PL92914B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych peptydów o hipoikailcemicznym dziala¬ niu, okreslonych ogólnym wzorem 1, w którym li¬ nia przerywana laczaca pierwszy i siódmy amino¬ kwas oznacza wiazanie dwusiarczkowe, R oznacza atom wodoru lub ewentualnie zacylowana grupe aminowa, Y oznacza reszte L-asparaginy lub resz¬ te kwasu L-asparaginowego, X oznacza reszte L- -glutaminy lub reszte kwasu L-glutaminowego, jak i ich soli addycyjnych z kwasami i kompleksów ze zwiazkami metali.Sposród nowych zwiazków jako szczególnie ko¬ rzystne wymienia sie peptydy o wzorze 1, w któ¬ rym R oznacza grupe NH2, symbol X umiejsco¬ wiony w pozycji 14 i 24 'oznacza resizte kwasu. glui- taminowego, symbol Y umiejscowiony w pozycji 3 i 17 oznacza reszte L-asparaginy, a symbol Y u- miejscowiony w pozycji 15 oznacza reszte kwasu L-asparaginowego. Takim wyzej wymienionym zwiazkiem jest kalcytonina M.Jako grupy acylowe do acylowania grup amino¬ wych zwlaszcza grup N a-aminowych stosuje sie rodniki kwasów karboksylowych, takie jak alifa¬ tycznych, aromatycznych, aryloalifatycznych, hete¬ rocyklicznych i heterocykldilioailifatyicznyeh, zwlaszcza nizszych jedno- lub dwuwartosciowych kwasów al- kanowych lub alkenowych, takie jak kwasu mrów¬ kowego, octowego, propionowego lub maslowego.Jako sole addycyjne z kwasami nalezy przede wszystkim wymienic sole kwasu odpowiedniego do stosowania leczniczego, takiego jak kwas solny, oc¬ towy, siarkowy, fosforowy i kwasy sulfonowe, jak niskoalkanowe benzeno- lub toluenosulfonowe.Okresleniem „kompleksy" objeto zwiazki o niewy¬ jasnionej jeszcze budowie, powstajace po dodaniu pewnych nieorganicznych substancji do dlugolan- cuchowych peptydów i nadajace peptydom ceche przedluzonego dzialania. Substancje takie opisano na przyklad dla insuliny i ACTH oraz innych pep¬ tydów o dzialaniu adrenokortykotropowym. Sposród tych substancji nalezy wymienic na przyklad nie¬ organiczne zwiazki wywodzace sie z metali jak wapn, magnez, glin, kobalt, a zwlaszcza cynk, prze¬ de wszystkim trudno rozpuszczalne sole jak fos¬ forany, pirofosforany i polifosforany, jak równiez wodorotlenki tych metali, ewentualnie w kombi¬ nacji z kwasnymi zwiazkami organicznymi, na przyklad polisacharydami zawierajacymi kwasne Srupy jak karboksymetyloceluloza lub kwas gar¬ bnikowy, kwas poliglutaminowy lub czesciowo zhy- drolizowana zelatyna, polifosforany metali alka¬ licznych, jak na przyklad „Calgon N", „Calgon 322", „Calgon 188" lub „Polyron B 12". Substan¬ cjami organicznymi, które powoduja przedluzenie dzialania sa na przyklad nie antygenne zelatyny, na przyklad polioksyzelatyna, poliwinylo-piroliden i karboksymetyloceluloza, dalej estry kwasu sul¬ fonowego lub fosforowego kwasu alginowego, de¬ kstran, polifenole i polialkohole, zwlaszcza wszyst¬ kie fosforany polifloretyny i kwas fitynowy, jak 9291492914 równiez polimery i kopolimery aminokwasów, na przyklad protamina lub kwas poliglutaminowy.Nowe zwiazki wykazuja dzialanie hipokalcemicz- ne. Tak wiec amid t.j. pochodna zwiazku o wzorze 1, zawierajaca grupe amidowa przy koncowym ato¬ mie wegla wykazuje u szczurów aktywnosc 100— 200 jednostek MRC na mg peptydu, w tescie opi¬ sanym przez Kumara i inn., J. Endoerinology 33 (1965), 470. Nowe zwiazki obnizaja zawartosc wap¬ nia i fosforanu w plazmie krwi ssaków, jak wy¬ kazano doswiadczeniami na szczurach o wadze 50— 150 g. U pacjentów z podwyzszonym metaboliz¬ mem kosci obnizaja one poziom wapnia we krwi po dozylnej, domiesniowej lub podskórnej dawce 0,01—5 mg, na przyklad w 0,1 M octanowym bu¬ forze o wartosci pH 4,6 dlatego tez zwiazki te mo¬ ga byc stosowane przy leczeniu hiperkalcemii i chorób kostnych, jak choroba Paigeta lub ostereo- poroza.Sposobem wedlug wynalazku nowe zwiazki o wzorze 1, ich pochodne, jak i sole addycyjne z kwasami oraz kompleksy wytwarza sie, jesli po¬ szczególne aminokwasy oznaczone kolejnymi nu¬ merami ilustrujacymi ich umiejscowienie w 1—32 sekwencji peptydu o wzorze 1, takie jak L-cysteina, desamino-L-cysteina lub N-acylo-L-cysteina (1), glicyna (2), L-asparagina lub kwas L-asparagino- wy (3), L-leucyna (4), L-seryna (5), L-treonina (6), L-cysteina (7), L-metiona (8), L-leucyna (9), glicy¬ na (10), L-treonina (11), L-tyrozyna (12), L-treoni¬ na (13), L-glutamina lub kwas L-glutaminowy (14), kwas L-asparaginowy lub L-asparagina (15), L- -fenyloalanina (16), L-asparagina lub kwas L-as- paraginowy (18), L-lizyna (18), L-fenyloalanina (19), L-histydyna (20), L-treonina 21), L-fenyloalanina (22), L-prolina (23), L-glutamina lub kwas L-gluta¬ minowy (24), L-treonina (25), L-alanina (26), L-izo- leucyna (27), glicyna (28), L-walina (29), glicyna (30), L-alanina (31) i amid L-proliny (32) ewentu¬ alnie w postaci ich aktywowanych pochodnych, takich jak estry, azydki lub mieszane bez¬ wodniki, poddaje sie kondensacji przy oslonie¬ ciu ich grup funkcyjnych takich jak grupy karbo¬ ksylowe, aminowe i merkaptanowe, w znany spo¬ sób, przy czym kondensacje poszczególnych ami¬ nokwasów prowadzi sie wedlug wyzej okreslonej kolejnosci az do uizyskania (peptydu 1—32 lu/b kondem- suje sie kolejno ze soba wytworzone uprzednio mniejsze jednostki peptydowe, jak zwlaszcza 1—6, 7—10, 11—16, 17—20, 21—28 i 29—32 az do uzyska¬ nia sekwencji 1—32, z tym, ze po wytworzeniu sekwencji 1—10 lub 1—32 wytwarza sie mostek dwusiarczkowy 1—7, za pomoca utleniania i o- trzymany amid dotriakontapeptydu o wzorze 1 ewentualnie przeprowadza sie w jego sól addycyjna z kwasem lub w kompleks ze zwiazkiem metalu.Szczególnie korzystne nowe peptydy o wzorze 1, w którym R oznacza grupe NH2, symbol X w po¬ zycji 14 i 24 oznacza reszte L-glutaminy, a symbol Y umiejscowiony w pozycji 3 i 17 oznacza reszte L-asparaginy, natomiast Y w pozycji 15 oznacza reszte kwasu L-asparaginowego, wytwarza sie spo¬ sobem wedlug wynalazku, jesli dekapeptyd o wzo¬ rze 7, w którym linia przerywana miedzy pierw¬ szym i siódmym aminokwasem oznacza mostek dwusiarczkowy poddaje sie kondensacji z amidem dekozapeptydu o wzorze H-Tre/tBu/-Tyr-/t-Bu/-Tre/ /tBu/-Glu/NH2/-Asp/OtBu/-Fen-Asp/NH2/-Liz/BOC/ -Fen-His-Tre/tBu/-Fen-Pro-Gly/NH2/-Tre/tBu/-Ala- -Ile-Gli-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2, prowadzonej w o- becnosci dwucykloheksylokarbodwuimidu i z otrzy¬ manego peptydu odszczepia sie grupy ochronne za pomoca stezonego kwasu solnego lub kwasu trój- fluorooctowego.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie no¬ we peptydy przez laczenie poszczególnych amino¬ kwasów, jesli jest to konieczne lub pozadane, przy zastosowaniu latwo odszczepialnych grup ochron¬ nych, w podanej kolejnosci pojedynczo lub po uprzednim wytworzeniu mniejszych jednostek pe- ptydowych, przy czym, w danym przypadku, wy¬ twarza sie mostek dwusiarczkowy w odpowiednim etapie tej syntezy. Reakcje prowadzi sie celowo w warunkach znanych z literatury, dla wytwarzania dlugolancuchowych peptydów, z uwzglednieniem mostka dwusiarczkowego, opisanych na przyklad w ksiazce „The peptides" ( E. Schródera i K. Lub¬ ke, Academic Press, New York and London (1965).Jako grupy ochronne stosuje sie zwlaszcza gru- pe III-rzed-butyloksykarbonylowa dla grupy ami¬ nowej i III-rzed-butyloestrowa dla grupy karbo¬ ksylowej i eterowa grupe III-rzed-butylowa dla grup hydroksylowych seryny, treoniny lub tyro¬ zyny, jesli osloniecie tych grup jest konieczne.Wszystkie grupy ochronne, jesli jest to pozada¬ ne, mozna odszczepic w jednym etapie za pomoca kwasowej hydrolizy, przeprowadzonej na przyklad kwasem trójfluorooctowym lub kwasem solnym.Grupy merkaptanowe oslania sie korzystnie gru- sa parni tritylowymi, które usuwa sie za pomoca jodu w metanolu, równoczesnie z wytworzeniem most¬ ka dwusiarczkowego (porównaj szwajcarski opis patentowy nr 498805). Wytworzenie mostka dwu¬ siarczkowego moze byc dokonane w etapie wy- 40 tworzenia tej czesci sekwencji, która zawiera obie reszty cysteiny, na przyklad przy uzyskaniu de- kapeptydu 1—10 lub dotriakontapeptydu.Polaczenie jednostek aminokwasowych i/lub pe- ptydowych przeprowadza sie na przyklad za po- 45 moca reakcji aminokwasu lub peptydu o ochron- * nej grupie a-aminowej i aktywowanej koncowej grupie karboksylowej z aminokwasem lub pepty- dem posiadajacym wolna grupe a-aminowa i wol¬ na lub chroniona, na przyklad zestryfikowana lub 80 zamidowana koncowa grupe karboksylowa, albo przez reakcje aminokwasu lub peptydu o aktywo¬ wanej grupie a-aminowej i chronionej koncowej grupie karboksylowej z aminokwasem lub pepty- dem o wolnej grupie karboksylowej i chronionej 55 grupie a-aminowej. Grupe karboksylowa mozna zaktywowac na przyklad przez przeprowadzenie w azydek kwasowy, bezwodnik kwasowy, imidazo- lid kwasowy lub w aktywowany ester, taki jak ester cyjanometylowy, tiofenylowy, p-nitrotiofeny- oo Iowy, ti'ofcrezylowy, p-anetanosulfenyilafenyiloiwy, p- -nitrofenylowy, 2,4-dwunitrofenylowy, 2,4,5- lub 2, 4,6,-trójchlorofenylowy, pieciochlorofenylowy, N-hy- droksyamidu kwasu bursztynowego, N-hydroksy- ftalimidowy, 8-hydroksychinolinowy, N-hydroksy- 65 piperydynowy albo przez reakcje z karbodwuimi-5 92914 6 dem (w danym przypadku z dodatkiem N-hydro- ksysukcynimidu) lub N,N'-karbonylodwuimidazo- lem lub sola, izoksazoilowa, na przyklad odczynni¬ kiem Woodwarda, grupe aminowa przykladowo przez reakcje z fosforynem. Jako najczesciej sto¬ sowane metody wymienic nalezy metoda karbo- dwuimidowa, metode Weyganda-Wunscha (karbo- dwuimid w obecnosci N-hydroksysukcynimidu) me¬ tode azydkowa, metode aktywowanych estrów oraz metoda bezwodnikowa, ponadto metode Merrifielda i metode N-karboksybezwodników lub N-tiokarbo- ksybezwodników.Szczególnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest obok wytwarzania produktów koncowych tak¬ ze wytwarzanie substancji wyjsciowych, przede wszystkim odlamu peptydowego zawierajacego mostek dwusiarczkowy oraz jego polaczenie z po¬ zostala czescia peptydu. Stwierdzono, ze korzystne jest stosowanie jako produktu wyjsciowego sek¬ wencji obejmujacej pierwsze 10 N-koncowych ami¬ nokwasów i z tym N-fragmentem kondensowac ca¬ la pozostala sekwencje.Mozna takze polaczyc wymieniona N-koncowa sekwencje z fragmentem az do 28 aminokwasu (gli¬ cyny) z wolna C-koncowa grupe karboksylowa i kondensowac oktakozapeptyd z tetrapeptydem aminokwasów 29—32. To postepowanie nadaje sie takze szczególnie do wytwarzania C-koncowych estrów, na przyklad takich, które wyprowadzaja sie z dlugolancuchowych alkanoli albo do wytwa¬ rzania N-podstawnych C-koncowych amidów. Kon¬ densacje przeprowadza sie przykladowo wedlug metody Weyganda-Wunscha. Jezeli przeprowadza sie kondensacje sekwencji 1—10 z C-koncowa sek¬ wencja 11—32, wtedy stosuje sie szczególna meto¬ de karbodwuimidowa lub metode Weyganda-Wuns¬ cha. Ponizej wyjasniono blizej wytwarzanie N-kon- cowego dekapeptydu (1—10). Mozna gó zbudowac na przyklad z sekwencji 1—4 i 5—10 lub 1—5 i 6— lub 1—6 i 7—10 lub 1—7 i 8—10, jak to wi¬ doczne ze schematów 1—8; mozna jednak takze stosowac inne czesci do budowy sekwencji 1—10.Jako grupe ochronna dla grupy a-aminowej przy cySteinie1 stosuje sie szczególnie grupe III-rzed.- butyloksykarbonylowa lub grupe równowazna, od- szczepiana przez kwasna hydrolize, albo jezeli ma byc otrzymany Na-acylowany dotriakontapeptyd, odpowiednia grupe acylowa, na przyklad acetylo- wa. Równiez dla ochrony grup merkaptanowych stosuje sie takie grupy, które mozna odszczepic selektywnie w stosunku do chronionej (na przy¬ klad grupa Ill-rzed.-butyloksykarbonylowa) grupy Na-aminowej, odszczepialnej przez kwasna hydro¬ lize, na przyklad grupe benzylowa lub tritylowa.Koncowa grupa karboksylowa dekapeptydu nie musi byc koniecznie chroniona, na przyklad w przypadku jezeli przeprowadza sie kondensacje metoda azydkowa lub bezwodnikowa. Mozna jed¬ nak te grupe chronic takze przez estryfikacje me¬ tanolem lub etanolem (odszczepienie grupy estro¬ wej nastepuje rozcienczonym lugiem sodowym) lub alkoholem benzylowym albo analogami, odszcze¬ pienie grupy estrowej przeprowadza sie na przy¬ klad sodem w cieklym amoniaku. Ochrona grup aminowych produktów posrednich nastepuje przy pomocy zwyklych grup ochronnych, na przyklad karbabenaotosylowych, tiityHowyich, IH-irzed.4uty- loksykarbonylowej lub 2-/p-bifenylilo/-izopropylo- ksykarbonylowej. Grupy karboksylowe produktów posrednich, jesli to pozadane, estryfikuje sie w zna% sposób. Grupy hydroksylowe rodnika sery- nowego i treoninowego moga byc chronione przez estryfikacje, na przyklad Ill-rzed.-butanolem lub równowaznymi.Na rysunkach, schematach i w przykladach za¬ stosowano nastepujace oznaczenia: 1) — metoda azydkowa 2) — metoda mieszanych bezwodników 3) — metoda aktywowanych estrów, zwlaszcza estru p-nitrofenylowego (ONP) lub estru hydroksy- sukcynimidu (OSU), 4) — metoda karbodwuimidowa ) — metoda wedlug Weyganda-Wunscha, BOC — Ill-rzed.-butyloksykarbonyl, DPC — 2-/p-dwufenylilo/-izopropyloksykarbonyl, Z — karbobenzoksy, TRI — trityl, Bzl — benzyl, OtBu — III-rzedowy ester butylowy OBzl — ester benzylowy, • ONB — ester p-nitrobenzylowy, ONP — ester p-nitrofenylowy, OMe — ester metylowy, OCP — ester 2,4,5-trojchlorofenyIowy, OEt — ester etylowy, tBu — III-rzedowy butylowy eter, Ac — acetyl, Bmp — 0-merkaptopropionyl, TFA — kwas trójfluorooctowy Estrowe grupy p-nitrobenzylowe i benzylowe od- szczepia sie w sekwencjach zawierajacych metio- nine za pomoca sodu w cieklym amoniaku, poza tym przez hydrogenolize w obecnosci palladu na weglu, grupe karbobenzoksylowa równiez przez 40 hydrogenolize, grupe N-tritylowa wodnym kwasem octowym, grupe Ill-rzed.