Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cieczy fermentacyjne} o podwyzszonej zawartosci witaminy B12 na drodze anaerobowej fermentacji, prowadzonej w warunkach septycznych, za pomoca miesza¬ nych zbiorowisk bakterii, wytwarzajacych metan, w obecnosci znanych skladników pozywki i prekursorów..Wiadomo, ze witamine B12 mozna wytwarzac w ogólnosci albo na drodze sterylnej fermentacji monokul¬ tur, lub za pomoca pochodzacych z osadów sciekowych mieszanych zbiorowisk, przystosowanych do specjalnych pozywek (porównaj na przyklad austriacki opis patentowy nr 266311).Dalej wiadomo, ze przy uzyciu mieszanych zbiorowisk bakterii mozna zwiekszyc wytwarzanie witaminy B12 nie przez zwiekszenie zdolnosci wytwarzania poszczególnych rodzajów bakterii, co jest wiadome i zwykle w przypadku sterylnej fermentacji monokultur. W mieszanych zbiorowiskach metabolizm poszczególnych rodza¬ jów drobnoustrojów nie jest zalezny od metabolizmu obecnych innych rodzajów drobnoustrojów. To oddzialy¬ wanie wzajemne moze byc w pewnych przypadkach pozytywne do tego stopnia, ze przez to zwieksza sie wytwarzanie zadanego produktu przemiany materii -byc moze nawet w duzej ilosci (porównaj Acta Microbiol.Acad. Sci. Hung. VI/4, 1959), moze jednak równiez byc negatywne, co mozna zaobserwowac na przyklad przy septycznej fermentacji, gdzie zwyczajne, zakazone bakterie nie moga sie rozmnazac w cieczy fermentacyjnej.Znane sa rózne sposoby zwiekszania wytwarzania witaminy B12 w fermentacji, wykonanej za pomoca mieszanych zbiorowisk bakterii, wytwarzajacych metan. Wedlug tych metod mozna wytwarzac ciecz fermenta¬ cyjna, zawierajaca witamine B12 w ogólnosci tylko okolo 10000 do 11500/ig/litr.Celem niniejszego wynalazku bylo opracowanie sposobu, dzieki któremu przy obecnie stosowanej zwyklej pólciaglej fermentacji za pomoca zbiorowisk bakterii, pochodzacych z osadów sciekowych, mozna osiagnac jeszcze wyzsza wydajnosc witaminy Bi2. Przy praktycznym rozwiazaniu tego zadania wzieto pod uwage nastepujace wyniki badan ewentualnie fakty:2 94 427 Przy badaniu fermentacji za pomoca bakterii metanowych, pochodzacych z osadów sciekowych, wytwa¬ rzajacych witamine Bi2, stwierdzono, ze 93-97% wytworzonej witaminy B12 znajduje sie w organizmach bakterii i dostaje sie do cieczy sklarowanej nad osadem po obumarciu bakterii (B.Johan: Acta Microbiol. Acad.Sci. Hung. 17, 319—328 (1970)). Z tego wynika, ze jesli chce sie zwiekszyc wytwarzanie witaminy Bi2 w fermentacji, wtedy nalezy zwiekszyc liczbe bakterii, wytwarzajacych witamine Bi 2.Czas podwajania bakterii, wytwarzajacych metan, w zbiorowiskach bakterii, pochodzacych z osadów sciekowych (szczególnie ziarniaki (cocei) i dwoinki (diplococci)) jest stosunkowo dlugi. Wsród tych bakterii nie ma rzeczywistej „fazy logarytmicznej", która przedstawia soba poza tym charakterystyczna ceche rozmnazania wiekszosci rodzajów bakterii. Typ rozmnazania tych bakterii odpowiada opisanej wczesniej przez Lamana i Mallette „arithmetic linear growth" (porównaj C. Lamana, M. Mallette: Basic Bacteriology, 368 (1965)).Wiadomo równiez, ze bakterie rozmnazaja sie w korzystnych warunkach na drodze podzialu, to znaczy z jednej bakterii powstaja dwie jednostki. W korzystnych zewnetrznych warunkach zachodzi dalsze podwojenie juz podzielonych bakterii, w niekorzystnych jednak