one or more biological activities, including, but not limited to, neurotrophic activity, binding by neurotrophin antibodies, binding to related receptors, and the like. The term " neurotrophic activity " as used herein should be construed as referring to a biological effect on cells of the nervous system, including, but not limited to, neurons, astrocytes, glial cells, oligodendrocytes, the microglia and Schwann cells . The biological effect is a change in the structure and / or physiology of a nerve cell that does not occur in the absence of direct or indirect exposure to the chimeric neurotrophic factor. Examples of biological effects are the prolongation of survival, neurite outgrowth, maintenance of the development of differentiated functions (such as the expression of an enzyme, echoline-acetyltransferase or tyrosine hydroxylase), or otherwise death or cell senescence or dedifferentiation. The presence of neurotrophic activity may be determined using any assay known for such activity as well as systems which may be developed in the future. 74 586 6526-056-118 Systems
sistemas de bioensaio de cultura de tecidos usando explantes de tecidos, células preparadas a partir de tecidos ou linhas celulares imortalizadas, por exemplo derivadas do cérebro, espinal-medula ou sistema nervoso periférico, bem como sistemas de teste in vivo. nos quais o factor neurotrófico pode ser administrado a um animal; os efeitos neurotróficos podem ser detectados neste animal por realização de testes químicos, histológicos ou comportamentais usando o referido animal. Adicionalmente, um factor neurotrófico pode ser incorporado como um transgene num animal transgénico não humano e os seus eféitos biológicos podem ser medidos no referido animal.tissue culture bioassay systems using tissue explants, cells prepared from immortalized tissues or cell lines, for example derived from the brain, spinal cord or peripheral nervous system, as well as in vivo test systems. in which the neurotrophic factor can be administered to an animal; neurotrophic effects may be detected in this animal by performing chemical, histological or behavioral tests using said animal. In addition, a neurotrophic factor can be incorporated as a transgene into a non-human transgenic animal and its biological epoetins can be measured in said animal.
Por exemplo, mas não como limitação, a actividade neurotrófica pode ser medida usando qualquer dos sistemas de bioensaio bem conhecidos, seguintes: (i) sistema de ensaio de gânglios da raiz dorsal, tal como descrito em Barde et al.. 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77:1199-1203, que é aqui incorporado para referência, na sua totalidade; (ii) sistema de ensaio de gânglios nodosos, como descrito por Lindsay et al.. 1985, Dev. Biol. 112:319-328. que é aqui incorporado para referência na sua totalidade; (iii) ensaio de gânglios simpáticos como descito por Barde et al.. 1982, EMBO J. 1.:549-553, que é aqui incorporada para referência na sua totalidade; (iv) neurónios da espinal-medula. Resumidamente, pode ser removida a espinal-medula, assépticamente, de um animal de teste, cortada em posição caudal em relação ao bolbo raquidiano e libertada de gânglios sensoriais e de meninges. A medula pode, então, ser subdividida em segmentos ventral e mediodorsal para culturas separadas, e os tecidos cortados em pequenos pedaços e dissociados por trituração através de uma pipeta de Pasteur numa mistura de 50 por cento de DMEM (Gibco) e 50 por cento de mistura nutriente de Ham F12 74 586 6526-056-118 -26-For example, but not as a limitation, neurotrophic activity can be measured using any of the well known bioassay systems, as follows: (i) dorsal root ganglia assay system, as described in Barde et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Know. USA. 77: 1199-1203, which is hereby incorporated by reference in its entirety; (ii) nodal ganglia assay system, as described by Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112: 319-328. which is hereby incorporated by reference in its entirety; (iii) sympathetic ganglia assay as described by Barde et al., 1982, EMBO J., 1: 549-553, which is hereby incorporated by reference in its entirety; (iv) spinal-cord neurons. Briefly, the spinal cord can be removed aseptically from a test animal, cut caudal to the spinal bulb and released from sensory ganglia and meninges. The medulla may then be subdivided into ventral and mediodorsal segments for separate cultures, and the tissues cut into small pieces and dissociated by trituration through a Pasteur pipette in a 50 percent DMEM (Gibco) mixture and 50 percent nutrient mixture of Ham F12 74 586 6526-056-118 -26-
(Gibco) suplementada com glucose 33 mMf glutamina 2 mM, NaHC03 15 mM, HEPES 10 mM, 25 μg/ml de insulina, 100 jLig/ml de transferrina, putrescina 60 μΜ, progesterona 20 nM, selenito de Na 30 nM, 0,5 μg/ml de penicilina G, 0,5 μg/ml de estreptomicina e 2,5 μg/ml de albumina de soro bovino. A trituração pode, depois, ser repetida duas vezes e os sobrenadantes podem ser reunidos e filtrados através de um filtro Tetko de 40 μιη. As células ventrais dissociadas podem, então, ser plaqueadas numa placa de cultura revestida com poli-D-lisina (10 μg/ml) a uma densidade de 0,5 milhões de células por placa de 35 mm. As células mediodorsais dissociadas podem ser plaqueadas a uma densidade de 1,5 milhões de células por placa de 35 mm revestida com poli-D-lisina (10μg/ml), poli-L-ornitina (10 μg/ml) ou poli-L-ornitina mais laminina (5 μg/ml). (v) ensaios de neurónios colinérgicos do prosencéfalo basais (ver Publicação PCT WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991); (vi) ensaio de neurónios dopaminérgicos mesencefálicos ventrais (ver Publicação PCT WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991; e (vii) ensaios de células PC12.(Gibco) supplemented with 33 mM glucose, 2 mM glutamine, 15 mM NaHC03, 10 mM HEPES, 25 μg / ml insulin, 100 μg / ml transferrin, 60 μg putrescine, 20 nM progesterone, 30 μM Na selenite, 5 μg / ml penicillin G, 0.5 μg / ml streptomycin and 2.5 μg / ml bovine serum albumin. The grinding can then be repeated twice and the supernatants can be pooled and filtered through a 40 μ Tetko filter. The dissociated ventral cells can then be plated on a culture plate coated with poly-D-lysine (10 μg / ml) at a density of 0.5 million cells per 35 mm dish. Dissociated mediodorsal cells can be plated at a density of 1.5 million cells per 35 mm plate coated with poly-D-lysine (10 μg / ml), poly-L-ornithine (10 μg / ml) or poly-L -ornithine plus laminin (5 μg / ml). (v) baseline forebrain cholinergic neuron assays (see PCT Publication WO 91/03568, published March 21, 1991); (vi) testing of ventricular mesencephalic dopaminergic neurons (see PCT Publication WO 91/03568, published March 21, 1991; and (vii) PC12 cell assays.