-butyloksykarbonylowa kwasem TFA, grupe dwufenyloizopropyloksykar- bonylowa wodnym kwasem octowym lub miesza¬ nina lodowatego kwasu octowego, kwasu mrówko¬ wi wego 82,8*/« i wody uzytych w stosunku jak 7:1:2, jak opisano w szwajcarskim opisie patentowym nr 509266.Ester p-nitrobenzylowy lub metylowy mozna przeprowadzic w hydrazyd przy pomocy wodzianu 50 hydrazyny. Grupe metyloestrowa hydrolizuje sie rozcienczonym lugiem sodowym. Trzeciorzedowy ester butylowy oraz trzeciorzedowy eter butylowy odszczepia sie kwasem trójfluorooctowym. Grupy S-tritylowe usuwa sie za pomoca octanu rteciowe- 55 go i siarkowodoru, grupe S-benzylowa sodem w cieklym amoniaku, przy czym w danym przypad¬ ku odszczepiaja sie równoczesnie istniejace grupy benzylo- lub p-nitrobenzylo-estrowe. Zamkniecie pierscienia do dwusiarczku nastepuje na przyklad 60 przez utlenienie l^Hdwujodoetanem, zas chronio¬ nych ziwiajzków SHtrjltyttowych za pomoca jodu w metanolu.C-koncowa sekwencje obejmujaca aminokwas 11—32, wzglednie 11—28, która ma byc polaczona 65 z sekwencja N-koncowa, skladac mozna przykla-7 dbwo z sekwencji 11—16, 17—20, 21—28 i 29—32, jak pokazuje schemat 9.W tym schemacie grupy karboksylowe rodni¬ ków treoninowych i tyrozynowych. sa chronione, nie jest to jednak bezwarunkowo konieczne. Mozna równiez polaczyc ze soba inne sekwencje czeftio- we i zastosowac inne grupy ochronne.Schemat 10 pokazuje budowe (synteze) heksa- peptydu (w postaci hydrazydu) aminokwasów 11— 16. Mozna go polaczyc wedlug metody azydkowej z sekwencja 17—28 lub 17-^32.Sekwencje 17—28 mozna zbudowac wedlug me¬ tody azydkowej z fragmentów 17—20 i 21—28.Schemat 11 pokazuje synteze hydrazydu tetra¬ peptydu aminokwasów 17—20, schemat 12 — bu¬ dowe oktapeptydu 21—28.Po polaczeniu obu sekwencji odszczepia sie o- chronna grupe a-aminowa (grupe karbobehzoksyIo¬ wa przez hydrogenólize w obecnosci palladu na weglu) i kondenstije tak otrzymany dodekapeptyd o chronionych lancuehach bocznych z hydrazydem heksapeptydu 11—16 wedlug metody azydkowej (schemat 10).W ten sposób otrzymana sekwencja li—28 moze byc polaczona z aminem' tetrapeptydu aminokwa¬ sów 29—32, na przyklad wedlug metody Weygan- da-Wtinscha, otrzymanie którego pokazuje sche¬ mat 13. Otrzymuje sie wtedy chroniony amid de- kozapeptydu 11—32; 2 tego ostatniego mozna od- szczepic a-aminowa grupe ochronna (karbobenzo- ksylowa na przyklad hydrogenolitycznie, DPC 90*/o kwasem octowym lub lodowatym kwasem octowym, kwasem mrówkowym 82,8*/# i wóda w stosunku 7:1:2 iw ten sposób otrzymany zwiazek z wol¬ na grupa a-aminowa, po usunieciu kwasu octowego, polaczyc' z N-koncowym dekapeptydem (schematy 1^-8), ; przykladowo wedlug metody mieszanych bezwodników; 'aktywowanych estrów (OSU) lub metoda Weyganda-Wunscha; Mozna jednak równiez sekwencje 11—28fz wol¬ na C-kbncowa grupa karboksylowa, po odszczepie- niu a^aminoWej grupy ochronnej w wymieniony sposób, polaczyc z: N-koncowym dekapeptydem wedlug metody mieszknjrch bezwodników i w ten sposób otrzymany produkt kohdensowac z amidem tetrapeptydu 29-^32, na przyklad wedlug metody Weyganda-Wunscha.Dalsza mozliwosc budowy (syntezy) C-koncowej sekwencji 11—32 polega ha przyklad na laczeniu sekwencji czesciowych 11—19 i 20^32, które po¬ kazane sa na schematach 14 i 15, zwlaszcza we¬ dlug metody mieszanych bezwodników lub Wey¬ ganda-Wiinscha.Wedlug schematu 15 mozna otrzymac takze C- -koncbwa sekwencje z wolna grupa karboksylowa, przy czym wówczas na przyklad nie odszczepia sie grupy III-rzedowego estru butylowego znajdujacej sie przy aminokwasie 32 i przeprowadza w grupe amidowa, lecz zachowuje sie az do stopnia J.Kondensacje sekwencji 20—32 z C-koncowa wol¬ na grupa karboksylowa z sekwencja 11—19 ze schematu 14 przeprowadza sie na przyklad we¬ dlug metody mieszanych bezwodników, tak samo polaczenie otrzymanej w ten sposób sekwencji 11— 32 z N-koncowa sekwencji 1—10. 8 Z chronionego amidu dotriakontapeptydu odszcze¬ pia sie grupy ochronne na przyklad kwasem trój- fluorooctowym albo stezonym kwasem solnym.Dotriakontapeptyd z wolnymi wzglednie chro- nionymi przez grupy tritylowe grupami —SH, ewentualnie stosowany w wariancie 2 sposobu we¬ dlug wynalazku, mozna otrzymac w analogiczny sposób, jak wyzej opisany chroniony dotriakonta¬ peptyd, z ta róznica, ze zachowuje sie do konca syntezy chronione grupy —SH. Dopiero po usunie¬ ciu wszystkich pozostalych grup ochronnych z do¬ triakontapeptydu chronionego odszczepia sie ochron¬ ne grupy —SH, wzglednie utlenia bezposrednio chroniony tritylem zwiazek, jak podano wyzej.Sposób wedlug wariantu 3 jest odpowiedni szcze¬ gólnie do wytwarzania produktów koncowych, w których grupa a-aminowa i aminowa w lancuchu bocznym sa acylowane. Na-acylowany dekapeptyd otrzymuje sie na przyklad wedlug punktu K sche¬ matu 5, mozna jednak takze jako aminowa grupe ochronna od poczatku wybrac grupe acylowa, któ¬ ra ma byc zachowana. Metody syntezy odpowiada¬ ja wyzej opisanym. 2g Nowe zwiazki zaleznie od sposobu postepowania otrzymuje sie w postaci zasad lub soli. Z soli moz¬ na uzyskac w znany sposób zasady, z których przez przemiane z kwasami mozna wytworzyc sole na¬ dajace sie do stosowania w lecznictwie, jak na ^ przyklad sole z nieorganicznymi kwasami, takimi jak chlorowcokwasy, przykladowo kwas solny lub bromowodoTowy, kwasy nadchlorowy* aoitowy, tdo- cyjanowy, siarkowy, kwasy fosforowe, lub z kwa¬ sami organicznymi jak mrówkowy, octowy, propio- w nowy, glikolowy, mlekowy, pirogronowy, szczawio¬ wy, malonowy, bursztynowy, maleinowy, fumaro¬ wy, jablkowy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, hydroksymaleinowy, dwuhydroksymaleinowy, ben¬ zoesowy, fenylooctowy, 4-aminobenzoesowy, 4-hy- 4o droksybenzoesowy, antralinowy, cynamonowy, mi¬ gdalowy, salicylowy, 4-aminosalicylowy, 2-fenoksy- ibenzoesowy, 2-acetoksyfoerazoesowy, meitaniosuMono- wy, etanosulfonowy, hydroksyetanosulfonowy, ben- zenosulfonowy, p-toluenosulfonowy, naftalenosulfo- w nowy lub sulfanilowy.Peptydy wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku moga znalezc zastosowanie w postaci prepara¬ tów fainmaceutycznych, zawierajacych peptydy w mieszaninie z odpowiednim nosnikiem farmaceu- 50 tycznym, organicznym lub nieorganicznym odpo¬ wiednim do stosowania jelitowego i poza jelitowego.Jako nosniki stosuje sie substancje nie reagujace z polipeptydami, takie jak na przyklad zelatyna, cukier mlekowy, glukoza, sól kuchenna, skrobia, 55 sitearyniam magnezu, talk, oleje roslinne, alkohole benzylowe, guma, polialkilenoglikple, wazelina, cho- lesteryna lub inne znane nosniki leków. Preparaty farmaceutyczne moga byc stosowane na przyklad w postaci liofilizatu lub plynnej, jako roztwór, za- oo wiesina lub emulsja, ewentualnie skrystalizowane i/lub zawierac substancje pomocnicze, takie jak srodki konserwujace, stabilizujace, zwilzajace lub emulgujace oraz jeszcze inne leczniczo cenne sub¬ stancje.M Wynalazek opisany jest w nastepujacych przy-9 92914 kladach. Tempeiraltiuira podana w Sitopndach Ceifejju- sza.W chromatografii cienkowarstwowej stosuje sie. nastepujace uklady: ukald 37 — n-butanol-pirydyna-woda (46 : 31 : 23) uklad 43A — III-rzed. alkohol amylowy-izopropa- nol-woda (100 : 40 :10) uklad 43C — III-rzed. alkohol amylowy-izopropa- nol-woda (51: 21 : 28) uklad 43E — III-rzed. alkohol amylowy-izopropa- nol-woda (32 : 32 : 36) uklad 45 — II-rzed. butanol-3% wodny amoniak (70:30) uklad 52 — n-butanol-kwas octowy lodowaty- -woda (75:7,5:21) uklad 52A — n-butanol-kwas octowy lodowaty- -woda (67 :10 : 23) uklad 53 — n-butanol-kwas mrówkowy-woda (60: : 0,75: 39) uklad 70 — octan etylu-pirydyna-woda (40 : 20 : :40) uklad 79 — n-butanol-pirydyna-woda (34 : 33 : 33) uklad 87 — izopropanol-kwas mrówkowy-woda (77 :4 :19) uklad 89 — octan etylu-aceton-woda (72 : 24 : 4) uklad 96 — II-rzed. butanol-kwas octowy lodo¬ waty-woda (67 :10 : 23) uklad 100 — octan etylu-pirydyna-lodowaty kwas octowy-woda (62 : 21 :11) uklad 101 — n-butanol-pirydyna-kwas octowy lo- dowaty-woda (38 : 24 :30) uklad 101A — n-butanol-pirydyna-kwas octowy lo¬ dowaty- woda (42 : 24 : 30) uklad 102A — octan etylu-metyloetyloketon-kwas mrówkowy-woda (50 : 30 :10 :10) uklad 102E — octan etylu-metyloetyloketon-kwas octowy lodowaty-woda (50 : 30 :10 : :10) uklad 104 — chloroform-metanol-17°/o wodny a- moniak (41: 41:18) uklad 107 —octan etylu-pirydyna-woda (49:24: :27) uklad 110 — octan etylu- n-butanol-pirydyna-kwas octowy lodowaty-woda (42 : 21: 21 : :6:10) uklad 115 — octan etylu-pirydyna-kwas mrówko¬ wy-woda (63 : 21:10 : 6) uklad 121A — izopropanol-amoniak (26%) -woda (85:5:10) uklad 1 — benzen-etanol (80 : 20) uklad 2 — benzen-etanol (90 :10) uklad 3 — benzen-etanol (95 : 5) uklad 4 — alkohol n-amylowy-kwas mrówko¬ wy-woda (70 :20 :10) uklad 5 — n-butanol-kwas octowy-woda (66: 6:16,7:16,7) uklad 6 — n-butanol-pirydyna-kwas octowy- -woda (66,6 :12,5 : 4,2) uklad 7 — alkohol n-amylowy-pirydyna-woda (50:30:20) uklad 8 — chloroform-metanol-kwas octowy lo¬ dowaty (87,4 : 9,7 : 2,9) uklad 9 — ibenzen^etanol (70 : 30) Chromatografie cienkowarstwowa przeprowadza sie na zelu krzemionkowym lub tlenku glinu („A- iox" DO fdrmy Gaimag. z 9°/o gjpsoi (loito na ceilulo- zie („Selecta 1440" firmy Schleicher i Schuell).Przylad I. Sposób wytwarzania kaleytoniny M o wzorze 5. 150 mg pochodnej peptydu o wzorze 6 rozpuszcza sie w 3 ml 95*/o kwasu trójfluorooctowego, oplukuje azotem i pozostawia w ciagu 90 minut w-tempera¬ turze 25°. Trójfluorooctan uwolnionego amidu do- triakontapeptydu wyjtraca sie nastepnie przez doda* iq nie 60 ml absolutnego, wolnego od nadtlenków eteru jako bezpostaciowy proszek, odwirowuje, zawiesza w 10 ml swiezego eteru, jeszcze raz odwirowuje i suszy pozostalosc w temperaturze t3Q°C Dla przemiany w octan rozpuszcza sie trójfluoro- octan w 3 ml wody i filtruje przez kolumne slabo zasadowego wymieniacza jonowego zrównowazone¬ go (aeauilibriert) 0,02 N kwasem octowym (na przyklad jonit Mercka nr IJ, 0=7,5 mm, =20 cm).Wyplukuje sie 0,02 N kwasem octowym az do rie- gatywnej reakcji fplinowej, koncentruje ehiat do objetosci okolo 5 ml i filtruje przez kolumne Bio^ -Cel P6, zrównowazona w 0,1 N kwasie octowym (objetosc zloza zelazowego =200* mlk-.J&luat. anali¬ zuje sie chromatograficznie metoda cienkowarstwo- wa (Alox, uklad 32). Glówne frakcje (maksimum przy okolo 100—120 ml) laczy sie, odparowuje do sucha w rotacyjnej wyparce (temperatura ¦ wew¬ netrzna w granicach do 20°C), rozpuszcza znów w ml wody i liofilizuje.W ten sposób otrzymany produkt dla ostatecz-, nego oczyszczenia poddaje sie podzialowi Craiga (Craig — Verteilung) poprzez 50Q stopni w ukladzie rozpuszczalnikowy n-butainol — lodowaty kwas oc¬ towy — woda (4 :1: 5 objetosciowo) z falowymi ofo« 55 jejtosciaimi po 3 mil. Z elementów piodzdafainir 141-^- 1I18O (maksiimuim przy nr 162, K=04#) •-¦•wyodrebnia sie przez odparowanie do sucha- (wyparka Totacyj- na, temperatura wewnetazna' najiwyizeg 20°C), roz- pusizczenie w 0,1 N kwasie oatowym i liofilizacje, 40 chromatograficizniie i eflektroferetyciznie jednorodny amid dotoriakonitapeptydu jako bialy, bezpostaciowy proszek.W chromatografii cienkowarstwowej wykazuje on nastepujace wartosci Rf: 45. ...... :V na „Alox DO" (flamiy Gaimag, : Rf (52)=0,56 tlenek glinu z 8*/o gipsu) Rf (79)=0,66 RfV(45)=0,45 . ,. na celulozie ,£eiecta 1440 Rf (45)=0,51 M firmy Schleicher-Schuell, gotowe plytki) Rf (101A) ^=0,60 Elektroforeza-na celulozie ,»Selecta 1440" pH 1,9, 1,5 godzin, 280 wolt, droga wedrówki do katody =3,5 cm. pH 7,1/ 1,5 godzin, 280 wolt; droga wedrówki do katody =1,3 cm. 55 Substancje wyjsciowa mozna otrzymac jak na¬ stepuje: , " 60 1. Z-Asp-NH* —* Leu — OMe 16,7 g H-Leu-OMe i 46,0 g Z-Asp-NH2-ONP rozpuszcza sie w:100 ml swiezo destylowanego dwumetyloformamidu. Roz¬ twór pozostawia sie w ciagu 19 godzin w tempera¬ turze 25°C. Nastepnie dodaje sie 1,2 litra wody « i odsacza krystaliczny osad na nuczy; Pochodna?92914 11 dwupeptydu suszy sie pod obnizonym cisnieniem w temperaturze 40°C i nastepnie dwukrotnie prze- krystalizowuje z metanolu-wody. Temperatura top¬ nienia (Tt)=il80^iaio; [a]2°D= +0° (c=2,05 w chlo¬ roformie). 2. H-Asp-NH2-Leu-OMe 15,0 g Z-Asp-NH2-Leu- -OMe rozpuszcza sie w 400 ml III-rzed. butanolu- -wody (9:1) i uwodarnia w obecnosci 2 g pallado¬ wego wegla (10e/o Pd). Po zakonczonym uwodornie¬ niu odsacza sie katalizator i przesacz odparowuje w temperaturze 40°.Pozostalosc stosuje sie bezposrednio dalej. 3. Z-Gli-Asn-Leu-OMe. 4,4 mM H-Asp-NH2-Leu- -OMe rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformamidu i nastepnie dodaje 5,5 mmoli estru Z-gli-p-nitro fenylowego. Klarowny zólty roztwór pozostawia sie w ciagu 18 godzin w temperaturze 27°. Po tym odparowuje pod wysoka próznia w temperaturze 40°, suszy i zadaje octanem etylu pozostalosc, któ¬ ra przy tym krystalizuje. Po 1 godzinie odsacza na nuczy w temperaturze 0° i suszy. Nastepnie suspen- duje sie produkt jeszcze raz w 25 ml octanu etylu, rozciera, odsacza i suszy. Temperatura topnienia 154°. 4. H-gli-asn-leu-OMe. 1,3 g Z-gli-Asp-NH2-Leu- -OMe rozpuszcza sie na cieplo w 100 ml metanolu i uwodornia roztwór oziebiony do temperatury po¬ kojowej w obecnosci palladowego wegla (lOtyo Pd).Po zakonczeniu przyjmowania wodoru odsacza sie katalizator i przesacz odparowuje do sucha. Otrzy¬ muje sie przy tym 760 mg H-gli-Asp-NH2-Leu-OMe w formie bezpostaciowej.. BOC-cys-/TRI/-gli-Asp-NH2-Leu-OMe. 710 mg H-gli-Asp-NHf-Leu-OMe i 1,36 g BOC-Cys-/TRI/- -OH rozpuszcza sie w 12 ml acetonitrylu i oziebio¬ ny do temperatury 0° roztwór zadaje 820 mg dwu- cykloheksylokarbodwuimidu. Po 30 minutach w temperaturze 0° i po 50 godzinach w temperaturze 28° odsacza sie dwucykloheksylomocznik i odparo¬ wuje przesacz do sucha. Pozostalosc zadaje eterem naftowym, rozciera, odlewa roztwór w eterze naf¬ towym i zadaje nierozpuszczalny produkt octanem etylu.Roztwór w octanie etylu plucze sie w tempera¬ turze 0° rozcienczonym roztworem kwasu cytry¬ nowego, woda, roztworem kwasnego weglanu sodu i woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje. Otrzy¬ mana pochodna tetrapeptydu w postaci bezbarw¬ nej zywicy wytraca sie kilkakrotnie z acetonu-ete- iru dla oczyszczenia.Wydajnosc: 1,2 g proszku, który jest jednorodny wedlug chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym: Rf=0,39 w ukladzie chloroform- metanol (9:1). 6. BOC-cys/TRl/-gli-asn-leu-NHNH2. 988 mg BOC- -cys-/TRI/-gli-asn-leu-OMe rozpuszcza sie w 20 ml metanolu i dodaje do roztworu oziebionego do tem¬ peratury 0° 2 ml wodzianu hydrazyny. Po 14 go¬ dzinach w temperaturze 2° dodaje sie 200 ml lo¬ dowato zimnego 0,5 N kwasu octowego, wydzielony osad rozciera dokladnie, odsacza na nuczy, plucze woda lodowata do reakcji obojetnej i suszy w ek- sykatorze prózniowym przez noc. Surowy hydrazyd BOC-Cys/TRI/-glu-NH2-Asp-NH2-leucyny oczyszcza sie przez dwukrotne wytracenie z metanolu-wody. 12 W chromatografii cienkowarstwowej na plytkach z zelu krzemionkowego Rf=0,2 w ukladzie chloro- form-metanol (9 :1). 7. BOC-met-leu-gli-OMe. 5 g Z-leu-gli-OMe (J.Am.Chem.Soc. 78, 212.6 (1965) rozpuszcza sie w 200 ml metanolu i roztwór intensywnie mieszajac u- wodarnia sie w temperaturze 0° w obecnosci 1 g palladowego wegla (10°/o Pd). Po zakonczeniu uwo¬ dorniania odsacza sie katalizator i roztwór odpa- rowuje w prózni w temperaturze lazni 25°. Oleista pozostalosc bez suszenia zadaje 4 g BOC-metioniny i rozpuszcza mieszanine w 100 ml acetonitrylu, na¬ stepnie zateza pod obnizonym cisnieniem do obje¬ tosci 60 ml, oziebia do temperatury 0° i dodaje 4,5 g dwucykloheksylokarbodwuimidu. Po odgazo- waniu przy pomocy azotu pozostawia w ciagu 30 minut w temperaturze 0° i 18 godzin w tempera¬ turze 25°. Nastepnie odsacza sie na nuczy wydzie¬ lony dwucykloheksylomocznik i odparowuje prze- sacz do sucha, a pozostalosc rozciera z eterem naf¬ towym i plucze, dekantuje roztwór w eterze nafto¬ wym i suszy nierozpuszczalny produkt. Produkt rozpuszcza sie nastepnie w octanie etylu i plucze roztwór rozcienczonym roztworem kwasu cytryno- wego, woda, roztworem kwasnego weglanu sodu i woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje.Pozostalosc w celu oczyszczenia rozpuszcza sie w minimalnej ilosci wolnego od nadtlenków ace¬ tonu i wytraca przez dodanie wolnego od nadtlen- ków eteru, otrzymujac pochodna trójpeptydu BOC- -Met-Leu-gli-OMe w postaci stalego proszku. 8. H-Met-Leu-gli-OMe. 3 g otrzymanej w punk¬ cie 7 pochodnej trójpeptydu zadaje sie 60 ml 0,4 N HC1 w octanie etylu i pozostawia mieszanine reakcyjna w ciagu 90 minut w temperaturze 25°.Po tym odparowuje si£ do sucha i suszy pozosta¬ losc (H-met-leu-gli-OMe chlorowodorek) w ciagu 24 godzin nad stalym wodorotlenkiem sodu przy 0,01 tor cisnienia. 