warunkach bakterie przechodza w stan spoczynku. Bakterie, które znajduja sie w tym stanie, zaczynaja sie potem znowu rozmnazac w odpowiednich warunkach ekologicz¬ nych — po bardziej lub mniej dlugim okresie przygotowania („lag phase"). Ten przebieg jest normalnym cyklem rozmnazania bakterii. W danej kulturze znajduja sie bakterie w róznorodnych fazach tego cyklu rozmnazania.Jezeli w trakcie fermentacji, prowadzonej pólciagle (z codziennym odbiorem okolo 10% cieczy fermenta¬ cyjnej i uzupelnianiem taka sama iloscia pozywki), oznacza sie w cieczy fermentacyjnej zawartosc bakterii i zawartosc witaminy Bt 2, to stwierdza sie, ze wartosci oznaczane codziennie sa prawie takie same, a wiec liczba bakterii i ilosc witaminy Bt 2 osiaga w 24 godziny znowu poziom, istniejacy przed odbiorem cieczy. Ten fakt mozna unaocznic w nastepujacy sposób: jezeli w danej ilosci cieczy fermentacyjnej znajduje sie na przyklad 100 milionów bakterii i odbiera sie 10% tej cieczy fermentacyjnej (równomiernie wymieszanej) i uzupelnia sie taka sama iloscia swiezej pozywki, wtedy pozostaje tylko 90 milionów bakterii w cieczy fermentacyjnej rozcienczonej w ten sposób. Ta liczba zwieksza sie jednak w sposobie wedlug wynalazku az do nastepnego dnia do 100 milionów. Fakt ten mozna najprosciej tak wyjasnic, ze sposród pozostalych 90 milionów bakterii podzielilo sie tylko 10 milionów, to znaczy z tych 10 milionów bakterii powstalo 20 milionów, czym osiaga sie razem z niepodzielonymi pozostalymi 80 milionami bakterii znowu pierwotna liczbe bakterii 100 milionów.Jezeli chce sie osiagnac wyzsza liczbe bakterii — i przez to równiez wyzsza wydajnosc witaminy B12, wtedy trzeba osiagnac, aby dzielilo sie na raz nie tylko 10 milionów bakterii, lecz mozliwie jak najwiecej bakterii i tym samym liczba bakterii, obecnych w cieczy fermentacyjnej, powinna znacznie przekroczyc dotychczasowy poziom. To mozna jednak tylko osiagnac tak, ze mozliwie duza liczbe bakterii doprowadzi sie w tej samej fazie cyklu rozmnazania, a wiec synchronizuje sie mozliwie jak najdalej podzial bakterii.Celem wynalazku byla mozliwie jak najdalej idaca synchronizacja cyklu rozmnazania calej masy bakterii w cieczy fermentacyjnej i tym samym osiagniecie znacznie wyzszego stezenia bakterii w cieczy fermentacyjnej i odpowiednio wyzsze wytwarzanie witaminy B12 i utrzymanie tego w sposób niezmienny wciagu zwyklej pólciaglej fermentacji.Cel ten mozna osiagnac na przyklad tym, ze wychodzi sie ze srodowiska fermentacyjnego, zawierajacego mieszane zbiorowiska bakterii wytwarzajace metan na drodze zwyklej anaerobowej septycznej fermentacji, oraz zawierajacego okolo 9500-10000jug/litr witaminy B12 —celowo po okresie glodowym trwajacym kilka dni, w którym karmi sie bakterie tylko niewielka iloscia metanolu — substancje pozywkowe dodaje sie w nastepujacy sposób dozowania, powtarzajacy sie okresowo: — pierwszego dnia odbiera sie czesc, korzystnie 10% cieczy fermentacyjnej i dodaje sie 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu i jedna objetosc, odpowiadajaca ilosci cieczy odebranej stezonej pozywki, która to pozywka zawiera z wyjatkiem metanolu zwykle dodatki i substancje pozywkowe uzywane w dotychczasowej fermentacji, ale o stezeniu wielokrotnym, korzystnie dziesieciokrotnym; — nastepnego dnia nie odbiera sie cieczy i