6. EXEMPLO: CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DA QUIMERA NGF-PREPRO/BDNF MADURO6. EXAMPLE: CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF NGF-PREPRO / BDNF MADURO CHIMMER
6.1. CONSTRUÇÃO DE MOLÉCULAS DE ÁCTDO NUCLEICO QUIMÉRICAS USANDO REACCÃO EM CADEIA DE POLIMERASE6.1. CONSTRUCTION OF CHEMICAL NUCLEIC ACID MOLECULES USING POLYMERASE CHAIN REACTION
Foi utilizada uma clonagem por reacção em cadeia de polimerase (PCR; Saiki et al.. 1985, Science 230:1350-1354) para a construção de uma quimera prepro NGF/BDNF maduro consistindo na forma prepro comprida de NGF de ratinho fundida com a sequência de BDNF humano maduro. 74 586 6526-056-118 -27-Polymerase chain reaction cloning (PCR; Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1354) was used for the construction of a mature NGF / BDNF prepro chimera consisting of the long prepro form of mouse NGF fused to mature human BDNF sequence. 74 586 6526-056-118 -27-
PCR. O iniciador 5' (5'-CTC-GTC-GAC-AGC-CGG-CAC-TCT-GAC-CCT-GCG-CGC-CGA-3') [SEQ ID Na17] codificava os 7 primeiros aminoácidos do BDNF incluindo dois sítios de restrição únicos, Nael e BssH2, que foram gerados por modificação da utilização dos codões. 0 inicador 3' de PCR era um oligo 3· pCDM8 correspondendo a uma região a jusante da sequência poliligadora na extremidade 3' da sequência de BDNF em pC8hB (5'-CAA-AGA-TCC-TCT-AGA-GTC-G(C)-3') [SEQ ID Na18 ]. 0 poliligador contém um sítio de restrição Notl. Estes dois iniciadores foram usados em PCR com ADN de pC8hB (hBDNF em pCDM8) como molde. Usaram-se 5 microgramas de pCShBcom 500 ng de cada um dos iniciadores durante 5 ciclos de PCR. 0 produto de PCR foi digerido com Nael e Notl simultaneamente e isolou-se um produto de digestão de 365 pb por electroforese em gel. A preparação do vector foi realizada por digestão do pC81mN (NGF de ratinho, comprido, em pCDM8) com Eco47 e Notl e isolamento do fragmento de vector de 4,6 kb por electroforese em gel. O fragmento de 365 pb foi ligado nos sítios Eco47/Notl do pC8lmN. Esta ligação resultou numa fusão directa no quadro da região prepro do NGF de ratinho com a região de codificação do BDNF maduro. As construções foram testadas diagnosticamente por digestão com BssH2, avaliando a perda do sítio Eco47 durante a subclonagem e, por fim, por sequênciação de ADN.PCR. The 5 'primer (5'-CTC-GTC-GAC-CGC-CGC-CAC-TCT-GAC-CCT-GCG-CGC-CGC-CGA-3') [SEQ ID Na17] encoded the first 7 amino acids of BDNF including two sites NaEL and BssH2, which were generated by modifying the use of the codons. The 3 'primer was a 3' pCDM8 oligo corresponding to a region downstream of the polylinker sequence at the 3 'end of the BDNF sequence in pC8hB (5'-CAA-AGA-TCC-TCT-AGA-GTC-G (C ) -3 ') [SEQ ID Na18]. The polylinker contains a NotI restriction site. These two primers were used in PCR with pC8hB DNA (hBDNF in pCDM8) as template. Five micrograms of pCShB were used with 500 ng of each of the primers for 5 cycles of PCR. The PCR product was digested with Nael and Notl simultaneously and a 365 bp digestion product was isolated by gel electrophoresis. The vector preparation was performed by digesting pC81mN (mouse NGF, long in pCDM8) with Eco47 and NotI and isolating the 4.6 kb vector fragment by gel electrophoresis. The 365 bp fragment was ligated into the Eco47 / NotI sites of pC81 mM. This binding resulted in a direct fusion within the prepro region of the mouse NGF with the mature BDNF coding region. The constructs were diagnostically tested by digestion with BssH2, evaluating the loss of the Eco47 site during subcloning and, finally, by DNA sequencing.
