PL95080B1

PL95080B1 -

Info

Publication number: PL95080B1
Application number: PL171393A
Authority: PL
Original assignee: Ajinómoto Co
Filing date: 1974-05-24
Publication date: 1977-09-30

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza- nia 1-lizyny na drodze fermentacji, a zwlaszcza sposób fermentacyjnego wytwarzania 1-lizyny na pozywce z dodatkiem antybiotyków, srodków po- wierzchniowo-czynnych i/lub srodków przeciw- utleniajacych.Celem wynalazku jest opracowanie ulepszonego sposobu wytwarzania 1-lizyny na pozywce stano¬ wiacej zródlo wegla. 1-lizyna jest znana jako nie¬ zbedny skladnik pozywienia ludzi i zwierzat i spo¬ dziewane jest jej szerokie zastosowanie do spo¬ rzadzania i wzbogacania produktów spozywczych.Znane jest wytwarzanie 1-lizyny z weglowodanów ulegajacych fermentacji przez fermentacje przy uzyciu mikroorganizmów. Wsród mikroorganizmów produkujacych 1-lizyne znane sa obecnie trzy rodzaje bakterii. Pierwszy rodzaj stanowi mutant Micrococcus glutamicusr wymagajacy jako pozywki homoseryny, metioniny lub treoniny, opisany w opisie patentowymi Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 2 979 439. Drugi rodzaj jest reprezentowany przez mutanty wrazliwe na treonine lub metionine i przez wrazliwe na treonine i wymagajace treo¬ niny mutanty, których wzrost jest inhibitowany stezeniem treoniny lub metioniny, lecz te ostatnie wymagaja treoniny do wzrostu, jak opisano w opi¬ sie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 616 218. Trzeci rodzaj reprezentowany jest przez mutant odporny na dzialanie analogów lizy¬ ny, takich jak S-(2-amrnoetylo)-l-cysiteina (ozna- czana dalej skrótem AEC), opisany w opisach pa¬ tentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3 707 440 i 3 707 441, oraz przez mutant odporny na AEC i wymagajacy jednego lub wiecej srodków odzywczych, jak ujawniony w belgijskim opisie patentowym nr 798 890.Obecnie stwierdzono, ze 1-lizyne wytwarza' sie na drodze fermentacji pozywki z mikroorganizmem produkujacym 1-lizyne przy wartosci pH 5—9, za^ wierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, sole nieorganiczne, substancje konieczne do roz¬ woju i substancje wzrostowe.Sposób wytwarzania 1-lizyny wedlug wynalazku polega na tym, ze fermentacje prowadzi sie w sro¬ dowisku antybiotyków i/lub srodków powierz- chniowo-czynnych i/lub srodków przeciwutleniaja- cych, a nastepnie odzyskuje sie wytworzona 1-lizyne nagromadzona w srodowisku hodowlanym.Jako mikroorganizmy produkujace 1-lizyne sto¬ suje sie wyzej wymienione mutanty szczepów bakterii reprezentowanych przez rodzime szczepy rodzaju Brevibacterium i Corynebacterium, o ko¬ niecznej odpornosci wobec AEC i/lub wymagajace jednego ze skladników odzywczych.Szczepy stosowane w sposobie wedlug wyna¬ lazku wytwarza sie znanym sposobem przez pod¬ danie wegetatywnych komórek macierzystych dzia¬ laniu swiatla ultra-fioletowego, promieni-x albo promieni-gamma i przez kontaktowanie szczepów macierzystych z roztworem azotynu sodu, sulfo- 95 08095 080 nianem etylometylowym lub N-metylo-N'-nitro- -N-nitrozoguanidyna wedlug J. Gen. Appl. Micro- bial. 13, 349—358 (1967) i w znany sposób selek¬ cjonuje mutanty, które wymagaja skladnika od¬ zywczego i/lub sa odporne na analogi lizyny i/lub wrazliwe na dzialanie treoniny lub metioniny.Jako antybiotyki