dodaje sie tylko 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu do cieczy fermentacyjnej; — nastepnie, okolo 4 do 10 dni znowu pobiera sie codziennie czesc, korzystnie 10% cieczy fermentacyjnej i dodaje sie 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu i dodaje sie jedna objetosc, odpowiadajaca ilosci cieczy odebranej, zwyklej pozywki, zawierajacej zwykle substancje pozywkowe i dodatki o stezeniu, uzywanym podczas dotychczasowej fermentacji.Pólciagla fermentacje prowadzi sie nastepnie dalej z tym okresowym zmiennym dodatkiem pozywki, to znaczy kazdorazowo po 4 do 10 dniach zwyklego pobierania cieczy fermentacyjnej i dodatku zwyklej pozywki, jak tez 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu, wtraca sie dwa dni ze zmiennym karmieniem: jednego dnia, w którym odbiera sie zwykla czesc cieczy fermentacyjnej i dodaje sie pozywke o stezeniu wielokrotnym, korzystnie dziesieciokrotnym, jak tez 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu, a w dniu nastepujacym po tym bez pobierania cieczy dodaje sie tylko 0,4 do 1,5% objetosciowych metar-lu.94 427 3 Przez ten cykliczny sposób karmienia synchronizuje sie cykl rozmnazania wszystkich zbiorowisk bakterii, przez co wzrasta stopniowo stezenie bakterii i odpowiednio do tego równiez stezenie witaminy B! 2 w srodowis¬ ku fermentacyjnym. Powyzej opisany sposób postepowania i przez to osiagniety stopniowy wzrost wytwarzania witaminy B12 jest szczególowo opisany w nastepujacym przykladzie II. Jak to widoczne jest zwartosci liczbowych tam podanych, osiaga sie po okolo 7 do 8 cyklach, a wiec w okolo 50 do 60 dni stezenie witaminy B12 równe okolo 30000 do 40000 /ig/litr. Jezeli prowadzi sie dalej pólciagla fermentacje w ten sam sposób, wtedy utrzymuje sie równiez dalej to wysokie stezenie w czesci cieczy fermentacyjnej, pobieranej codziennie do obróbki (codziennie okolo 10%) i tak podwyzsza sie trzy- do czterokrotnie biezace wytwarzanie witaminy B! 2 w porównaniu do pierwotnej fermentacji- Sposobem wedlug wynalazku mozliwe jest równiez znaczne skrócenie wyzej opisanego stopniowego wzrostu stezenia witaminy B12 w srodowisku fermentacyjnym z okolo 10000 fxg/\\tr do okolo 30-40000 jug/litr. Sa na to dwie rózne mozliwosci.Przed przejsciem na sposób karmienia cykliczny wedlug wynalazku (1 dzien stezona pozywka, 1 dzien tylko metanol, 4—10 dni zwykla pozywka) mozna wlaczyc tak. zwany przyspieszony okres wzbogacania.Podczas tego okresu wzbogacania odbiera sie pierwszego dnia zwykle okolo 10% cieczy fermentacyjnej, dodaje sie taka sama objetosc pozywki o stezeniu okolo dziesieciokrotnym i 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu, potem przez 6 do 12 dni nie pobiera sie cieczy i codziennie dodaje sie tylko 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu, potem odbiera sie okolo 10% cieczy fermentacyjnej dodaje sie taka sama objetosc stezonej pozywki i 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu. Przy tym sposobie postepowania osiaga sie zadana synchronizacje i tym równiez osiaga sie zadane wysokie stezenie witaminy Bt 2 równe okolo 30-40000 jLeg/litr w stosunkowo krótkim czasie, wokolo 15 do 25 dni. Dlugosc okresu czasu, w którym powinno dodawac sie stezona pozywke,zalezy od zuzycia substancji pozywkowych przez bakterie i moze byc okreslone po stopniowej