PT100568A - MONOCLONAL AND ANTIGENIC ANTIBODIES FOR HUMAN MELANOMA - Google Patents
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Description
"ΜΕ20: ANTICORPOS MONOCLONAIS E ANTIGÉNEOS PARA O MELANOMA HUMANO"" ΜΕ20: MONOCLONAL AND ANTIGEN ANTIBODIES FOR HUMAN MELANOMA "
Campo Técnico da Invengão A presente invenção diz respeito à descoberta de uma nova proteina da superfície celular designada por antigéneo ME20 (AgME20), que existe nas células de melanoma humano, e de anticorpos tais como o mAB ME20 e fragmentos de anticorpos, os quais foram desenvolvidos e reagem imunemente de modo espe cífico com essa proteína da superfície celular. A presente invenção refere-se também a novos péptidos que contêm regiões nas suas sequências de resíduos aminoácidos que correspondem praticamente aos domínios do AgME20.TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the discovery of a novel cell surface protein designated by ME20 antigen (AgME20), which exists in human melanoma cells, and antibodies such as mAb ME20 and antibody fragments which have been developed and react specifically with this cell surface protein. The present invention also relates to novel peptides which contain regions in their amino acid residue sequences which correspond substantially to the AgME20 domains.
Antecedentes da InvençãoBackground of the Invention
As células tumorais expressam alguns antigéneos que não existem, ou existem em pequenas quantidades, nas suas cor respondentes partes celulares normais. Muitos deles são anti géneos de diferenciação partilhados por células tumorais por células tumorais e por algumas células embriónicas. Admite--se que alguns desses antigéneos com selectividade suficiente em tumores possam vir a servir como eventuais agentes terapêu ticos . Esta possibilidade tem vindo a ser ponderada no caso do melanoma maligno [Hellstrõm e Hellstrõm , in Accomplishment in Câncer Research - 1984 Prize Year, General Motors Câncer Research Foundation, J. G. Fornter & J. E. Rhoads, eds., J. B.Tumor cells express some antigens that do not exist, or exist in small amounts, in their corresponding normal cell parts. Many of them are antigen differentiation genes shared by tumor cells by tumor cells and by some embryonic cells. Some of these antigens with sufficient selectivity in tumors may be expected to serve as possible therapeutic agents. This possibility has been considered in the case of malignant melanoma [Hellström and Hellström, in Accomplishment in Cancer Research - 1984 Prize Year, General Motors Cancer Research Foundation, J. G. Fornter & J. E. Rhoads, eds., J.B.
Lippincott Company, Philadelphia, (1985) pp. 216-240; Hellstròm e Hellstrõm, in In Vitro Diagnosis of Human Tumors Using Mono-clonal Antibodies, Immunology Series, Η. Z. Kupchick, ed. Mareei Dekker, Inc. New York/Basel, (1988) Vol 39, pps. 123-139]^ e também nos casos de outros tumores [Burchell e Taylor-Papa-dimitrious, in R. W. Baldwin e V. S. Byers, eds., Monoclonal Antibodies for Tumor Detection e Drug Targeting, Academic Press (1985) pps. 1-15; Kemshead, ibid, pp. 281-302]. Têm sido preparados muitos anticorpos para os antigé-nêos da superfície celular que são expressos pelos tumores humanos em quantidades maiores do que pelos tecidos normais. É também ponto assente que alguns anticorpos para os antigé-neos da superfície celular podem ser citotóxicos para as células tumorais na presença de um agente complementar (Hellstrõm et al., (1962) Progr. Allergy 9^:158-245; Hellstrõm e Hellstrõm Human Melanoma; S. Ferrone, ed., Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelburg (1990) pps. 442-466)e que alguns anticor pos podem desempenhar a função de mediadores da citotoxicida dè celular dependente do anticorpo ([Perlmann et al., (1969) Adv. Immunol. 11^:117-193; MacLennan et al., (1969), Immunol. 17^:896-910; Shurzak et al., (1972) Int. J. Câncer _9: 316-323] .Lippincott Company, Philadelphia, (1985) pp. 216-240; Hellstròm and Hellström, in In Vitro Diagnosis of Human Tumors Using Monoclonal Antibodies, Immunology Series, Η. Z. Kupchick, ed. Mareei Dekker, Inc. New York / Basel, (1988) Vol 39, pps. 123-139] and also in the cases of other tumors [Burchell and Taylor-Papa-dimitrious, in R. W. Baldwin and V. S. Byers, eds., Monoclonal Antibodies for Tumor Detection and Drug Targeting, Academic Press (1985) p. 1-15; Kemshead, ibid, pp. 281-302]. Many antibodies have been prepared for the cell surface antigens that are expressed by human tumors in larger amounts than by normal tissues. It is also believed that some antibodies to cell surface antigens may be cytotoxic to tumor cells in the presence of a complementary agent (Hellström et al., (1962) Allergy 9: 158-245; Hellström and Hellström Human Melanoma, S. Ferrone, ed., Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelburg (1990) pp. 442-466) and that some antibodies may play the role of antibody dependent cell cytotoxicide mediators ([Perlmann et al., (1969) Adv. Immunol., 11: 117-193; MacLennan et al., (1969), Immunol 17: 896-910; Shurzak et al., (1972) Int. J. Cancer : 316-323].
No primeiro caso é necessária uma .fonte adequada de agente complementar (geralmente coelho ou cobaia) e no último caso é necessária uma fonte de células efectoras (geralmente proveniente do murganho).In the former case, a suitable source of complementary agent (usually rabbit or guinea pig) is required and in the latter case a source of effector cells (usually from the mouse) is required.
Os anticorpos tais como aqueles que são dirigidos pa ra os antigéneos associados aos tumores podem aniquilar as cé lulas tumorais humanas na presença de células efectoras humanas [Hellstrõm et al., (1981) Int. J. Câncer 27:281-285] naAntibodies such as those directed to tumor associated antigens can kill human tumor cells in the presence of human effector cells [Hellström et al., (1981) Int. J. Cancer 27: 281-285] in the presence of human effector cells.
presença de soro humano que constitui uma: fonte de agente complementar [Hellstrõm et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1499-1502; Hellstrõm et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology ,presence of human serum which constitutes a source of complementary agent [Hellström et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Know. 82: 1499-1502; Hellström et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology,
Vol. 27, pps. 149-164, Alan R. Liss, Inc., NY] .Vol. 27, pps. 149-164, Alan R. Liss, Inc., NY].
Os anticorpos anti-tumor têm sido utilizados em imuno--histologia [Garrigues et al., (1982) Int. J. Câncer 29:511-515; Natali et al., in Carcinogenesis - A Comprehensive Sur-vey, C. J. Conti, T. J. Slaga e A. J. P. Klein-Szanto, eds.,Anti-tumor antibodies have been used in immunohistology [Garrigues et al., (1982) Int. J. Cancer 29: 511-515; Natali et al., In Carcinogenesis - A Comprehensive Surveil, C. J. Conti, T. J. Slaga and A.J.P. Klein-Szanto, eds.
Raven Press, Ltd. New York, (1989) Vol. 11. pps. 133-164] e em imunoterapia [Hellstrõm e Hellstrõm (1988) Pigment Cell Res. S.1:180-184; Neuwelt et al., (1987) Neurosurgery 20:885--895], e ainda na obtenção de imagens para diagnóstico [Larson et al., (1983) J. Clin. Invest. 72^2101-2114; Murray et al., (1988) in Malignant Melanoma: Biology, Diagnòsis e Therapy, L. Nathanson, ed., Khiwer Academic Publishers, Boston, pps. 123-149] .Raven Press, Ltd. New York, (1989) Vol. 11. pps. 133-164] and in immunotherapy [Hellström and Hellström (1988) Pigment Cell Res. S.1: 180-184; Neuwelt et al., (1987) Neurosurgery 20: 885--895], and still in imaging for diagnosis [Larson et al., (1983) J. Clin. Invest. 72: 2101-2114; Murray et al., (1988) in Malignant Melanoma: Biology, Diagnostics and Therapy, L. Nathanson, ed., Khiwer Academic Publishers, Boston, p. 123-149].
Algumas técnicas para a preparação de agentes anti--cancro implicam a marcação de anticorpos com isótopos radio activos [Larson et al., (1983) Clin. Invest. T2:2101-2114 ;Some techniques for the preparation of anti-cancer agents involve the labeling of antibodies with radioactive isotopes [Larson et al., (1983) Clin. Invest. T2: 2101-2114;
Order, (1984) Compr. Ther. 10^9-18; Carrasquillo et al., (1984) Câncer Treatments Reports 68^:317-328; de Nardo et al., (1985) Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 11^335-345 , ou a conjugação de anticorpos para toxinas [Jansen et al., (1982) Immunol. Rev. 6_2:185-216; Vitetta e Uhr (1984) Trans-plant. 3_7:535.538] ou ainda fãrmacos anti-cancro [Ghose et al., (1972) Brit. Med. J. 3:495-499; Hurwitz et al., (1975) Câncer Res. 35^:1175-1181; Rowland et al., (1985) Câncer Immu-nol. Immunother. 19:1-7]. Nesses casos o anticorpo proporcio -4- ίγ. na a especificidade de discriminar o agente para a célula tu-moral adequada e o isótopo ou o fãrmaco proporcionam a capaci dade para destruir o tumor. Contudo, uma desvantagem deste tipo de abordagem, até ao momento da presente invenção, tem sido a falta de uma elevada especificidade do anticorpo o qual em muitos casos se pode ligar também a tecido não canceroso.Order, (1984). The R. 10: 9-18; Carrasquillo et al., (1984) Cancer Treatments Reports 68: 317-328; de Nardo et al., (1985) Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 11 335-345, or the conjugation of antibodies to toxins [Jansen et al. (1982) Immunol. Rev. 6_2: 185-216; Vitetta and Uhr (1984) Trans-plant. 537: 535-538] or anti-cancer drugs [Ghose et al., (1972) Brit. Med. J. 3: 495-499; Hurwitz et al., (1975) Cancer Res. 35: 1175-1181; Rowland et al., (1985) Cancer Immunol. Immunother. 19: 1-7]. In these cases the antibody provides -4- γ. in the specificity of discriminating the agent for the appropriate tumor cell and the isotope or drug provides the ability to destroy the tumor. However, a disadvantage of this type of approach up to the present invention has been the lack of high specificity of the antibody which in many cases can also bind to non-cancerous tissue.