6.2.EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS QUIMÉRICAS6.2.CHECKING OF CHEMICAL MOLECULES
Usaram-se células CHO-DG44 para se gerarem linhas estáveis para a produção de BDNF bioactivo. As células CHO-DG44 (obtidas junto do Dr. L. Chasin da Universidade de Columbia) não têm ambas as cópias do gene da di-hidrofolato-redutase (Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220). As linhas de células CHO-DG44, estavelmente transfectadas, expressando BDNF, foram anteriormente descritas (Publicação Internacional de PCT Na WO 91/03568, publicada em 21.de Março de 1991). Estas linhas foram geradas por transfecção com ADN de pC8hB que codifica o gene do BDNF humano incluindo a região prepro clonada no vector de expressão pCDM8. As células CHO-DG44 (lxlO6 células/placa de 100 mm) foram transfectadas pelo proceso da coprecipitação com -28- 74 586 6526-056-118 fosfato de cálcio com 20 μg da quimera NGF/BDNF (pC81mN/B) em conjunto com 0,2 /tg do plasmideo p410 que codifica um gene enfraquecido da di-hidrofolato-redutase (dhfr). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram passadas em meios de selecção (F12 de Ham sem hipoxantina e timidina contendo 10% de soro de bovino fetal dialisado e 1% de cada um de penicilina e estreptomicina; meios -HT). Os clones resistentes a -HT foram tratados como conjuntos para amplificação com metotrexato (MTX). Os clones obtidos com MTX 0,05μΜ foram também tratados como conjuntos para amplificação adicional com MTX 2,5 μΜ. Isolou-se um clone único, seleccionado primeiro em MTX 0,05 μΜ e, depôis, em MTX 2,5 μΜ (consequentemente duas séries de amplificação) (DGC-N/B-2.5#23), que provou ser o maior produtor de BDNF tal como avaliado por bioactividade e marcação metabólica. Avaliou-se a bioactivdade classificando o crescimento para o exterior de neurites de gânglios da raiz dorsal (DRG) de pinto embrionário (E8) (Maisonpierre et al. . 1990, Science 247.:1446-1451).CHO-DG44 cells were used to generate stable lines for the production of bioactive BDNF. CHO-DG44 cells (obtained from Dr. L. Chasin of Columbia University) do not have both copies of the dihydrofolate reductase gene (Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220). Stably transfected CHO-DG44 cell lines expressing BDNF were previously described (PCT International Publication WO 91/03568, published March 21, 1991). These lines were generated by transfection with pC8hB DNA encoding the human BDNF gene including the prepro region cloned into the pCDM8 expression vector. CHO-DG44 cells (1 x 106 cells / 100 mm dish) were transfected by the coprecipitation process with calcium phosphate with 20 μg of the NGF / BDNF chimera (pC81mN / B) together with 0.2 μg of plasmid p410 encoding a weakened dihydrofolate reductase (dhfr) gene. Forty-eight hours post-transfection, the cells were passed through selection media (Ham's F12 without hypoxanthine and thymidine containing 10% dialyzed fetal bovine serum and 1% each of penicillin and streptomycin; The HTH-resistant clones were treated as pools for methotrexate (MTX) amplification. Clones obtained with 0.05 μM MTX were also treated as pools for further amplification with 2.5 μM MTX. A single clone, selected first in 0.05 μM MTX and, by deposition, in 2.5 μ MT MTX (hence two amplification series) (DGC-N / B-2.5 # 23), which proved to be the largest producer of BDNF as assessed by bioactivity and metabolic labeling. The bioactivity was assessed by classifying the outward growth of embryonic chick dorsal root ganglia (DRG) neurites (E8) (Maisonpierre et al., 1990, Science 247: 1446-1451).
7. EXEMPLO: COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE PROCESSAMENTO ENTRE BDNF PREPRO. HOMOLOGO. E A QUIMERA NGF PREPRO/BDNF7. EXAMPLE: COMPARISON OF PROCESSING EFFICIENCY BETWEEN BDNF PREPRO. HOMOLOGO. AND THE CHEMERA NGF PREPRO / BDNF
Realizaram-se experiências para a comparação directa do processamento e expressão do BDNF prepro com a quimera NGF prepro/BDNF em células CHO.Experiments were performed for the direct comparison of the processing and expression of prepro BDNF with the NGF prepro / BDNF chimera in CHO cells.
7.1 MARCAÇÃO METABÓLICA7.1 METABOLIC MARKING
As linhas de células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com pC8hD ou pC81mN/B e amplificadas com metotrexato 2,5 μΜ foram comparadas por marcação metabólica (Figura 1). Para esta experiência de marcação, as células CHO-DG44 que expressam BDNF da construção de BDNF prepro curta (linha celular=DGZ1000-B-3-2.5) ou da construção quimérica NGF prepro comprida de ratinho/BDNF (linha celular=DGC-N/B-2.5-#23) foram semeadas a densidades iguais (2xl05 células/alvéolo em placa de 6 alvéolos) 24 horas antes da marcação. As células foram, então, marcadas com 35S-cisteína e 35S-metionina durante 4 horas sob condições de isenção de soro. Resolveram-se aliquotas de 30 μΐ dosCHO-DG44 cells stably transfected with pC8hD or pC81mN / B and amplified with 2.5 μM methotrexate were compared by metabolic labeling (Figure 1). For this labeling experiment, BDNF-expressing CHO-DG44 cells from the short preprocedure BDNF construct (cell line = DGZ1000-B-3-2.5) or from the prepro long NGF chimeric construct from mouse / BDNF (cell line = DGC-N /B-2.5-#23) were seeded at equal densities (2x105 cells / well in 6-well plate) 24 hours prior to labeling. Cells were then labeled with 35 S-cysteine and 35 S-methionine for 4 hours under serum-free conditions. Aliquots of 30 μΐ of
74 586 6526-056-118 -29- sobrenadantes de células marcadas por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (gel a 15%) e as proteínas marcadas foram transferidas para membranas de nylon e visualizadas por auto-radiografia. Tal como se observa na Figura 1, as células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o gene do NGF humano no vector de expressão pCDM8 expressaram a forma madura do NGF que migrava a uma massa molecular de aproximadamente 12 300 (Figura 1, faixa 2). Na faixa 1 mostram-se células CHO-DG44 de tipo selvagem, como controlo. Detectaram-se proBDNF não processado (31 kD), a porção pro do precursor proBDNF processado (16 kD) e a forma madura (14 kD) a proteína BDNF prepro curta, na linha celular transfectâda estavelmente DGZ1000-B-3-2.5 (obtida após selecção semelhante em MTX e amplificação tal como usada para a linha celular DGC-N/B-2.5-#23) (Figura l, faixa 3). Apenas se detectou a forma madura processada proteoliticamente de BDNF (14 kD) em DGC-N/B-2.5-#23, estavelmente transfectada com a construção quimérica proNGF/BDNF comprida (Figura 1, faixa 4). Não foi detectado proNGF/BDNF nos meios condicionados desta linha celular. Calculamos, a partir da intensidade da marcação do BDNF maduro, que a linha celular DGC-N/B-2.5-#23 produza cerca de cinco (5) vezes mais proteína BDNF madura por célula em relação à linha celular DGZ1000-3-2.5 feita com a construção proBDNF curta.Supernatants from cells labeled by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (15% gel) and the labeled proteins were transferred to nylon membranes and visualized by autoradiography. As seen in Figure 1, CHO-DG44 cells stably transfected with the human NGF gene in the pCDM8 expression vector expressed the mature form of NGF migrating to a molecular mass of approximately 12,300 (Figure 1, lane 2). Wild-type CHO-DG44 cells are shown in lane 1 as a control. Unprocessed proBDNF (31 kD), the propro portion of the processed proBDNF precursor (16 kD) and the mature form (14 kD) were preprocessed short BDNF protein in the stably transfected cell line DGZ1000-B-3-2.5 (obtained after similar selection in MTX and amplification as used for the DGC-N / B-2.5- # 23 cell line (Figure 1, lane 3). Only the mature, proteolytically processed form of BDNF (14 kD) in DGC-N / B-2.5- # 23, stably transfected with the long proNGF / BDNF chimeric construct (Figure 1, lane 4) was detected. No proNGF / BDNF was detected in the conditioned media of this cell line. We calculated, from the strength of mature BDNF labeling, that the DGC-N / B-2.5- # 23 cell line produces about five (5) fold more mature BDNF protein per cell relative to the DGZ1000-3-2.5 cell line made with short proBDNF construction.