40 9. TRI-Cys-/TRI/-Met-Leu-gli-OMe. 1,23 g H-Met- -Leu-gli-OMe. HC1 i 1,43 TRI-Cys/TRI/-OH zadaje sie 15 ml acetonitrylu i 300 mg N-metylomorfoliny.Po oziebieniu do temperatury 0° dodaje sie 800 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza w ciagu 45 godziny w temperaturze 0° i 45 godzin w tempe¬ raturze 30°C pod azotem. Nastepnie produkt odsa¬ cza sie, odparowuje przesacz w prózni do sucha i pozostalosc rozciera z eterem naftowym. Roztwór w eterze naftowym dekantuje, pozostalosc suszy 50 i rozpuszcza w octanie etylu.Roztwór w octanie etylu plucze w temperaturze 0° roztworem kwasu cytrynowego, woda, roztwo¬ rem kwasnego weglanu sodu i woda, suszy siar¬ czanem sodu i odparowuje. Dla oczyszczenia suro- w wy produkt slabo zóltawa zywice rozpuszcza sie w mozliwie malej ilosci metanolu i chromatógra- fuje roztwór na przygotowanej metanolem kolum¬ nie wypelnionej Sephadex LH-20 (2,5+90 cm). Od¬ biera sie frakcje po 4 ml, odparowuje pojedynczo 60 i kontroluje ich czystosc za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym w ukla¬ dzie chloroform-metanol (99 :1). lOa. H-Cys-/TRI/-Met-Leu-gli-OMe. 1,11 g otrzy¬ manej wedlug punktu 9 pochodnej tetrapeptydu 65 rozpuszcza sie w 15 ml 73% kwasu octowego i po-13 92914 14 zostawia w ciagu 1 godziny w temperaturze 30°, po czym odparowuje sie roztwór pod wysoka próz¬ nia do sucha i rozciera pozostalosc z wolnym od natlenków eterem. Otrzymana sól kwasu octowego H-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OMe w postaci stalego proszku odsacza sie na nuczy, plucze eterem i su¬ szy, wydajnosc 695 mg. lOb. H-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH. 740 mg H-Cys /TRI/-Met-Leu-Gli-OMe rozpuszcza sie na cieplo w 10 ml metanolu i 1,3 ml wody i do otrzymane¬ go roztworu, w atmosferze azotu wkrapla sie w temperaturze pokojowej 3,0 ml 1,0 N lugu sodowe¬ go i miesza w ciagu 25 minut. Nastepnie miesza¬ nine oziebia sie do temperatury 0°, dodaje 3,0 ml 1,0 N kwasu solnego i 20 ml wody, odsacza klacz- kowaty osad, plucze zimna woda i suszy w tem¬ peraturze pokojowej nad stalym wodorotlenkiem sodu pod wysoka próznia az do stalej wagi. Rf 70 = 0,40, Rf 121A=0,45. 11. H-Tre/tBu/-OMe. 12,92 g (40 mM Z-Tre/tBu/- -OMe) uwodornia sie w temperaturze pokojowej w 200* ml lodowatego kwasu octowego w obecnos¬ ci 3 g palladowego wegla (10°/o Pd). Przyjmowanie wodoru zakonczone jest po 1 godzinie. Roztwór odsacza sie od katalizatora i odparowuje w tem¬ peraturze 35° pod próznia pompki wodnej. Po su¬ szeniu pod wysoka próznia w temperaturze 35° o- trzymuje sie 7,3 g oleju, który wedlug chromato- graimu cienkowarstwowego jest jednorodny i stosu¬ je sie bezposrednio dalej. 12. DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-OMe. 19,3 g (38,6 mM) DPC-Ser-/tBu/-OH. sól cykloheksylaminy rozpusz¬ cza sie w 500 ml chloroformu i wytrzasa w tempe¬ raturze 0° trzykrotnie z 25 ml 1 N kwasu cytryno¬ wego i pieciokrotnie z 40 ml pólnasyconego roztwo¬ ru soli kuchennej. Po wysuszeniu roztworu siar¬ czanem sodu, odparowuje sie i rozpuszcza o- trzymana piane w 250 ml octanu etylu, nastepnie dodaje 5,36 ml (38,6 mM) trójetyloaminy, oziebia roztwór do temperatury —10° i mieszajac zadaje ,13 ml (38,6 mM) izobutylochloroweglanu, miesza sie jeszcze w ciagu 10 minut w temperaturze —10° a nastepnie tak wkrapla oziebiony do temperatury -12° roztwór 7,3 g (38,6 mM) H-tr/tBu/-OMe w 100 ml octanu etylu, aby nie przekroczyc tempe¬ ratury reakcji —10°.Po zakonczeniu wkraplania miesza sie jeszcze w ciagu 1 godziny w temperaturze —10° i pozosta¬ wia w ciagu nocy w temperaturze pokojowej. Roz¬ twór odsacza sie od wydzielonego chlorowodorku trójetyloaminy i plucze w temperaturze 0° trzy¬ krotnie 1 N kwasem cytrynowym po 20 ml i 5 ra¬ zy nasyconym roztworem soli kuchennej, suszy i odparowuje. Otrzymuje sie 22,07 g surowego pro¬ duktu w postaci oleju, który sie ohromaitogiraifuje na kolumnie silikazelowej (2,5 cm, 30 cm), wypelnio¬ nej 1 g silikaizelu. Po zebraniu 110 ml przedgonu, utzyskuje sie 787 mg czystego produktu eluujac ete¬ rem nafitowyim-octanam etyflu (1:1).W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym w ukladzie toluen-aceton (7:3) Rf=0,51. 13. DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-NH-NH2. 4,253 g (7,4 mM) DPC-Ser/tBu/-tr/tBu/-QMe w 18 ml metanolu zadaje sie 5,55 ml (okolo 110 mM) wodzianu hydra¬ zyny i zostawia w ciagu 10 godzin w temperaturze pokojowej i 2 godziny w temperaturze 40°. Nastep¬ nie roztwór zadaje sie 450 ml octanu etylu i plucze 4 razy pólnasyconym roztworem soli kuchennej.Roztwór, po wysuszeniu siarczanem sodu odparo¬ wuje sie do okolo 15 ml i zadaje okolo 5 ml eteru naftowego. W ciagu nocy wykrystalizuje 3,17 g hydrazydu o temperaturze topnienia 132—134°.Otrzymany produkt w chromatogramie cienkowar¬ stwowym na zelu krzemionkowym w ukladzie to¬ luen-aceton (7 : 3) wykazuje Rf=0,40. 14a. DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu- -Gli-OMe. 900 mg DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-NH-NH2 w 12 ml dwumetyloformamidu zadaje sie w tem¬ peraturze -^20° 2,0 ml 2,0 N roztworu HC1 w octa¬ nie etylu a nastepnie 210 mg III-rzed. azotynu bu¬ tylu. Po 15 minutach w temperaturze —10° wkrap¬ la schlodzony do —10° roztwór 680 mg soli kwasu octowego H-cys/TRI/-met-leu-gli-OMe w 9 ml dwu¬ metyloformamidu i dodaje wtedy jeszcze 350 mg N-metylomorfoliny, przy czym przy wprowadzaniu powyzszych substancji temperatura reakcji nie po¬ winna przekraczac —5°. Nastepnie roztwór miesza sie w ciagu godziny w temperaturze —5° i 18 go¬ dzin w temperaturze 25°, po czym odparowuje pod obnizonym cisnieniem a potem pod wysoka próznia do malej objetosci i wytraca surowy produkt przez dodanie wody lodowej. Produkt rozciera sie do¬ kladnie, odlewa wodny roztwór i suszy nierozpusz¬ czalna pochodna heksapeptydu. Dla oczyszczenia wytraca sie ja po 2 razy z roztworu metanolu przez dodanie wody i potem z roztworu octanu etylu przez dodanie eteru naftowego. Otrzymuje sie 480 mg DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/Met-Leu-Gli- OMe. 14.b DPC-Ser/tBu/-Tre/ tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu- -Gli-OH. 857 mg DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-NH-NH2 w 8,0 ml dwumetyloformamidu zadaje sie w temperaturze —10° 1,87 ml 2,0 N roztworu HC1 w octanie etylu i 0,19 ml III-rzed. azotynu butylu. Po 15 minutach w temperaturze —10° wkrapla sie, pluczac azotem, roztwór 665 mg H-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH i 0,665 ml trój etyloaminy w 7 ml dwumetyloformamidu i miesza sie jeszcze w ciagu godziny w tempera¬ turze —10°, po czym zostawia w temperaturze O0 w ciagu 24 godzin.Mieszanine zageszcza sie do okolo 3 ml (pod wy¬ soka próznia w temperaturze 30°), a nastepnie wy¬ traca produkt 50 ml wody otrzymujac klaczkowata substancje, która odsacza sie, plucze woda i suszy nad sitalyim wodorotlenkiem sodu pod wysoka próz¬ nia. Produlkit oczyszcza sie za pomoca wytracenia z mieszaniny benzenu-heksanu, otrzymujac w chro¬ matogramie cienkowarstwowym Rf = 0,36 w ukla¬ dzie chloroform-metanol (7 : 3).. DPC-Ser/ tBu/-Tre/tBu/-Cys/ TRI/-Met-Leu- -Gli-OH. 2,3 g otrzymanej w punkcie 14a pochodnej he¬ ksapeptydu rozpuszcza sie w 100 ml dioksanu-wo¬ dy (4:1) i dodaje 5 ml 1 N roztworu wodorotlen¬ ku sodu. Po 90 minutach w temperaturze 27° zobo¬ jetnia sie nadmiar wodorotlenku sodowego przez dodanie malej ilosci stalego dwutlenku wegla, za¬ geszcza roztwór pod obnizonym cisnieniem do ob- 36 40 45 50 55 W15 9Z9t4 16 jetosci okolo 10 ml i dodaje po tym 80 ml lodo¬ wata zimnego 2°/o roztworu kwasu cytrynowego.Wyteajcona pochbdha ftudksapeprtyidu rozclDera slia do¬ kladnie, odsacza, plucze kilkoma porcjami wody lodowatej i suszy w eksykatorze prózniowym. 1S1 H-Ser/tBu/-Tre/ tBu/-Cys/ TRI/-Met-Leu-Gli- -OH. (sól kwasu octowego). 870 mg otrzymanej w punkcie 15 pochodnej he- ksapeptydu rozpuszcza sie w 15 ml 809/o kwasu oc¬ towego i pozostawia roztwór w ciagu 6 godzin w temperaturze 30°. Nastepnie odparowuje do sucha pod wysoka próznia w temperaturze 30°, pozosta¬ losc suszy w ciagu 1 godziny w temperaturze 30°, a nastepnie dodaje eteru wolnego od nadtlenków i dokladnie rozciera powstaly proszek, po czym odsacza, przemywa duza iloscia eteru i suszy. 17. BOOCys/ TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser/ tBu/- -Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH 1,0 g BOC-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH-NH2 rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu i do¬ daje do roztworu ochlodzonego do temperatury —10° mieszajac 1,5 ml 2,0 N HCL w octanie etylu i 143 mg Ill-rzed. azotynu butylu. Po 15 minutach w temperaturze —10° dodaje dalsze 10 ml dwume¬ tyloformamidu ochlodzonego do temperatury —10°, 1,0 g dobrze sproszkowanej soli kwasu octowego H-Ser/ tBu/-Tre/ tBu/-Cys/ TRI/-Met+Leu-Gli-OH i 400 mg N-metylomorfoliny.Mieszanine reakcyjna utrzymywana w atmosfe¬ rze azotu miesza sie w ciagu godziny w temperatu¬ rze ^10° i 48 godzin w temperaturze 28°, nastep¬ nie zageszcza pod wysoka próznia do objetosci oko¬ lo 6 ml i wytraca pochodna dekapeptydu przez dodanie 100 ml wody lodowej. Powstaly osad roz¬ ciera sie, odsacza na nuczy i suszy w eksykatorze prózniowym nad stalym wodorotlenkiem sodu. Pro¬ dukt wykazuje w chromatogramie cienkowarstwo¬ wym na zelu krzemionkowym Rf w ukladzie chlo- roform-metanol (7 : 3) = 0,60. 18. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzorze 7. 300 mg BOC-Cys/ TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser/tBu /-Tre/ tBu/-Cys-2TRI/-Met-Leu-Gli-OH rozpuszcza sie w 100 ml metanolu i wkrapla w ciagu godziny do intensywnie mieszanego roztworu 400 mg jodu w 120 ml metanolu, po czym miesza sle jeszcze w ciagu 45 minut i ochlodzony do temperatury 0° roztwór odbarwia 1 N wodnym roztworem tiosiar¬ czanu sodu. Nastepnie zateza w prózni do obje;- tosci okolo 10 ml i wytraca pochodna dekapeptydu przez dodanie 100 ml lodowato zimnego lD/o roztwo¬ ru kwasu octowego.Po roztarciu, odsaczeniu na nuczy i przepluka¬ niu woda lodowa produkt suszy sie w eksykatorze nad stalym wodorotlenkiem sodu, po czym w celu dalszego oczyszczenia poddaje ekstrakcji przeciw- pradowej w ukladzie metanol-bufor-chloroform- -czterochlorek wegla, (10:3:5:4) stosujac roztwór buforowy: 29 ml kwasu octowego lodowatego, 19 g octanu amonu, dopelnionego woda do 1 litra. Frak¬ cje zawierajace czysta pochodna dekapeptydu la¬ czy sie i odparowuje roztwór. Dla usuniecia octanu amonu produkt rozpuszcza sie w chloroformie i plu¬ cze roztwór 3 razy rozcienczonym kwasem cytry¬ bowym j 3 razy woda i pdpa?owuje do .sucha.Chromatógram cienkowarstwowy otrzymanego pro¬ duktu wykazuje na zelu krzemionkowym Rf 100 == 0;45, Rf 121A = 0,55, Rf 70 = 0,40, Rf 43C * 0,35. 19. Z-Asp-NH2/OtBu/-Fen-OCH8. 3,0 g chlorowo- dar^ku estru fenyloalanimomeityloweigio razem z 6,17 g Z-Asp/OtBu/rONP rozpuszcza sie w 25 ml. t abso¬ lutnego N,N-dwumetyloformamidu do klarownego roztworu i dodaje mieszajac 1,93 ml trój etyloaminy.Ciemnozólta zawiesine • miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu nocy, nastepnie dodaje duza ilosc octanu etylu, przemywa 3 razy rozcienczonym wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 5 razy rozcienczonym wodnym roztworem sody i w koncu nasyconym wodnym roztworem soli kuchennej tak dlugo, az ciecz pluczaca bedzie obojetna. Roztwór po wysuszeniu nad siarczanem sodu. odparowuje sie, a otrzymany olej rozpuszczalny w eterze i chlo¬ roformie oczyszcza chromatograficznie na kolum¬ nie wypelnionej zelem krzemionkowym ekiujac sUJb- sitancje toluenem i mieszanina toluen eter jak 4:1.Otrzymuje sie produikt bezbarwny, oleisty, wyka»- Eujacy w chroima(togramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym wartosc Rf w chlorotfonmie- -imetanolu (9:1) 0,75; fw cMoroformie-acettpnie (1 :1) 0,67.. H-Asp/OtBu/-Fen-OCH8HCL. 770 mg peptydu Z-Asp/OtBu/-Fen-OMe rozpuszcza sie w 200 ml metanolu i dodajac 0,60 ml BC1 w dioksanie (3,0 N, 1,8 mM) i 200 mg katalizatora (palladowego wegla, °/o Pd) dekarbobenzoksyluje wodorem w tempe¬ raturze pokojowej na wstrzasarce. Po zakonczeniu bardzo szybkiego przyjmowania wodoru, mieszani¬ ne reakcyjna odsacza sie, odparowuje, odsacza od malej ilosci nierozpuszczalnej w octanie etylu sub¬ stancji i wytraca produkt eterem v W chromatogra¬ mie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym w ukladzie chloroform-metanol (9:1) Rf = 0,62; Rf 43C = 0,63. 21. Z-Gln-Asp/ OtBu/-Fe-OCHs. 550 mg H-Asp/ OtBu/-Fe-OCH8-HCl razem z 574 mg Z-Gln-ONP rozpuszcza sie w 2,5 ml absolutnego N,N-dwumety- loformamidu i miesza z 0,20 ml trójetyloaminy w ciagu 15 godzin w temperaturze lazni 30—33°. Na¬ stepnie wytrzasa z duza iloscia octanu etylu, jak opisano w punkcie 19, suszy i odparowuje. 22. H-Gln-NH2-Asp/ OtBu/-Fen-OCH8-HCL. 4,4 g Z-GlPrAsp/OtBuZ-FenOCHa w 300 ml metanolu po dodaniu 2,4 ml chlorowodoru w dioksanie (3,0 N, 7,2 mM) dekarbobenzoksyluje sie wodorem w tem¬ peraturze pokojowej w obecnosci 900 mg 10°/* ka¬ talizatora palladowego osadzonego na weglu, przy mechanicznym wstrzasaniu. Po zakonczeniu przyj¬ mowania wodoru roztwór odsacza sie od kataliza¬ tora i odparowuje pod próznia do sucha, rozciera zóltawa, stala pozostalosc z eterem i bez dalszego oczyszczenia stosuje do nastepnego etapu. 23. Z-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp/ OtBu/-Fen-OCH8. 3,68 g Z-Tre/tBu/-OH\sól dwucykloheksyloamonio- wa wytrzasa sie z octanem etylu, nastepnie 3 razy rozcienczonym roztworem kwasu cytrynowego i 3 razy nasyconym wodnym roztworem soli kuchen¬ nej, suszy siarczanem sodu i odparowuje. Otrzyma¬ ny klarowny jak woda olej miesza sie z 3,34 g H-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH8-HCL w 40 ml chlorJcu metylenu, dodaj e 0,9 ml trójetyloamjny 40 45 50 55 6092914 17 ' 1S i wkrapla roztwór 1,54 g dwucykloheksylokarbo- dwuimidu w 10 ml chlorku metylenu, splukujac wkraplacz 10 ml chlorku metylenu, po czym otrzy¬ mana zawiesine miesza w temperaturze pokojowej w ciagu 14 godzin, a nastepnie wstawia do lodów¬ ki na 2 godziny, odsacza od stalego osadu, przemy¬ wa osad mala iloscia chlorku metylenu i przesacz wyibrzasa z duza iloscia octanu etylu, jak opisano w punkcie 19. Bezpostaciowa pozostalosc po od¬ parowaniu rozciera sie z mieszanina eter-heksan (1:1) i suszy. 24. H-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp/ OtBu/-Fen-OCHs. 4,3 g Z-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH8 u- wodornia sie w zwykly sposób w 300 ml metanolu przy pomocy 1 g 10"°/o katalizatora palladowego na weglu i po zakonczeniu przyjmowania wodoru od¬ sacza i odparowuje. Pozostalosc po odparowaniu, w postaci stalej bezbarwnej piany bez dalszego oczyszczenia stosuje sie w nastepnym etapie.. Z-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/ OtBu/- -Fen-OCH8.Z 3,5 g Z-Tyr/tBu/-OH dwucykloheksyloaminowa sól uwalnia sie w octanie etylu, jak opisano w pun¬ kcie 23, za pomoca kwasu cytrynowego, kwas i mie¬ sza otrzymany klarowny olej z 3,29 g H-Tre/tBu/- -Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH8 w 80 ml acetoni- itrylu, po czyim dodaje 1,31 g dwucykloheksyilokar- ibodwuiim'idu w postaci stalej i miesza w ciagu 24 godzin w temperatorze pokojiowej, a nastepnie od¬ sacza wytracony dwucykloheksylomoczndk i prze¬ mywa mala iloscia acetonitrylu i odparowuje prze¬ sacz do sucha. Pozostalosc rozpuszcza sie w duzej ilosci chlorofonmu i wytrzasa 3 razy z rozcienczo¬ nym wodnym roztworem kwasu cyttrynowego, na¬ stepnie 3 razy rozcienczonyim wodnym roztworem sody i 4 razy z nasyconym roztworem soli kuchen¬ nej. Po wysuszeniu siarczanem sodu roztwór od¬ parowuje sie i pozostalosc rozpuszcza w mieszani¬ nie metanol-octan etylu (1:8), po czym wytraca produkt na zimno za pomoca eteru naftowego, po- witainzajac operacje rozpuszczania i wytracania.Chroniony penitapeptyd otrzymuje sie w postaci drobnoziarnistego bezpostaciowego proszku* 26. H-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/- -Fen-OCH8. 