Uma vez que tanto os fármacos anti-cancro como os radioisõto pos possuem um nivel elevado de toxicidade para os tecidos normais, esta incorporação não específica em diversos órgãos tais como os rins, o fígado ou a medula óssea pode eventualmente originar efeitos secundários consideráveis.Since both anti-cancer drugs and radioisotopes possess a high level of toxicity to normal tissues, this non-specific incorporation into various organs such as the kidneys, liver or bone marrow may possibly lead to considerable side effects.
Outro tipo de abordagem à terapia do cancro consiste no desenvolvimento de imunogénes específicos, frequentemente apresentados como vacinas terapêuticas [Hellstrõm, K. E., Hel. lstróm, I., e Hu, S.-L. (1990) "Why Câncer Vaccines?" In: New Generation Vaccines: The Molecular Approach (Woodrow, G. C., e Levine, Μ. M., eds) Mareei Dekker, Inc. pps 885-862], Esses imunogénes são utilizados para induzir um estado de imunidade tumoral activa nos pacientes. O nível de especificidade turno ral é crucial para este processo e a presente invenção encami nha esta questão para o caso do melanoma que éum neoplasma a_l tamente maligno.Another approach to cancer therapy is the development of specific immunogens, often presented as therapeutic vaccines [Hellström, K.E., Hel. lstrom, I., and Hu, S.-L. (1990) " Why Cancer Vaccines? &Quot; In: New Generation Vaccines: The Molecular Approach (Woodrow, G. C., and Levine, M., eds.) Mareei Dekker, Inc. pps 885-862], These immunogens are used to induce a state of active tumor immunity in patients. The level of shift specificity is crucial to this process and the present invention raises this question for the case of melanoma which is an absolutely malignant neoplasm.
Sumário da Invenção A presente invenção visa proporcionar um anticorpo mo noclonal designado por mAB ME20 o qual é imunoespecífico para uma proteína da superfície celular existente nas células: de melanoma humano e também em células de uma fraeção de nevos -5- . ..· Lf, displasicos mas nao significativamente noutras células. Admi-te-se que tanto o melanoma como os nevos derivem embriológica mente da cristã neural. A presente invenção engloba também fragmentos de mAb ME20 tais como os fragmentos Fab, Fv, Fab' e (Fab1)2 e ainda outros anticorpos e fragmentos com especifi cidade idêntica. 0 anticorpo monoclonal ME20 (e os seus fra£ mentos) pode ser unido funcionalmente, ou conjugado a outro composto tal como um fãrmaco, uma toxina, um agente marcador, um radionuclido, um factor de crescimento ou uma enzima. A presente invenção refere-se também a métodos de diagnostico e terapêuticos que utilizam esse anticorpo e descreve ainda os métodos e as composições para a utilização desses anticor pos monoclonais.Summary of the Invention The present invention is directed to providing a monoclonal antibody designated mAB ME20 which is immunospecific for a cell surface protein present in human melanoma cells and also in cells of a nevus fraction. .. · Lf, dysplastic but not significantly in other cells. It has been assumed that both melanoma and nevi are derived embryologically from the neural Christian. The present invention also encompasses ME20 mAb fragments such as the Fab, Fv, Fab 'and (Fab1) 2 fragments and still other antibodies and fragments of similar specificity. The monoclonal antibody ME20 (and its fractions) may be functionally linked, or conjugated to another compound such as a drug, a toxin, a marker agent, a radionuclide, a growth factor or an enzyme. The present invention also relates to diagnostic and therapeutic methods using that antibody and further describes the methods and compositions for the use of such monoclonal antibodies.
Por outro lado a presente invenção visa ainda um novo antigêneo da superfície celular designado por AgME20, caracte-rlstico das células do melanoma humano, e visa também um pépti^ do praticamente puro que contém uma região que corresponde a um domínio do antigêneo da superfície celular do melanoma tal como o antigêneo AgME20. A presente invenção descreve também métodos de diagnóstico e terapêuticos que utilizam esse péptido e descreve ainda os métodos e as composições que utilizam esse novo péptido.On the other hand, the present invention further relates to a novel cell surface antigen called AgME20, which is characteristic of human melanoma cells, and also targets a substantially pure peptide containing a region corresponding to a cell surface antigen domain of melanoma such as AgME20 antigen. The present invention also describes diagnostic and therapeutic methods that utilize that peptide and further describes methods and compositions using such a novel peptide.
Descrição dos Aspectos Preferenciais A presente invenção refere-se a compostos e a métodos úteis na detecção e no tratamento do melanoma humano.Description of the Preferred Aspects The present invention relates to compounds and methods useful in the detection and treatment of human melanoma.
Especificamente, a presente invenção refere-se a um no vo anticorpo monoclonal mAb ME20 e aos seus fragmentos tais co -6- mo Fab, Fv, Fab' e Fíab'^ e refere-se também às cadeias po-lipeptidicas sintetizadas que reagem imunemente de modo espe cífico com uma proteína da superfície do melanoma humano ,Specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody monoclonal mAb ME20 and to fragments thereof such as Fab, Fv, Fab 'and Fabab, and also relates to the polypeptide chains synthesized which react immunity specifically with a human melanoma surface protein,
AgME20, â qual se liga o anticorpo mAb ME20'tal como agora descrito. A presença desta proteína existente á superfície das células apenas é detectável em células de melanoma e em Λ células de uma fracção de nevos displãsicos (2 em 6 testados). Admite-se que tanto o melanoma como os nevos derivem embriolo gicamente de células da cristã neural. 0 anticorpo mAb ME20, os seus fragmentos e outros anticorpos e fragmentos que se li gam de modo idêntico podem ser utilizados, inter alia, na de-tecção e/ou no tratamento do melanoma, quer isoladamente quer em conjunto com um outro composto. De acordo com o aspecto preferencial, um anticorpo ou um fragmento da presente invenção une-se funcionalmente a um composto tal como um fãrmaco, uma toxina, um agente marcador, um factor de crescimento, um radionuclido ou um radioisótopo ou uma enzima.AgME20, â € ƒâ € ƒâ € ƒwherein the mAb ME20 antibody is as described herein. The presence of this existing protein on the cell surface is only detectable in melanoma cells and in Λ cells of a fraction of dysplastic nevi (2 in 6 tested). Both melanoma and nevi are thought to be derived embryologically from neural Christian cells. The mAb ME20 antibody, fragments thereof and other antibodies and fragments which are identical in shape can be used, inter alia, in the detection and / or treatment of melanoma, either alone or in combination with another compound. According to the preferred aspect, an antibody or fragment of the present invention functionally binds to a compound such as a drug, a toxin, a marker agent, a growth factor, a radionuclide or a radioisotope or an enzyme.
Tal como agora utilizado, o termo "reage imunemente" refere-se à produção de uma interacção de ligação específica de natureza semelhante à ligação imunolõgica que ocorre entre um antigéneo e um anticorpo dirigido para esse antigéneo. De acordo com um aspecto preferido da presente invenção, um poli pêptido tal como o anticorpo monoclonal mAb ME20-, reage imune, mente com um antigéneo de superfície celular, tal'como o an-tigineo AgME20, nas células do melanoma humano. Ospolipép-tidos da presente invenção ligam-se às células e tecidos adul^ tos humanos normais em grau muito menor do que ãs células do melanoma.As used herein, the term " reacts immune " refers to the production of a specific binding interaction of a similar nature to the immunological binding that occurs between an antigen and an antibody directed to that antigen. According to a preferred aspect of the present invention, a polypeptide such as the monoclonal antibody mAb ME20-, reacts immune with a cell surface antigen, such as AgME20, in human melanoma cells. The polypeptides of the present invention bind to normal human adult cells and tissues to a much lower extent than to melanoma cells.
Tal como agora utilizado o termo "ligam-se em muito menor grau" significa que a ligação não serã de todo detectã- -7- vel quando se utilizarem técnicas imuno-histológicas normali zadas. Pelo contrário, o anticorpo mAb ME20 liga-se com um elevado grau de especificidade a um novo antigéneo caracterís; tico do melanoma humano. 0 anticorpo mAb ME20 e polipeptidos e fragmentos idên ticos da presente invenção tal como descrito antes, podem unir-se funcionalmente a outros compostos e podem'ser utiliza dos para fins de diagnóstico, localização ou terapêuticos.As used herein the term " bind to a much lesser extent " means that the binding will not be entirely detectable when standard immunohistological techniques are used. In contrast, the antibody mAb ME20 binds with a high degree of specificity to a novel antigen characteristic; of human melanoma. The ME20 mAb antibody and identical polypeptides and fragments of the present invention as described above, may functionally bind to other compounds and may be used for diagnostic, locational or therapeutic purposes.
Tal como agora utilizados, os termos "polipéptido" e "anticorpo" são intermutáveis e referem-se a uma molécula de origem natural ou sintética constituída por resíduos aminoáci. dos acoplados por ligações peptldicas que podem reagir imunemente de modo específico com uma proteína da superfície celular do melanoma humano, englobando as proteínas glicosiladas designadas por imunoglobulinas (anticorpos), fragmentos de an ticorpos e proteínas sintéticas e fragmentos de proteínas que são capazes de se combinar ou reagir imunemente de modo específico com uma proteína da superfície do melanoma.As used herein, the terms " polypeptide " and " antibody " are interchangeable and refer to a molecule of natural or synthetic origin consisting of amino acid residues. of those coupled by peptide bonds that can specifically react with a human melanoma cell surface protein, encompassing the glycosylated proteins designated as immunoglobulins (antibodies), fragments of anthyodies and synthetic proteins, and fragments of proteins that are capable of combining or immunoreact specifically with a melanoma surface protein.