7.2 BIOACTIVIDADE7.2 Bioactivity
Comparou-se a bioactividade do BDNF produzido nas duas linhas de células CHO, descritas anteriormente. Os sobrenadantes em bruto foram ensaiados com gânglios da raiz dorsal de pinto embrionário (E8) e registou-se o crescimento para o exterior de neurites. Consistentemente com as experiências de marcação metabólica, a linha celular DGC-N/B-2.5-#23 parecia produzir aproximadamente cinco (5) vezes mais BDNF maduro em relação à linha celular DGZ1000-B-3-2.5. Por exemplo, o crescimento para o exterior de neurites máximo foi conseguido com 10 μΐ de sobrenadante derivado de células DGC-N/B-2.5-#23 ao passo que eram necessários 50 μΐ de sobrenadante de DGZ1000-B-3-2.5 para conseguir a bioactividade máxima de DRG (Figura 2). 74 586 6526-056-118The bioactivity of the BDNF produced in the two CHO cell lines described above was compared. Crude supernatants were assayed with embryonic dorsal root ganglia (E8) and outgrowth of neurites was recorded. Consistent with metabolic labeling experiments, the DGC-N / B-2.5- # 23 cell line appeared to produce approximately five (5) times more mature BDNF relative to the DGZ1000-B-3-2.5 cell line. For example, maximum neurite outward growth was achieved with 10 μΐ of DGC-N / B-2.5- # 23 cell derived supernatant whereas 50 μΐ of DGZ1000-B-3-2.5 supernatant was required to achieve the maximal bioactivity of DRG (Figure 2). 74 586 6526-056-118
•sP"' -30- 7.3• sP " ' 7.3
COMPARAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NGF USANDO REGIÕES PREPRO DE NGF COMPRIDA E CURTACOMPARISON OF NGF EXPRESSION USING NGF PREPRO REGIONS COMPLETED AND SHORT
As células COS foram transfectadas com NGF prepro contendo a região comprida (,,lmNGFH) ou curta ("smNGF") do NGF prepro com a região de codificação do NGF maduro. Os sobrenadantes da cultura foram recolhidos 48 horas após a transfecção e ensaiados em explantes de DRG, em conjunto com o NGF purificado e um sobrenadante de células COS falsamente transfectadas. Os resultados usando três concentrações diferentes de cada construção, como se mostra na Tabela 1, revelam bioactividade significativa do NGF expresso com qualquer uma das formas comprida e curta da região prepro. TABELA 1COS cells were transfected with prepro NGF containing the long region (1mNGFH) or short (" smNGF ") of NGF prepro with the mature NGF coding region. Culture supernatants were harvested 48 hours post-transfection and assayed in DRG explants, together with purified NGF and a supernatant of falsely transfected COS cells. The results using three different concentrations of each construct, as shown in Table 1, show significant bioactivity of NGF expressed in any of the short and long forms of the prepro region. TABLE 1
Efeito dos Vários Sobrenadantes de Células COS em Explantes de DRG AMOSTRA DILUIÇÃO DRG (-) CONTROLO NGF io ng/ml 0, 0, 0, 0, 0,5 5+,5+,5+,5+,5+ FALSA 10 jLíl 0, 1, 1, 1, 1 50 JL6l 0,5, 1, 1, 1, 1,5 100 μΐ 0,5, 0,5, 1, 1, 1 250 μΐ 2, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5 smNGF 10 μΐ 2, 3, 3, 3, 3,5 50 μΐ 5, 5, 5, 5, 5 100 μΐ 5+, 5+, 5+, 5+, 5+ 250 μΐ 5+, 5+, 5+, 5+, 5+ lmNGF 10 μΐ 2, 2, 2, 2, 2 50 μΐ 4, 4, 4, 4, 4 100 μΐ 5, 5, 5, 5, 5 250 μΐ 5, 5, 5, 5, 5 74 586Effect of Various COS Cell Supernatants on DRG Explants SAMPLE DILUTION DRG (-) CONTROL NGF io ng / ml 0, 0, 0.55 + 5 + 5 + 5 + 5 + FALSE 10 0.5, 1, 1, 1, 250, 2, 2.5, 2, 1, 1, 1, 5, 2.5, 2.5 smNGF 10 μΐ 2, 3, 3, 3, 3.5 50 μΐ 5, 5, 5, 5 100 μΐ 5+, 5+, 5+, 5+, 5+ 250 μΐ 5+, 5+, 5+, 5+, 5+ lmNGF 10 μΐ 2, 2, 2, 2, 2 50 μΐ 4, 4, 4, 4, 4 100 μΐ 5, 5, 5, 5 250 μΐ 5, 5, 5, 5, 5 74 586
6526-056-118 -31-6526-056-118 -31-
7.4.CONCLUSÕES7.4.CONCLUSIONS
Conclui-se destes estudos que a porção pro comprida do NGF é melhor adequada para o processamento do BDNF em células CHO do que a porção pro curta do BDNF. As vantagens da construção de gene quimérica proNGF/BDNF maduro, consiste em permitir maiores níveis de expressão de BDNF numa base por célula em células de mamífero. Adicionalmente, deve permitir melhores esquemas de purificação para o BDNF por não aparecerem formas contaminantes de BDNF não processado nos sobrenadantes em bruto.It is concluded from these studies that the pro long portion of NGF is better suited for the processing of BDNF in CHO cells than the short pro portion of BDNF. The advantages of the mature proNGF / BDNF chimeric gene construct are to allow higher levels of BDNF expression on a per cell basis in mammalian cells. Additionally, it should allow better purification schemes for BDNF as no contaminant forms of unprocessed BDNF appear in the crude supernatants.