4,0 g Z-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/- -Fen-OCH8 w 100 ml absolutnego wstepnie uwo¬ dornionego N,N-dwumetyloformamidu, w obecnos¬ ci 1,4 g 10*/o palladowego wegla jako katalizatora, dekarbobenzoksyluje sie za pomoca wodoru w tem¬ peraturze pokojowej. Po zakonczeniu przyjmowa¬ nia wodoru mieszanine poreakcyjna rozciencza sie 400 ml metanolu, odsacza i odparowuje pod obni¬ zonym cisnieniem. Bezbarwna stala pozostalosc bez dalszego oczyszczania stosuje sie w nastepnym eta¬ pie. 27. Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp /OtBu/-Fen-OCH8.Zw 2,85 g Z-Tre/tBu/-OH dwucykloheksyloamonio- wa sól uwalnia sie kwas w octanie etylu, jak opi¬ sano w punkcie 23, za pomoca kwasu cytrynowego i miesza otrzymany olej Z-Tr/tBu/-OH z 3,33 g H-Tyr/tBu/-Tr/tBu/-Gln-Asp/OtBu/-Fe-OCH8 w 80 ml acetonitrylu w temperaturze pokojowej, po czym dodaje 1,20 g dwucykloheksylokarbodwuimidu w postaci stalej i miesza w ciagu 23 godzin w tem¬ peraturze pokojowej. Wytracony dwucykloheksylo- mocznik, odsacza sie przemywa trzema porcjami po 7 ml acetonitrylu, odparowuje pod obnizonym cis- 9 nieniem i wytraca pozostalosc 3 razy z roztworu mieszaniny octanu etylu z alkoholem za pomoca eteru naftowego. 28. Z-Tre/tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/tBu/-Gln IfH2-Asp /OtBu/-Fen-NH-NH2 1.3 g Z-Tre/ tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2- -Asp/OtBu/-Fen-OCH8 rozpuszcza sie w 30 ml me¬ tanolu i dodaje w temperaturze 0° 0,6 ml wódzia- nu hydrazyny i pozostawia w ciagu 3 dni w lo¬ dówce, przy czym wypada galaretowaty osad. Osad ten zestala sie za pomoca dodania eteru, odsacza i pozostalosc przekrystalizowuje z mieszaniny eta¬ nolu i eteru. 29. Z-Liz/BOC/-Fen-OMe. ,0 g Z-Liz/BOC/-ONP i 10,7 g H-Fen-OMe-HCl w 70 ml dwumetyloformamidu zadaje sie miesza¬ jac w temperaturze pokojowej 6,9 ml trójetyloami- ny i miesza jeszcze w ciagu 16 godzin. Po rozcien¬ czeniu octanem etylu plucze sie roztworem wegla¬ nu potasu do usuniecia nitrofenolu, wytrzasa 0,1 M roztworem kwasu cytrynowego a nastepnie woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje pod obnizo¬ nym cisnieniem do sucha. Z octanu etylu-heksanu krystalizuje chroniony peptyd o temperaturze top¬ nienia 78—80°, wykazujacy w chromatogramie cien¬ kowarstwowym na zelu krzemionkowym w ukla¬ dzie chloroform-aceton (8 : 2) Rf = 0,45.. Z-Liz/BOC/-Fen-NH-NH2. 27 g powyzszego estru metylowego dwupeptydu rozpuszcza sie w 135 ml cieplego metanolu, dodaje w temperaturze pokojowej 25 ml wodzianu hydra¬ zyny i pozostawia w ciagu 16 godzin. Do krystali- zatu dodaje 135 ml wody, odsacza na nuczy i.plu¬ cze dobrze woda. Otrzymuje sie produkt o tempe¬ raturze topnienia 173—174° po przekrystalizowaniu z wodnego metanolu, wykazujacy w chromatogra- mie cienkowarstwowym na zelu1 krzemionkowym w ukladzie chloroform-metanol (95 : 5) Rf = 0,3. 31. Z-Liz/BOC/-Fen-His-OMe. .4 g Z-Liz/BOC/-Fen-NH-NH2 w 40 ml dwume¬ tyloformamidu zadaje w temperaturze —16°, 6,8 ml 3,66 N roztworu HC1 w dioksanie i nastepnie 1,5 ml III-rzed. azotynu butylu. Po 10 minutach w tem¬ peraturze —10° do —15° dodaje 3,5 ml trójetylo- aminy, a nastepnie 3,64 g H-His-OMe -.2 HC1 w po¬ staci stalej, po czym wkrapla 4,2 ml trójetyloami- ny. Mieszanine reakcyjna ogrzewa w ciagu godzi¬ ny do temperatury 0° w atmosferze biernego gazu, przy czym przez dodanie ogólem 0,8 ml trójetylo- aminy doprowadza sie roztwór do wartosci pH oko¬ lo 7. Po mieszaniu w ciagu nocy w temperaturze 0° wlewa sie mieszanine reakcyjna do 250 ml wo¬ dy i przez roztarcie z woda mazisty produkt prze¬ chodzi w konsystencje proszku, wykazujacym w chromatogramie cienkowarstwowym na silikazelu w chloroformie-etanolu (9 :1) Rf = 0,4. Tempera¬ tura topnienia 136—137° (z octanu etylu). 32. H-Liz/BOC/-Fen-His-OMe. 6,8 g Z-Liz/BOC/-Fen-His-OMe w 140 ml meta¬ nolu uwodornia sie w obecnosci 1 g palladowego wegla (10°/§ Pd). Po skonczonym uwodornieniu od^ 40 45 50 55 6092914 19 szacza sie katalizator, przesacz odparowuje do su¬ cha i natychmiast przerabia dalej pozostalosc. 33. Z-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-OMe.Otrzymany w punkcie 32 ester metylowy trój- peptydu (5,4 g) i 4,5 g Z-Asn-ONP miesza sie w 20 ml dwumetyloformamidu w ciagu 20 godzin w tem¬ peraturze pokojowej, po czym za pomoca dodania mieszaniny eteru z heksanem wytraca sie pochod¬ na peptydowa, odsacza i wymywa eterem az do za¬ niku nitrofenolu. Produkt oczyszczony po ponow¬ nym wytraceniu z dwumetyloformamidu-eteru jest chromatograficznie jednorodny (w chromatografii cienkowarstwowej). 34. Z-Asp-NH2/BOC/-Fen-His-NH-NH2. 3,94 g Z-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-OMe rozpu¬ szcza sie w 20 ml wrzacego metanolu. Do cieplego roztworu o temperaturze okolo 30° dodaje 2,5 ml wodzianu hydrazyny i pozostawia w ciagu 20 go¬ dzin w temperaturze pokojowej. Za pomoca doda¬ nia wody wytraca sie hydrazyd peptydu, odsacza i przemywa woda do zaniku hydrazyny. Produkt wytraca sie ponownie z dwumetyloformamidu-wo- dy.. Z-Tre/tBu/-Fen-Pro-OH. 4 g Z-Fen-Pro-OH rozpuszcza sie w metanolu- -iwodzie (4:1) i uwodornia w obecnosci palladowe¬ go wegla (10% Pd). Po zakonczeniu przyjmowania wodoru odsacza sie katalizator na nuczy, przesacz odparowuje do sucha i suszy pozostalosc (H-Fen- -Pro-OH), nastepnie do pozostalosci dodaje sie 1,1 g H-metylomorfoliny i tyle wody, aby produkt u- legl rozpuszczeniu. Roztwór rozciencza sie dwume- tyloformamidem tak, aby byl klarowny i ochladza do terriperatury —5°, po czym do roztworu doda¬ je sie mieszanego bezwodnika Z-Tre/tBu/-OH, któ¬ ry przygotowuje sie nastepujaco: 3,6 g Z-Tre/tBu/-OH rozpuszcza sie w 40 ml ab¬ solutnego czterowodorofuranu, dodaje 1,8 ml ab¬ solutnej trój etyloaminy i ochlodzony do tempera¬ tury —10° roztwór zadaje 1,7 g estru izobutylo- wego kwasu chloroweglowego. Po 5 minutach w temperaturze —10°, nie zwazajac na wydzielony chlorowodorek trójetyloaminy dodaje cala miesza¬ nine reakcyjna do powyzszego roztworu dwupep- tydu. Mieszanine pozostawia sie w ciagu godziny w temperaturze —5° i 18 godzin w temperaturze °. Po tyim odsacza od nierozpuszczalnych czesci, uwalnia eluat w prózni od czterowodorofuiranu i w wysokiej prózni od dwiimetyilofortmaimidu, a na¬ stepnie zadaje pozostalosc roztworem kwasnego weglanu sodu.Nierozpuszczalne czesci usuwa sie przez prze¬ mywanie eterem, wodna faza nawarstwia sie octa¬ nem etylu i zakwasza. Pochodna trójpeptydu za¬ daje sie octanem etylu i przemywa roztwór w oc¬ tanie etylu woda do reakcji obojetnej. Roztwór po wysuszeniu siarczanem sodu, odparowuje sie otrzymujac Z-TWltBu/-Fe^Plro-OH jako bezbarw¬ ny zywicowaty produkt, oczyszczany za pomoca kilkakrotnego wytracania z benzenu-eteru nafto¬ wego. 36. Z-Ilen-Gli-OMe. 2,23 g Z-Ilen-OH. dwucyklobeksyloaimoniowa sol zawiesza sie w octanie etylu i zakwasza 0,2 N roz¬ tworem kwasu cytrynowego. Otrzymany roztwór w octanie etylu wymywa sie do reakcji obojetnej, suszy i odparowuje do sucha. Pozostalosc rozpusz¬ cza sie w 15 ml acetonlltrylu, do roztworu dodaje 750 mg H-Gli-OMe'-HCl i w temperaturze 0°, mie- szajac, 0,84 ml trój etyloaminy. Po 10 minutach do¬ daje 1,24 g dwucykloheksylokarbodwuimidu i mie¬ sza w ciagu nocy w temperaturze 0°. Osad odsacza sie i przesacz odparowuje do sucha, pozostalosc rozpuszcza w 30 ml octanu etylu i odsacza. Roztwór w octanie etylu przemywa 0,2 N kwasem cytry¬ nowym i nasyconym roztworem kwasnego wegla¬ nu sodu, suszy i zageszcza pod obnizonym cisnie¬ niem do okolo 10 ml. Po dodaniu 25 ml heksanu wykrystalizowuje chroniony dwupeptyd o tempe- raturze topnienia 120—122°. Wykazujacy w chro- matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym w ukladzie chloroform-metanol (95 : 5). 37. H-Ilen-Gli-OMe. 3,36 g Z-Ilen-Gli-OMe rozpuszcza sie w 100 ml metanolu i 10 ml 1 N roztworu kwasu solnego i uwodornia w obecnosci 0,5 g palladowego wegla (10% Pd). Po odsaczeniu katalizatora odparowuje sie calkowicie rozpuszczalnik. Otrzymana piana jest jednorodna w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf = 0,26 w chloroformie- -metanolu (95 : 5). 38. Z-Ala-Ilen-Gli-OMe. 2,39 g powyzszego chlorowodorku estru dwupep- tydu i 3,78 g Z-Ala-ONP w 40 ml dwumetyloform- amidu zadaje sie, mieszajac, 1,4 ml trójetyloaminy i miesza powstala zawiesine w ciagu nocy w tem¬ peraturze pokojowej. Po rozcienczeniu octanem ety¬ lu plucze rozcienczonym roztworem weglanu po¬ tasu do zaniku nitrofenolu, nastepnie jeszcze 0,1 M kwasem cytrynowym i woda. Czesc pochodnej trój¬ peptydu nierozpuszczona w czasie wytrzasania, od¬ sacza sie i roztwór w octanie etylu po wysusze¬ niu odparowuje sie calkowicie. Pozostalosc jest równiez czystym produktem. Temperatura topnie- 40 nia 190—191°. W chromatogramie cienkowarstwo¬ wym na zelu krzemionkowym w ukladzie chloro¬ form-metanol (95 : 59) Rf = 0,5. 39. H-Ala-Ilen-Gli-OMe. 2,0 g Z-Ala-Ilen-Gli-OME rozpuszcza sie w 40 ml 45 metanolu przy slabym ogrzewaniu i uwodornia w obecnosci 300 mg palladowego wegla (10% Pd). Po zakonczonym uwodornieniu odsacza sie kataliza¬ tor i przesacz odparowuje calkowicie do sucha. Po¬ zostalosc jednorodna w chromatogramie cienko- 50 'warstwowym przerabia sie natychmiast dalej. 40. Z-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OME. 1,36 g powyzszego estru trójpeptydu i 2,6 g Z-Tre/tBu/-ONP miesza sie w 3 ml dwuHietyló- formamidu w ciagu 20 godzin- w temperaturze po- 55 kojowej. Pochodna tetra#eptydu wytraca sie ete¬ rem, odsacza i przemywa eterem do zaniku nitro¬ fenolu. Produkt oczyszcza sie przez ponowne wy¬ tracenie z dwumetyloformamidu-eteru. 41. H-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OMe. 60 5,66 g powyzszego zwiazku karbobenzoksy uwo¬ dornia sie w 50 ml dwumetyloformamidu w obec- - nosci 1 g palladowego wegla (10% Pd). Po odsa¬ czeniu katalizatora przez warstwe 2 g norytu (we¬ giel aktywny) odparowuje sie dwumetyloformamid 65 pcd wysoka próznia w temperaturze 40° i bezpo-21 staciowa pozostalosc przerabia dalej w surowym stanie. 42. H-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 4,3 g estru metylowego tetrapeptydu rozpuszcza sie w 43 ml metanolu lagodnie ogrzewajac. Po ochlodzeniu do temperatury 20° dodaje sie 12 ml 1 N roztworu lugu sodowego. Po 5, 10 i 15 minu¬ tach dodaje po 5 ml wody, a po 1 godzinie w tem¬ peraturze pokojowej dodaje sie 12 ml 1 N roztworu kiwasu solnego-, uwalnia od .metanolu pcd obnizo¬ nym cisnieniem i ekstrahuje n-butanolem. Roz¬ twór butanolowy przemywa woda do zaniku chlor¬ ku, po czyim bez suszenia odpaTowuje do sucha pod obnizonym cisnieniem. Pozostalosc bez dalszego o- czyszczania stosuje sie do nastepnego etapu. 43. Z-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH.Wyzej otrzymana. pochodna tetrapeptydu (4,2 g) miesza sie z 4,8 g Z-Gln-NH2-ONP i 1,35 ml trójety- loaminy w 30 ml dwumetyloformamidu w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej. Produkt wy¬ tracony za pomoca dodania eteru odsacza sie na nuczy i przemywa eterem do zaniku nitrofenolu, a nastepnie rozpuszcza w nasyconym woda n-buta- nolem i wytrzasa w temperaturze 0° z 1 N roztwo¬ rem kwasu solnego, po czym przemywa woda do zaniku chlorku i bez suszenia odparowuje pod ob¬ nizonym cisnieniem w temperaturze 40°. Przez po¬ nowne wytracenie z dwumetyloformamidu-eteru o- trzymuje sie czysty produkt. Po suszeniu w wy¬ sokiej prózni w temperaturze 40° nad pieciotlen¬ kiem fosforu przy potencjometrycznym miarecz¬ kowaniu 0,1 N roztworem NaOH w 80% metanolu otrzymany produkt wykazuje ciezar równowazni¬ kowy 693, z obliczenia 680. 44. H-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH-HCL. 3,40 g Z-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH roz¬ puszcza sie w 70 ml cieplego dwumetyloformami¬ du. Po oziebieniu do temperatury pokojowej do¬ daje 5 ml 1 N roztworu kiwasu solnego i 500 mg palladowego wegla (10% Pd) i uwodornia. Po skonczonym uwodornieniu odsacza sie katalizator na nuczy przez 1 g norytu i przesacz zateza pod wysoka próznia w temperaturze 40° do okolo 10 ml. Roztwór wkrapla sie do 100 ml eteru, odsacza wytracona substancje i plucze eterem. Produkt wy¬ suszony pod wysoka próznia w temperaturze po¬ kojowej wykazuje przy potencjometrycznym mia¬ reczkowaniu 0,1 N roztworem lugu sodowego w 80% metanolu zawartosc 91%. 45. Z-Tre/ tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala- -Ilen-Gli-OH. 2,8 g Z-Tre/tBu/-Fen-Pro-OH i 0,77 ml absolut¬ nej trójetyloaminy rozpuszcza sie w 30 ml suche¬ go czterowodorofuranu i ochlodzony do tempera¬ tury —10° roztwór zadaje kroplami 700 mg izobu- tylochloroweglanu, przy czym nalezy uwazac, aby nie przekroczyc temperatury —5°. Po tym pozo¬ stawia w ciagu 10 minut w temperaturze —10° i nastepnie dodaje oziebiony do temperatury ^20° roztwór 2,5 g H-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli- -OH*HCl w 65 ml dwumetyloformamidu-wody (9 :1), po czym dodaje kroplami 1,2 ml trójetylo- aminy i pozostawia w ciagu godziny w temperatu¬ rze —10° i 18 godzin w temperaturze 0°. Z kolei 92914 ti£ 40 50 55 W temperaturze lazni 40° do objetosci okolo 15 mf i wytraca przez dodanie 100 ml lodowato zimnego 2% kwasu octowego. Odsacza sie na nuczy, plucze woda lodowata, suszy i wytraca dla oczyszczenia dwa razy z metanolu-wody, wydajnosc 3,9 g po¬ chodnej oktapeptydu. 46. H-Tre/ tBu/-Fen-Pro-Gln NH2-Tre/ tBu/-Ala- -Ilen-Gli-OH. 3,6 g otrzymanego w punkcie 45 Z-Tre/tBu/-Fen- -Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH rozpuszcza sie w 100 ml 80% kwasu octowego i uwodornia roz¬ twór w obecnosci 0,5 g palladowego wegla (10% Pd). Po zakonczeniu przyjmowania wodoru odsacza na nuczy katalizator i odparowuje roztwór do su¬ cha. Otrzymany bezbarwny firn soli kwasu octowe¬ go pochodnej oktapeptydu suszy sie w wysokiej prózni. 47. Z-Asp-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen- -Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-ÓH. 1,60 g Z-Aisip-1NH2-Liz/BOC/Fen-His-hydrazyd za¬ daje sie 25 ml dwumetyloformamidu, oziebia do temperatury —20°, dodaje 4 ml 2,5 N roztworu wodnego kwasu solnego i miesza w temperaturze —20° az do calkowitego rozpuszczenia hydrazydu.Nastepnie wkrapla sie 2,0 ml 1,0 N roztworu azo¬ tynu sodu, ogrzewa mieszanine reakcyjna do —10° i pozostawia w ciagu 20 minut w temperaturze —10°. Nastepnie dodaje ochlodzony do tempera¬ tury -10° roztwór 1,5 g H-Tr/tBu/-Ala-Ilen-Gli- -OH. w postaci soli kwasu octowego w 25 ml 80% dwumetyloformamidu i 1,11 g N-metylomorfoliny.Mieszanine reakcyjna zostawia w ciagu 16 godzin w temperaturze 0°, po czym zateza w wysokiej prózni do objetosci okolo 8 ml i wytraca lodowato zimnym 1% kwasu octowego. Po odsaczeniu i wy¬ suszeniu w eksykatorze prózniowym, surowy pro¬ dukt w celu oczyszczenia wytrafca sie dwukrotnie z dwuimietyftoforinaimidu — octanu etylu. Wydaj¬ nosc ctoronionegio dodekaipeptydiU wynosi 2,1 g. 48. H-Asp-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ tBu/-Fen -Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 1,85 g powyzszego chronionego dodekapeptydu rozpuszcza sie w 50 ml 90% kwasu octowego i u- wodornia w obecnosci 0,4 g palladowego wegla (10% Pd), jak zwykle. Po odparowaniu roztworu i wysuszeniu w wysokiej prózni pozostala sól kwa¬ su octowego H-Asp-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ /tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH przerabia sie bez dalszego oczyszczania. 