Tal como é agora utilizado, o termo "antigéned1 refere--se a uma entidade que é capaz de se unir especificamente a um anticorpo. No caso de um antigéneo ser capaz de induzir a produção, de anticorpos designa-se também por "imunogene".As used herein, the term " antigen 1 " refers to an entity which is capable of specifically binding to an antibody. In the event that an antigen is capable of inducing production, antibodies are also referred to as " immunogen ".
Tal como é agora utilizado o termo "ligado funcional-mente" refere-se a uma ligação que não interfere com a capacidade de qualquer dos grupos ligados funcionar conforme descrito. De acordo com um aspecto preferencial, o anticorpo mAb ME20 está ligado funcionalmente a um composto biologicamente activo tal como um fãrmaco de modo a permitir que o polipepti do se una a uma proteína da superfície do melanoma humano e sem -8- -8- ν· / qualquer interferência com a actividade biológica do fármaco.As used herein the term " functionally linked " refers to a bond that does not interfere with the ability of any of the attached groups to function as described. According to a preferred aspect, the mAb ME20 antibody is functionally linked to a biologically active compound such as a drug so as to allow the polypeptide to bind to a human melanoma surface protein and without · / Any interference with the biological activity of the drug.
De acordo com um aspecto particularmente preferido o anticorpo mAb ME20 está funcionalmente ligado a um fármaco quimioterapêutico tal como a dacarbazina, a adriamicina ou a mitomicina C.According to a particularly preferred aspect the antibody mAb ME20 is functionally linked to a chemotherapeutic drug such as dacarbazine, adriamycin or mitomycin C.
Os pólipeptidos da presente invenção que reagem imune mente de modo especifico com o antigéneoME20 englobam anticor pos tais como o anticorpo monoclonal mAb ME20. A actividade biológica dos anticorpos é multifacetada. A região Fc da mo lêcula determina em grande parte a capacidade das moléculas do anticorpo para activarem o agente complementar e medeia a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA) [Uanue and Benacerraf (1984) Textbook of Immunology, 2nd Edition, WiJL liams and Wilkins, Chap. 12, pps. 218-238].The polypeptides of the present invention that specifically react with the ME20 antigen include antibodies such as the monoclonal antibody mAb ME20. The biological activity of the antibodies is multifaceted. The Fc region of the molecule largely determines the ability of antibody molecules to activate the complementary agent and mediates antibody-dependent cellular cytotoxicity (CCDA) [Uanue and Benacerraf (1984)] Textbook of Immunology, 2nd Edition, WiJL liams and Wilkins , Chap. 12, pps. 218-238].
Os anticorpos encontram-se divididos em diversas clajs ses e sub-classes. Os anticorpos monoclonais preferidos da presente invenção pertencem às sub-classes IgGl, IgG2a e IgG3. De um modo geral, os anticorpos das sub-classes IgG2a e IgG3 podem mediar frequentemente a CCDA e activar o complemento em soro.Antibodies are divided into several clachs and subclasses. Preferred monoclonal antibodies of the present invention belong to the subclasses IgG1, IgG2a and IgG3. In general, antibodies of the IgG2a and IgG3 subclasses can often mediate CCDA and activate complement in serum.
Os polipeptidos da presente invenção encontram-se preferencialmente presentes numa composição farmacêutica conjunta mente com um ou vários veículos farmaceuticamente aceitáveis.The polypeptides of the present invention are preferably present in a pharmaceutical composition together with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
Tal como agora utilizado o termo "veículo farmaceuti^ camente aceitável" refere-se a um composto susceptível de ser administrado a um paciente e que não produza efeitos tóxicos ou indesejados ao fazer-se esssa administração. Como exemplos ilustrativos de veículos farmaceuticamente aceitáveis referem--se as soluções salinas tamponadas com fosfato, a solução de -9- -9-As used herein the term " pharmaceutically acceptable carrier " refers to a compound capable of being administered to a patient and which does not produce toxic or undesired effects upon such administration. As illustrative examples of pharmaceutically acceptable carriers are phosphate buffered saline solutions, the solution of -9-
Ringer, os óleos, os geles e as microesferas e ainda os lipo somas. Existem outros veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos no campo farmacêutico e que se consideram en globados pela presente invenção.Ringer, oils, gels and microspheres and also lipo sums. Other pharmaceutically acceptable carriers are well known in the pharmaceutical field and are considered to be globular by the present invention.
Tal como é agora utilizado o termo "agente marcador" refere-se a um único átomo ou molécula que ao ficar funciona lmente ligado a um produto da presente invenção permite a detecção da sua presença num método de ensaio. A título ilus^ trativo refere-se como agentes marcadores os corantes fluorescentes, os radioisótopos, as enzimas e os anticorpos que podem ser detectados independentemente ou que podem ser dete ctados conjuntamente com a adição de um substracto ou de outra molécula que com eles reaja. 0 anticorpo monoclonal mAb ME20 existe em duas formas isotípicas, respectivamente IgGl e IgG2a, tendo essas formas sido produzidas a partir de hibridomas que se encontram depositados na American Type Culture Collection (colecção américa na de culturas tipo) (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, em total conformidade com os requisitos de deposição exigidos pelo United States Patent and Trademark Office (Instituto de Marcas e Patentes Norte Americano) e pelo Tratado de Budapeste, em 4 de Junho de 1991, possuindo respec tivamente os números de acesso HB10764 e HB10763.As used herein the term " marker agent " refers to a single atom or molecule which, when functionally linked to a product of the present invention, allows detection of its presence in a test method. Illustrative are fluorescent dyes, radioisotopes, enzymes and antibodies which can be detected independently or which can be detected together with the addition of a substrate or other molecule which reacts with them as marker substances. The monoclonal antibody mAb ME20 exists in two isotype forms, respectively IgG1 and IgG2a, these forms being produced from hybridomas that are deposited with the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, in full compliance with the deposition requirements of the United States Patent and Trademark Office and the Budapest Treaty on June 4, 1991, respectively, having the accession numbers HB10764 and HB10763.
Os anticorpos da presente invenção são especificamen-te imunoreactivos com sítios determinantes num antigeneo gli-coproteico, conhecido pela designação AgME20, associado com células do melanoma humano e o qual não foi encontrado noutros tumores humanos. Essa especificidade imunorreactiva para esses anticorpos diminui bastante a probabilidade dos anticorpos da -10- presente invenção se ligarem aos carcinomas da mama, do pul mão, do cólon e de tipo idêntico.Antibodies of the present invention are specifically immunoreactive with sites determining in a glycoprotein antigen known as AgME20 associated with human melanoma cells and not found in other human tumors. Such immunoreactive specificity for such antibodies greatly diminishes the likelihood that the antibodies of the present invention will bind to breast, lung, colon, and the like carcinomas.
Em particular salienta-se que não foi observada qual. quer ligação do anticorpo mAb ME20 às células normais adultas de seres humanos e que os tecidos foram detectados por ensaio imuno-histológico.In particular it is noted that it was not observed which. either binding of mAb ME20 antibody to normal adult human cells and that tissues were detected by immunohistological assay.
Os anticorpos da presente invenção são úteis tanto isoladamente como em combinação com outros agentes em métodos tumoristáticos e/ou tumoricidas para o tratamento do melanoma. Esses anticorpos podem ser preparados pelos processos de hibri doma, recombinantes ou de síntese e abrangem os fragmentos , multímeros e os seus derivados. Tal como agora utilizado o termo "multímero" refere-se a uma molécula que contém várias unidades repetitivas de uma porção da molécula. Um péptido multimérico da presente invenção contém preferencialmente entre 2 e cerca de 10 regiões repetitivas de uma porção de uma sequência de resíduos de aminoácidos do péptido funcionalmente' ligadas entre si. De acordo com um aspecto da presente in venção proporciona-se um anticorpo multimérico que corresponde a vãrias moléculas de um anticorpo, tal como o anticorpo mAb ME20, funcionalmente ligadas entre si originando uma molécula que possui vários sítios de ligação funcionais podendo cada um deles reagir imunemente de modo especifico com uma proteína da superfície celular do melanoma humano tal como o antigéneo AgME20. Os anticorpos da presente invenção também podem ser utilizados em métodos e testes para a diagnose, de-tecção e tratamento do melanoma humano. A presente invenção engloba também um péptido substan cialmente purificado que contém uma região que emita ou prati- -11- -11-Antibodies of the present invention are useful either alone or in combination with other agents in tumor and / or tumoricidal methods for the treatment of melanoma. Such antibodies may be prepared by the hybridoma, recombinant or synthetic methods and encompass the fragments, multimers and derivatives thereof. As used herein the term " multimer " refers to a molecule that contains several repeating units of a portion of the molecule. A multimeric peptide of the present invention preferably contains between 2 and about 10 repeating regions of a portion of a peptide amino acid residue sequence functionally linked together. According to one aspect of the present invention there is provided a multimeric antibody corresponding to various molecules of an antibody, such as mAb antibody ME20, functionally linked to each other to provide a molecule having several functional binding sites each of which can react immunologically specifically with a human melanoma cell surface protein such as the AgME20 antigen. The antibodies of the present invention may also be used in methods and tests for the diagnosis, detection and treatment of human melanoma. The present invention also encompasses a substantially purified peptide which contains a region that emits or practically-
camente corresponde a um domínio de uma proteína da superfície celular do melanoma humano. Os péptidos da presente invenção são capazes de reagir imunemente de modo específico como um anticorpo da presente invenção tal como o anticorpo mAb ME20.corresponds to a domain of a human melanoma cell surface protein. The peptides of the present invention are capable of specifically immune-reacting as an antibody of the present invention such as mAb ME20 antibody.