Para além disso, a utilização da região prepro comprida ou curta do NGF resulta na expressão de NGF biologicamente activo. Isto indica que a região prepro comprida ou curta do NGF pode ser utilizada na construção de genes neurotróficos quiméricos.In addition, the use of the long or short prepro region of NGF results in the expression of biologically active NGF. This indicates that the long or short prepro region of NGF can be used in the construction of chimeric neurotrophic genes.
8. EXEMPLO: CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DA QUIMERA NT-3 PREPRO/BDNF8. EXAMPLE: CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF THE NT-3 PREPRO / BDNF CHIMERA
8.1. CONSTRUÇÃO DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUIMÉRICAS8.1. CONSTRUCTION OF CHEMICAL NUCLEIC ACID MOLECULES
Obteve-se um fragmento de ADN de Hindlll-Xhol contendo toda a região de codificação do BDNF prepro e maduro humano a partir de digestão do plasmideo pC8hB com as enzimas de restrição correspondentes. O plasmideo pC8hB foi derivado por clonagem das sequências de codificação do BDNF humano, incluindo toda a região prepro, no vector de expressão pCDM8 (discutido supra). este fragmento foi ligado em pDSRa2 (ver Pedido de Patente Europeia Publicado 90305433.6, Publicação EPO Νδ 0398753A2, incorporada aqui para referência na sua totalidade. O plasmideo pDSRa2 tinha sido previamente digerido para tornar disponíveis os sítios de clonagem δ'-ΗΐηάΙΙΙ e 3/-Sall, para ligação do fragmento contendo BDNF humano. O plasmideo resultante foi designado pDSRa2(BDNF).A HindIII-XhoI DNA fragment containing the entire coding region of human prepro and mature BDNF was obtained from digestion of plasmid pC8hB with the corresponding restriction enzymes. Plasmid pC8hB was derived by cloning the human BDNF coding sequences, including the entire prepro region, into the pCDM8 expression vector (discussed supra). this fragment was ligated into pDSRa2 (see European Published Patent Application 90305433.6, EPO Publication 0398753A2, incorporated herein by reference in its entirety. Plasmid pDSRa2 had been pre-digested to make available the cloning sites δ'-ΗΐηάΙΙΙ and 3 / Sal I for attachment of the human BDNF containing fragment. The resulting plasmid was designated pDSRα2 (BDNF).
Para a geração de um plasmideo quimérico com uma sequência NT-3 prepro e uma sequência BDNF madura, prepararam-se três fragmentos de ADN como se segue, e em seguida ligaram-se numa orientação específica. Um fragmento de ADN 5/-HindIII/3/-NarI de 74 586 6526-056-118 -32-For generation of a chimeric plasmid with a prepro NT-3 sequence and a mature BDNF sequence, three DNA fragments were prepared as follows, and then ligated in a specific orientation. A 5'-HindIII / 3 / -NarI DNA fragment of 74 586 6526-056-118 -32-
aproximadamente 400 pb contendo toda a sequência de BDNF prepro humano sofreu delecção por digestão com enzima de restrição a partir do plasmideo de expressão pDSRa2(BDNF) descrito anteriormente. Um fragmento de ADN recuperado desta digestão continha todo o vector de expressão pDSRa2 e a sequência de BDNF humano maduro, limitada pelos sítios 5'-HindIII e 3#-NarI (fragmento de ADN marcado Nal). Um fragmento de ADN δ'-ΗίηάΙΙΙ/^'-SacII de aproximadamente 300 pares de bases, contendo a região prepro da NT-3 humana, foi obtido através de digestão do plasmideo pC8hN3 com as enzimas de restrição correspondentes. Sequências de codificação, correspondendo a 35 resíduos de aminoácido da região prepro da NT-3, sofreram delecção a jusante do sítio SacII como uma consequência da digestão. 0 plasmideo pC8hN3 foi derivado por clonagem das sequências de codificação de NT-3 humana, incluindo toda a região prepro, no vector de expressão pCDM8. 0 fragmento de 300 pares de bases 5/-HindIII/3/-SacII foi marcado fragmento de ADN Na2. Finalmente, preparou-se o fragmento de ADN Na3, que era um ligador oligonucleotídico sintetizado para regenerar os 35 resíduo de aminoácido em falta, anteriormente referidos (Figura 6 e SEQ ID N2:15-17). O ligador também continha os meios sítios dos sítios de restrição 5'-SacII e 3'-Narl para promover a ligação aos fragmentos de ADN N8s 1 e 2 descritos supra. Esta ligação resultou no vector de expressão pDSRa2(NT-3/BDNF), em que a região prepro da NT-3 (fragmento Ns2) está ligada ao BDNF maduro (fragmento Nal) pelo ligador oligonucleotídico (fragmento Na3; Figura 6 e SEQ IDNa:15).approximately 400 bp containing the entire human prepro BDNF sequence was deleted by restriction enzyme digestion from the pDSRa2 expression plasmid (BDNF) described above. A DNA fragment recovered from this digestion contained the entire pDSRα2 expression vector and the mature human BDNF sequence, bounded by the 5'-HindIII and 3'-NariI sites (Nal labeled DNA fragment). A δ'-ΗίηάΙΙΙ / ''-SacII fragment of approximately 300 base pairs containing the prepro region of human NT-3 was obtained by digestion of the plasmid pC8hN3 with the corresponding restriction enzymes. Coding sequences, corresponding to 35 amino acid residues from the prepro region of NT-3, were deleted downstream of the SacII site as a consequence of digestion. Plasmid pC8hN3 was derived by cloning the human NT-3 coding sequences, including the entire prepro region, into the pCDM8 expression vector. The 300 bp 5-HindIII / 3 / -SacII fragment was labeled Na2 DNA fragment. Finally, the Na3 DNA fragment, which was an oligonucleotide linker synthesized to regenerate the previously missing amino acid residue, was prepared (Figure 6 and SEQ ID NO: 15-17). The linker also contained the half sites of the 5'-SacII and 3'-Narl restriction sites to promote binding to the N8s 1 and 2 DNA fragments described supra. This binding resulted in the expression vector pDSRa2 (NT-3 / BDNF), wherein the NT-3 prepro region (Ns2 fragment) is bound to the mature BDNF (Nal fragment) by the oligonucleotide linker (Na3 fragment; Figure 6 and SEQ ID NO 15).