49. Z-Tre/tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp /OtBu/-Fen-Asp-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ tBu/- -Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 2,30 g Z-Tre/ tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2- -Asp/OtBu/-Fen-NH-NH2 rozpuszcza sie w 35 ml dwumetyloformamidu i wkrapla do ochlodzonego do temperatury —20° roztworu 3,5 ml 3 N roztwo¬ ru wodnego kwasu solnego. Po tym dodaje 2,7 ml 0,9 N roztworu azotynu sodu i pozostawia miesza¬ nine reakcyjna w ciagu 20 minut w temperaturze —10°. Nastepnie wkrapla sie oziebiony do tempera¬ tury —10° roztwór 1,72 g H-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen- -His-Tre/ tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala- -Ilen-Gli-OH. (sól kwasu octowego) w 30 ml 90% dwumetyloformamidu i 1,0 g N-metylomorfoliny, zageszcza sie w prózni, potem w wysokiej prózni 65 po czym mieszanine utrzymuje sie w ciagu 18 go-23 92914 24 dzin w temperaturze 0°, zageszcza w wysokiej próz¬ ni do konsystencji oleistej i wytraca produkt za pomoca dodania 100 ml lodowato zimnego 2°/t kwa¬ su cytrynowego. Osad rozciera sie dokladnie, od¬ wirowuje, przemywa 4 razy malymi porcjami wg- s dy lodowatej i suszy w eksykatorze prózniowym nad stalym wodorotlenkiem sodu. W celu oczysz¬ czenia produkt rozpuszcza sie kilkakrotnie wytraca z mieszaniny dwumetyloformamidu — octanu etylu. 50. Z-Ala-Pro-NH2. 10 2,28 g H-Pro-NH2 i 7,57 g Z-Ala-ONP rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu i pozostawia zólty roztwór w ciagu 18 godzin w temperaturze pokojowej, po czym odparowuje sie w wysokiej prózni do sucha, a pozostalosc zadaje octanem ety- 15 lu i powstaly proszek dokladnie rozciera. Po od¬ saczeniu i wysuszeniu otrzymuje sie 5,5 g Z-Ala- -Pro-NH2 o temperaturze topnienia 164—165°. 51. Z-Gli-Ala-Pro-NHa. ,1 g powyzszej pochodnej dwupeptydu rozpusz- 20 cza sie ogrzewajac w 200 ml wstepnie uwodornio¬ nej mieszaniny Ill-rzed.-butanolu-wody (9:1). O- ziebiony do temperatury pokojowej roztwór uwo¬ dornia sie w obecnosci 1 g palladowego wegla (10*/* Pd). Po zakonczeniu uwodornienia roztwór odparo- 25 wuje sie natychmiast w temperaturze lazni 30° i pod cisnieniem 0,01 tor odparowuje do sucha, po¬ zostalosc H-Ala-Pro-NH2 rozpuszcza w 300 ml ozie¬ bionego do temperatury —20° dwumetyloformami¬ du i dodaje roztworu mieszanego bezwodnika Z-Gli- 30 -OH przygotowanego jak nastepuje: 3,7 g Z-Gli- -OH i 2,65 ml absolutnej trójetyloaminy rozpusz¬ cza sie w 25 ml absolutnego czterowodorofuranu i wkrapla do oziebionego do temperatury —10° roz¬ tworu 1,85 g esitru etylowego kwasu chlorowegio- *5- wego mieszajac i chlodzac w ten sposób, aby nie przekroczyc temperatury —5°, po czym ochladza do temperatury —10°, zostawia w przeciagu 5 mi¬ nut i dodaje mieszanine, nie zwazajac na wydzie¬ lony chlorowodorek trójetyloaminy, do powyzszego *o roztworu H-Aila-IPro-NHf. Po 1 godzinie w jtempe- ra/tutrze —10° i po 18 godzinach w teiniperaitiurae 0° roztwór odsacza sie i odparowuje przesacz w prózni i potem w wysokiej prózni do sucha.Nastepnie dodaje 1 litr chloroformu, odsacza od 45 chlorowodorku trójetyloaminy, plucze roztwór chlo¬ roformowy 2 razy 20 ml pólnasyconego roztworu soli kuchennej, suszy siarczanem sodu i odparo¬ wuje. Otnzyimana pochodna trój(peiptydu w chiroma- itograifiii cienkowarstwowej na zelu krzemionko- » wym Rf=0,58 ( w metanolu). 52. H-Gli-Ala-Pro-NH2. 3,8 g otrzymanej w punkcie 51 surowej pochodnej trójpeptydu uwodornia sie, wedlug sposobu podob¬ nego w punkcie 51. Po odsaczeniu i usunieciu ka- 55 talizatora, odparowaniu rozpuszczalników otrzymu¬ je sie 2,2 g produktu, który w chromatografii cien¬ kowarstwowej na zelu krzemionkowym w meta¬ nolu wykazuje wartosc Rf=0,15. 53. Z-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2. «° Otrzymany w punkcie 52 surowy amid trójpepty¬ du rozpuszcza sie w 30 ml dwumetyloformamidu i do roztworu dodaje 4,1 g estru Z-Wal-p-nitrofe- nylu i pozostawia na 18 godzin w temperaturze pokojowej, po czym odparowuje zólty roztwór do « sucl^a, pozostalosc zadaje octanem etylu, rozciera, odsacza i galaretowaty proszek rozpuszcza w 2 li¬ trach chloroformu, plucze roztwór 2 razy po 20 ml % roztworu kwasu cytrynowego i 2 razy pólna- syconym roztworem soli kuchennej i roztwór chlo¬ roformowy suszy siarczanem sodu a nastepnie od- pairowiuje. Pozostalosc po odparowaniu zadaje, 0- grzewajac, 100 ml octanu etylu i po odstaniu w temperaturze 0° odsacza wydzielona pochodna te- traipepitydu jako staly proszek o temperaturze top¬ nienia 205—210°, wartosc Rf na zelu krzemionko¬ wym=0,80 w ukladzie chlorotform-anetanol (1:1). 54. H-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2. 1,1 g Z-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 rozpuszcza sie w 50 ml dwumetyloformamidu i uwodornia roztwór w obecnosci 0,3 g palladowego wegla (lOtyo Pd). Po zakonczeniu przyjmowania wodoru odsacza sie ka¬ talizator po czym odparowuje roztwór i pozosta¬ losc suszy pod wysoka próznia w temperaturze lazni 35°. Otrzymuje sie tetrapeptyd H-Wal-Gli- -Ala-Pro-NH2 jako bezbarwna substancje, wartosc Rf=0,20 (plytki z zelem krzemionkowym, uklad chloroform-metanol: 1:1). 55. Z-Tre/ tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp /OtBu/-Fen-Asp-Liz/ BOC)-Fen-His-Tre/ tBu/-Fen- -Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal-Gli -Ala- -Pro-NH2. 800 mg Z-Tre/ tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2- -Asp/OtBu/-Asp-NH2/ BOC/-Fen-His-Try/tBu/-fen- -Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ile-Gli-OH, 510 mg H-Wal-Gli-A\a-Pro-NH2 i 120 mg N-hydroksybur- sztynoimidu rozpuszcza sie w 9 ml dwumetyloform¬ amidu mieszajac w temperaturze 45° a nastepnie zadaje 120 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu.Mieszanine reakcyjna miesza sie w temperaturze 45° lacznie 12 godzin, przy czym po 3 i 7 godzi¬ nach dodaje jeszcze po 20 mg dwucykloheksylo- kavbodwuimddu i 20 mg N-hydrcfcsybursizttynoimi- du, po czym wlewa do 200 eteru i odsacza subtel¬ ny osad. Dla oczyszczenia poddaje sie produkt eks¬ trakcji przeciwpradowej w ukladzie metanol-bufor- -chloroform-czterochlorek wegla (10:3:5:6) sto¬ sujac roztwór buforowy jak podano w punkcie 18). 56. H-Tre/ tBu/-Tyr/ tBu/-Tre /tBu/-Gln-NH2- -Asp/ OtBu/-Fen-Asp-NH2-Liz/ BOC/-fen-His-Tre/ tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal- -Gli-Ala-Pro-NH2. 227 mg otrzymanego w punkcie 55 chronionego dokozapeptydoamidu rozpuszcza sie w 10 ml 90°/o kwasu octowego i uwodornia roztwór w obecnosci 100 mg palladowego wegla (10i°/o Pd), mieszajac in¬ tensywnie. Po zakonczeniu przyjmowania wodo¬ ru odsacza sie katalizator i-przesacz odparowuje do sucha. Pozostalosc rozpuszcza sie w nasyconym woda n-butanolu — wytrzasa trzykrotnie z maly¬ mi porcjami 5*/o roztworu weglanu sodu i 2 razy z mala iloscia wody, a nastepnie roztwór butano¬ lu bez poprzedniego suszenia odparowuje pod wy¬ soka próznia w temperaturze lazni 35° i suszy po¬ zostalosc pod wysoka próznia. Otrzymuje sie 185 mg zdekarbobenzoksylowanego dokozapeptydu ja¬ ko bezbarwna zywice. 57. Wytwarzanie pochodnej peptydu o wzorze 6. 181 mg pochodnej peptydu o wzorze 7, 288 mg H-tyr/ tBu/-Tyr-/ tBuMr/ tBu/-Gln-Asp/OtBu/-Fe-92914 -Asn-Liz/ BOC/-Fe-His-tr/ tBu/-Fe-Pro-Gln-tr/tBu/ -Ala-Ile-Gli-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 i 23 mg N-hy- droksybursztynoimidu, ogrzewajac rozpuszcza sie w 2 ml absolutnego dwumetyloformamidu i po o- chlodzeniu do temperatury pokojowej dodaje 31 mg s dwucykloheksylokarbodwuimidu. Nastepnie opluku- je naczynko azotem, zamyka i pozostawia na okres godzin w temperaturze 45°.Otrzymany krystaliczny dwucykloheksylomocznik odsacza sie, przemywa dwa razy po 0,5 ml dwu- 10 metyloformamidu, zateza przesacz w wysokiej próz¬ ni do polowy objetosci i wytraca surowy produkt przez dodanie 20 ml benzenu i 120 ml eteru nafto¬ wego. Dla oczyszczenia wytraca sie go jeszcze raz z metanolu-benzenu-heksanu, odsacza i suszy w 15 temperaturze 45° do stalej wagi. W ten sposób otrzymuje sie chroniony dotriakontapeptyd jako bezpostaciowy proszek, który wykazuje w,, chroma¬ tografii cienkowarstwowej plame glówna i rózne produkty uboczne. W tym stanie moze byc zasto- 20 sowany do odszczepienia grup ochronnych.Przykl.ad II. Sposób wytwarzania Kalcytoni- ny M o wzorze 5. 23 mg pochodnej peptydu o wzorze 6 zalewa sie w temperaturze 0° 0,6 ml stezonego kwasu solne- 25 go, plucze naczynie azotem, zamyka i w tempera¬ turze 0° miesza w ciagu 10 minut, nastepnie roz¬ twór oziebia sie do okolo —60° i zageszcza pod wysoka próznia podnoszac powoli temperature do 0°, do konsystencji syropu. Po dodaniu 0,4 ml wo- 30 dy liofilizuje, rozpuszcza pozostalosc w 0,2 ml 0,1 N kwasu octowego i przesacza dla przemiany w octan przez kolumne (0=6 mm, 1 = 100 mm) slabo za¬ sadowego wymieniacza jonowego (na przyklad Merck nr II), zrównowazonego 0,1 N kwasem oc- 35 towym. Eluat zateza sie do objetosci 0,5 ml, liofili¬ zuje, dosusza w temperaturze 40° w wysokiej próz¬ ni i wreszcie równowazny wilgocia powietrza przez pozostawienie, w otwartym naczyniu.W ten sposób otrzymuje sie octan Kalcytoniny M 40 jako bialy, rozpuszczalny w wodzie proszek. Sto¬ sowany jako substancja wyjsciowa chroniony do¬ triakontapeptyd mozna otrzymac w nastepujacy sposób: 1. H-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe. 45 2,0 g Z-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe, (o temperaturze topnienia 158—159° po przekrystalizowaniu z me¬ tanolu-wody), rozpuszcza sie ogrzewajac w 20 ml metanolu i uwodornia przy pomocy 200 mg palla¬ dowego wegla (IW* Pd) jako katalizatora az do »o zakonczenia przyjmowania wodoru. Katalizator od¬ sacza sie, przesacz odparowuje w temperaturze laz¬ ni 40° do sucha, otrzymujac ester metylowy trój- peptydu bezposrednio w czystej postaci krysta¬ licznej. Wydajnosc 1,34 g, o temperaturze topnie- 55 nia 138—139°). Produkt mozna ewentualnie prze- krys/taiizowac z metanolu-octanu etyfliu. Rf = 0,22 (na zelu kraemfionkowyim). 2. BOC-Cys/Tri/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe. ,7 g H-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe, 9,2 g BOC-Cys/ *° /TRI/-OH i 4,16 g N-hydroksyimidu kwasu bur¬ sztynowego rozpuszcza sie w 200 ml dwumetylo¬ formamidu, ochladza do temperatury 0° i miesza¬ jac zadaje 5,57 g dwucykloheksylokarbodwuimidu w postaci stalej, miesza jeszcze w ciagu godziny 65 w temperaturze 0°, pozostawia w ciagu nocy w temperaturze okolo 20°, zateza pod wysoka próznia do objetosci okolo 100 ml i odsacza wydzielony dwucykloheksylomocznik. Przesacz odparowuje sie w wysokiej prózni az do powstania kleistej masy i rozpuszcza w 200 ml n-butanolu, po czym plucze kolejno woda, 5#/o roztworem kwasu winowego, 1 N kwasnym weglanem sodu i znowu woda. Roz¬ twór zateza sie do objetosci okolo 50 ml i wytra¬ ca pochodna tetrapeptydu przez dodanie 300 ml eteru naftowego, który oczyszcza sie przez ponow¬ ne wytracenie z dwumetyloformamidu-wody i z mieszaniny metanolu-octanu etylu-eteru nafto¬ wego. Otrzymuje sie pochodna tetrapeptydu jako bezpostaciowy proszek o temperaturze topnienia 145—148°, wykazujacy w chromatogramie cienko^ warstwowym na zelu krzemionkowym nastepujace wartosci wspólczynnika Rf: Rf 115 = 0,68, Rf (ace¬ ton) = 0,59, Rf (chloroform-metanol 8:2) = 0,60. 3. BOC-Cys/TRI/-GU-Asp-NH2-Leu-NH-NH2 2,7 g BOC-Cys/TRI/-Gn-Asp-NH2-Leu-OMe roz¬ puszcza sie w 22 ml metanolu, ochladza do tem¬ peratury 0° i dodaje 2,2 ml wodzianu hydrazyny i utrzymuje roztwór w ciagu 30 minut w tempera¬ turze 0°, po czym pozostawia na kilkanascie godzin w temperaturze 20°, a nastepnie ochladza do tem¬ peratury 0° i zadaje 102 ml 3'/o lodowato zimnego kwasu octowego. Wytracony osad po dokladnym zhomogenizowaniu, odsacza sie i przemywa lodo¬ wato zimnym 3P/o kwasem octowym do ujemnej reakcji folinowej cieczy przemywajacej i nastep¬ nie suszy. Otrzymuje sie 2,2 g chromatograficznie czystego hydrazydu tetrapeptydu o temperaturze rozkladu okolo 195°, wykazujacego w chromato¬ gramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym nastepujace wartosci Rf: Rf (chloroform-metanol 8:2) = 0,30, Rf (aceton-metanol 9:1) = 0,53. 4. BOC-Met-Leu-Gli-OMe. 6,72 g Z-Leu-Gli-Ome uwodornia sie w 50 ml metanolu przy pomocy 500 mg palladowego wegla (10*/oPd ) az do zakonczenia przyjmowania wodoru.Roztwór odsacza od katalizatora, przesacz zageszcza pod obnizonym cisnieniem do objetosci okolo 10 ml, rozciencza 30 ml dwumetyloformamidu zageszcza ponownie pod obnizonym cisnieniem do objetosci okolo 20 ml i przy chlodzeniu lodem zadaje 7,7 g BOC-Met-OCP, po czym utrzymuje klarowny roz¬ twór w ciagu 6 godzin w temperaturze 20°, a na¬ stepnie odparowuje rozpuszczalnik pod wysoka próznia.Oleista pozostalosc rozpuszcza sie w octanie ety¬ lu i przemywa kolejno w temperaturze 0° 5Vo roz¬ tworem potasu, 0,2 N kwasem solnym i w koncu woda, faze organiczna suszy siarczanem sodu i od¬ parowuje do sucha. Oleista pozostalosc krystalizu¬ je sie z benzenu-eteru naftowego/ temperatura topnienia 126—127°; na zelu krzemionkowym Rf 43C = 0,66; Rif (itioluen-acetom 1-: 1) = 0,58.. H-Met-Leu-Gli-OMe. chlorowodorek. 3,24 BOC-Met-Leu-Gli-OMe. rozpuszcza sie w 13 ml 3,8 N chlorowodoru w octanie etylu i pozosta¬ wia w ciagu 30 minut w temperaturze 20°. Przez dodanie 100 ml eteru naftowego wytraca sie chlo¬ rowodorek estru trójpeptydu w postaci kleistej ma¬ sy i dekantuje znajdujacy sie nad nim roztwór. Pott *mt i* roztarciu z 100 ml eteru wolnego od nadtlenków w temperaturze 0° otrzymuje sie drobnoproszko- wy produkt, który odsacza sie i suszy w eksykato- rze nad wodorotlenkiem potasu, w temperaturze pokojowej do stalej wagi. Otrzymany bezposta¬ ciowy i silnie hydroskopijny zwiazek jest chroma¬ tograficznie czysty. Wykazuje na zelu krzemionko¬ wym nastepujace wartosci Rf: Rf 43C = 0,48; Rf (toluen-aceton 1:1) — 0,35. 6. TRI-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OMe. 3,22 g TRI-Cys/TRI/-OH • 1,97 g H-Met-Leu-Gli- -OMe • HCL i 0,74 ml trój etyloaminy rozpuszcza sie w 32 ml acetonitrylu i dodaje 1,54 g dwucyklo- heksylokarbodwuimidu w postaci stalej. Klarow¬ ny z poczatku roztwór, z którego wydziela sie dwu- cykloneksylomocznik, pozostawia sie na okres 16 godzin w temperaturze 20°, nastepnie ochladza do temperatury 0°, dodaje 100 ml wody, homogenizuje i odsacza bialy osad. Osad przemywa sie woda, su¬ szy i w ciagu 5 minut rozciera dokladnie w tem¬ peraturze 40° z 50 ml octanu etylu.Nierozpuszczalny dwucykloheksylomocznik odsa¬ cza sie w temperaturze pokojowej i przemywa 20 ml octanu etylu. Z przesaczu wytraca sie pochod¬ na tetrapeptydu za pomoca dodania 300 ml eteru naftowego otrzymujac galaretowaty osad, który odsacza sie i suszy. Po ponownym wytraceniu su¬ rowego produktu z mieszaniny metanolu-octanu etylu-eteru naftowego otrzymuje sie chromatogra¬ ficznie jednorodny produkt o temperaturze topnie¬ nia okolo 215°, wykazujacy w chromatogramie na zelu krzemionkowym nastepujace wartosci wspól¬ czynnika Rf: w ukladzie chloroform-metanol (97 : 3) Rf = 0,57; w octanie n-butylu Rf = 0,51. 