Tal como agora utilizado o termo "substancialmente" refere-se a um nível elevado de semelhança. Um péptido subs tancialmente purificado da presente invenção significa uma preparação que possui menos de dez por cento de outros péptidos diferentes. Uma sequência substancialmente idêntica de acordo com a presente invenção exibe uma variação menor do que dez por cento relativamente ã sequência de referência.As used herein the term " substantially " refers to a high level of similarity. A substantially purified peptide of the present invention means a preparation having less than ten percent of other different peptides. A substantially identical sequence according to the present invention exhibits a variation of less than ten percent with respect to the reference sequence.
De acordo com um aspecto preferido , um péptido da pre sente invenção engloba moléculas de origem natural ou sintética substancialmente purificadas que contêm sequências de resíduos de aminoácidos e/ou glicosilação.que podem reagir imunemente com o anticorpo monoclonal ME20.According to a preferred aspect, a peptide of the present invention encompasses molecules of substantially purified natural or synthetic origin containing sequences of amino acid residues and / or glycosylation. Which may react immunity with the monoclonal antibody ME20.
Esses péptidos podem ser preparados por métodos norma lizados de purificação de proteínas e por síntese química ou recombinante e englobam fragmentos, multímeros e os seus deri. vados que mantenham a capacidade de reagir' imunemente de modo específico com os anticorpos da presente invenção. A proteína da superfície celular do melanoma humano, ME20, designada por AgME20, é uma glicoproteína que possui um peso molecular compreendido aproximadamente entre 80 kD e 120 kD. De acordo com um aspecto preferido a proteína da superfície celular do ME20 possui um peso molecular, determinado em conformidade com o protocolo SDS-PAGE, compreendido aproximadamente entre 100 kD e 116 kD. -12- -12-Such peptides may be prepared by standard methods of purification of proteins and by chemical or recombinant synthesis and encompass fragments, multimers and derivatives thereof. which retain the ability to react specifically with the antibodies of the present invention. The human melanoma cell surface protein, ME20, designated AgME20, is a glycoprotein having a molecular weight of approximately 80 kD to 120 kD. According to a preferred aspect the cell surface protein of ME20 has a molecular weight, determined according to the SDS-PAGE protocol, comprised between approximately 100 kD and 116 kD. -12-
Os anticorpos da presente invenção podem ser utiliza dos em métodos de tratamento e para a detecção de melanoma humano.The antibodies of the present invention may be used in methods of treatment and for the detection of human melanoma.
De acordo com um aspecto, um anticorpo da presente in venção susceptivel de se ligar a uma proteína de superfície celular do melanoma humano pode ser utilizado para detectar a presença de células de melanoma humano em ensaios efectua-dos in vitro e in vivo. De acordo com este método faz-se con tactar as células humanas de um paciente com uma quantidade eficaz do anticorpo de modo a permitir a ligação do anticorpo a quaisquer células de melanoma que se encontrem presentes. Depois procede-se ã detecção da presença do anticorpo ligado recorrendo-se a qualquer dos diversos métodos conhecidos na especialidade. A título ilustrativo refere-se que os métodos de detecção englobam a detecção radiográfica da presença de um radioisótopo funcionalmente ligado ao anticorpo, a utilização de um segundo anticorpo identificador que possa ser detectã-vel e o qual reaja imunemente com a região exposta do anticor po ligado e ainda a utilização de meios indicadores, tais como um substracto que é convertido numa molécula fluorescente por uma enzima funcionalmente ligada ao anticorpo.According to one aspect, an antibody of the present invention capable of binding to a human melanoma cell surface protein can be used to detect the presence of human melanoma cells in assays performed in vitro and in vivo. According to this method the human cells of a patient are treated with an effective amount of the antibody so as to allow binding of the antibody to any melanoma cells that are present. The presence of the bound antibody is then detected by any of several methods known in the art. By way of illustration, the methods of detection encompass radiographic detection of the presence of a radioisotope functionally linked to the antibody, the use of a second identifiable antibody which is detectable and which reacts immune to the exposed region of the antibody and also the use of indicator means, such as a substrate that is converted into a fluorescent molecule by an enzyme functionally bound to the antibody.
De acordo com outro aspecto administra-se um polipép-tido da presente invenção, tal como o anticorpo mAb ME20, segundo lima dose terapeuticamente eficaz a um determinado pacien te, em conjunto com um agente quimioterapêutico durante um in tervalo de tempo considerado suficiente para originar a inibi^ ção de proliferação adicional de quaisquer células de melanoma presentes. A título ilustrativo refere-se que os agentes qui-mioterapêuticos são preferencialmente os fãrmacos e as toxinas -13 vulgarmente utilizados no tratamento do melanoma. 0 agente quimioterapêutico pode ser adicionado separadamente do poli^ péptido da presente invenção, em conjunto com o polipéptido ou funcionalmente ligado ao polipéptido tal como sucede no caso de um conjungado entre um fãrmaco e um polipéptido. Δ presente invenção abrange também uma composição imunogênica susceptível de gerar uma resposta imune quando administrada a um paciente. As composições imunogénicas con têm um péptido da presente invenção substancialmente purificado correspondente a uma região de uma proteína da superfície celular do melanoma humano e contêm também um agente que aumenta a resposta imune tal como um hapteno ou um adjuvante, como o alúmen. Este tipo de proteína da superfície celular , tal como o AgME20, também pode ser administrado a um paciente em diversos tipos de "vacinas", por exemplo, o AgME20 pode ser expressado num vírus de uma vacina recombinante [Estin et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:1052-1056] contendo o géne que codifica o péptido associado ao melanoma de 80 -120 kD ou uma sua parte. Reivindica-se também como parte da presente invenção outros imunógénes^ específicos associados ao antigéneo AgME2 0.According to another aspect a polypeptide of the present invention, such as mAb ME20 antibody, is administered according to a therapeutically effective dose to a given patient, together with a chemotherapeutic agent for a period considered sufficient to cause the inhibition of further proliferation of any melanoma cells present. By way of illustration, it is to be understood that the chemotherapeutic agents are preferably the drugs and the commonly used toxins used in the treatment of melanoma. The chemotherapeutic agent may be added separately from the polypeptide of the present invention, together with the polypeptide or functionally linked to the polypeptide as in the case of a conjugate between a drug and a polypeptide. The present invention also encompasses an immunogenic composition capable of generating an immune response when administered to a patient. The immunogenic compositions have a substantially purified peptide of the present invention corresponding to a region of a human melanoma cell surface protein and also contain an immune response enhancing agent such as a hapten or an adjuvant, such as alum. This type of cell surface protein, such as AgME20, can also be administered to a patient in several types of " vaccines ", for example, AgME20 can be expressed on a virus from a recombinant vaccine [Estin et al., ( 1988) Proc. Natl. Acad. Know. USA 85: 1052-1056] containing the gene encoding melanoma-associated peptide of 80-120 kD or a part thereof. Other specific immunogens associated with the AgME20 antigen are also claimed as part of the present invention.
De acordo com um aspecto da presente invenção administra-se uma composição imunogênica contendo um péptido da presente invenção a um determinado paciente numa dose suficiente para gerar uma resposta imune dirigida ãs células do melanoma humano. De acordo com a presente invenção faz-se observar que a composição peptídica imunogênica pode gerar uma resposta imune num paciente sendo especificamente dirigi, da contra um epítope presente na proteína da superfície celu -14 lar do melanoma humano tal como o antigeneo AgME20. A presente invenção engloba também estojos que contêm anticorpos e/ou péptidos, contendo ainda esses estojos instruções adequadas para a sua utilização. De acordo com um aspecto específico, cada estojo de acordo com a presente invenção contém o anticorpo monoclonal ME20.According to one aspect of the present invention an immunogenic composition containing a peptide of the present invention is administered to a given patient in a dose sufficient to generate a targeted immune response to human melanoma cells. According to the present invention it is noted that the immunogenic peptidic composition can generate an immune response in a patient being specifically directed against an epitope present on the cell surface protein 14 of human melanoma such as AgME20 antigen. The present invention also encompasses kits containing antibodies and / or peptides, said kits further containing instructions suitable for their use. According to a specific aspect, each kit according to the present invention contains the monoclonal antibody ME20.
Os exemplos seguintes ilustram mais claramente a pre sente invenção e têm apenas objectivos ilustrativos e não li mitativos. EXEMPLO 1 ANTICORPO MONOCLONAL ME20 A. Preparação do anticorpo ME20The following examples further illustrate the present invention and are for illustrative and non-limiting purposes only. EXAMPLE 1 MONOCLONAL ANTIBODY ME20 A. Preparation of antibody ME20
Utilizaram-se murganhos da estirpe Balb/C (com aproxi^ madamente 2 meses de idade) que receberam seis inoculações , tanto por via subcutânea (sc) como intraperitoneal (ip), com células de melanoma humano. As primeiras quatro inoculações foram efectuadas com um afastamento temporal de cerca de um mês, efectuando-se a quinta inoculação uma semana mais tarde e efectuando-se a sexta inoculação três semanas após a quinta inoculação. Cada inoculação continha cerca de 10 células de melanoma humano H3614 e/ou H3606 (obtidas a partir de tumores primários); as inoculações 1, 2 e 3 continham células H3614 e as inoculações 4, 5 e 6 continham simultaneamente células H3614 e H3606.Balb / C (approximately 2 months old) mice were given six inoculations both subcutaneously (sc) and intraperitoneally (ip) with human melanoma cells. The first four inoculations were carried out with a time lapse of about one month, the fifth inoculation being carried out one week later and the sixth inoculation being carried out three weeks after the fifth inoculation. Each inoculation contained about 10 H3614 and / or H3606 human melanoma cells (obtained from primary tumors); inoculations 1, 2 and 3 contained H3614 cells and inoculations 4, 5 and 6 contained both H3614 and H3606 cells.