stosuje sie chloramphenicol, erytromycyne, oleandomycyne, kauamycyne, strep¬ tomycyne, kasugaimycyne, tetracyklime, oksytetra- cykline, mytomycyne C, aktynomycyne D, cyklo- seryne, zwiazki z grupy penicylin, zwiazki z grupy cefalosporyn, polimiksine i azaseryne. Stwierdzono, ze szczególnie skuteczne w sposobie wedlug wy¬ nalazku sa antybiotyki, takie jak chloramphenicol, erytromycyna, oleandomycyna", streptomycyna i ka- sju^amycyna, które jak wiadomo reaguja z czescia ?n|j!kr£^^ bialko.? Jako srodki* powierzchniowo-czynne stosuje sie i srodki anionowe, f takie jak siarczany wyzszych I cHfCUMMsp^aJj^abptizenosulfoniany, alkilofosforany ^jT3^Q@lktk*ulfoni|rsztyniany i srodki kationowe, takie jak soTe klkiloaminowe i czwartorzedowe sole amoniowe, srodki niejonowe, takie jak alkiloeter polioksyetylenu, sorbitanomonoalkiloeter polioksy- etylenu i jednolaurynian sorbitamu, oraz srodki amfoteryczne, takie jak imidazol i betaina.Jako srodki przeciwutleniajace stosuje sie: 4,4'- -dwuhydroksy-3,3'-dwumetylodwufenyl; 2,6-dwu- -3-butylofenol; katechine, butylokatechine, kwas protokatechowy, a-tokoferol, purogallol, kwas ga¬ lusowy, estry kwasu galusowego, naftol, zwiazki fenolowe takie jak aminofenol, aminy takie jak naftyloaminy, dwufenyloamina, dwu-2-butylo-p- -fenylenodiwuamina, 6-etoksy-2,3,4-trójimetylo-l,2- -dwuhydrochinolina, semikarbazyd, fenotiazyna i czterofenylohydrazyma, oraz zwiazki zawierajace siarke, takie jak kwas tiodwupropionowy i kwas tiodwuglikolowy.Stwierdzono, ze ilosc 1-lizyny gromadzacej sie w bulionie hodowlanym, wytwarzanym w znany sposób zwieksza sie zwykle dzieki dodaniu do po¬ zywki antybiotyków, srodków powierzchniowo- czynnych i/lub srodków przeciwutleniajacych. Nie wiadomo jednak, jak wyjasnic powód zwiekszone¬ go gromadzenia sie 1-lizyny po wprowadzeniu tych dodatków. Przypuszcza sie tylko, ze dodatek anty¬ biotyku lub srodków powierzchniowo-czynnych wplywa ewentualnie na przepuszczalnosc scianek lub blon komórkowych mikroorganizmów produku¬ jacych 1-lizyne tak, ze 1-lizyna wytworzona przez mikroorganizm moze byc uwolniona do srodowiska fermentacji oraz, ze dodatek srodków przeciwutle¬ niajacych ewentualnie zapobiega dezaktywacji przez utlenianie enzymów, koniecznych do bio¬ syntezy 1-lizyny.Antybiotyki i/lub substancje powierzchniowo- czynne i/lub srodki przeciwutleniajace dodaje sie do srodowiska hodowli w takiej ilosci, ze wzrost mikroorganizmu w srodowisku zawierajacym te substancje jest dluzej inhibitowany niz w srodo¬ wisku nie zawierajacym wyzej wymienionych do¬ datków. Dodatki te dodaje sie do srodowiska ho¬ dowli w ilosci powodujacej zapoczatkowanie wzro¬ stu, kontynuowanie wzrostu lub przerwanie wzro¬ stu mikroorganizmów podczas hodowania.Stosowana pozywka fermentacyjna jest pozywka naturalna lub sztuczna, zaspokajajaca podstawowe potrzeby stosowanych mikroorganizmów wraz ze specyficznym srodkiem lub srodkami odzywczymi z wymienionej poprzednio grupy.Odpowiednie zródlo wegla stanowia zwykle weglowodany, takie jak glikoza, fruktozo, malto¬ za, sacharoza, skrobia hydrolizowana, melasa a tak¬ ze kwasy organiczne, zwlaszcza kwas octowy, pro- pionowy, benzoesowy lub fumarowy i alkohole, zwlaszcza metanol, proipanol i etanol, przy czym pozywka moze zawierac kilka róznych zródel wegla. Niektóre mutanty przyswajaja jako zasad¬ nicze lub uboczne zródlo wegla takze weglowo- dory.Azot dostarcza sie w postaci soli amonowych, azotanów, mocznika, aminokwasów, wyciagu na- mokowego kukurydzy, ekstraktu drozdzy, ekstrak¬ tu miesa, maczki rybnej, peptonu, bulionu, hydro- lizowanej kazeiny, ich mieszanin, a takze w po¬ staci amoniaku.Niezbedne jony nieorganiczne dostarcza sie w po¬ staci siarczanu magnezu, fosforanu sodu, jedno i dwuwodorofosforanów potasu, siarczanu zelaza, chlorku magnezu, chlorku wapnia, chlorku sodu i innych.Specjalne srodki odzywcze, wymagane przez nie¬ które mutanty, wprowadza sie w postaci zawiera- jacyeh je produktów maturalnych, i w postaci prostych pochodnych produktów naturalnych, ta¬ kich jak hydrolizowane bialko sojowe, ekstrakt drozdzy, wyciag namokowy kukurydzy, pepton, hydrolizowana kazeina itp.Dla optymalnego wytwarzania 1-lizyny wazne jest regulowanie wartosci pH pozywki fermentacyjnej.Najlepsze wyniki osiaga sie, utrzymujac wartosc pH w zakresie 5—9, co osiaga sie zwykle przez dodawanie podczas fermentacji mocznika, amonia- 40 ku, weglanu wapnia, a w miare potrzeby orga¬ nicznych i nieorganicznych kwasów. Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 24—37°C, chociaz korzystna temperatura w znacznym stopniu zalezy od stosowanego mikroorganizmu, w ciagu 2—7 dni 45 w warunkach aerobowych.Wytworzona w ten sposób 1-lizyne odzyskuje sie z bulionu fermentacyjnego w znany sposób, taki jak absorpcja i eluacja z jomowymienionych'zywic, usuwanie komórek i zatezenie przesaczu zawiera- 50 jacego 1-lizyne itd.L-lizyne, nagromadzona w bulionie fermentacyj¬ nym identyfikuje sie za pomoca reakcji ninhydry- nowej na chromatogramie bibulkowym, ma pod¬ stawie wartosci wspólczynnika Rf na chromato¬ gramie bibulkowym, metoda elektroforezy w pró- 55 bach mikrobiologicznych i na dzialanie karboksy- lazy lizyny jak równiez przez porównanie z wy¬ nikami uzyskanymi przy uzyciu slepych próbek.Ilosc lizyny, wytworzonej w bulionie hodowla¬ nym oznacza sie metoda kalorymetryczna, oparta 60 na reakcji ninhydrynowej soli miedzi w kwasnym srodowisku, i przedstawionej w postaci chlorowo¬ dorku.Przyklad I. Podstawowa pozywke hodowla¬ na, zawierajaca 10% glikozy, 4,5% siarczanu amo- 65 nu, 0,1% KH2PQ4, 0,04% MgS04, 7% H20, 2 ppm95 080 6 Fe+ + , 2 ppm Mn++, 50 mg/litr biotyny, 200 mg/litr chlorowodorku tiaminy, 1% hydrolizowanego bialka sojowego (o calkowitej zawartosci azotu 7%) i 5% weglanu wapnia (sterylizowanego oddzielnie), o wartosci pH 8, dzieli sie na 20 ml porcje. Do kazdej porcji pozywki dodaje sie nastepnie chloramphenicól lub Miramol 2 " MCA (nazwa handlowa kationowego srodka powierzchmiowo- czynnego, wytwarzanego przez firme Miranol Che¬ mical Co., Inc.) to jest laurylosiarczanu 2-unde- cylo-N-karboksymetylo-N-(2-karboksymetoksy)- -etyloimidazolinotrójmetyloglicyny, jak wskazano dalej, kazda porcje umieszczono w kolbie do wy¬ trzasania o pojemnosci 500 ml i sterylizuje sie.Porcje pozywki szczepi sie odpowiednio Breviba- cterium lactofermentum FERMP-1944 (szczep od¬ porny na AEC, pochodzacy z Brevibacterium lacto¬ fermentum ATCC 13869) i Corynebacterium gluta¬ micum FERMP-1987 (szczep odporny na AEC, po¬ chodzacy z Micrococcus glutamicus ATCC 13032), wyhodowanymi poprzednio na agarze bulionowo- glikozowym i wstrzasajac prowadzi sie hodowle w temperaturze 31°C. Porcje pozywki dzieli sie na dwie grupy.Do pierwszej grupy porcji pozywki chloramphe¬ nicol dodaje sie na poczatku i/lub po 15 godzinach :d chwili zaszczepienia, w ilosci podanej w ta- olicy I. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 72 go¬ dzin. Ilosc 1-lizyny nagromadzonej w bulionie, oznaczona w postaci chlorowodorku, podano w ta¬ blicy I.Z bulionu pofermentacyjnego badano ponad 3000 róznych prób szczepów, hodowanych na po¬ zywce bez dodatku antybiotyku, przy czym badano zdolnosc tych szczepów do wytwarzania 1-lizyny.W wyniku tego potwierdzono, ze wszystkie te szczepy posiadaja odpornosc na AEC, która jest oryginalna charakterystyczna cecha szczepu i w konsekwencji sa zdolne do wytwarzania 1-lizyny. Wskazuje to, ze w mutancie szczepu, sto¬ sowanego nawet po hodowli w ciagu 72 godzin nie wystepuje powtórna mutacja.Do drugiej czesci porcji pozywki dodaje sie na poczatku hodowli lub w ciagu 7 godzin od chwili zaszczepienia wspomniany Miranol 2MCA, w ilosci podanej w tablicy II. Ilosc 1-lizyny, nagromadzona w kazdej porcji bulionu po fermentacji zakonczo¬ nej po 72 godzinach przedstawiono w tablicy II.Przyklad II. Prowadzi sie fermentacje 1-li¬ zyny jak opisano w przykladzie I, z ta róznica, ze do pozywki poczatkowo dodaje sie 0,5 mg/ml erytromycyny, a nastepnie po 15 godzinach od chwili zaszczepienia 3 mg/ml erytromycyny. Ilosc 1-iizyny nagromadzonej w bulionie po prowadzeniu hodowli w ciagu 72 godzin podano w tablicy III.Przyklad III. Prowadzi sie fermentacje 1-li¬ zyny jak opisano w przykladzie I (II) z ta róznica, ze do pozywki dodaje sie Tween-20 (nazwa handlo¬ wa, pochodna polioksyalkilenowa jednolaurynianu sorbitamu, wytwarzana przez Atlas Powder Co., Inc.), w ilosci podanej w tablicy IV. Ilosc 1-lizyny nagromadzonej w bulionie po prowadzeniu hodowli w ciagu 742 godzin podano w tablicy IV.Przyklad IV. Prowadzi sie fermentacje 1-lizy¬ ny jak opisano w przykladzie -1 z ta róznica, ze 40 45 55 65 stosuje sie Breyibactedrium lactoleimienium FERMP-1711 (odporna na AEC i wymagajacy alaniny), Corynebacterium glutamicum FERMP-1613 (odporny na AEC i wymagajacy seryny) Cotryne- bacterium glutamicus FERMP-1982 (odporny na AEC i wymagajacy piroliny), Brevibacterium lacto¬ fermentum FERMP-1857 (odporny na AEC i wy¬ magajacy alaniny i leucyny), Breyibaciterium lacto¬ fermentum FERMP-1574 (odporny na AEC i wy¬ magajacy kwasu nikotynowego lub amidu kwasu nikotynowego) i Brevibacterium lactofermentum FERMP-1575 (odporny na AEC i wymagajacy hypoksantyny), a antybiotyki dodaje sie. w sposób pedany w tablicy V.Ilosc 1-lizyny, nagromadzonej w bulionie po prowadzeniu hodowli w ciagu 72 godzin podano w tablicy V.Przyklad V. Prowadzi sie fermentacje 1-lizy¬ ny jak opisano w przykladzie I z ta róznica, ze stosuje sie Corynebacterium glutamicum FERMP- -1613, Corynebaciterium glutamicum (wymagajacy . hemoeryny), Brevibacterium lactofermentum FERMP-1579, (odporny na AEC i wymagajacy seryny i l^cyny), Brevibacterium lactofermentum FERMP-1574, Brevibacterium Iactofermeintum FERM-1575 oraz Brevibacterium lactofermentum FERMP-1811 (wymagajacy treoriiny). Wymagany srodek odzywczy dodaje sie jak pokazano w tablicy VI. Srodek powierzchniowo-czynny, przedstawiony w tej samej tablicy, dodaje sie odpowiednio po kultywacji hodowli w ciagu 16 godzin.Ilosc 