7. H-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OMe. octan.Do roztworu 1,862 g TRI-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli- -OMe w 16 ml lodowatego kwasu octowego wkra- pla sie 4 ml wody w ten sposób, aby utworzony osad za kazdym razem ulegal rozpuszczeniu. Kla¬ rowny roztwór miesza sie w temperaturze pokojo¬ wej w ciagu godziny, po czym w temperaturze 0° dodaje sie 12 ml wody i otrzymany osad odsacza, przemywa zimnym 50Vo kwasem octowym i za¬ geszcza pod wysoka próznia w temperaturze 30° do powstania oleju, który rozciera sie z woda i liofi¬ lizuje. Otrzymany bialy proszek po wysuszeniu w ciagu 15 godzin nad wodorotlenkiem potasu w wy¬ sokiej prózni, jest produktem jednorodnym co stwierdzono chromatogramem cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym. W toluenie-acetonie (7 : : 3) Rf = 0,28; w chloroformie-metanolu (95 : 5) Rf = 0,48. 8. DPC-Ser/ tBu/-Tre/ tBu/-Cys/ TRI/-Met-Leu- -Gli-OMe. 2,284 g DPC-Ser/tBu/-Tre/ tBu/-NH-NH2 (wedlug przykladu I, pod 1) w 15 ml dwumetyloformamidu zadaje sie w temperaturze —20° 6,5 ml 1,53 N chlorowodoru w octanie etylu i 0,51 ml III-rzed. azotynu butylu, po czym miesza w ciagu 15 minut w temperaturze —10°. Po dodaniu 1,4 ml trój etylo¬ aminy wkrapla sie oziebiony do temperatury —10° roztowór 1,406 g N-Cys/TRI/^Met-Leu-Gli OMe. oc¬ tanu w 10 ml dwumetyloformamidu, pH roztworu reakcyjnego wynosi wtedy okolo 5. Za pomoca do¬ dania 2 kropli trójetyloaminy w dwumetyloform- amidzie (2,8 ml trój etyloaminy dopelnione do 1(7 ml dwumetyloformamidem), roztwór doprowadza sie do wartosci pH 7—8, po 5, 10 i 20 minutach podwyizsza znów wartosc pH kazdorazowo dwo¬ ma kroplami roztworu trój etyloaminy do wartosci pH 7—8. Potem wartosc ta pozostaje stala.Roztwór reakcyjny pozostawia w ciagu godziny w temperaturze —10° i 15 godzin w temperaturze 0°. Nastepnie odsacza wydzielony chlorowodorek trój etyloaminy i odporowuje przesacz w tempera¬ turze 30° pod wysoka próznia do powstania oleju, który rozciera sie z woda otrzymujac proszek. Pro¬ szek przemywa sie woda, nastepnie rozciera wo¬ da i liofilizuje. Po dwukrotnym roztarciu z 10 ml benzenu-eteru naftowego (1: 2) otrzymuje sie czy¬ sta pochodna heksapeptydu, wykazujaca w chro¬ matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym w toluenie-acetonie (7:3) Rf = 0,42. 8a. DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-OH. ,7 g DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-NH-NH2 w 50 ml dwumetyloformamidu zadaje sie w temperaturze —15° 16,35 ml 1,53 N chlorowodoru w octanie etylu i 1,4 ml III-rzed. azotynu butylu i pozostawia w ciagu 15 minut w temperaturze —10°. Po dodaniu 3,5 ml trójetyloaminy wkrapla sie oziebiony do temperatury -10° 3,63 g H-Cys/TRI/-OH i 1,4 ml itróóietytaiminy w 40 ml dwumeityloformaimidu i 16 ml wody, miesza w ciagu godziny w temperaturze —10° i pozostawia w ciagu 15 godzin w tempera¬ turze 0°.Klarowny roztwór odparowuje sie pod wysoka próznia w temperaturze 40°, pozostalosc zadaje oc¬ tanem etylu i woda i plucze faze organiczna 50*/o nasyconym roztworem soli kuchennej. Otrzymany po odparowaniu olej rozpuszcza sie w malej ilosci octanu etylu i mieszajac wkrapla w temperaturze 0° do 300 ml eteru naftowego. Produkt wytraca sie jako slalbo zólty proszek, wykazujacym w chro¬ matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym w ukladzie chloroform-metanol (7:3) Rf = 0,62. 8b. H-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-OH. 909 mg DPC-Ser-/tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-OHroz¬ puszcza sie w 10 ml chlorku metylenu, dodaje 12 ml kwasu monochlorooctowego w wodzie (75 g kwasu chlorooctowego i 25 ml wody) i w tempera¬ turze pokojowej miesza w ciagu 15 minut. Roz¬ twór ochladza sie nastepnie do temperatury 0°, do¬ daje 50 ml wody i doprowadza wartosc pH do 6,5 stezonym amoniakiem, wytracajac produkt jako olej. Olej rozciera sie jeszcze 2 razy woda, zadaje III-rzed. butanolem i liofilizuje. Przez rozcieranie liofilizatu z eterem naftowym otrzymuje sie jed¬ norodny produkt, wykazujacy w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym w ukladzie cMorctfoimnmeitainol (1:1) Rf=0,40; w me¬ tanolu Rf = 0,50. 9. H-Ser/ tBu/-Tre/ tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli- -OMe. 2 g DPC-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys/ TRI/-Met-Leu- -Oli-OMe rozpuszcza sie w temperatuirze 45° w 40 ml 80% kwasu octowego lodowatego, po czym po¬ zostawia na okres 1 godziny w temperaturze 45°.Nastepnie roztwór zateza sie w prózni do objetosci okolo 10 ml i liofilizuje. Pozostalosc w celu calko- 40 50 50 55 6029 92914 witego usuniecia kwasu octowego rozpuszcza sie w 15 ml III-rzed. butanolu i 1,5 ml wody i ponow¬ nie liofilizuje. Otrzymuje sie proszkowata pozo¬ stalosc, która rozpuszcza sie w 5 ml metanolu i 20 ml octanu etylu i powolnie wytraca przez dodanie 150 ml eteru naftowego. Po pozostawieniu w ciagu krótkiego czasu w temperaturze 0° odsacza sie, prze¬ mywa eterem naftowym i suszy. Otrzymuje sie bezpostaciowy proszek o temperaturze topnienia 180°, zawierajacy jako jedyne zanieczyszczenie tyl¬ ko slady 2-/p-bifenylilo/-propanol-2. Heksapeptyd w tej postaci przerabia sie dalej. W chromatogra- mie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym wykazuje on nastepujace.wartosci Rf: w ukladzie chloroform-aceton (1:1) Rf = 0,48; w ukladzie chloroform-metanol (9:1) Rf = 0,54; w ukladzie toluen-aceton (1 :1 Rf = 0,49.. H-Ser/tBu/-Tre/ tBu/-Cys/ TRI/-Met-Leu-Gli- -OH. 1,4 g estru metylowego heksapeptydu otrzyma¬ nego jak pod 9, rozpuszcza sie w temperaturze 45° w 16 ml 90% metanolu, schladza do 20° (przy czym peptyd czesciowo znów sie wytraca) i dodaje 4,32 ml 1 N lugu sodowego. Suspensje miesza sie w ciagu 25 minut w temperaturze 22° (po okolo 15 minutach rozpuszcza sie wszystkie klarownie) i wy¬ traca wtedy heksapeptyd przez dodanie 4,32 ml L N kwasu solnego i 30 ml wody jako drobnoklacz- kowaty osad. Pozostawia jeszcze w ciagu 15 minut w temperaturze 0°, odsacza i przemywa woda az do usuniecia jonów chlorkowych.Po wysuszeniu nad wodorotlenkiem potasu i pie¬ ciotlenkiem fosforu otrzymuje sie 1,3 g surowego produktu, który dla oczyszczenia homogenizuje sie w ciagu 5 minut w temperaturze 80° mieszanina ml dwumetyloformamidu i 60 ml benzenu i wy¬ traca przez dodanie 120 ml eteru naftowego. Po odstaniu w ciagu 10 minut w temperaturze 0° od¬ sacza sie, przemywa benzenem i eterem naftowym i suszy. Otrzymana w ten sposób chromatograficz¬ nie czysta pochodna heksapeptydu wykazuje tem¬ perature rozkladu okolo 210° i jest trudno rozpusz¬ czalna w wielu rozpuszczalnikach. W chromatogra¬ fii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym Rf 45 = 0,39; Rf 52 = 0,77; Rf 100 = 0,47. 11. BOC-Cys/ TRI/-Gli-Asp NH2-Leu-Ser/ tBu/- -Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH. 1,04 g BOC-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH-NH2 rozpuszcza sie w 8 ml absolutnego dwumetyloform¬ amidu, oziebia do temperatury —25° i wkrapla do tego powoli 0,92 ml 3,6 N kwasu solnego w dio¬ ksanie, potem 0,179 ml III-rzed. azotynu butylu.Mieszanine te miesza sie w ciagu 15 minut w tem¬ peraturze —10°, schladza do temperatury —15° i wkrapla do oziebionego do temperatury —15° roz¬ tworu 878 mg N-Ser/tBu/-Tre(tBu/-Cys-/TRI/-Met- -Leu-Gli-OH i 0,588 ml trójetyloaminy w 12 ml absolutnego dwumetyloformamidu. Miesza sie w ciagu okolo 10 minut w temperaturze —10° i 3 go¬ dziny w temperaturze 0°. Dla utrzymania slabo za¬ sadowej reakcji (pH okolo 8) dodaje sie poczatko¬ wo jeszcze 2 razy po 0,065 ml trójetyloaminy. Mie¬ szanine pozostawia w ciagu 15 godzin w tempera¬ turze 0° i zateza w wysokiej prózni do brejowa- tej konsystencji. Przez dodanie 50 ml metanolu wytraca sie pochodna dekapeptydu. Substancje ogrzewa sie w ciagu 5 minut do temperatury 40°, pozostawia na 10 minut w temperaturze 0°, odsa¬ cza i przemywa osad 20 ml metanolu. Przy susze- niu w wysokiej prózni nad wodorotlenkiem potasu i pieciotlenkiem fosforu otrzymuje sie czysta po¬ chodna dekapeptydu o nie ostrej temperaturze roz¬ kladu okolo 220—230°. Wykazuje ona w chromato¬ gramie cienkowarstwowym na zelu krzemionko¬ wym nastepujace wartosci Rf: w ukladzie chloroform-metanol (8 : 2) Rf = 0,28/ w ukladzie70 Rf = 0,55; w ukladzie104' Rf = 0,75; w ukladzie 121A Rf = 0,59. 12. Wytwarzanie pochodnej peptydu o wzorze 7. 1,7 g BOC-Cys/TRI/-Gli-Asp NH2-Leu-Ser/tBu/- .-Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-ÓH rozpuszcza sie w 170 ml goracego dwumetyloformamidu i po ochlodzeniu do temperatury pokojowej i do inten¬ sywnie mieszanego roztworu wkrapla sie w ciagu godziny 2,5 g jodu w 500 ml metanolu, miesza jesz¬ cze 1 godzine i oziebiony do temperatury 0° roz¬ twór odbarwia 1 N tiosiarczanem sodu, prawie cal¬ kowicie. Po zageszczeniu roztworu w prózni i wre¬ szcie w wysokiej prózni w temperaturze 40° do okolo 100 ml dodaje sie eteru, wydzielajac calkowi¬ cie produkt w postaci szybko zestalajacego sie ole¬ ju.Po zdekantowaniu roztworu eterowego pozosta¬ losc suszy sie, krótko pod obnizonym cisnieniem a nastepnie rozciera z woda. Wytracona pochodna dekapeptydu odsacza sie, przemywa woda i suszy w celu dalszego oczyszczenia rozpuszcza sie w 25 ml chloroformu, a po odsaczeniu niewielkiej ilos¬ ci nierozpuszczalnej substancji, zateza przesacz do polowy objetosci i produkt wytraca heksanem.Otrzymujac czysta pochodna dekapeptydu, wyka¬ zujaca w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf = 0,48. 13. Z-Asp/OtBu/-Fen-OCH8. ,3 g Z-Asp/OtBu/-ONP i 18,3 g H-Fen-OCHs • • HC1 rozpuszcza sie w 150 ml dwumetyloformami¬ du, po czym do otrzymanego klarownego roztworu wkrapla 11,8 ml trójetyloaminy. Powstaja zawie¬ sine miesza sie w ciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej, przy czym zabarwia sie ona na kolor ciemnozólty.. Nastepnie mieszanine reakcyjna za¬ geszcza sie pod obnizonym cisnieniem do okolo 100 ml i wytrzasa z 1 litrem mieszaniny octanu etylu-chloroformu (4:1), 3 razy z 5 trynowym, 19 razy z okolo 2 N roztworem wegla¬ nu sodu i nasyconym roztworem soli kuchennej do reakcji obojetnej.Produkt surowy w postaci zóltego oleju, rozpusz¬ cza sie w eterze i odbarwia weglem aktywnym, a po zaszczepieniu krystalizuje z 650 ml eteru-he- ksanu (1:1) w lodówce. Otrzymuje sie produkt w postaci bezbarwnych igiel o temperaturze topnie¬ nia 74,5—76,5°, wykazujacy f chromatogramie cien-, kowarstwowym na zelu krzemionkowym wartosc w ukladzie chloroform-metanol (95 :5) Rf = 0,74; w ukladzie chloroform-aceton (75:25) Rf = 0,65. 14. H-Asp/tBu/-Fen-OCH8. 48,6 g Z-Asp/OtBu/-Fen-OCH8 w 700 ml meta¬ nolu po dodaniu 33,5 ml 3 N chlorowodoru w dio- 40 45 50 5531 ksanie i 5 g 10°/o katalizatora palladowego na we¬ glu dekarbobenzoksyluje sie w temperaturze poko¬ jowej na wstrzasarce. Po zakonczeniu przyjmowa¬ nia wodoru mieszanine poreakcyjna odsacza sie i odparowuje. Otrzymuje sie 38,7 g bialej piany.W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym w ukladzie chloroform-metanol (9:1 Rf = 0,60; w chloroformie-acetonie (1:1) Rf = 0,58; Rf 102 E = 0,42. Produkt stosuje sie bez dalszego oczyszczania do dalszej kondensacji.. Z-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-CHs. 38,6 g otrzymanego H-Asp/OtBu/-Fen-OCH8. HC1 i 42 g Z-Gln-NH2-ONP rozpuszcza sie w 170 ml dwumetyloformamidu do klarownego slabo zóltego roztworu, mieszajac dodaje powoli 13,9 ml trójme- tyloaminy. Powstaje pomaranczowa zawiesina, któ¬ ra miesza sie w ciagu 24 godzin w temperaturze lazni 30—35°. W tym czasie dodaje sie dalsze 40 ml dwumetyloformamidu, a nastepnie jeszcze 1,39 ml trój etyloaminy.W celu dalszego oczyszczenia produkt rozpusz¬ cza sie w 4 litrach chloroformu i przemywa w 20- -stopniowej przeciwpradowej aparaturze rozdziel¬ czej (objetosc fazowa 1 naczynia: dolna faza 4O0ml, górna faza 200 mfli) kolejno 1 litrem 5°/o roztwo¬ ru kwasu cytrynowego, 400 ml nasyconego roztworu soli kuchennej, 6 litrami okolo 2 N sody i 2,8 litra¬ mi nasyconego roztworu soli kuchennej. Po wysu¬ szeniu i odparowaniu krystalizuje sie powoli po¬ chodna trójpeptydu z 1,8 litra etanolu w lodówce.Otrzymuje , sie Z-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH3 o temperaturze topnienia 186—188°.W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym otrzymuje sie nastepujace war¬ tosci Rf: w ukladzie chloroform-metanol (9:1) Rf = 0,39, chloroform-aceton (1 :1) Rf = 0,24; Rf 102 E = 0,69; Rf 89 = 0,46/ Rif 43 A = 0,65/ [a] £° = —28° (c = 1,3% w dwumetyloformamidzie). 16. H-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH8. 7,35 g Z-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH8 rozpusz¬ cza sie w 400 ml metanolu, dodaje 4,1 ml 3 N HC1 w dioksanie i uwodornia w obecnosci 2 g pallado¬ wego wegla (10% Pd). Po odsaczeniu katalizatora i odparowaniu przesaczu otrzymuje sie H-Gln-NH2- -Asp/OtBu/-Fen-OCH8 • HC1 jako bezbarwna pia¬ ne. W chromatografie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym otrzymuje sie nastepujace wartos¬ ci Rf: w ukladzie chloroform-metanol (9:1) Rf = 0,13; chloroform-aceton (25 :75) Rf = 0,14; Rf 102 E =0,22. 17. Z-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH8.Cala ilosc chlorowodorku wytworzonego wedlug przykladu podanego w punkcie 16 i 7,4 g Z-Tre/ /tBu/-OSU rozpuszcza sie w 14 ml dwumetyloform¬ amidu w temperaturze pokojowej i do otrzymanego roztworu wkrapla przy oziebieniu w lazni lodowej, 1,72 ml trójetyloaminy. Nastepnie otrzymana bru¬ natna zawiesine mesza sie w ciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej. Po zwyklej przeróbce z duza iloscia octanu etylu (po 3 razy plukanie 5% kwasem cytrynowym i okolo 2 N weglanu sodu), plukanie neutralne nasyconym roztworem soli ku¬ chennej, suszenie siarczanem sodu i odparowanie w prózni w temperaturze 30^40°) tirakituje su- 92914 32 rowy produkt w etanolu weglem aktywnym i kry¬ stalizuje z 90 ml etanolu w lodówce.Temperatura topnienia wynosi 155—161°. W chro¬ matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion- kowym otrzymuje sie nastepujace wartosci Rf: w ukladzie chloroform-metanol (9:1) Rf = 0,52 cy- kloheksan-aceton (3:7) Rf = 0,48; Rf 89 = 0,48; Rf 121 A = 0,76. [a] ™= -4° ±0,5° (c = 2,3% w dwumetyloformamidzie). 18. H-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH8. 478 mg Z-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen-OCH8 w 15Q^ml metanolu uwodornia sie w obecnosci 100 mg palladowego wegla (10°/o Pd) neutralnie w tem¬ peraturze pokojowej. Otrzymuje sie 395 mg bez- barwnej piany H-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/-Fen- -OGHs, która bez dalszego oczyszczenia stosuje sie do nastepnej kondensacji. W chromatogramie cien¬ kowarstwowym na zelu krzemionkowym otrzymuje sie nastepujace wartosci Rf: w ukladzie chloro- form-metanol (1:1) Rf = 0,75; chloroform-meta¬ nol (9 :1) Rf = 0,17; w acetonie Rf = 0,18; Rf 102 E = 0,23; Rf 89 = 0,12. 19. Z-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp/ OtBu/- -Fen-OCH8. 