8.2. EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DA QUIMERA NT-3/BDNF EM CÉLULAS CHO8.2. EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF NT-3 / BDNF CHEMERA IN CHO CELLS
Usaram-se células CHO-D(-) (número de acesso ao ATCC CCL 61) para gerarem linhas estáveis para produção de BDNF bioactivo. As células CHO-D(-) não têm o gene codificando a di-hidrofolato--redutase e são mantidas no meio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM), suplementado com aminoácidos não essenciais de MEM, 1% de cada uma de penicilina e estreptomicina, 10% de soro de bovino fetal, hipoxantina e timidina. As células CHO-D(-) (0,8xl06/placa 74 586 6526-056-118 -33-CHO-D (-) cells (ATCC accession number CCL 61) were used to generate stable lines for bioactive BDNF production. CHO-D (-) cells lack the gene encoding dihydrofolate reductase and are maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM), supplemented with MEM non-essential amino acids, 1% each of penicillin and streptomycin, 10% fetal bovine serum, hypoxanthine and thymidine. CHO-D (-) cells (0.8 x 106 / plate 74 586 6526-056-118)
fosfato de cálcio, usando 2,5 μg da construção quimérica NT-3/BDNF [pDSRa2(NT-3/BDNF)] linearizado previamente por digestão com enzima de restrição Pvul. Este vector (pDSRa2) codifica um minigene da di-hidrofolato-redutase de ratinho (dhfr) que, quando expresso, permite às células CHO-(-) transfectadas ultrapassarem a deficiência no gene dhfr e tornarem-se capazes de crescerem na ausência dos nucleótidos hipoxantina e timidina. As células CHO-D(-) progenitoras ou as células transfectadas sem sucesso pelo vector pDSRa2 não sobreviverão nos meios de selecção, que tem a composição do meio de manutenção descrito anteriormente, com a excepção de o soro de bovino fetal ser substituído por soro de bovino fetal dialisado e a hipoxantina e a timidina serem omitidas. As células foram tripsinizadas e semeadas 48 horas após a transfecção a lxlO5 células /placa de 100 mm em meios de selecção. As colónias individuais foram recolhidas duas semanas mais tarde usando cilindros de clonagem. Cada clone foi expandido em placas de 100 mm. Quando as culturas atingiram a confluência, os meios originais contendo soro foram aspirados e substituídos com 3 ml de meios isentos de soro. Os meios condicionados (CM) foram recolhidos e carregou-e 50 μΐ de cada um num gel de pliacrilamida-SDS a 15% e submeteram-se a electroforese em gel. A transferência de Western do gel foi realizada com antissoro de coelho específico para o BDNF maduro. Como se mostra na figura 7, todos os clones expressando o BDNF original a partir de pDSRa2(BDNF) segregaram formas múltiplas de BDNF não processado, para além da forma madura, processada de BDNF. A razão de formas não processadas para forma processada era de cerca de 2:1. Em contraste, todos os clones expressando NT-3/BDNF quimérico a partir de pDSRa2(BDNF) segregaram apenas a forma totalmente processada, madura do BDNF sem precursores parcialmente processados detectáveis.calcium phosphate using 2.5 μg of the NT-3 / BDNF chimeric construct [pDSRα2 (NT-3 / BDNF)] pre-linearized by restriction enzyme digestion Pvul. This vector (pDSRa2) encodes a mouse dihydrofolate reductase (dhfr) minigene which, when expressed, allows transfected CHO - (-) cells to overcome deficiency in the dhfr gene and become capable of growing in the absence of the nucleotides hypoxanthine and thymidine. The progenitor CHO-D (-) cells or cells unsuccessfully transfected by the vector pDSRa2 will not survive in the selection media, which has the maintenance medium composition described above, except that the fetal bovine serum is replaced with serum of bovine fetal dialysate and hypoxanthine and thymidine are omitted. Cells were trypsinized and seeded 48 hours post-transfection at 1 x 10 5 cells / 100 mm dish in selection media. Individual colonies were collected two weeks later using cloning cylinders. Each clone was expanded into 100 mm plates. When cultures reached confluency, the original serum-containing media were aspirated and replaced with 3 ml of serum-free media. The conditioned media (CM) was collected and loaded 50 μΐ each onto a 15% SDS-polyacrylamide gel and subjected to gel electrophoresis. Western blotting of the gel was performed with rabbit antiserum specific for mature BDNF. As shown in Figure 7, all clones expressing the original BDNF from pDSRa2 (BDNF) secreted multiple forms of unprocessed BDNF, in addition to the mature, processed form of BDNF. The ratio of unprocessed forms to processed form was about 2: 1. In contrast, all clones expressing chimeric NT-3 / BDNF from pDSRa2 (BDNF) secreted only the fully processed, mature form of BDNF without detectable partially processed precursors.
Um litro de meios condicionados isentos de soro de um dos clones NT-3/BDNF quiméricos foi submetido a purificação por passagem através de uma coluna de S-Sepharose seguida por uma coluna de exclusão de tamanhos Sephacryl S-200. A análise porOne liter of serum-free conditioned media from one of the chimeric NT-3 / BDNF clones was subjected to purification by passage through an S-Sepharose column followed by a Sephacryl S-200 size exclusion column. The analysis by
74 586 6526-056-118 -34- SDS-PAGE e a determinação da sequência de aminoácidos mí que tinha sido obtida uma proteína homogénea com uma massa molecular de 14 kD (tal como previsto para o BDNF maduro humano), com uma sequência N-terminal única de acordo com a sequência N-terminal do BDNF humano maduro. Para além disso, demonstrou-se por ensaio de gânglios da raiz dorsal de pinto (descrito para a quimera NT-3/BDNF, supra) que o BDNF purificado possuía actividade biológica completa.SDS-PAGE and determination of the amino acid sequence m and a homogeneous protein having a molecular weight of 14 kD (as predicted for mature human BDNF) had been obtained with an N sequence terminal sequence according to the N-terminal sequence of mature human BDNF. In addition, it was demonstrated by pinto dorsal root ganglia assay (described for chimeric NT-3 / BDNF, supra) that purified BDNF had complete biological activity.