obnizce wartosci pH w srodowisku fermentacyjnym. Stwierdzono, ze spadek wartosci pH do 5,5-5,8 mozna uwazac za oznake rozpoczynajacego sie braku substancji pozywkowej; przy osiagnieciu tej wartosci pH konieczny jest wiec dodatek nastepne] porcji stezonej pozywki. .Zadane wysokie stezenie bakterii w srodowisku fermentacyjnym mozna osiagnac w prostszy sposób równiez tym, ze od innej cieczy fermentacyjnej, otrzymanej na drodze fermentacji, wykonanej w zwykly sposób, oddziela sie zyjace organizmy bakterii, na przyklad na drodze wirowania i tak wytwarza sie stezenie komórek bakterii o zawartosci Witaminy B12 okolo 80000 do 90000 jug/litr i potem dodaje sie to stezenie do cieczy fermentacyjnej uzywanej jako srodowisko wyjsciowe w takiej ilosci, aby tym osiagnac stezenie witaminy B12 w srodowisku o zadanej wartosci na przyklad 30000 /ig/litr. Potem mozna przejsc od razu do pólciaglej fermentacji ze zmiennym wedlug wynalazku cyklem karmienia, przy czym utrzymuje sie na biezaco ustalone na poczatku wysokie stezenie witaminy Bi 2 w codziennie odbieranych ilosciach cieczy fermentacyjnej .Dotychczas nie rozpatrywanym, ale równiez nie bez znaczenia elementem sposobu wedlug wynalazku jest dawkowanie metanolu, dodawanego do srodowiska fermentacyjnego, zarówno w fazie przygotowawczej sposobu, jak tez w ciagu pólciaglej fermentacji, prowadzonej sposobem wedlug wynalazku. Wykonane próby wykazaly, ze istnieje jednoznaczna i liniowa zaleznosc pomiedzy iloscia metanolu, dodawana codziennie, a wydzielajacymi sie tak zwanymi biogazami, tak ze z objetosci biogazu, wytwarzanego w jednolitych odstepach czasu, mozna wywnioskowac jednoznacznie ilosc metanolu, zuzytego przez bakterie. Korzystne jest dodawanie wymaganej ilosci metanolu wzamian wlasnie zuzytego, poniewaz przedawkowanie moze prowadzic do nagromadzenia sie metanolu w srodowisku fermentacyjnym, a nadmierne nagromadzenie metanolu moze wywierac toksyczne dzialanie na zbiorowiska bakterii. Nastepujaca tablica 1, na podstawie wartosci ustalonych empirycznie, pokazuje te zaleznosc w odniesieniu do 1 litra srodowiska fermentacyjnego; za pomoca tej tablicy 1 mozna wiec na podstawie objetosci gazu, wytworzonego przez 1 litr srodowiska fermentacyjnego wciagu 1 godziny, okreslic ilosc metanolu, konieczna do dodania codziennie do srodowiska fermentacyjnego.Tablica 1 Gaz wytwarzany w 1 litrze Ilosc metanolu srodowiska fermentacyjnego wymagana codziennie, ml/godz % objetosciowe 114 0,5 140* 0,6 164 0,7 186 0,8 210 0,994 427 232 256 280 304 326 348 L-i_ Ilosci gazu, podane w tablicy 1, obejmuja praktycznie caly zakres zwyklych szybkosci wydzielanego gazu w sposobie fermentacji wedlug wynalazku; z tej tablicy widoczne jest to, ze wciagu procesu ilosci metanolu, dodawane codziennie na calkowita objetosc srodowiska fermentacyjnego, wynosza okolo 0,4 do 1,5% objetosciowych, przy czym wsród tego zakresu korzystnie dodaje sie ilosci, wynikajace z tablicy 1.Sposób wytwarzania cieczy fermentacyjnej o podwyzszonej zawartosci witaminy B12 na drodze anaerobo- wej fermentacji, prowadzonej w warunkach septycznych za pomoca zbiorowisk bakterii, wytwarzajacych metan, w obecnosci znanych skladników pozywki i prekursorów, polega wedlug wynalazku na tym, ze wychodzi sie z otrzymanego w znany sposób wedlug wspomnianej metody srodowiska