687 mg Z-Tyr/tBu/-OH. dwucyk'1'atoeksyloamonio wa sól w chloroformie wytraca sie wodnym kwa¬ sem cytrynowym i otrzymany wolny kwas w posta¬ ci oleju klarownego zadaje sie 0y139 ml Nnmetylo- fonwalmy w 6,5 ml czterowodorofuranu. W tempe- raiturze —22° dodaje sie 0,170 mil estru izobutylowe- go kiwasu cMoromrówkowego i miesza w ciagu pól godziny w temperaturze —22 do —10°, a nastep¬ nie wkrapla sie wyzej opisany H-Tre/tBu/-Gln- -NH2-Asp/OtBu/-OCH8 rozpuszczony w 15 ml czte- rowodorofuranu i po oziebieniu plucze z 5 ml tego samego rozpuszczalnika. Po pól godzinie mieszanina w temperaturze —10° miesza sie jeszcze w ciagu godzin w temperaturze pokojowej. Nastepnie odparowuje pod obnizonym cisnieniem i przerabia 40 jak zwykle w octanie etylu na przyklad wedlug sposobu podanego w punkcie 17. Produkt surowy rozpuszcza sie w 15 ml octanu etylu, wytraca 40 ml eteru i krystalizuje z metanolu w lodówce.Otrzymuje sie krótkie, grube igly, sublimujace przy 45 suszeniu w wysokiej prózni w temperaturze 50°.Temperatura topnienia 169—173°.W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym otrzymuje sie nastepujace war¬ tosci Rf: w ukladzie chloroform-metanol (9:1) Rf 50 = 0,46; chloroform-metanol (1 :1) Rf = 0,95; chlo¬ roform-aceton (1:1) Rf = 0,44; Rf 89 = 0,61; Rf aceton = 0,68; Rf 102 E = 0,73. [a] £° = -54° ±0,5° (c = 2,0% w dwumetyloformamidzie).. H-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp/ OtBu/- 55 -Fen-OCH3. 2,36 g Z-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/- -Fen-OCH8 uwodornia sie w 450 ml metanolu przy pomocy 500 mg 10% palladowego wegla, stosujac temperature pokojowa. Otrzymuje sie bezbarwna 60 piane, jednorodna w chromatogramie cienkowar¬ stwowym, stosowany do dalszego przerobu. W chro¬ matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym otrzymuje sie nastepujace wartosci Rf: w ukladzie chloroform-metanol (95: 5) Rf = 0,22; 65 Rf 89 =0,42. '33 92914 34 21. Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp OtBu/-Fen-OCH8.Produkt otrzymany w punkcie 20 oraz 1,48 g Z- -Tre/tBu/-OSU rozpuszcza sie w 3 ml dwumetylo- tormamidu i miesza w ciagu 21 godzin w tempera¬ turze pokojowej i po rozcienczeniu roztworu duza iloscia octanu etylu przerabia dalej jak podano na przyklad w punkcie 17. Surowy produkt rozpuszcza sie w 30 ml octanu etylu-metanolu (9 : 1) na cieplo i po ochlodzeniu w laznf lodowej wytraca za po¬ moca 80 ml eteru. Otrzymuje sie produkt w posta¬ ci bezbarwnego bezpostaciowego proszku o tem¬ peraturze 146—148°, wykuzjacego w c forornatagra¬ rnie cienkowarstwowyim na silikazelu nastepujace wartosci. Rf: w ukladzie chaoiroiforimHmieitanol (9:1) Rf = 0,55; chloroform-aceton (1 :1) Rf = 0,60; Rf 89 = 0,43; [a]20D = +6 ±0,5° (c=2,0 w dwurcietyllo- formamidzie). 22. Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp . /OtBu/-Fen-NH-NH2. 1,91 g Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp /OtBu/-Fen-OCHs rozpuszcza sie w 80 ml metanolu i miesza z 8 ml wodzianu hydrazyny. Po 22 godzi¬ nach odstania w temperaturze pokojowej wytraco¬ ny produkt wyodrebnia sie i suszy w temperaturze 60° pod wysoka próznia. Otrzymuje sie mikrokry¬ staliczny hydrazyd o temperaturze topnienia 226— 229° (rozklad).W chromatogramie cienkowarstwowym na silika- zelu znajduje sie nastepujace wartosci Rf: w ukla¬ dzie chloroform-metanol (9:1) Rf = 0,32; cyklo- heksan-aceton (3:7) Rf = 0,23; Rf 89 = 0,34. [a]20D= +4° ±1° (c=l,0 w diwuimetylioifiOTmaimidzie). 23. Z-Asp NH2-Liz/BOC/-Fen-His-OMe. 3,4 g H-Liz/BOC/-Fen-His-OMe (por. przyklad I) < 4.5 g Z-Asp-NH2-ONP miesza sie w 20 ml dwu- metyloformamidu w ciagu 20 godzin w tempera¬ turze pokojowej, po czym przez dodanie octanu etylu wytraca sie pochodna peptydowa, za pomoca dodania octanu etylu, odsacza i przemywa eterem.Po przekrystalizowaniu z metanolu otrzymuje sie orodukt o temperaturze topnienia 182—183°, wyka¬ zujacy w chromatogramie cienkowarstwowym KI 100 = 0,57 na zelu krzemionkowym, [a] J° = —28^ (c = 1 w dwumetyloformamidzie). 34. Z-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-NH-NH2. 3,97 g Z-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-OMe roz- Duszcza sie w 8 ml cieplego dwumetyloformamidu i 12 ml metanolu. Do roztworu o temperaturze 30° dodaje 2,5 ml wodzianu hydrazyny i pozostawia w ciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej, a na¬ stepnie wytracony za pomoca wody hydrazyd pep- lydowy, odsacza i przemywa woda do usuniecia Hydrazyny. Produkt krystalizuje sie z etanolu, otrzymujac zwiazek o temperaturze topnienia 200— 401u, wykazujacy w chromatogramie cienkowar¬ stwowym na zelu krzemionkowym Rf 43 C = 0,5.. H-Fen-Pro-OH.Z-Fen-Pro-OH przeprowadza sie za pomoca ka¬ talitycznej redukcji (Pd — wegiel) w metanolu- -wodzie (4:1) do wolnego dwupeptydu, odsacza ka¬ talizator i po odparowaniu roztworu do malej ob¬ jetosci, dodajac aceton otrzymuje sie krystaliczny monohydrat dwupeptydu o temperaturze topnie¬ nia 125—128°. 26. Z-Tre/tBu/-Fen-Pro-OH. ,2 g Z-Tre/tBu/-OSU, 13,3 g H-Fen-Pro-OH. (monohydrat) i 6,54 ml trój etyloaminy rozpuszcza sie w 80 ml dwumetyloformamidu i pozostawia .na okres kilkunastu godzin w temperaturze 20°, po czym zateza w wysokiej prózni az do utworzenia kleistej masy. Mase rozpuszcza sie w 500 ml octanu etylu i plucze 5 razy po 100 ml 5*/o roztworu kwa¬ su winowego i nastepnie woda do odczynu obojet¬ nego. Faze organiczna odparowuje do sucha, prosz¬ kuje pozostala stala piane i suszy pod wysoka próz¬ nia w temperaturze 40°. Przez Idwukrotne wytra¬ cenie z octanu etylu-eteru naftowego otrzymuje sie 13,3 g bezpostaciowej, chromatograficznie czystej pochodnej trójpeptydu o nie ostrym zakresie tem¬ peratury topnienia 75—85°. W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf 115 = 0,68; Rf 121 A = 0,57. 27. Z-Tre/tBu/Ala-Ilen-Gli-OME. 1,36 g H-Ala-Ilen-Gli-OMe (por. przyklad I) i 2,5 g Z-Tre/tBu/-OSU miesza sie w 3 ml dwume¬ tyloformamidu w ciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej. Pochodna tetrapeptydu wytraca sie ete¬ rem, odsacza i plucze eterem. Po przekrystalizo¬ waniu z etanolu temperatura topnienia = 229— —230°-[a]2£= -^3° (c=l w metanolu). Rf=0,55 w ukladzie chloroformmetanol (95 :5) na zelu krze¬ mionkowym. 28. H-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OMe. ,66 g powyzszego zwiazku karbobenzoksy roz¬ puszcza sie w 400 md cieplego metanolu i uwodornia w obecnosci 1 g palladowego wegla (10^/tPd). Po odsaczeniu katalizatora odparowuje sie metanol w prózni w temperaturze 40°, a stala pozostalosc prze¬ rabia sie natychmiast dalej. Rf=0,2 w ukladzie chloroform-metanol (95:5) na zelu krzemionko¬ wym. 29. H-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 4,3 g estru metylowego tetrapeptydu rozpuszcza sie w 43 ml metanolu przy lagodnym ogrzewaniu.Po ochlodzeniu do temperatury 20° dodaje sie 12 ml IN roztworu wodorotlenku sodowego. Po 5 minu¬ tach dodaje 20 ml wody i po dalszych 10 minutach 12 ml IN roztworu kwasu solnego i 20 ml metano¬ lu. Krystaliczny osad odsacza sie i plucze 90i/t me¬ tanolem. Otrzymuje sie produkt o temperaturze top¬ nienia od 240° z rozkladem, wykazujacy na silika- zelu krzemionkowym Rf 100=0,15. 30a. Z-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH.Opisana w punkcie 29 pochodna tetrapeptydu (4,2 g) zawiesza sie w 110 ml 90°/o dwumetyloform¬ amidu, dodaje 1,4 ml trójetyloaminy i ogrzewa do temperatury 70°, az do prawie calkowitego roz¬ puszczenia. Po oziebieniu do temperatury 25° do¬ daje sie 4,8 g Z-Gln-NH2-ONP, miesza w ciagu 18 godzin w temperaturze pokojowej, dodaje dalsze 2,4 g Z-Gln-NH2-OPN i 0,7 ml trójetyloaminy i mie¬ sza jeszcze w ciagu 20 godzin w temperaturze 50°.Wytracony produkt odsacza sie, lug macierzysty zadaje eterem i wydzielony produkt równiez wyod¬ rebnia.Obie frakcje zawiesza sie razem w 60 ml III- -rzed. bultanolai, dobrze rozciera i po dodaniu 2(N roztworu kwasu solnego do uzyskania wartosci pH 2, wytraca produkt woda za pomoca dodawania 40 45 50 55 6035 iporcjanii ogólem 600 ml wody. Produkt odwirowu¬ je sie, plucze sie jeszcze 2 razy po 200 ml wody i liofilizuje. Otrzymany produkt mozna przekrysta- lizowac z duzej ilosci metanolu. Temperatura top¬ nienia od 230? z rozkladem. Produkt zawiera 5 moli wody. W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym otrzymuje sie Rf 100=0,4. 30b. Z-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OMe. 4.6 g opisanego w punkcie 28 H-Tre/tBu/-Ala- -Ilen-Gli-OMe w 30 ml dwumetyloformamidu zada¬ je sie 3,5 g Z-Gli-ONP i miesza w temperaturze pokojowej az do zestalenia mieszaniny. Po odstaniu w ciagu kilkunastu godzin, rozciencza sie eterem az do usuniecia nitrofenolu. Chroniony pentapeptyd wykazuje w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf=0,14 w ukladzie chloro- form-metanol (95:5). Temperatura topnienia po¬ wyzej 250°. 31a. H-Gm-iNH2-Tre/tB;U/-Ala^nen-Gli-OH. HO 3.7 g Z-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH zawie¬ sza sie w 150 ml 80°/o metanolu i 5,5 ml IN kwasu solnego, po czym uwodornia w obecnosci 2 g palla¬ dowego wegla (10% Pd), az substancja ulegnie roz¬ puszczeniu nie uzyskujac dalszego przyjmowania wodoru. Po odsaczeniu katalizatora przesacz zateza sie silnie w prózni w temperaturze 30°, rozciencza IH-rzed. butanolem i liofilizuje. Otrzymany produkt w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym wykazuje Rf 101=0,48. 31ib. H-Gln-'NH2-Tre/tBu/-AHa-IlenHGai-OMe-HO 14,4 g opisanej w punkcie 30b pochodnej penta- peptydu zawiera sie w 800 ml 80% metanolu i o- grzewa przez pewien czas do temperatury 50°, po czym zawiesine oziebia sie do temperatury pokojo¬ wej, zadaje 20,8 ml kwasu solnego i 3 g palladowe¬ go wegla (10% Pdi) i uwodornia az do zakonczenia przyjmowania wodoru i calkowitego rozpuszczenia sie substancji wyjsciowej. Po odsaczeniu katalizato¬ ra odparowuje sie przesacz pod obnizonym cisnie¬ niem w temiperaturze 40° i odwadnia pozostalosc przez dwukrotne odparowanie z metylofoirimamidu w prózni. Otrzymany produkt stosuje sie bez dal¬ szego oczyszczania. Rf 100=0,33 w chromaitogramie cienkowairstwowym na zelu krzemionkowym. 32. Z-Tre-/tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala- -Ilen-Gli-OMe. 12,0 g opisanego w punkcie 31b chlorowodorku estru metylowego pentapeptydu rozpuszcza sie v. 80 ml dwumetyloformamidu i mieszajac dodaje ko lejno w temperaturze pokojowej, 13,3 g Z-Tre/tBu/- -Fen-Pro-OH i 5,75 g N-hydroksysukcynimidu, na¬ stepnie w temperaturze 0° 2,76 ml trójetyloaminy i 6,2 g dwucykloheksylokarbodwuimidu, po czym miesza sie w temperaturze 0° az do zgestnienia mie¬ szaniny i pozostawia w ciagu nocy w temperatu¬ rze 0°. Po zatezeniu w wysokiej prózni do okolo 50 ml produkt wytraca sie z 300 ml eteru. Wyod¬ rebniona substancje przemywa 0,05M kwasem cy¬ trynowym i woda, suszy w wysokiej prózni w tem¬ peraturze 40°, a nastepnie oczyszcza przez krysta¬ lizacje z okolo 1 litra izopropanolu, otrzymujac 18,2 g chronionej pochodnej oktaipeptydu Rf 89 = =0,27, w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym. 36 33. Z-Tre/tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala- -Ilen-Gli-OH. ,9 g opisanego powyzej pod 32 estru metylo¬ wego oktapeptydu rozpuszcza sie w 190 ml 90% metanolu ogrzewajac do temperatury 70°. Po ozie¬ bieniu do temperatury pokojowej dodaje 30 ml IN wodorotlenku sodowego i 10 minut pózniej 160 ml wody w malych porcjach. Potem odsacza az do uzyskania klarownego roztworu i z przesaczu wy- traca produkt przez wlanie do 600 ml 0,05N lodo¬ wato zimnego kwasu solnego. Osad odsacza sie i przemywa woda do odczynu obojetnego. Produkt w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym jest jednorodny (Rf 100=0,45), ewentualnie mozna krystalizowac z metanolu-wody. 34. H-Tre/tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala- -Ilen-Gli-OH. 3.6 g otrzymanego powyzej w punkcie 33 Z-Tre/ /tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH rozpuszcza sie w 100 ml 80% kwasu octowego "i uwodornia w obecnosci 0,5 g palladowego wegla (10% Pd). Po zakonczeniu przyjmowania wodoru odsacza sie katalizator i przesacz odparowuje do sucha. Otrzymana sól kwasu octowego pochodnej okta peptydu w postaci bezbarwnego firnu suszy sie w wysokiej prózni. Produkt w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym wyka¬ zuje Rf 100 = 0,21.. Z-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-Tre^tBu/-Fen- -Pro-Gln-NH2-Tre-/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 11,25 g Z-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-hydrazyd rozpuszczonego w 65 ml dwumetyloformamidu za¬ daje sie w temperaturze -^20° do —215° w ciagu 2 minut 8,4 ml 4,2 N chlorowodoru w dioksanie, po czym w temperaturze —1S1 do —20° dodaje sie 2,1 ml IH-rzed. -azotynu butylu i pozostawia w ciagu 1'5 minut w temperaturze -^15°. Po ochlo¬ dzeniu do temperatury -^2K)° dodaje sie 4,8 ml trójetyloaminy, a nastepnie roztwór 9,0 g opitea- 40 nego powyzej (punkt 34), produktu w 2ilO ml 90% dwumetyloformamidu z intensywnym chlodzeniem utrzymuje sie temperature wewnetrzna —15Q. Nar stepnie w ciagu 1 godziny ogrzewa sie do tem¬ peratury 0°, utrzymujac wartosc pH 7^8 za po- 4B moca dodawania trójetyloaminy. Ogólem dodaje sie jeszcze 3;5 ml trójetyloaminy.Po mieszaniu w ciagu nocy w temperaturze 0° mieszanine reakcyjna wlewa sie do 3 litrów eteru, odsacza klaczkowaty osad i przemywa 2 razy ete- 50 rem i raz woda. Surowy produkt rozpuszcza sie w 500 ml cieplego metanolu i wytraca ponownie przez wlanie do 1,5 litra 1% kwasu octowego. Od¬ saczony i dwukrotnie przemyty woda produkt wy¬ traca sie ponownie w ten sam sposób. Rf 100=0,33 55 na plytkach z zelem krzemionkowym. 36. H-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen- -Pro-Gln-NH2-Tre-/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 1.7 g wyzej wymienionego chronionego dodeka- peptydiu rozpuszcza sie w 100 ml 80% kwasu octo- 60 wego i uwodornia w obecnosci 0,5 g palladowego wegla (10% Pd) jak zwykle. Po odsaczeniu katali¬ zatora przesacz odparowuje sie w wysokiej prózni w temperaturze 30° i pozostalosc liofilizuje III-nzed. butanolem. Otrzymany z ilosciowa wydajnoscia w 65 chromatogramie cienkowarstwowym (Rf 100=04 na /37 zelu krzemionkowym) jednorodny produkt przera¬ bia sie natychmiast dalej. 37. Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp /OtBu/-Fen-Gln-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ tBu/- -Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 1,73 g opisanej powyzej (punkt 22) pochodnej pe- ptydowej rozpuszcza sie w temperaturze 50° w 10 ml dwumetyloformamidu. Po oziebieniu do tem¬ peratury —20° wkrapla sie 0,9 ml 4,2 N chlorofor¬ mu w dioksanie. Potem dodaje sie w temperaturze —15° 0,22 ml III-rzed. azotynu butylu i prowadzi reakcje w ciagu 15 minut w temperaturze —15°, po czym oziebia sie ponownie do temperatury —20° i wkrapla 0,53 ml trójetyloaminy, a nastepnie roz¬ twór 1,6 g opisanej powyzej (punkt 36) pochodnej peptydowej w 40 ml 90% dwumetyloformamidu.Podwyzsza sie temperature w ciagu 1 godziny do temperatury 0°, utrzymujac wartosc pH 7—8 za pomoca trój etyloaminy. Ogólem dodaje sie 0,25 ml trójetyloaminy. Po dalszych 15 godzinach mieszania w temperaturze 0° produkt wytraca sie przez wla¬ nie do eteru, odsacza osad i przemywa eterem i woda. Dla oczyszczenia wytraca sie raz z dwu- metyloformamidu-octanu etylu i raz z dwumetylo¬ formamidu — 0,02 N kwasu solnego. Czysta sub¬ stancja wykazuje w chromatogramie cienkowar¬ stwowymi na zelu krzemionkowym Rf 100=0,40. 38. Z-Ala-Pro-NH2. 2,28 g H-Pro-NH2 i 7,57 g Z-Ala-ONP rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidzie i utrzymuje zólty roztwór w ciagu 18 godzin w temperaturze pokojowej, po czym odparowuje w wysokiej próz¬ ni do sucha, pozostalosc zadaje eterem i powstaly proszek dokladnie rozciera. Po odsaczeniu i wysu¬ szeniu otrzymuje sie 5,5 g Z-Ala-Pro-NH2 o tem¬ peraturze topnienia 167,5—168,5°. [a] g = -74° (c = 1 w metanolu). 