8.3. EXPRESSÃO EM CÉLULAS COS E BIOACTIVIDÃDE DA QUIMERA NT—3/BDNF8.3. EXPRESSION IN COS-BIOACTIVIDIDES OF BACTERIUM NT-3 / BDNF
Usaram-se células COS-7 (número de acesso ao ATCC CRL 1651) como sistema de expressão transiente para testar a produção de BDNF bioactivo. As células COS-7 são rotineiramente mantidas em D-MEM com 10% de soro de bovino fetal e 1% dos antibióticos penicilina e estreptomicina. As células COS-7 (5xl06 células/ml) foram transfectadas por electroporação a 1600 volt durante 0,4 ms com, individualmente, 20 μg de cada um de pDSRa2, pDSRa2(BDNF) e pDSRa2(NT-3/BDNF). As células COS-7 transfectadas foram plaqueadas a 2xl06 células/placa de 60 mm. Recolheu-se meio condicionado acumulado entre 24 e 72 horas após transfecção. Avaliou-se a bioactividade graduando o crescimento para o exterior de neurites de gânglios da raiz dorsal de pinto (E8) (tal como para a quimera NGF/BDNF). Tal como se mostra na tabela 2, o isolados clonais Cl 1 e Cl 20 do pDSRa2(NT-3/BDNF) quimérico eram aproximadamente 5 vezes mais activos do que o BDNF maduro expresso a partir de pDSRa2(BDNF), contendo este último a região prepro inalterada do BDNF. (SEGUE TABELA 2)COS-7 cells (ATCC accession number CRL 1651) were used as the transient expression system to test the production of bioactive BDNF. COS-7 cells are routinely maintained in D-MEM with 10% fetal bovine serum and 1% of the antibiotics penicillin and streptomycin. COS-7 cells (5x106 cells / ml) were transfected by electroporation at 1600 volts for 0.4 ms with individually 20 μg of each of pDSRa2, pDSRa2 (BDNF) and pDSRa2 (NT-3 / BDNF). Transfected COS-7 cells were plated at 2x106 cells / 60mm dish. Conditioned media was collected between 24 and 72 hours post-transfection. Bioactivity was assessed by grading the outgrowth of pinus dorsal root ganglia (E8) neurites (such as for the NGF / BDNF chimera). As shown in Table 2, clonal isolates Cl 1 and Cl 20 of chimeric pDSRa2 (NT-3 / BDNF) were approximately 5-fold more active than mature BDNF expressed from pDSRa2 (BDNF), the latter containing unprocessed pre-BDNF region. (SECTION TABLE 2)
74 586 6526-056-118 -35- TABELA 274 586 6526-056-118 TABLE 2
Ensaio de Explantes de DRG de Pinto de Meios Condicionados a Partir de Células COS Transfectadas com ADN Plasmídico 1- 1 FONTE DE ADN -Γ 1 Volume de 1--, | Graduação do cresci- 1 1 Meio testado | mento para o exterior | 1 I μ,Ι | de neurites 1 J_ 1 |pDSRa2 1 1 10 o O ** o o o 1 I 50 10, 0, 0, 0,5, 0,5 | I 1 |pDSRa2(BDNF) 1 1 10 1 1 |0, 0,5, 0,5, 0,5, 0,5 | 1 I 50 |1, 1/ 1/ 1/5, 1/5 | I I |pDSRa2(NT-3/BDNF), 1 CI 2 | 10 1 1 |1, 1, 1/5, 1,5, 1,5 | 1 I 50 |2,5, 2,5, 2,5, 2, 2 | |pDSRa2(NT-3/BDNF), 1 CI 20 | 10 1 1 |1/ 1/ 2, 2, 2 | 1 1 _L 50 |2,5, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5 J 1 1Pinto DRG Explants Assay of Media Conditioned from COS Cells Transfected with Plasmid DNA 1- 1 DNA FOUND -Γ 1 Volume of 1-, Graduation of the 1 1 Med. to the outside | 1 I μ, Ι | of neuritis 1 1 | pDSRa2 1 1 10 o O ** o o 1 1 50 10, 0, 0.5, 0.5 | I 1 | pDSRa2 (BDNF) 1 1 10 1 1 | 0, 0.5, 0.5, 0.5, 0.5 | 1 I 50 | 1, 1/1 / 1/5, 1/5 | I 1 pDSRa 2 (NT-3 / BDNF), 1 IC 2 | 10 1 1 | 1, 1, 1/5, 1,5, 1,5 | 1 I 50 2.5, 2.5, 2.5, 2, 2 | | pDSRa2 (NT-3 / BDNF), 1 IC 20 | 10 1 1 | 1/1/2, 2, 2 | 1 1 50 50 2.5, 2.5, 2.5, 2.5, 2.5 J 11
8.4. CONCLUSÕES8.4. CONCLUSIONS
Estes estudos demonstram que a substituição da região prepro do BDNF com a região prepro de NT-3 facilita o processamento proteolítico da região prepro e aumenta significativamente o rendimento líquido do BDNF maduro. Além disso, o sítio de clivagem reconstituído entre as sequências de ADN de NT-3 prepro e BDNF maduro foi reconhecido com precisão pela célula hospedeira sem qualquer alteração no terminal NH2 do BDNF processado, maduro. Tal como com a construção de gene quimérico de NGF/BDNF, a construção de gene quimérico de NT-3/BDNF resulta em níveis mais elevados de BDNF processado na base de uma célula em células de mamíferos e isto deve também permitir melhores esquemas de purificação por eliminação e minimização de formas contaminantes não processadas.These studies demonstrate that the substitution of the prepro region of BDNF with the prepro region of NT-3 facilitates proteolytic processing of the prepro region and significantly increases the net yield of mature BDNF. In addition, the cleavage site reconstituted between the prepro NT-3 and mature BDNF DNA sequences was accurately recognized by the host cell without any change in the NH 2 terminus of the mature, processed BDNF. As with the chimeric NGF / BDNF gene construct, the chimeric NT-3 / BDNF gene construct results in higher levels of BDNF processed at the base of a cell in mammalian cells and this should also allow for better purification schemes by eliminating and minimizing unprocessed contaminant forms.