Decorridos três dias após a sexta inoculação procedeu· -se â remoção do baço de um murganho e utilizou-se no protoco lo de fusão. Destruíu-se o baço de modo a obter-se células efectuando raspagens sobre diversos crivos e depois enxaguou--se com meio RPMI. As células do baço foram separadas do tecido restante por centrifugação a 200 x g durante 10 minutos e com elas preparou-se uma nova suspensão em meio RPMI e a seguir misturou-se com células do mieloma Ag8-653 segundo uma proporção entre células de Ag8-653/cêlulas de baço da or dem de 1:10.Three days after the sixth inoculation the spleen was removed from a mouse and used in the fusion protocol. The spleen was destroyed so as to obtain cells scraping over various sieves and then rinsed with RPMI medium. The spleen cells were separated from the remaining tissue by centrifugation at 200æg for 10 minutes and with them was resuspended in RPMI medium and then mixed with Ag8-653 myeloma cells at a ratio between Ag8- 653 / spleen cells of the order of 1:10.
Submeteu-se a mistura de células Ag8-653 e de células de baço imunizadas a centrifugação a 200 x g durante 10 minutos e depois removeu-se o meio sobrenadante mantendo-se as células ã temperatura de 37°C.The mixture of Ag8-653 cells and immunized spleen cells was subjected to centrifugation at 200 x g for 10 minutes and the supernatant was then removed by keeping the cells at 37øC.
Adicionou-se polietileno-glicol (PEG, 1 ml) ãs células durante um período de um minuto com agitação durante mais um minuto.Polyethylene glycol (PEG, 1 ml) was added to the cells over a period of one minute with stirring for another minute.
Adicionou-se meio de Dulbecco modificado por Iscove (MDMI) sem HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (a quantidade adicionada foi de 1 ml durante o período de 1 minuto); depois adicionou-se mais 8 ml durante 2 minutos. Submeteu-se as células a centrifugação durante 10 minutos a 160 x g ã tem peratura ambiente. Removeu-se o sobrenadante e com as células preparou-se uma nova suspensão em 25 ml de MDMI. Misturou-se - 8 depois essa nova suspensão celular com 2 x 10 timocitos de murganho recentemente obtidos a partir de murganhos da estirpe Balb/C com a idade compreendida entre 3 e 4 semanas. A mistura de cultura celular de células Ag8-653, célu las de baço e timocitos foi utilizada para a preparação de uma suspensão num volume de MDMI e 2 ml de 50 x HAT. Manteve-se a -16- cultura à temperatura de 37°C sob uma atmosfera contendo 7 %Iscove-modified Dulbecco's medium (MDMI) without HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) was added (the added amount was 1 ml over the 1 minute period); then an additional 8 ml was added over 2 minutes. The cells were centrifuged for 10 minutes at 160 x g at ambient temperature. The supernatant was removed and the cells were resuspended in 25 ml of MDMI. This new cell suspension was mixed with 2 x 10 mouse thymocytes freshly obtained from Balb / C mice aged 3 to 4 weeks. The cell culture mixture of Ag8-653 cells, spleen cells and thymocytes was used to prepare a suspension in one volume of MDMI and 2 ml of 50 x HAT. The culture was maintained at 37øC under an atmosphere containing 7%
de C02 durante um intervalo de tempo variável entre 12 e 16 horas e depois procedeu-se ã transferência das células para placas de microtitulação de 96 cavidades na quantidade deof C02 for a time interval varying between 12 and 16 hours, and then the cells were transferred to 96-well microtiter plates in the amount of
uma atmosfera contendo 7% de C02· Decorridos 3 dias procedeu-se ao exame microscópico das placas para a determinação da eficiência da fusão.an atmosphere containing 7% CO 2. After 3 days the plates were examined microscopically for the determination of the melt efficiency.
Efectuou-se depois o rastreio das células híbridas para verificação da produção de anticorpos e os híbridos po sitivos foram transferidos para placas de 48 cavidades adicionando-se mais timocitos.The hybrid cells were then screened for antibody production assay, and the pooled hybrids were transferred to 48 well plates with additional thymocytes added.
Depois procedeu-se ao rastreio dos anticorpos resul^ tantes produzidos pelos clones híbridos, em conformidade com o ensaio imunoabsorvente ligado ã enzima (protocolo ELI_ SA) na imunização de linhas celulares do melanoma e fibro-blastos (fibroblastos da pele humana). Isolou-se o anticor po ME20 com base na sua propriedade de ligação ãs células do melanoma mas sem qualquer ligação aos fibroblastos. Obte ve-se ainda uma melhor caracterização do mAb ME20 por imuno--histologia e análise celular em SCAF.The resulting antibodies produced by the hybrid clones were then screened in accordance with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELI-SA protocol) in the immunization of melanoma cell lines and fibroblast (human skin fibroblasts). The ME20 antibody was isolated based on its binding property to melanoma cells but without any binding to the fibroblasts. Further better characterization of mAb ME20 is obtained by immunohistology and cellular analysis in SCAF.
Foram efectuados estudos utilizando o método de se-lecção celular activada por fluorescência (SCAF) ãs tempera turas de 4°C e de 37°C sobre células do melanoma H3606. Os resultados adiante apresentados demonstram que o anticorpo ME20 se liga fundamentalmente ã superfície celular do melanoma ã temperatura de 4°C e ã temperatura de 37°C o anticor po foi detectado essencialmente na região perinuclear. A localização perinuclear foi ainda confirmada por microsco- -17- -17-Studies were performed using the fluorescence activated cell sorting method (SCAF) at 4Â ° C and 37Â ° C temperatures on H3606 melanoma cells. The results presented below demonstrate that antibody ME20 binds primarily to the melanoma cell surface at 4Â ° C and at 37Â ° C the antibody was detected essentially in the perinuclear region. The perinuclear location was further confirmed by microscopy.
pia confocal. A internalização do anticorpo ocorre ã tempe ratura de 37°C. B. Imuno-histoloqia A ligação do anticorpo mAb ME20 a diversos tecidos humanos normais e tumorais foi observada de acordo com as técnicas imuno-histolõgicas da peroxidase-anti-peroxidase (PAP) descritas por Hellstrôm et al., (1983) J. Immunol. 130: 1467. Os resultados indicados no Quadro 1 demonstraram que o anticorpo mAb ME20 se liga especificamente ao melanoma humano e que se liga a cerca de 1/3 dos nevos diplãsicos ensaiados, mas não se liga ao tecido humano normal. Admite-se que tanto as células do melanoma como as células dos nevos derivam embriologicamente da cristã neural e podem partilhar ou expressar alguns dos antlgéneas de superfície comuns. A inexi^ tência de qualquer ligação detectãvel do anticorpo mAb ME20 ao tecido normal demonstra que este anticorpo é altamente especifico e útil para a detecção e para o tratamento do me lanoma humano. -18- -18-Confocal sink. Internalization of the antibody occurs at a temperature of 37 ° C. B. Immunohistochemistry The binding of mAb ME20 antibody to various normal and tumor human tissues was observed according to the immunohistological peroxidase-anti-peroxidase (PAP) techniques described by Hellström et al., (1983) J. Immunol . 130: 1467. The results shown in Table 1 demonstrated that mAb ME20 antibody binds specifically to human melanoma and binds to about 1/3 of the measured diphasic nevi, but does not bind to normal human tissue. Both melanoma cells and nevi cells are believed to derive embryologically from neural Christian and may share or express some of the common surface antigens. The inexistence of any detectable binding of mAb ME20 antibody to normal tissue demonstrates that this antibody is highly specific and useful for the detection and treatment of human melanoma. -18-
QUADRO 1TABLE 1
IMUNO-HISTOLOGIA TECIDO TUMORAL TECIDO NORMAL Tipo Positivo/Não testado Tipo Positivo/Não En saiado Mama 0 10 Supra-renais 0 3 Cólon 0 10 Intestino 0 1 Pulmão 0 15 Cérebro 0 1 Melanoma 18 19 Mama 0 3 Ovário 0 2 Cólon 0 6 Nevos (di-plásicos) 2 6 Esófago 0 3 Coração 0 4 Rim 0 10 Fígado 0 8 Pulmão 0 8 Nevo linfático 0 4 Nervo óptico 0 1 Ovários 0 2 Pâncreas 0 6 Pele 0 5 Baço 0 9 Estômago 0 4 Testículos 0 2 Tirõide 0 2 Amígdalas 0 1 -19- C. Caracterização do anticorpo ME20 com o anticorpo mAb ME20IMMUNO-HISTOLOGY TUMOR FABRIC NORMAL TISSUE Type Positive / Not tested Type Positive / No En outpatient Breast 0 10 Suprarenal 0 3 Colon 0 10 Intestine 0 1 Lung 0 15 Brain 0 1 Melanoma 18 19 Breast 0 3 Ovary 0 2 Colon 0 6 Nevos (di-plastics) 2 6 Esophagus 0 3 Heart 0 4 Kidney 0 10 Liver 0 8 Lung 0 8 Lymphatic Nevus 0 4 Optic Nerve 0 1 Ovaries 0 2 Pancreas 0 6 Skin 0 5 Spleen 0 9 Stomach 0 4 Testis 0 2 Thyroid 0 2 Tonsil 0-1 -19- C. Characterization of antibody ME20 with antibody mAb ME20
Marcou-se metabolicamente células do melanoma H3606 35 utilizando S-metionina durante 10 minutos seguindo-se a incubação em meio RPMI-1640 isento de metionina enriquecido com 5% de soro de bovino fetal tratado por diãlise, durante um intervalo de tempo compreendido entre 0 e 10 horas e ã temperatura de 37°C. Extraíu-se depois o agregado celular com solução salina tamponada com fosfato a pH 7,4 , contendo alternativamente 1% de NP-40, PMSF (10 yug/ml) e aprotinina (20 jag/ml) ou 0,4% de Triton X-100 e inibidores de proteinase. Provocou-se a imnuprecipitação do antígéneo ME20 incubando o lisado celular com o anticorpo mAb ME20 du rante 15 minutos ã temperatura de 4°C. O complexo antigeneo -anticorpo precipitou com anti-IgG do murganho conjugado no coelho e "Protein A-Sepharose" (Sigma Chemical Co., St.H360635 melanoma cells were metabolically labeled using S-methionine for 10 minutes followed by incubation in methionine-free RPMI-1640 medium enriched with 5% dialyzed fetal bovine serum for a time between 0 and 10 hours at 37 ° C. The cell pellet was then extracted with phosphate buffered saline at pH 7.4, alternatively containing 1% NP-40, PMSF (10æg / ml) and aprotinin (20æg / ml) or 0.4% Triton X-100 and proteinase inhibitors. Immunoprecipitation of the ME20 antigen was incubated by incubating the cell lysate with mAb ME20 antibody for 15 minutes at 4 ° C. The antigen-antibody complex precipitated with rabbit anti-mouse IgG and " Protein A-Sepharose " (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO). Apõs a lavagem do imunoprecipitado submeteu-se a análise por SDS-PAGE de acordo com o protocolo sob condições de redução e efectuou-se a sua visualização por fluoro grafia apõs impregnação do gel com "AMPLIFY'' (Amersham, Ar-lington Heights, IL).Louis, MO). After washing of the immunoprecipitate, the cells were subjected to SDS-PAGE analysis according to the protocol under reducing conditions and were displayed by fluorography after impregnation of the gel with " AMPLIFY " (Amersham, Arlington Heights , IL).