fermentacyjnego, zawierajacego zywe zbiorowiska bakterii, zachodzaca wobec okresowego odbierania czesci cieczy fermentacyjnej i zastepowania odebranej objetosci swieza pozywka pólciagla fermentacje, ewentualnie po wzbogaceniu srodowiska w zawartos¬ ci bakterii, prowadzi sie dalej tak, ze po odebraniu czesci, celowo 10% cieczy fermentacyjnej, zastepuje sie odebrana objetosc dodatkiem stezonej pozywki, zawierajacej z wyjatkiem metanolu zwykle substancje pozywko- we o stezeniu wielokrotnym, korzystnie dziesieciokrotnym, i przy tym dodaje sie 0,5 do 1,5% objetosciowych metanolu, nastepnego dnia, nie odbierajac cieczy, dodaje sie tylko 0,5 do 1,5% objetosciowych metanolu, w nastepnych 5-10 dniach odbiera sie codziennie czesc, korzystnie 10% cieczy fermentacyjnej, i dodaje sie taka sama objetosc pozywki, zawierajacej substancje pozywkowe o stezeniu dotychczas stosowanym, nastepnie dodaje sie 0,5—1,5% objetosciowych metanolu, a dalej powtarza sie periodycznie opisane dodawanie na przemian stezonej i zwyklej pozywki w opisanej kolejnosci podczas calej dalszej fermentacji.Wzbogacenie srodowiska w zawartosc bakterii, wspomniane wyzej, ewentualnie wykonane przy przejsciu ze zwyklej znanej metody fermentacji na sposób wedlug wynalazku moze nastapic w powyzej juz opisany sposób, a wiec albo przez zwykly dodatek koncentratu organizmów bakterii, pochodzacych z innej fermentacji i otrzymanego na przyklad na drodze wirowania, albo przez wlaczenie okresu wzbogacenia, opisanego powyzej równiez szczególowo. W ostatnim wypadku dodaje sie celowo przez kilka, na przyklad trzy dni tylko okolo 0,5% objetosciowych metanolu do cieczy fermentacyjnej, uzytej jako srodowisko wyjsciowe, potem odbiera sie okolo 10% cieczy fermentacyjnej i zastepuje sie taka sama objetoscia wspomnianej pozywki, zawierajacej substancje pozywkowe o stezeniu wielokrotnym, korzystnie dziesieciokrotnym, przy czym dodaje sie równiez 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu, potem przez 6 do 10 dni, nie odbierajac cieczy, dodaje sie codziennie tylko 0,4 do 1,5% objetosciowych metanolu i taka kolejnosc powtarza sie okresowo az do osiagniecia zadanego wysokiego stezenia organizmów bakterii, a tym samym równiez i zadanego wysokiego stezenia witaminy B12.Potem przy nastepnym dodatku stezonej pozywki przechodzi sie na opisany powyzej sposób wykonania wedlug wynalazku pólciaglej fermentacji, przy czym w codziennie odbieranej cieczy fermentacyjnej (z wyjatkiem nastepujacego dnia na dodatek stezonej pozywki) utrzymuje sie juz zadane wysokie stezenie witaminy B, 2.Zalety sposobu wedlug wynalazku sa przede wszystkim nastepujace: Osiaga sie tak wysokie stezenie witaminy B12 w cieczy fermentacyjnej (30000 do 40000/ig/litr), jakie dotychczas w ogóle nie moglo byc osiagniete na drodze septycznej fermentacji, a takze na drodze sztucznie aktywowanej fermentacji monokultur. Do wytworzenia takiej cieczy fermentacyjnej,zawierajacej witamine Bi 2, w ilosci trzy- do czterokrotnej w porównaniu do cieczy fermentacyjnej, zawierajacej okolo 10000 M9/''tr witaminy Bj 2, otrzymanej na drodze dotychczas zwyklej, technicznej, septycznej fermentacji, zuzywa sie -w porównaniu do dotychczas zwyklego sposobu —tylko 2- do 2,5-krotna ilosc substancji pozywkowych i najwyzej trzykrotna ilosc metanolu.Wytwarzanie cieczy fermentacyjnej