74 586 6526-056-118 -36- 0 presente invento não deve ser limitado em âmbito pelas concretizações específicas aqui descritas. De facto, várias modificações do invento, para além das descritas aqui tornar-se--ão evidentes para os peritos na arte a partir da descrição anterior e das figuras que a acompanham. Estas modificações destinam-se a cair dentro do âmbito das reivindicações em anexo. São aqui citadas várias publicações e pedidos de patente, sendo as suas descrições incorporadas para referência nas suas totalidades.The present invention is not to be limited in scope by the specific embodiments described herein. In fact, various modifications of the invention, in addition to those described herein, will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and the accompanying figures. These modifications are intended to fall within the scope of the appended claims. Various publications and patent applications are cited herein, and their disclosures are incorporated by reference in their entirety.
Lisboa, 13. íiQ'!. 1992Lisbon, 13. 1992
Por RE6ENER0N PHARMACEUTICALS, INC. e AMGEN, INC. =0 AGENTE 0FICIAL=By RE6ENER0N PHARMACEUTICALS, INC. and AMGEN, INC. = 0 FACTORY AGENT =
Claims (50)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US79249291A | 1991-11-14 | 1991-11-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PT101064A true PT101064A (en) | 1994-02-28 |
Family
ID=25157066
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PT101064A PT101064A (en) | 1991-11-14 | 1992-11-13 | PROTEINS AND PREPRO CHEMICALS, NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CODE THEM, AND PRODUCTION PROCESS OF A NEUROTROFIN |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07501220A (en) |
CN (1) | CN1078493A (en) |
AU (1) | AU3074992A (en) |
IL (1) | IL103751A0 (en) |
PT (1) | PT101064A (en) |
WO (1) | WO1993010150A1 (en) |
ZA (1) | ZA928776B (en) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5166317A (en) * | 1988-10-31 | 1992-11-24 | Houston Biotechnology Incorporated | Neurotrophic factor |
AU3564595A (en) * | 1994-09-12 | 1996-03-29 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Biologically active molecules derived from neurotrophins |
DE69738521T2 (en) | 1996-04-05 | 2009-05-07 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville | ALPHAVIRUS VECTORS WITH A REDUCED INHIBITION OF THE SYNTHESIS OF CELL MACROMOLECULES |
WO1998022614A1 (en) * | 1996-11-19 | 1998-05-28 | Yamasa Corporation | Process for producing nucleoside 5'-triphosphates and application of the same |
US6143496A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4923808A (en) * | 1985-03-12 | 1990-05-08 | Genentech, Inc. | Method for identifying mutants secreting high levels of heterologous proteins |
-
1992
- 1992-11-13 JP JP5509415A patent/JPH07501220A/en active Pending
- 1992-11-13 WO PCT/US1992/009792 patent/WO1993010150A1/en active Application Filing
- 1992-11-13 ZA ZA928776A patent/ZA928776B/en unknown
- 1992-11-13 PT PT101064A patent/PT101064A/en not_active Application Discontinuation
- 1992-11-13 IL IL103751A patent/IL103751A0/en unknown
- 1992-11-13 AU AU30749/92A patent/AU3074992A/en not_active Abandoned
- 1992-11-14 CN CN 92114889 patent/CN1078493A/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL103751A0 (en) | 1993-04-04 |
WO1993010150A1 (en) | 1993-05-27 |
AU3074992A (en) | 1993-06-15 |
ZA928776B (en) | 1993-05-13 |
CN1078493A (en) | 1993-11-17 |
JPH07501220A (en) | 1995-02-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5512661A (en) | Multitrophic and multifunctional chimeric neurotrophic factors | |
RU2128226C1 (en) | Isolated dna fragment, a method of preparing a recombinant protein exhibiting neurotropic activity, protein nt-3 and a pharmaceutical composition | |
CA2040437C (en) | Neurotrophin-3, a novel neurotrophic factor related to nerve growth factor and brain derived neurotrophic factor | |
AU705371B2 (en) | Ciliary neurotrophic factor | |
CA2240516C (en) | Novel tyrosine kinase receptors and ligands | |
NZ332921A (en) | Method of treating cellular degeneration using neurturin and related growth factors | |
US6866851B1 (en) | GFRα1-RET specific agonists and methods therefor | |
US6413740B1 (en) | Tyrosine kinase receptors and ligands | |
JPH06509413A (en) | Neurotrophin activity assay system | |
Hallböök et al. | Production and characterization of biologically active recombinant beta nerve growth factor | |
PT101064A (en) | PROTEINS AND PREPRO CHEMICALS, NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CODE THEM, AND PRODUCTION PROCESS OF A NEUROTROFIN | |
US20040009950A1 (en) | Secreted human proteins | |
AU9483898A (en) | Persephin and related growth factors | |
JPH04218374A (en) | Human hair-like nerve nutritive factor | |
EP0866861B1 (en) | Molecular cloning and characterization of molecules related to relaxin and the insulin family of ligands | |
KR20030074588A (en) | Glycosylated vegf-b and method for increasing the amount of soluble vegf-b | |
JPH08510987A (en) | Therapeutic and diagnostic methods based on neurotrophin-4 expression | |
DE69632064T2 (en) | NEW TYROSINKINASE RECEPTORS AND LIGANDS | |
HU211318A9 (en) | Multitrophic and multifunctional chimeric neurotrophic factors, and nucleic acids and plasmids encoding the chimeras |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19930715 |
|
FC3A | Refusal |
Effective date: 19990607 |