As células do melanoma humano H3606 foram marcadas 3 metabolicamente com H-glucosamina por incubaçao em 50% de DMEM de ISCOVE, 50% de meio RPMI-1640 isento de glicose e 5% de soro fetal de bovino tratado por diãlise. O antigeneo ME20 foi imunoprecipitado a partir do lisado celular com mAb ME20, anti-IgG de murganho conjugado no coelho e "Protein A-Sepharose". Submeteu-se o imunoprecipitado a análise de -20- acordo com o protocolo SDS-PAGE sob condições de redução e efectuou-se a visualização por autorradiografia.H3606 human melanoma cells were metabolically labeled with H-glucosamine by incubation in 50% ISCOVE DMEM, 50% RPMI-1640 glucose-free medium and 5% dialyzed fetal bovine serum. ME20 antigen was immunoprecipitated from the cell lysate with ME20 mAb, rabbit anti-mouse IgG and " Protein A-Sepharose ". The immunoprecipitate was subjected to analysis on the SDS-PAGE protocol under reduction conditions and autoradiography was performed.
Surgiu uma banda principal Mr = 105000 (conforme d£ terminado pelo protocolo SDS-PAGE em geles de poliacrilami-da a 7,5%) do antigeneo AgME20 decorridos 10 minutos de marcação e permaneceu como banda predominante durante cerca de 1 hora, tornando-se muito fraca decorridas cerca de 3 horas. Surgiu um componente de alevado peso molecular de Mr = 120000 ao fim de 10 minutos e manteve-se presente durante 2 horas. Decorridos tempos de ensaio mais longos (4 a 10 horas) a banda Mr = 97000 foi o componente mais predominante imuno-precipitado pelo anticorpo mAb ME20. ✓ O anticorpo ME20 precipitou especificamente antige-neos glicoproteicos com Mr = 120000, Mr = 105000 e Mr = 97000 conforme determinado pelo protocolo SDS-PAGE em geles de po liacrilamida a 7,5%. Os resultados demonstram que o determinante antigénico reconhecido pelo anticorpo mAb ME20 está localizado sobre uma nova glicoproteína. O antigeneo ligado ã membrana é libertado num meio condicionado de células H3606. A forma solúvel do antigeneoAgME20 possui um valor Mr = 97000. A análise da sequência aminoterminal indica que a forma solúvel do antigeneoAgME20 possui a mesma sequência aminoterminal do antigeneoME20 ligado à membrana e que e tam bem uma glicoproteína de cadeia única. D. Caracterização da ligação do anticorpo monoclonal ME20A major band of Mr = 105,000 (as terminated by the SDS-PAGE protocol on 7.5% polyacrylamide gels) of the AgME20 antigen was produced after 10 minutes of labeling and remained the predominant band for about 1 hour, if very weak after about 3 hours. A high molecular weight component of Mr = 120000 emerged after 10 minutes and remained present for 2 hours. After longer test times (4 to 10 hours) the Mr = 97000 band was the most predominant component immuno-precipitated by mAb ME20 antibody. ✓ ME20 antibody specifically precipitated glycoprotein antigens with Mr = 120000, Mr = 105000 and Mr = 97000 as determined by the SDS-PAGE protocol on 7.5% polyacrylamide gels. The results demonstrate that the antigenic determinant recognized by mAb ME20 antibody is located on a new glycoprotein. The membrane bound antigen is released in conditioned medium from H3606 cells. The soluble form of the antigeneAgME20 has a Mr = 97000 value. Analysis of the amino terminal sequence indicates that the soluble form of the antigen AgME20 has the same amino terminal sequence of the membrane bound antigen MEL20 and which is also a single chain glycoprotein. D. Characterization of binding of monoclonal antibody ME20
Investigou-se a capacidade do anticorpo mAb ME20 pa ra se ligar e internalizar em células tumorais pelo método -21 indirecto da imunotoxina com o objectivo de se detectar a internalizaçào de um conjugado anticorpo-toxina com subsequente aniquilação das células que internalizam o conjugado, em conformidade com o método de Till et al., (1988) Can cer Res. 4^: 1119-1123. Pez-se reagir um fragmento FAB de anti-imunoglobulina do murganho conjugada na cabra aco piado a uma cadeia de ricina A com células previamente ex postas a uma concentração de 10 ^ig/ml de mAb ME20 ou de mAb BR96. 0 anticorpo mAb BR96 é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente às células cancerosas da mama, do cõlon e do pulmão e ê internalizado pelas células positivas em antigeneoBR96 [Hellstrom et al., (1990) Câncer Res. 50^:2183-2190] .The ability of mAb ME20 antibody to bind to and internalize in tumor cells was investigated by the indirect immunotoxin -21 method in order to detect the internalization of an antibody-toxin conjugate with subsequent killing of the cells that internalize the conjugate in according to the method of Till et al. (1988) Can cer Res. 4: 1119-1123. A FAB fragment of the mouse conjugated anti-mouse immunoglobulin was reacted with a ricin A chain with cells previously exported at a concentration of 10æg / ml ME20 mAb or BR96 mAb. The BR96 mAb antibody is a monoclonal antibody that specifically binds to breast, colon and lung cancer cells and is internalized by the antigen-positive cells BR96 [Hellstrom et al., (1990) Cancer Res. 50: 2183-2190] .
Os valores de inibição percentual de sobrevivência das células testadas em conjunto com os valores da proporção de ligação, conforme medidos pelo métcdo da SCAF, encon tram-se representados no QUADRO 2 e demonstram a internalização do anticorpo mAb em células de melanoma humano, tal como evidenciado pela aniquilação especifica das células do melanoma no caso do anticorpo mAb ME20. -22- QUADRO 2The percent survival inhibition values of the tested cells in conjunction with the binding ratio values as measured by the SCAF method are shown in TABLE 2 and demonstrate the internalization of the mAb antibody in human melanoma cells such as evidenced by the specific annihilation of melanoma cells in the case of mAb ME20 antibody. TABLE 2
FACSFACS
Linha Celular Anticorpo . % de inibição Proporção < inibição 3606 ME20 95 16 (melanoma) BR961 26 1 3774 ME 20 82 2 (melanoma) BR96 8 1 2669 ME20 94 5 (melanoma) BR96 5 1 HT29 ME20 0 1 (cólon) BR96 6 1 2707 ME20 31 1 (pulmão) BR96 98 29 3396 ME20 17 1 (mama) BR96 99 54 1 O anticorpo mAb BR96 liga-se ãs células cancerosas da mama, do cólon e do pulmão e é internalizado pelas célu las positivas em antígénea A análise pelo método da SCAF da ligação do anticor po mAb ME20, conforme se mostra no QUADRO 2, mediu a ligação de um anticorpo secundário marcado por isotiocianato de fluoresceína (FITC) ãs células tumorais in vitro que ha viam sido tratadas com a concentração de 10 ug/ml de mAb BR96 ou de mAb ME20. -23-Cell Line Antibody. % Inhibition Ratio < inhibition 3606 ME20 95 16 (melanoma) BR961 26 1 3774 ME 20 82 2 (melanoma) BR96 8 1 2669 ME20 94 5 (melanoma) BR96 5 1 HT29 ME20 0 1 (colon) BR96 6 1 2707 ME20 31 1 (lung) BR96 98 29 3396 ME20 17 1 (breast) BR96 99 54 1 BR96 mAb antibody binds to breast, colon and lung cancer cells and is internalized by antigen-positive cells SCAF analysis of antibody binding po mAb ME20, as shown in TABLE 2, measured the binding of a fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled secondary antibody to in vitro tumor cells that had been treated with the concentration of 10æg / ml BR96 mAb or mAb ME20. -23-
Foram ainda efectuados outros estudos, conforme se mostram no QUADRO 3, utilizando um anticorpo secundário de um anticorpo de murganho conjugado na cabra marcado com FITC. A proporção de ligação representa o quociente entre o brilho, designado por equivalente linear de fluorescência (ELF), de células afectadas pelo anticorpo especifico mAb ME2G e a população celular não afectada.Further studies were also performed, as shown in TABLE 3, using a secondary antibody of a FITC-labeled goat-conjugated mouse antibody. The binding ratio represents the ratio of the brightness, termed linear fluorescence equivalent (ELF), of cells affected by the specific mAb ME2G antibody and the unaffected cell population.