1-lizyny, nagromadzonej w bulionie po pro¬ wadzeniu hodowli w ciagu 72 godzin podano w tablicy VI.Przyklad VI. Prowadzi sie fermentacje 1-li¬ zyny jak opisano w przykladzie I, z ta róznica, ze stosuje sie Breyibacterium lactofermentum FERMP-1944, FERMP-1711, FERMP-1572, FERMP- ' -1574, FERMP-1575, FERMP-1841 oraz Coryne¬ bacterium glutamicum FERMP-1987, FERMP-1613, FERMP-1982 i w pewnych przypadkach dodaje sie skladnik odzywczy jak podano w tablicy VII oraz srodki przeciwutleniajace w sposób podany w ta¬ blicy VII.Ilosc 1-lizyny, nagromadzonej w bulionie po pro¬ wadzeniu hodowli w ciagu 72 godzin podano w tablicy VII.Przyklad VII. Podstawowa pozywke, zawie^ rajaca 10% melasy z buraków cukrowych (jako zródlo glikozy), 4,5% siarczanu amonu, 0,1% KH2P04, 0,04% MgS04-7 \H;20, 2 ppm Mn+ + 50 mg/litr biotyny, 200 mg/litr chlorowodorku tiaminy, 1,5% hydrolizowanego bialka sojowego / (o calkowitej zawartosci azotu wynoszacej 7"%) i 5'% weglanu wapnia (sterylizowanego oddzielnie), o wartosci pH 8,0 dzieli sie na porcje o objetosci ml. Kazda z porcji pozywki umieszcza sie w kolbie do wytrzasania o pojemnosci 500 ml i poddaje sterylizacji. Nastepnie porcje pozywki szczepi sie Brevibacterium lactofermentum FERMP-1711, wyhodowanym wczesniej na skosie agarowym bulionowo-glikozowym i prowadzi sie hodowle w ciagu 72 godzin w temperaturze 31°C wytrzasajac zawartosc kolby, z dodawaniem do pozywki chloraniiphenicolu, erytromycyny, Mira-95 080 8 nolu-2,MCA i/lub Tw^een 20, w sposób podany w tablicy VIII. Ilosc 1-lizyny, gromadzacej sie w bulionie podano w tablicy VIII.Przyklad VIII. Prowadzi sie hodowle Bre- vibaoterirum lactofermentum FERM-P-1711 jak opisano w przykladzie VII z ta róznica, ze stosuje sie pozywke zawierajaca jako zródlo glikozy 15°/o melasy z buraków cukrowych i dodajac do niej po 26 godzinach od chwili zaszczepienia 0,l°/o Miranolu 2* MCA. Po prowadzeniu hodowli w ciagu 90 godzin stwierdzona w bulionie zawartosc 1-li¬ zyny wynosi 5,8 g/dl. Z drugiej strony, w bulionie z hodowli prowadzonej w ten sam sposób lecz bez Tab dodatku Miranolu 2 MCA zawartosc 1-lizyny wy¬ nosi 5,2 g/dl.P r z y k l d IX. Prowadzi sie hodowle Coryne- bacterium glutamicum FERMP-1982 jak opisano w przykladzie Vii z ta róznica, ze zamiast melasy z buraków cukrowych stosuje sie melase z trzciny cukrowej a do pozywki w sposób podany w ta¬ blicy IX dodaje sie tetracykline, Nissannion LT 221 lub kwas galusowy.Ilosc 1-lizyny nagromadzonej w bulionie po pro¬ wadzeniu' hodowli w ciagu 72 godzin podano w tablicy IX. lica I Szczep FERMP-1944 FERMP-1987 Stezenie chloramphenicolu mg/ml Czas do 0 godz. 1 2 1 1 0 1 0 dawania godz. 0 0 50 0 0 Wzrost (OD) 1,18 1,18 0,91 0,76 1,25 0,95 1,25 Pozostalosc glikozy (g/dl) 0 0,05 0,2 3,5 0 0,5 0 Ilosc nagroma¬ dzonej 1-lizyny (g/dl) 2,0 2,0 3,1 2,0 1,8 3,0 1,8 Wydajnosc obliczona na podstawie . zuzycia glikozy 21 32 31. 