o stezeniu witaminy B12 trzy- do czterokrotnym jest szczególnie korzystne z punktu widzenia technologii obróbki, poniewaz do otrzymania danej ilosci witaminy B12 nalezy traktowac i obrabiac stosunkowo mniejsze ilosci cieczy.Technika synchronizacji, uzyta w sposobie wedlug wynalazku, byla uzywana dotychczas tylko do celów naukowych, na przyklad do oznaczania czasu podwajania przez bakterie, ale tylko przy czystych monokulturach.W sposobie wedlug wynalazku uzyto te technike po raz pierwszy przy mieszanych zbiorowiskach bakterii i takze 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,594 427 5 po raz pierwszy w technicznej fermentacji. Wmieszanych zbiorowiskach czas podwajania poszczególnych obecnych rodzajów moze byc wprawdzie bardziej lub mniej przesuniety, ale z jednej strony mozna sprowadzic te rózne rodzaje do jednolitego w przyblizeniu stanu spoczynku przez okres glodowy, stosowany w fazie wstepnej sposobu, korzystnie przez 1 —3 dni, przez co przyspiesza sie synchronizacje rozmnazania, z drugiej strony przez okresowo zmienne przetwarzanie substancji pozywkowych przyspiesza sie rozmnazanie gatunków Diplococcus i Coccus, latwiej przystosowujacych sie w tym cyklu i wykazujacych jednoczesnie lepsze wytwarzanie witaminy B12 i raczej tlumi sie rozmnazanie bakterii o mniejszej zdolnosci wytwarzania, przez co zwieksza sie wtedy równiez specyficzna zdolnosc wytwarzania mieszanych zbiorowisk bakterii.Podane nizej przyklady objasniaja blizej realizacje praktyczna sposobu wedlug wynalazku.Przyklad I. Dwie doswiadczalne kadzie fermentacyjne zaopatrzone w rurke odprowadzajaca gaz, kazda o pojemnosci 10 litrów, zaladowuje sie 10 litrami cieczy fermentacyjnej, zawierajacej 9940 /ug/litr witaminy Bx 2, otrzymanej znanym sposobem na drodze pólciaglej fermentacji za pomoca mieszaniny mezofilowych zbiorowisk bakterii, wytwarzajacych metan. Przy tej fermentacji, dostarczajacej srodowisko wyjsciowe, sposobem wedlug wynalazku dodaje sie codziennie (przy jednoczesnym odbiorze takiej samej ilosci cieczy fermentacyjnej) pozywke o nastepujacym skladzie: Woda po specznieniu kukurydzy —koncentrat 5 g/litr Hydrolizat drozdzy piwnych,20%-wy 1 g/litr Melasa 2 g/litr Lugposiarczynowy 1,6 g/litr Ekstrakt watrobowy,10%-wy 1 g/litr Wodorotlenek amonowy,24%-owy 1,1 g/litr Wodorofosforandwuamonowy 2g/litr Wodoroweglanamonowy 3 g/litr Siarczanamonowy 1,5 g/litr Wodorosiarczeksodowy 0,02 g/litr Chlorekmagnezowy 0,1 g/litr Chlorekkobaltowy 0,01 g/litr Bezwodnik bursztynowy 0,006 g/litr Glicyna 0,006 g/litr ,6-dwumetylobenzimidazol 0,003 g/litr Obok tej pozywki, która uzywa sie w dalszym przebiegu procesu i która dalej nazywa sie „pozywka NBt ", dodaje sie codziennie równiez 0,6% objetosciowych metanolu.Kadzie fermentacyjne A i B, zaladowane kazda 10 litrami cieczy fermentacyjnej otrzymanej w powyzszy sposób utrzymuje sie w temperaturze 32-34°C i przez trzy dni dodaje sie codziennie tylko 50 ml metanolu.Czwartego dnia odbiera sie 1 litr cieczy fermentacyjnej i dodaje sie taka sama objetosc stezonej ppzywki o nastepujacym skladzie (dalej oznaczanej jako pozywka NBi 0) - Woda po specznieniu kukurydzy — koncentrat 50 g Hydrolizat drozdzy piwnych,20%-wy 10 ml Melasa 20 g Lugposiarczynowy 10 g Ekstrakt watrobowy,10%-wy 10 ml Wodorotlenek amonowy,24%-wy 11 ml Wodorofosforandwuamonowy 