ELF amostra - = Proporção de ligação ELF I η controloELF sample - = Control ratio ELF I η control
Realizou-se a microscopia confocal sobre células de melanoma humano H3606 com o objectivo de se ilustrar melhor a internalização do anticorpo mAb ME20. As células H3606 viáveis foram coloridas por exposição, a temperatura de 4 C, ao anticorpo mAb ME20 conjugado em ficoeritrina (mAb ME20-PE). 0 anticorpo marcado associou-se ãs microvilosidades localizadas sobre a membrana plãsmica das células.Confocal microscopy was performed on H3606 human melanoma cells in order to better illustrate the internalization of mAb ME20 antibody. Viable H3606 cells were stained by exposing, at 4Â ° C, the mAb ME20 antibody conjugated to phycoerythrin (mAb ME20-PE). The labeled antibody was associated with microvilli located on the cell membrane of the cells.
No caso em que as células marcadas de modo idêntico foram mantidas ã temperatura de 37°C durante 2 horas, o mAb ME20 apresentou uma localização perinuclear citoplãsmica dji-fusa e esteve praticamente ausente da superfície celular in dicando que o anticorpo havia sido internalizado.In the case where the identically labeled cells were maintained at 37øC for 2 hours, the ME20 mAb showed a cytoplasmic perinuclear localization and was virtually absent from the cell surface in that the antibody had been internalized.
Estes estudos indicaram a distribuição nativa aparen te do antígeneoAgME20. As células que haviam sido previamen te permeabilizadas por detergente e fixadas com paraformal- -24- -24-These studies indicated the native apparent distribution of the antigen AgME20. Cells that had previously been permeabilized by detergent and fixed with paraformal-24-
deído foram expostas ao mAb ME20-PE. A distribuição ciai celular da ligação do anticorpo observada foi idêntica ã que se observou antes no caso da ligação do anticorpo mAb ME20 ã temperatura de 4°C. Além disso houve também uma intensa coloração associada com um compartimento perinuclear acêntrico, possivelmente representando o aparelho de Golgi. Estas observações sugerem que o antígeneo AgME20 recentemen te sintetizado é transportado através do aparelho de Golgi, exportado para a superfície da membrana plásmica e é depois internalizado apõs ligação pelo mAb ME20.were exposed to mAb ME20-PE. The cellular distribution of the binding of the observed antibody was identical to that observed above in the case of mAb ME20 antibody binding at 4 ° C. In addition there was also intense staining associated with a perinuclear acentric compartment, possibly representing the Golgi apparatus. These observations suggest that the newly synthesized AgME20 antigen is transported through the Golgi apparatus, exported to the surface of the plasma membrane and then internalized after binding by mAb ME20.
Estudou-se a avidez de ligação do anticorpo mAb ME20 ãs células do melanoma humano H3606 para dois isótopos do anticorpo mAb ME20. Submeteu-se o anticorpo mAb ME20 ioda-125 do ( I-mAbME20)a um ensaio de imunorreactividade em relação ãs células positivas do antígeneo e depois utilizou-se em estudos de ligação com células H3606. Procedeu-se ã anã lise de Scatchard e os resultados obtidos traduzem um valor Ka de aproximadamente 10 M tanto para o isótopo IgGl como IgG2 do anticorpo mAb ME20. EXEMPLO 2 AMTIGENEO. ME20 A. PurificaçãoThe binding avidity of mAb ME20 antibody to human melanoma H3606 cells was studied for two isotopes of mAb ME20 antibody. MAb ME20 ioda-125 mAb antibody (I-mAbME20) was subjected to an immunoreactivity assay against the antigen-positive cells and then used in H3606 cell binding studies. Scatchard was assayed and the results obtained translate a Ka value of approximately 10 M for both the IgG1 and IgG2 isotopes of mAb ME20 antibody. EXAMPLE 2 AMYGENEO. ME20 A. Purification
Isolou-se o antígeneoME20 (AgME20) a partir de célu las tumorais do melanoma humano (células H3606) obtidas a partir de uma lesão metastãsica definida pelos inventores como linha celular e purificou-se parcialmente por cromato grafia de imunoafinidade. Com as células H3606 preparou-se uma suspensão em solução salina fisiológica tamponada com fosfato (PBS). Adicionou-se um volume igual de tampão de solubilização até se obter uma concentração final de 0,4 M de NaCl, 1% de Triton X-100,· 10 mM de EDTA em 17 mM de tampão de fosfato, pH 7,6. 0 tampão continha os seguintes inibidores de proteinase: 1 mM de PMSF (fluoreto de fenil-metilsulfonilo), 2 mM de BAEE (éster etílico de N ¢( -ben-zoíl-L-arginina), e 1 jig/ml de cada um dos componentes leu peptina, aprotinina e pepstatina. As células foram tratadas com tampão de solubilização sob agitação suave durante 30 minutos ã temperatura de 4°C. Removeu-se o material in solúvel por centrifugação a 100000 x g durante 90 minutos e ã temperatura de 4°C. Purificou-se o antígenso ME20 a par tir do sobrenadante por cromatografia de imunoafinidade. Preparou-se uma solução de mAb ME20 (5 mg/ml) em tampão de fosfato de sódio 0,2 M contendo NaCl 0,5 M, pH 8,2 e adicio nou-se a 1 g de tresil-Sepharose húmido (Sigma). Manteve--se a reacçao de acoplamento sob agitação suave revolvendo durante 16 horas ã temperatura de 4°C. Tratou-se o gel com Tris-HCl 0,2 M, pH 8,5 durante 5 horas e ã temperatura de 20°C e lavou-se com: (1) tampão de acetato de sódio 0,2 M contendo NaCl 0,5 M, pH 3,5; (2) tampão de fosfato 17 mM contendo NaCl 0,4 M e 1% de Triton X-100, pH 7,4; (3) solução salina fisiológica tamponada com fosfato contendo 1% de Triton X-100, pH 7,4; (4) dietilamina 100 mM contendo 0,2% de Triton X-100, pH 11,5; e (5) solução salina fisiológica tamponada com fosfato contendo 1% de Triton X-100. Aplicou-se o lisado celular a uma coluna de 1 ml de (mAb -26- -26-Antigen ME20 (AgME20) was isolated from human melanoma tumor cells (H3606 cells) obtained from a metastatic lesion defined by the inventors as a cell line and partially purified by immunoaffinity chromatography. A suspension of phosphate buffered saline (PBS) was prepared with H3606 cells. An equal volume of solubilization buffer was added until a final concentration of 0.4 M NaCl, 1% Triton X-100, 10 mM EDTA in 17 mM phosphate buffer, pH 7.6 was obtained. The buffer contained the following proteinase inhibitors: 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 2 mM BAEE (NÎ ± -benzoyl L-arginine ethyl ester), and 1 Âμg / ml each The cells were treated with solubilization buffer under gentle agitation for 30 minutes at 4Â ° C. The in soluble material was removed by centrifugation at 100,000 xg for 90 minutes and at the temperature of 4Â ° C. The antigen ME20 was purified from the supernatant by immunoaffinity chromatography. A solution of mAb ME20 (5 mg / ml) was prepared in 0.2 M sodium phosphate buffer containing 0.5 M NaCl, pH 8.2 and added to 1 g of wet tresyl-Sepharose (Sigma) .The coupling reaction was kept under gentle stirring for 16 hours at 4 ° C. The gel was treated with Tris 0.2 M HCl, pH 8.5 for 5 hours at 20 ° C and washed with: (1) 0.2 M sodium acetate buffer 0.5 mM NaCl, pH 3.5, (2) 17 mM phosphate buffer containing 0.4 M NaCl and 1% Triton X-100, pH 7.4; (3) phosphate buffered saline containing 1% Triton X-100, pH 7.4; (4) 100 mM diethylamine containing 0.2% Triton X-100, pH 11.5; and (5) phosphate buffered saline containing 1% Triton X-100. The cell lysate was applied to a 1 ml column of (mAb -26-
ΜΕ20)-Sepharose e fez-se recircular durante 12 a 16 horas ã temperatura de 4°C. Lavou-se o suporte de afinidade com PBS contendo 0,2% de Triton X-100 e efectuou-se a eluição do an tigeneocom dietilamina 100 mM contendo 0,2% de Triton X-100, pH 11,5. Neutralizou-se o produto de eluição com tampão Tris-HCl 2M, pH 6,8. 0 antigéiEO AgME20 parcialmente purificado foi ainda melhor purificado em conformidade com o protocolo SDS-PAGE . 0 produto eluldo da coluna foi submetido a diãlise na presen ça de 0,1% de SDS. Procedeu-se em conformidade com o proto colo SDS-PAGE (10% de acrilamida) de acordo com o método de Laemmli utilizando miniplacas de gel com espaçadores com a espessura de 0,75 mm (BioRad).ΜΕ 20) -Sepharose and recirculated for 12 to 16 hours at 4 ° C. The affinity support was washed with PBS containing 0.2% Triton X-100 and eluted with 100 mM diethylamine antilene containing 0.2% Triton X-100, pH 11.5. The elution product was neutralized with 2M Tris-HCl buffer, pH 6.8. The partially purified AgME20 antigen was further purified according to the SDS-PAGE protocol. The eluate from the column was subjected to dialysis in the presence of 0.1% SDS. SDS-PAGE (10% acrylamide) according to the Laemmli method was performed using gel miniplates with 0.75 mm thick spacers (BioRad).