18 18 OD oznacza gestosc optyczna i wskazuje na ilosc komórek mikrobiologicznych.Wzrost: Po rozcienczeniu do objetosci 26 razy wiekszej od objetosci poczatkowej, wlasciwa gestosc optyczna wynosi 562[i. 35 Tablica II 40 45 50 Szczep FERMP-1944 FERMP-1987 Stezenie Miranolu 2 MCA, °/o 0 godzin 0,01 0,05 0 0 0 0,05 0 0 7 godzin 0 0 0,05 0,1 0 0 0,1 0 Ilosc nagroma¬ dzonej 1-lizyny (g/dl) 2,0 2,3 2,3 2,4 1,8 2,1 2,5 1,8 Tablica Szczep FERM P-1944 FERM P-1987 IV Stezenie Tween (°/o) 0 godzin 0,1 0,2 0 0 0 0,2 0 0 7 godzin 0 0 0,1 0,2 0 0 0,2 0 Ilosc nagroma¬ dzonej 1-lizyny (g/dl) 2 2—3 2,2 2,5 1,8 2,4 2—b 1,8 Tablica V Tablica III Szczep FERM P-1944 FERM P-1987 Erytro¬ mycyna dodana nie dodana dodana nie dodana Wzrost (OD) 0,94 1,25 0,95 1,25 Ilosc 1 nagroma¬ dzonej 1-lizyny (g/dl) 3,3 1,8 3,1 1,8 Uwaga: Wzrost taki sam jak w tablicy I. 65 Stosowany mikro¬ organizm Brevi: lacto- fermentum FERM P-1711 Dodawany antybiotyk Dwuhydro- ksystrapto- mycyna Poczatkowo: 0,5 mg/ml Po 24 godzi¬ nach 4 mg/ml Bez dodatku Wzrost (OD) 0,97 1,05 Ilosc nagro¬ madzo¬ nej 1-lizyny (g/dD 4,7 4,295 080 Tablica VI (ciag dalszy) Stosowany mikro¬ organizm Coryne glu- tamicum FERM P-1613 Coryne glu¬ tamicurn FERM P-1982 Dodawany antybiotyk Tetracyklina Poczatkowo 1 mg/ml Po 24 godzi¬ nach 7 mg/ml Bez dodatku Wzrost (OD) Ilosc nagro¬ madzo¬ nej 1-lizyny (g/dl) Brevi. lacto- fermentum FERM P-1857 Brevi. lacto- fermentum Penicylina Poczatkowo 1 jedno¬ stka/ml Po 20 godzi¬ nach: jedno¬ stek/ml Bez dodatku 1,00 1,00 1,11 0,93 1,02 Azaseryna Poczatkowo mg/ml Po 24 godzi¬ nach mg/ml Bez dodatku Polimiksy- na B Poczatkowo: 1 jedno¬ stka/ml Po 20 godzi¬ nach 4 jed.no- stki/iml Bez dodatku 0,98 1,08 0,93 1,10 Tablica VI 2,8 2,5 3,3 3,0 3,4 3,4 3,5 3,0 Stosowany mikro¬ organizm 1 Coryne. glutaimicum FERM P-1613 Coryne. glutamicum FERM P-1982 Doda¬ wany skladnik odzyw¬ czy i jego steze¬ nie (mg/dl) 2 — Dodawany srodek powierzch- niowoczynny i jego stezenie '(%) 3 Ryponol LE 110—0,05% Bez dodatku Ryponol LL — 0,1% Bez dodatku Ilosc nagro¬ madzo¬ nej 1-lizyny (g/dl) 4 3,5 3,0 3,3 3,0 1 40 45 55 60 1 Brevi. lakto- , fermentum FERM P-1572 Brevi-lacto- lermentum FERM P-1574 Brevi. lacto- fermentum FERM P-1575 Brevi. lacto- fermentum FERM P-1841 2 hypo- ksan- tyna mg/dl dl metio¬ nina 150 mg/dl 1 3 Ovanol 516 /0,O5% Bez dodatku Ryponox NCK — 0,1% Bez dodatku Nissannonion LT 221—0,2% Bez dodatku Catinol i HTM — 0,01% Bez dodatku 4 ! 4,6 | 3,6 3,1 1 3,8 3,0 1 2,9 2,3 Uwaga: Rypon LE — nazwa handlowa, sól eta-< noloaminowa kwasu alkilobenzenosulfonowego (wy¬ twarzana przez Lion Fat and Oil Co., Ltd.).Ryponol LL 103 — nazwa handlowa, siarczan laurylu (wytwarzany przez Lion Fat and Oil Co., Ltd.). Rypomin LH — nazwa handlowa, amfote- ryczny srodek powierzchniowo-czynny typu imida- zoliny (wytwarzany przez Lion Fat and Oil Co., Ltd.).Ryponox NCK — nazwa handlowa, alkilofenolo- eter polioksyetylenu (wytwarzany przez Lion Fat and Oil Co., Ltd). Ovanol 516 — nazwa handlowa, amfoiteryczny srodek 'powierzchniowo-czynny typu betainy (wytwarzany przez Tono Chemical Indu- strial Co., Ltd.).Nissannonion LT 221 — nazwa handlowa, nie¬ jonowy srodek powierzchniowo-czynny (wytwa¬ rzany przez Nippon Oils and Fat Co., Ltd.). 65 Stosowany mikro¬ organizm Brevi. lacto- fermentum FERM P-1944 Tablica VII Doda¬ wany sklad¬ nik odzyw¬ czy Dodawany srcdek przeciwutle- niajacy i jego stezenie (mg/ml) kwas galu¬ sowy doda¬ wany na po¬ czatku — 0,5% Bez dodatku , Ilosc nag.ro- ' madzo- nej 1-lizyny (g/dl) 2,5 1,811 tS080 12 Stosowany mikro¬ organizm Brevi. lacto- fermentum FERM P-1711 Brevi. lacto- fermentum FERM P-1572 Brevi. lacto- fermentum FERM P-1574 Brevi. lacto- fermentum FERM P-1575 Brevi. lacto- cermentum 1 FERM P-1841 Coryne glu¬ tamicum FERM P-1987 