20 g Wodoroweglanamonowy 30 g Siarczanamonowy 15 g Wodorosiarczeksodowy 0,2 g Chlorekmagnezowy 1,0 g Chlorekkobaltowy 0,1 g Bezwodnik bursztynowy 0,06 g Glicyna 0,06 g ,6-dwumetylobenzimidazol 0,03 g Woda do1000 ml Przedtem mierzy sie objetosc gazu, wychodzacego przez rure, odprowadzajaca gaz i gdy ilosc gazu, wytwarzana w jednej godzinie, obliczona na 1 litr cieczy fermentacyjnej, wynosi okolo" 160 ml, dodaje sie równoczesnie z pozywka NB10 takze 70 ml (0,7% objetosci) metanolu.6 94 427 W nastepnych 5 dniach, a wiec 5., 6., 7., 8. i 9., dnia próbny, bez odbioru cieczy dodaje sie metanol, mianowicie w ilosciach codziennie odpowiadajacych szybkosci wydzielania sie gazu wedlug tabeli 2 (patrz powyzej). Dziesiatego dnia znowu odbiera sie 1 litr cieczy fermentacyjnej, dodaje 1 litr pozywki NB10 i odpowiednia ilosc metanolu, tak samo dnia 17. i 25., podczas gdy w miedzyczasie, dnia 11 .,12., 13., 14., 15., 16., dalej 18., 19., 20., 21., 22., 23. i 24. znowu bez odbioru cieczy dodaje sie tylko odpowiednia ilosc metanolu.Od dnia 25. zaczyna sie biezaca, pólciagla fermentacja; dnia 26. bez odbioru cieczy dodaje sie tylko metanol, dalej od dnia 27. do 32. odbiera sie codziennie 1 litr cieczy fermentacyjnej, dodaje sie 1 litr pozywki NBi i wymagana ilosc metanolu, dnia 33. po odbiorze 1 litra cieczy fermentacyjnej znowu dodaje sie 1 litr pozywki NBio, ' tak dalej w okresowo powtarzajacej kolejnosci. W tym czasie od dnia 25. do 75. oznacza sie zawartosc witaminy B12 w odebranej cieczy fermentacyjnej. Stezenie witaminy Bl2 w cieczy fermentacyjnej wykazuje z biegiem czasu tylko niewielkie wahania; wartosci srednie wynosily: Kadz fermentacyjna „A" 43 268/ig/litr Kadz fermentacyjna „B" 43 543 //g/litr.Przyklad II. Postepuje sie wedlug przykladu I, z ta róznica, ze 4. dnia rozpoczyna sie od razu biezaca pólciagla fermentacje, jak dnia 25. w przykladzie I. W tym wypadku stezenie witaminy Bi2 w cieczy fermentacyjnej otrzymanej w sposób znany, stosowanej jako srodowisko wyjsciowe, wynosi 10600 jug/Htr.Obok okresowo zmiennego dodatku pozywki NBi0, ewentualnie NBi# dodaje sie codziennie ilosci metanolu, podane w tablicy 2.Tablica 2 Dzien próby 3.-9. .-12. 13.-14. . 16.I 17' Metanol I 80 ml 100 ml 120 ml 130 ml 140 ml 150 ml Ilosci metanolu, dodawane codziennie z dalszym biegiem próby, wyznacza sie na podstawie szybkosci wydzielania sie gazu, wedlug tablicy 1.W tej próbie oznacza sie ciagle zawartosc witaminy Bt 2 w cieczy fermentacyjnej. Nastepna tablica 3 podaje stopniowy wzrost stezenia az do 50. dnia.Tablica 3 Dzien próby 2. 4. 8. . 11. 14. . 16. 17. 18. 21. 22. 28. 31. 32. . 36.Witamina B12 1 w cieczy fermentacyjnej jug/litr | 12 400 11 700 I 16 800 14 900 16 200 14 900 16 200 19 872 23 124 400 23 124 23 200 21 432 26 400 27 700 944 26 60094 427 7 37. 38. 39. 43. 44. 45. 46. 49. 50. 32 800 32 200 33 270 28 152 400 32 200 27 200 500 31 600 Przyklad III. Doswiadczalna kadz fermentacyjna o pojemnosci 10 litrów, zaopatrzona w rure odpro¬ wadzajaca gaz zaladowuje sie 4500 ml cieczy fermentacyjnej, zawierajacej 9940 jtig/litr witaminy B12, otrzymanej znanym sposobem na drodze pólciaglej fermentacji za pomoca mieszanych mezofilowych zbiorowisk bakterii, wytwarzajacych metan, przy uzyciu pozywki NBi, opisanej w przykladzie I. Potem dodaje sie w 32°C 500 ml koncentratu bakterii, zawierajacego 88000 //g/litr witaminy B12, który otrzymuje sie z innej cieczy fermentacyjnej, wytworzonej wedlug tego samego sposobu na drodze wirowania. Do tych 5000 ml srodowiska, zawierajacego teraz 18500/Lig/litr witaminy Bi 2 w organizmach bakterii dodaje sie 500 ml pozywki NB! 0 i 75 ml metanolu. 