Após electroforese procedeu-se ã coloração do gel de SDS-poliacrilamida com azul brilhante de Coomassie e depois descolorou-se. Efectuou-se a excisão das bandas do antige^ieo ME20 coloridas (Mr = 116000 e 100000) com uma lâmina de barbear e depois submeteu-se a electroeluição. ✓After electrophoresis, the SDS-polyacrylamide gel was stained with Coomassie brilliant blue and then discolored. The bands of the colored antigen ME20 (Mr = 116000 and 100000) were excised with a razor blade and then electroeluted. ✓
Também se recuperou o antigeneoME20 a partir dos geles de SDS-poliacrilamida por electrocoloração sobre uma mem brana "Problot" (Applied Biosystems, Inc.) utilizando "Mini--Transblot Electrophoretic Transfer Cell" (BioRad Laboratories, Richmond, CA), conforme descrito por Matsudaira, P., (1987), J. Biol. Chem. 261; 10035-10038. A membrana foi tingida com azul brilhante de Coomassie, depois foi descolorida e procedeu-se à excisão das bandas do antigeneo AgME20 coloridas (Mr = 116000 e 100000) utilizando uma lâmina de barbear para posterior analise da sequência aminoterminal. -27 B. Análise sequencialThe ME20 antigen was also recovered from the SDS-polyacrylamide gels by electroblotting onto a membrane " Problot " (Applied Biosystems, Inc.) using " Mini-Transblot Electrophoretic Transfer Cell " (BioRad Laboratories, Richmond, CA), as described by Matsudaira, P., (1987), J. Biol. Chem. 261; 10035-10038. The membrane was stained with Coomassie brilliant blue, then decolorized and the AgME20 colored antigen bands (Mr = 116000 and 100000) were excised using a razor blade for further analysis of the amino terminal sequence. -27 B. Sequential analysis
Efectuou-se a degradação automática segundo Edman de três preparações, respectivamente com 9,9 pmoles, 7,7 pmoles e 3,0 pmoles, cada uma de antígeneo AgME20 num sequenciador de proteinas em líquido pulsatõrio, modelo 475A (Applied Bio systems, inc.) equipado com um carregador de reacção de fluxo vertical transverso, conforme descrito por Hewick e colaboradores [Hewick, R. M., et al., (1981) J. Biol. Chem. 256: 7990-7997].Edman's automatic degradation of three preparations, 9.9 pmol, 7.7 pmol and 3.0 pmol, respectively, each of AgME20 antigen was carried out on a 475A pulsed liquid protein sequencer (Applied Bio systems, inc. .) equipped with a transverse vertical flow reaction charger, as described by Hewick et al. (Hewick, RM, et al., (1981) J. Biol. Chem. 256: 7990-7997].
Os derivados de fenil-tio-idantoina (PTH) com amino-ãcidos foram analisados por cromatografià liquida de elevado rendimento de fase inversa (CLERfi) utilizando um modelo 120A de uma unidade de CLER em tempo real (Applied Biosystems , Inc.) com uma coluna PTH Cl8 (2,1 x 220 mm, Applied Biosystems, Inc,) e utilizando para eluição um gradiente de acetato de sódio/tetra-hidrofurano/acetonitrilo. A redução e a quantificação dos resultados foram efectuadas utilizando uma interface Nelson 760, um computador Hewlett Packard 9816 e um modelo 900A/modelo 475A da aplicação informática para análise do cromatograma (Applied Biosystems, Inc.).Phenylthio-idantoine (PTH) derivatives with amino acids were analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) using a 120A model of a real-time HPLC unit (Applied Biosystems, Inc.) with a column PTH Cl8 (2.1 x 220 mm, Applied Biosystems, Inc.) and using a gradient of sodium acetate / tetrahydrofuran / acetonitrile to elute. Reduction and quantification of results were performed using a Nelson 760 interface, a Hewlett Packard 9816 computer, and a 900A / model 475A computer application for chromatogram analysis (Applied Biosystems, Inc.).
Os estudos das sequências indicaram que 3 antigereos ME20 principais ligados à membrana (Mr = 116000; 100000; e 80000, conforme determinado pelo protocolo SDS-PAGE ém 10% de geles de poliacrilamida ) possuíam sequências de aminoãcidos aminoterminais idênticas. A sequência aminoterminal designa da por sequência I.D. NQ 1 é a seguinte: -28- -28- K V P R N Q D w L G Lys Vai Pro Arg Asn Gin Asp Trp Leu Gly 1 5 10 V S R Q L R T K A W Vai Ser Arg Gin Leu Arg Thr Lys Ala Trp 15 20 N R Q L Y P E W T X Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr X 25Sequence studies indicated that 3 major membrane-bound ME20 antigens (Mr = 116000; 100000; and 8000 as determined by the SDS-PAGE protocol are 10% polyacrylamide gels) had identical amino-terminal amino acid sequences. The amino terminal sequence is designated as I.D. NQ 1 is as follows: KVPRNQD w LG Lys Go Pro Arg Asn Gin Asp Trp Leu Gly 1 5 10 VSRQLRTKAW Will be Arg Gin Leu Arg Thr Lys Ala Trp 15 20 NRQLYPEWTX Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr X 25
(X: o aminoãcido não foi identificado) ^ ^ 4. *(X: the amino acid has not been identified)
Alem disso isolou-se uma forma solúvel do antigeneo AgME20 a partir do meio condicionado de células H3606. Purificou-se o antígeneopor cromatografia de afinidade e recu perou-se a partir da coluna do anticorpo mAb ME20 por elui-ção com dietilamina 100 mM, pH 11,5, na ausência de Triton X-100. O valor Mr do antigeneo solúvel foi de 97000.In addition, a soluble form of the AgME20 antigen was isolated from the conditioned medium of H3606 cells. The antigen was purified by affinity chromatography and recovered from the mAb ME20 antibody column by elution with 100 mM diethylamine, pH 11.5, in the absence of Triton X-100. The Mr value of the soluble antigen was 97,000.
Procedeu-se ã comparação da sequência aminoterminal do antigeneoAgME20 relativamente à base de dados PIR recente mente actualizada (edição 27) e ã base de dados integrada MIPSX. A comparação de sequências nao revelou semelhanças significativas com qualquer outra sequência conhecida. A memória descritiva e os exemplos anteriores tem co mo objectivo ilustrar a presente invenção mas sem contudo a limitarem. E possível introduzir diversas variações e modificações sem que haja afastamento do espírito e do âmbito da presente invenção. -29- -29-The amino terminal amino acid sequence of the antigeneAgME20 was compared to the recently updated PIR database (edition 27) and to the integrated MIPSX database. Sequence comparison showed no significant similarities to any other known sequence. The specification and the previous examples are intended to illustrate the present invention but without limiting it. Various variations and modifications may be introduced without departing from the spirit and scope of the present invention. -29-
LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Hellstrom, IngegerdLIST OF SEQUENCES (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Hellstrom, Ingegerd
Hellstrom, Karl Erik Marquardt, HansHellstrom, Karl Erik Marquardt, Hans
(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: "ME20: ANTICORPOS MONOCLONAIS E ANTIGÊNEOS PARA O MELANOMA HUMANO" (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 1 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Bristol-Myers Squibb Company (B) RUA: 3005 First Avenue (C) CIDADE: Seattle (D) ESTADO: Washington (E) PAÍS: USA (F) CP: 98121 (v) ELEMENTOS INFORMÁTICOS: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível(ii) TITLE OF THE INVENTION: " ME20: MONOCLONAL AND ANTIGENS ANTIBODIES FOR HUMAN MELANOMA " (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 1 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESS: Bristol-Myers Squibb Company (B) STREET: 3005 First Avenue (C) USA (F) CP: 98121 (v) COMPUTER ITEMS: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA:(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) PROGRAM:
Patentln Release Versão Nõ 1.0 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO DE PATENTE: (A) N0MERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÕSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO:(Vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) DEPOSIT DATE: (C) CLASSIFICATION:
Cviii) INFORMAÇÕES SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Sorrentino, Joseph (B) NÚMERO DE REGISTO: 32,598 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: ON0084- (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (206) 728-4800 (B) TELEFAX: (206) 448-4775 INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID NQ: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 Aminoãcidos (B) TIPO: Aminoãcido (D) TOPOLOGIA: Linear (li) TIPO DE MOLÉCULA: Péptido (iii) HIPOTÉTICO: Nenhum (iv) ANTI- -SENTIDO: Nenhum (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (Vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (F) TIPO DE TECIDO: Melanoma (H) LINHA CELULAR: células H3606 do Melanoma Humano -31- -31- (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1C) INFORMATION ON REPRESENTATIVE / AGENT: (A) NAME: Sorrentino, Joseph (B) REGISTRATION NUMBER: 32,598 (C) REFERENCE NUMBER / PROCEDURE: ON0084- (ix) TELECOMMUNICATIONS INFORMATION: (A) TELEPHONE: ) 728-4800 (B) TELEFAX: (206) 448-4775 INFORMATION FOR SEQ. Amino acids (D) TOPOLOGY: Linear (li) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: None (iv) ANTI-BREAKING HYPHEN (8209) (F) TYPE OF FABRIC: Melanoma (H) CELL LINE: Human Melanoma H3606 cells -31- - NON-BREAKING HYPHEN (1) 31- (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1
Lys Vai Pro Arg Asn Gin Asp Trp Leu Gly 15 10Lys Go Pro Arg Asn Gin Asp Trp Leu Gly 15 10
Vai Ser Arg Gin Leu Arg Thr Lys Ala Trp 15 20Will be Arg Gin Leu Arg Thr Lys Ala Trp 15 20
Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr 25Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr 25
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