Coryne glu- tamicum FERM P-1613 Brevi. lacto- fermemtum FERM P-1982 Doda¬ wany sklad¬ nik odzyw¬ czy _ hypo- ksan- tyna mg/dl dl-me- tionina 150 mg/dl .. Dodawany srodek pnzeciwutle- niajacy i j ego . stezenie (mg/ml) , kwas aspara¬ ginowy -f- ester laurylowy kwasu galu¬ sowego Po 12 godzi¬ nach — 0,05% Bez dodatku tiodwuglikol Po 12 godzi¬ nach — 0,5% Bez dodatku ct-tokoferol Po 12 godzi¬ nach — 0,1% Bez dodatku butylohydro- ksyanizol (BHA) Po 12 godzi¬ nach — 0,05% Bez dodatku butylokate- china Po 12 godzi¬ nach — 0,1% Bez dodatku kwas proto- katechowy Poczatko¬ wo — 1% Bez dodatku butylohydro- ksyitoluen Po 12 godzi¬ nach — 0,05% Bez dodatku BHA i kwas tiodwugliko- lowy Po 12 godzi¬ nach odpo¬ wiednio 0,02% i 0,1% Bez dodatku Ilosc nagro¬ madzo¬ nej 1-lizyny (g/dl) 4,6 4,2 ,0 4,6 3,7 3,1 3,4 3,0 2,7 2,3 1 2,2 1,8 j k 3,3 1 3,° 3,8 | 3,0 40 45 50 55 Stosowany mikro¬ organizm Microc. glu- [ tamicus ATCC 13286 Doda¬ wany sklad¬ nik odzyw¬ czy dl-me- tionina mg/dl Dodawany srodek przeciwutle- niajacy i jego stezenie (mg/ml) ester etylowy kwasu galu¬ sowego Po 12 godzi¬ nach — 0,1% Bez dodatku Ilosc nagro¬ madzo¬ nej 1-lizyny (g/dl) 4,4 3,8 T a b 1 ic a Dodatki Nazwa Chloram- phenicol Erytromycyna Miranol 2 MCA Tween 20 Chloram- phenicol + Bez dodatku (próbka kontrolna) Steze¬ nie mg/ml . 15 mg/mJ 0,1% 0,2% 0,2tyo — VIII Czas dodawania 17 godzin 17 godzin 18 godzin 18 godzin — Ilosc 1 nagro¬ madzo¬ nej 1-lizyny (g/dl) 4,3 4,1 3,9 3,8 3,5 Tablica Dodatek Nazwa Tetracyklina Nissannonion LT 221 Kwas galusowy Bez dodatku (próbka kontrolna) Steze-, nie mg/ml 0,2% 0,5% — IX • Czas doda¬ wania 19 godzin 19 godzin 19 godzin — Ilosc [ nagro¬ madzo¬ nej 1-lizyny (g/dl) | 4,2 3,6 1 3,5 3,1 | 65 PL

Claims

Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania 1-lizyny na drodze fer¬ mentacji pozywki zawierajacej zródla przyswa¬ jalnego wegla i azotu, sole nieorganiczne, substan¬ cje niezbedne dla rozwoju oraz wzrostowe sub¬ stancje organiczne przy wartosci pH 5—9, zna-13 mienny tym, ze fermentacje przeprowadzi sie z mikroorganizmem nalezacym do rodzaju Brevi- bacterium lub Corynebacterium w obecnosci anty¬ biotyku w ilosci odpowiedniej do zmniejszenia poziomu wzrostu mikroorganizmu do poziomu nizszego niz ten, który otrzymuje sie przez prowa¬ dzenie fermentacji pod nieobecnosc wymienionych antybiotyków.
2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie mikroorganizm produkujacy 1-lizyne odznaczajacy sie co najmniej odpornoscia na dzia¬ lanie S-(2-aminoetylo)-l-cysteiny.
3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sto¬ suje sie mikroorganizm produkujacy 1-lizyne wy¬ magajacy co najmniej jednego srodka odzywczego, takiego jak homoseryna, treonina, alanina, prolina, seryna, leucyna, kwas nikotynowy lub hypoksan- tyna.
4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie antybiotyki, takie jak chloramphenicol, erytromycyne, oleandomycyne, kauamycyne, strep¬ tomycyne, kasugamycyne, tetracykline, oksytetra- cykline, mytomycyne C, aktynomycyne d, cyklo- seryne, zwiazki z grupy penicylin, zwiazki z grupy cefalosporyn, polimiksine i azaseryne.
5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze antybiotyk dedaje sie do pozywki w calosci na po¬ czatku hodowli lub podczas hodowli albo okresowo w trakcie rozwoju mikroorganizmu podczas hodowli.