2. i 3. dnia fermentacji nie odbiera sie cieczy i dodaje sie codziennie tylko 75 ml metanolu, potem od dnia 4. do 10. odbiera sie po 500 ml cieczy fermentacyjnej i dodaje sie taka sama objetosc pozywki NBi i 75 ml metanolu. Dnia 11. przy takim samym odbiorze cieczy dodaje sie znowu stezona pozywke NB10 i zwykla ilosc metanolu i te okresowa kolejnosc prowadzi sie dalej równiez wedlug sposobu, opisanego w przykladzie II.Nastepujaca tablica 4 pokazuje stopniowy dalszy wzrost stezenia witaminy B, 2 w codziennie odbieranych cieczach fermentacyjnych.Tablica 4 I Dzien próby ~ 6. 7. . 11. 12 13. 14. 17. . 21. 22. 23. 26. 27. 28. 29. . 33. 34. . 36. 37. 43. 44. | Zawartosc witaminy Bi 2 w cieczy fermentacyjnej, I I jug/litr I 22 632 19 320 424 | 21 016 21 200 27 000 33 400 32 000 36 310 36 690 548 880 968 39 800 I 33 450 I 34 166 36 250 36 200 28 900 780 360 800 33 000 500 I 33 000 I8 94 427 Jezeli powyzsze wartosci uzupelni sie jeszcze iloscia obecnego biologicznie równowartosciowego czynnika III, to otrzymuje sie na przyklad nastepujace wartosci: dnia 20. 49 000 //g/1itr dnia 28. 44 500 fig/1itr dnia 34. 49 320 /wg/litr Przyklad IV. W technicznej kadzi fermentacyjnej o pojemnosci uzytecznej 50 m3 znajduje sie jako srodowisko wyjsciowe 50 m3 cieczy fermentacyjnej, zawierajacej 9936 /Ltg/litr witaminy B12, otrzymanej w sposób opisany w przykladzie I. W pierwszych trzech dniach przejscia na sposób wedlug wynalazku dodaje sie po 250 litrów metanolu. (Aby ulatwic wymieszanie metanolu i zmniejszyc miejscowe przedozowanie, korzystne jest rozcienczenie metanolu przed dodatkiem za pomoca 2- do 3-krotnej ilosci wody; w tym wypadku nalezy jednak odebrac odpowiednia objetosc cieczy fermentacyjnej, aby zmniejszyc nadmierny wzrost objetosci). 4. dnia odbiera sie 5 m3 cieczy fermentacyjnej, dodaje sie taka sama objetosc pozywki NBi0 i 400 litrów metanolu. Potem 10., 14., 21 .„ i 27. dnia fermentacji odbiera sie znowu 5 m3 cieczy fermentacyjnej i (przy dodatku zwyklej ilosci metanolu) dodaje sie tylko metanol w sposób, podany powyzej, w dniach 5. do 9., 11. do 13., 15. do 20. i 22. do 26. Od dnia 27. rozpoczyna sie zwykly okresowy cykl wytwarzania, w dniach 27., 33., 42., 46., 50., 59., 65., i 71. po odbiorze 5 m3 cieczy fermentacyjnej dodaje sie taka sama objetosc NB10 i odpowiednia ilosc metanolu, w dniach 28., 34., 43., 47., 51., 61., 66. i 72. bez odbioru cieczy dodaje sie tylko metanol, a w pozostalych dniach az do 77. dnia dalej prowadzonej fermentacji odbiera sie po 5 m3 cieczy fermentacyjnej i zastepuje taka sama objetoscia pozywki NBi. Ilosc metanolu, dodawanego codziennie, wynosila maksymalnie 750 litrów; kazdorazowo okreslano potrzebne ilosci na podstawie powyzszej tablicy 1.Zawartosc witaminy B12 w cieczy fermentacyjnej po stopniowym wzroscie az do przejscia na normalny okresowy cykl wytwarzania osiaga wartosc okolo 30000 jug/litr; od 46. dnia do konca próby wartosc srednia wynosila 32750 jug/litr (z tylko niewielkimi odchyleniami). PL