6. Sposób wytwarzania L-lizyny na drodze fer¬ mentacji pozywki zawierajacej zródla przyswa¬ jalnego wegla i azotu, sole nieorganiczne, substan¬ cje niezbedne dla rozwoju ora,z wzrostowe sub¬ stancje organiczne przy wartosci pH 5—9, zna¬ mienny tym, ze fermentacje przeprowadza sie z mikroorganizmem nalezacym do rodzaju Brevi- bacterium i Corynebacterium w obecnosci srodków powierzchniowo-czynnych i/lub przeciwuitleniaja- cych w ilosci odpowiedniej do zmniejszenia po¬ ziomu wzrostu mikroorganizmów do poziomu nizszego niz ten, który otrzymuje sie przez pro¬ wadzenie fermentacji pod nieobecnosc wymienio¬ nych srodków powierzchniowo-czynnych i/lub przeciwutleniaczy.
7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie mikroorganizm produkujacy L-lizyne odznaczajacy sie co najmniej odpornoscia na dzia¬ lanie S-(2-aminoetylo)-l-cysteiny.
8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie mikroorganizm produkujacy L-»lizyne wymagajacy co najmniej jednego srodka odzyw¬ czego, takiego jak homoseryna, treonina, metio¬ nina, alanina, prolina, seryna, izoleucyna, walina, leucyna, amid kwasu nikotynowego, guanina, hypo- ksantyna lub witamina B12.
9. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie srodki powierzchniowo-czynne, takie 14 jak siarczmy wyzszych alkoholi, alkilobenzeno- sulfoniany, alkilofosforany, dwualkilosiulfoburszity- niany, sole alkiloamin, czwartorzedowe sole amo¬ niowe, alkiloeter polioksyetylenu, sorbitanomo- 1 noalkiloeter polioksyetylenu, jednolaurynian sorbi- tanu, imidazoline i betaine.
10. Sposób wedlug zastrz. 6, znarrienny tym, ze stosuje sie srodki przeciwutleniajace, takie jak 4,4'-dwuhydroksy-3,3'-dwumetylodwufenyl, 2,6'- io -dwu-3-butylofenol, katechina, butylokatechina, kwas protekatechowy, 2-tokoferol, pirogallol, kwas galusowy, estry., kwasu galusowego, naftol, zwiazki fenolu, takie jak aminofenol*, aminy, takie jak naftyloaminy, dwufenyloamina, dwu-2-butylo-p- 15 -fenylenodwuamina, 6-etoksy-2,3,4-trójmetylo-l,2- -dwuwodorc chinolina, semikarbazyd, fenotiazyna i czterofenylohydrazyna, oraz zwiazki zawierajace siarke, takie jak kwas tiodwupropionowy i kwas tio-dwuglikolowy. 20
11. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze srodki powierzchniowo-czynne i/lub przeciwutle¬ niajace dodaje sie do pozywki w calosci na po¬ czatku hodowli lub podczas hodowli albo okresowo w trakcie rozwoju mikroorganizmu podczas ho- 25 dowli.
12. Sposób wytwarzania L-lizyny na drodze fer¬ mentacji pozywki zawierajacej zródla przyswajal¬ nego wegla i azotu, sole nieorganiczne substancje niezbedne dla rozwoju oraz wzrostowe substancje 30 organiczne przy wartosci pH 5—9, znamienny tym, ze fermentacje przeprowadza sie z mikroorganiz¬ mem nalezacym do rodzaju Brevibacterium lub Corynebacterium w obecnosci antybiotyków i srod¬ ków powierzchniowo-czynnych i przeciwutlenia- 35 jacyeh w ilosci odpowiedniej do zmniejszenia poziomu wzrostu mikroorganizmów do poziomu nizszego niz ten, który otrzymuje sie przez wpro¬ wadzenie fermentacji pod nieobecnosc wymienio¬ nych antybiotyków i srodków powierzchniowo- ^ czynnych oraz przeciwutleniaczy.
13. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze stosuje sie mikroorganizm produkujacy L-lizyne odznaczajacy sie co najmniej odpornoscia na dzia¬ lanie S-(2-aminoetylo)-L-cysteiny. 45
14. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze stosuje sie mikroorganizm produkujacy L-lizyne wymagajacy co najmniej jednego srodka odzyw¬ czego, takiego jak hemoseryna, treonina, metionina, alanina, prolina, seryna, izoleucyna walina, leucy¬ na, arginina, histydyna, amid kwasu nikotynowego, kwas pantotenowy, tiamina, guanina, hypoksanty- na lub witamina BI2.
15. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze antybiotyki i srodki powierzchniowo-czynne oraz przeciwutleniajace dodaje sie do pozywki Fo w calosci na poczatku hodowli lub podczas hodowli albo okresowo w trakcie rozwoju mikroorganizmu podczas hodowli. PL