39. Z-Gli-Ala-Pro-NH2. 27,1 g powyzszej pochodnej dwupeptydu rozpu¬ szcza sie w 425 ml etanolu i po dodaniu 85 ml 1,0 N wodnego kwasu solnego uwodornia sie w obec¬ nosci 4,25 g palladowego wegla (10% Pd). Po uwo¬ dornieniu i odsaczeniu katalizatora roztwór odpa¬ rowuje sie pod obnizonym cisnieniem w tempe¬ raturze lazni 40—50°. Pozostalosc rozpuszcza sie w temperaturze 40° w 40 ml dwumetyloformami¬ du i oziebia roztwór do temperatury 20°. Potem dodaje 29,1 g Z-Gli-ONP i po rozpuszczeniu, mie¬ szajac wkrapla w ciagu 45 minut 11,2 ml absolut¬ nej trójetyloaminy i miesza sie jeszcze w ciagu godzin w temperaturze pokojowej.Zawiesine odparowuje sie w temperaturze 40°, pod cisnieniem 0,01 tor i pozostalosc ekstrahuje mieszanine 600 ml wody i 300 ml eteru' Warstwe wodna ekstrahuje sie 2 razy po 300 ml eteru, a warstwe eterowa 2 razy po 300 ml wody. Pola¬ czone frakcje wodne odparowuje sie pod obnizo¬ nym cisnieniem w temperaturze 40—50° i uwalnia od wody przez kilkakrotne dodanie chloroformu i odparowanie. Dobrze wysuszona pozostalosc za¬ daje sie w temperaturze 40—50° 500 ml octanu etylu, odsacza nierozpuszczalny chlorowodorek trój- etyloaminy i do przesaczu dodaje w temperaturze —40° 10 ml eteru, po czym nastepuje krystali¬ zacja. Po okolo 20 godzinnym odstaniu w tem- 38 peraturze 5—10° wyodrebnia sie krysztaly, prze¬ mywa i suszy.Temperatura topnienia 105—106°. Produkt zawie¬ ra 3% chlorowodorku trój etyloaminy. W tej po- staci mozna go dalej przerabiac. Dla oczyszczenia rozpuszcza sie 5,0 g powyzszego surowego krystali- zatu w 10 ml wody i po dodaniu 20 ml chlorku me¬ tylenu zadaje 15 ml nasyconego roztworu wegla¬ nu potasu. Warstwe organiczna oddziela sie, eks- io tranuje 10 ml nasyconego roztworu weglanu po¬ tasu, zas warstwe wodna ekstrahuje 15 ml chlorku metylu.Polaczone roztwory chlorku metylenu suszy sie bezwodnym siarczanem sodu i odparowuje. Pozo- stalosc krystalizuje sie z 50 ml octanu etylu. Otrzy¬ muje sie 4,4 g pochodnej trójpeptydu o tempera¬ turze topnienia 109—112°. Po przekrystalizowaniu z acetonu-metanolu-eteru (10 : 4 : 6) otrzymuje sie krysztaly o temperaturze topnienia 144,5—145,5° (polimorfia krysztalów). [a]^° = —93Q/(c = 1,0 w metanolu). W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemioinkowyin w chloroformie — meta¬ nolu (8 : 2) Rf = 0,38. 40. H-Gli-Ala-Pro-NH2. 18,8 g otrzymanej powyzej (punkt 39) surowej pochodnej tróóipeptydoamidii rozpuszcza sie w 400 ml dwumetyloformamidu i uwodornia w obecnos¬ ci 1,0 g palladowego wegla (10% Pd). Po zakoncze¬ niu uwodornienia odsacza sie i po krótkim odga- zowaniu stosuje do nastepnego etapu. 41. Z-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2.Do roztworu otrzymanego powyzej (punkt 40) trójpeptydoamidu (550 ml) dodaje sie 20,1 g estru Z-Wal-p-nitrofenylowego i utrzymuje mieszanine w ciagu 18 godzin w temperaturze pokojowej. Na¬ stepnie mieszanine poreakcyjna odparowuje sie w temperaturze 50°—60° i pod cisnieniem 0,01 tor do sucha, rozciera pozostalosc z 300 ml,eteru i od¬ sacza. Pozostalosc po odsaczeniu suszy sie i miesza 40 w 210 ml absolutnego etanolu w ciagu 15 minut w temperaturze 70—80°, oziebia do temperatury 0° i odsacza. Pozostalosc krystalizuje sie z mieszani¬ ny 170 ml absolutnego czterowodorofuranu, 25 ml wody i 110 ml eteru. Temperatura topnienie 209— 45 211°. Wartosc Rf 0,42 na plytkach a zelem krze¬ mionkowym, w ukladzie chloroform-metanol (8:2). 42. H-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2. 1,1 g Z-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 rozpuszcza sie w 50 ml 80% metanolu i uwodornia roztwór w obec- 50 nosci 0,3 g palladowego wegla (10% Pd). Po za¬ konczeniu przyjmowania wodoru odsacza sie ka¬ talizator, roztwór odparowuje i pozostalosc suszy w wysokiej prózni w temperaturze laznti 35°. Otrzy¬ muje sie tetrapeptyd H-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 jako 55 bezbarwna substancje o wartosci Rf 0,20 (plytki z zelem krzemionkowym, uklad chloroform-metanol = 1:1). 43. Z-Tre/tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/tBu/-Glp-NH2-Asp /OtBu/-Fen-Asp-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His^Tre/ tBu/- 60 -Fen -Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-Hal-Gli- -Pro-NH2. 800 mg wytworzonej powyzej (punkt 37) pochod¬ nej peptydowej, 500 mg H-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 i 170 mg N-hydroksybursztynoimidu rozpuszcza sie 65 w 10 ml dwumetyloformamidu, zateza do polowy92914 39 pierwotnej objetosci w wysokiej prózni i dodaje 250 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza w ciagu nocy w temperaturze pokojowej, po czym wytraca produkt eterem, wyodrebnia i oczyszcza ekstrakcja przeciwpradowa Craiga w mieszaninie metanol-bufor (jak w przykladzie III, 12) chloro- form-czterochlorek wegla (10 : 3 : 5 : 6), K = 0,29.Czysty produkt wykazuje Rf 107 = 0,62 w chro- matogramie cienkowarstwowym na plytkach z ze¬ lem krzemionkowym. 44. H-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp /OtBu/-Fen-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ tBu/-Fen- -Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal-Gli-Ala- -Prq-NH2. 300 mg powyzszej pochodnej peptydowej rozpusz¬ cza sie w 30 ml 80P/o kwasu octowego i uwodornia w obecnosci 100 mg palladowego wegla (10*/o Pd).Po calkowitej dekarbobenzoksylacji odsacza sie katalizator, przesacz zateza silnie pod wysoka próz¬ nia w temperaturze 30° i pozostalosc liofilizuje z III-rzed. butanolu, po czym rozpuszcza w 10 ml metanolu, alkalizuje slabo za pomoca 1 N roztwo¬ ru kwasnego weglanu sodu i wytraca przez wkrop- lenie do 0,1 N roztworu weglanu sodowego. Wy¬ odrebniony produkt wytraca sie ponownie. W chro¬ matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym Rf 100 = 0,34. 45. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzorze 6. 288 g powyzszego produktu, 181 mg opisanej pod 12 pochodnej peptydowej i 46 mg N-hydroksybur- sztynoimidu rozpuszcza sie w 2 ml dwumetylo- formamidu przepuszczajac azot w temperaturze 45°.Po dodaniu 52 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu miesza sie jeszcze w ciagu 3 godzin w temperatu¬ rze 45a, a nastepnie wytraca produkt eterem wol¬ nym od nadtlenków. Wyodrebniony produkt oczy¬ szcza sie ekstrakcja przeciwpradowa Craiga w ukladzie metanol-bufor (wedlug sposobu podanego w przykladzie IIII punkt 12) — chloroform-cztero- chlorek wegla (11:3:6:7); K = 0,74. Czysty pro¬ dukt wykazuje w chromatogramie cienkowarstwo¬ wym Rf 52 A = 0,4; Rf 100 = 0,35 (na zelu krze¬ mionkowym).Przyklad III. Sposób wytwarzania (asp-NH2)15 -Kalcytoniny M o wzorze 8. 53 mg subtelnie sproszkowanego peptydu o wzo-r rze 9 rozpuszcza sie w 2 ml stezonego kwasu sol¬ nego w temperaturze 0° i w ciagu 5 minut miesza, poruszajac naczyniem. Nastepnie usuwa sie rozpu¬ szczony gazowy chlorowodór, w ciagu 5 minut za pomoca wysokiej prózni, rozciencza 4 ml lodowato zimnej wody i przeprowadza produkt w sól kwa¬ su octowego w malej kolumnie Amberlitu CG-45 (slabo zasadowy wymieniacz jonowy w postaci oc¬ tanu) i liofilizuje. Otrzymuje sie produkt w posta¬ ci bezbarwnego liofilizatu.W widmie nadfioletowym w 10% kwasie octo¬ wym mu = 275 mm (e—1700). W chromatogtrarciie cienkowarstwowym na celulozie (Selecta) Rf 45 = 0,48; Rf 101 A = 0,49; na tlenku glinu (Alox, Ca- mag) Rf 79 = 0,57.W elektroforezie przy 280 V substancja wedruje w ciagu 1,5 godziny na plytach celulozowych Se¬ lecta w kierunku katody przy wartosci pH = 1,9 40 (bufor: kwas octowy-kwas mrówkowy) : 3,5 cm.Substancja wyjsciowa moze byc otrzymana w na¬ stepujacy sposób: 1. Z-Glu-NH2-Asp-NHj-Fen-OCH,. 14,5 g Z-/Gln-NH2/-ONP razem z 10,8 g H-Asp- -NH2-Fen-OCH, • chlorowodorek [Ann. 688, 259 (1965)] rozpuszcza sie w 100 ml dwumetyloform- amidu i powoli dodaje 4,55 ml trój etyloaminy. Po 24-godzinnej reakcji w temperaturze pokojowej io mieszanine poreakcyjna odsacza sie i pozostalosc przemywa dwumetyloformamidem. Otrzymany Z- -Gln-NH2-Asp-NH2-Fen-OMe mozna przekrystalizo- wac z duzej ilosci goracego dwumetyloformamidu.Temperatura topnienia: 261—265° (rozklad), [a] £° = +1.1° (c = 0,94 w szesciometylotrójamiidzie kwa¬ su fosforowego). 2. H-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen-OCH8-HCl. 14,1 g Z-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen-OCH2 uwodornia sie w 800 ml metanolu w temperaturze 45°, doda- jac 8,5 ml 3 N chlorowodoru w dioksanie i 2,4 g palladowego wegla (10°/o Pd). Po zakonczeniu przyj¬ mowania wodoru mieszanine poreakcyjna odsacza sie i odparowuje, stosujac pozostalosc bez oczysz¬ czania do dalszej syntezy: W chromatogramie cien- kowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf 52 A — 0,27; Rf 45 = 0,31; Rf E = 0,50. 3. Z-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen-OCH,. 9,3 g H-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen-OCH8-HCl, 11,9 g Z-/Tre/tBu/-OSU rozpuszcza sie w 150 ml dwumety- loformamidu do uzyskania klarownego roztworu, nastepnie wkrapla 2,85 ml trójetyloaminy w 10 ml dwumetyloformamidu, miesza w ciagu 21 godzin w temperaturze pokojowej, po czym odparowuje pod obnizonym cisnieniem. Pozostalosc zadaje sie duza iloscia octanu etylu-chloroformu (9:1) i wy¬ traca 2 razy 200 ml 5°/o kwasu cytrynowego i raz 100 ml wody, po czym odsacza sie nierozpuszczalny . osad, wytrzasa przesacz jeszcze 2 razy 200 ml 2 N roztworem sody i 3 razy 100 ml wody, suszy siar- 40 czanem sodu i odparowuje. Pozostalosc po odpa¬ rowaniu przekrystalizowuje sie razem z wyzej otrzymanym odsaczonym osadem z dwumetylo- formamidu-eteru (1 :1). Temperatura topnienia 237—241° (rozklad): [<*]* = +8° (c = 1 w dwu- 45 metyloformamidzie). 4. H-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen-OCH, 6,31 g Z-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen-OCH, uwodornia sie w 600 ml metanolu w obecnosci 700 mg palladowego wegla (10°/o Pd), w temperaturze 50 pokojowej, na wstrzasarce, w srodowisku obojet¬ nym. Substancja przechodzi stopniowo do roztworu.Po odsaczeniu katalizatora bezpostaciowa pozosta¬ losc po odparowaniu stosuje sie bezposrednio do nastepnej kondensacji. 55 W chromatogramie cienkowarstwowym na sili- kazelu Rf 52 = 0,21; Rf 102 A = 0,21; na tlenku glinu Rf 43 A = 0,19.. Z-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen- -OCH8. 60 Roztwór 5,9 g Z-Tyr/tBu/-OH wydzielony z 8,8 g Z-Tyr/tBu/-OH dwucykloheksyloamoniowej soli w 85 ml czterowodorofuranu zadaje sie 1,84 ml N-me- tylomorfoliny i przeprowadza reakcje w tempera¬ turze —33° z 2,28 ml estru izobutylowego kwasu 68 chloromrówkowego, mieszajac w ciagu pól godziny41 w temperaturze —20 do —12°. Oziebiony do —10° roztwór pochodnej tetrapeptydu H-Tre/tBu/-Gln- -Asn-Fe-OCH8 wlewa sie do 23 ml dwumetyloform- amidu i plucze 15 ml dwumetyloformamidu.Po reakcji prowadzonej w temperaturze pokójo- 5 wej w ciagu 19 godzin mieszanine odparowuje sie pod obnizonym cisnieniem, a pozostalosc zawiesza w octanie etylu i wytrzasa 3 razy 5% roztworem kwasu cytrynowego, 3 razy 2 N roztworem sody i 5 razy pólnasyconym roztworem soli kuchennej. 10 Po odsaczeniu, zawiesine suszy sie w wysokiej próz¬ ni. Produkt mozna przekrystalizowac z metanolu.Temperatura topnienia 216—219°; [a] £° = +4° (c = 1,0 w dwumetyloformaimidzlie). W chromato¬ gramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym 15 Rf 52 = 0,64; Rf 102 A = 0,70; na tlenku glinu (Alox) jest Rf 43 A = 0,65; Rf 89 = 0,17. 6. H-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen- -OCH,. ,1 g Z-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp-NH2-Fen- 20 -OCHj dekarbobenzoksyluje sie w 600 ml metano¬ lu w temperaturze pokojowej w sposób zwykly w obecnosci palladowego wegla (10*/o Pd). Otrzyma¬ ny H-Tyr/tBu/-Tre/tBu/rGln-Asn-Fe-CH, wykazu¬ je w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu 25 krzemionkowym nastepujace wartosci Rf 89 = 0,15; Rf 102 E = 0,28; Rf w chloroformie-metanolu (9:1) = 0,11. 7. Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp- -NH2-Fen-OCH8. 30 Otrzymana powyzej (punkt 6) pochodna penta- peptydu H-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp-NH2- -Fen-OCH, i raz 4,3 g Z-tr/tBu/-OSU rozpuszcza sie w 40 ml dwumetyloformamidu, mieszajac w ciagu 18 godzin W temperaturze pokojowej, po czym 35 przerabia wedlug punktu 5. Pozostalosc, która jest trudno rozpuszczalna w octanie etylu, krystalizu¬ je sie z metanolu. Temperatura topnienia 206— 208°; [a] g» = +15° (c = 1,7 w dwumetyloform- amidzie). W chromatogramie cienkowarstwowym na 4° zelu krzemionkowym Rf 102 E = 0.69; Rf 89 = 0,28; Rf w ukladzie chloroform-metanol (9:1) = = 0,30. 8. Z-Tre/tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp- -NH2-Fen-NH-NH2 45 2,0 g Z--Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp -NH2-Fen-OCH8 rozpuszcza sie 150 ml metanolu, dodaje 10,7 ml wodzianu hydrazyny i prowadzi re¬ akcje w ciagu 6 godzin w temperaturze pokojowej.Wytworzony osad odsacza sie, osad przemywa me- 5° tanolem i suszy pod wysoka próznia nad stezonym kwasem siarkowym. Temperatura topnienia 231° (rozklad), [a]J° = +4° (c = 0,80 w dwumetylo- formamidzie). W chromatogramie cienkowarstwo¬ wym na zelu krzemionkowym Rf 43 C = 0,57; Rf ** 45 = 0,60; Rf 102 E = 0,58. 9. Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln NH2-Asp- -NH2-Fen-Asp-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ tBu/- -Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 800 mg Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2- * -Asp-NH2-Fen-NH-NH2 rozpuszcza sie w 18 ml dwumetyloformamidu, dodaje w temperaturze —20° 0,58 ml chlorowodoru w dioksanie i miesza z 0,16 ml III-rzed. azotynu butylu, nastepnie mie¬ sza sie w ciagu 15 minut w temperaturze —20° do 65 42 —15°, po czym dodaje 0,30 ml N,N-dwuizopropylo- etyloaminy i 855 ml H-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His- -Tre/ tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen- -Gli-OH. (octan) w 20 ml dwumetyloformamidu (90°/o) i miesza w temperaturze 0°. Po pierwszej i drugiej godzinie dodaje sie po 0,075 ml. N,N-dwu- izopropylo-etyloaminy (lacznie fr,15 ml) i miesza w ciagu 15 godzin w temperaturze 0°. Nastepnie mie¬ szanine reakcyjna miesza sie z 600 ml eteru, pozwa¬ la osiasc osadowi i odsacza na nuczy. Produkt w celu oczyszczenia poddaje sie wytraceniu z dwu- eityloforimamidu-octanu etylu, a nastepnie ponow¬ nemu wytraceniu z dwumetyloformamidu-wodnego roztworu 0,002 N kwasu solnego. W chromatogra¬ mie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf 43 E = 0,62; Rf 100 = 0,32; Rf 45 = 0,53; Rf 3 = 0,27.. Z-Tre/tBu/-Tyr/tMu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp- -NH2-Fen-Asp-NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ tBu/- -Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal-Gli- -Ala-Pro-NH2. 786 mg Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2- -Asp-NH2-Fen-Asp^NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ /tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH i 251 mg H-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 szlamuje sie ra¬ zem z 82 mg N-hydroksybursztynoimidu w 10 ml dwumetyloformamidu i mieszajac w temperaturze 40° dodaje roztwór 90 mg dwucykloheksylokarbo- dwuimidu w 1 ml dwumetyloformamidu. Po 3 go¬ dzinach dodaje w temperaturze 40° dalsze 65 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza lacznie 21 godzin w temperaturze 40°. Rozciencza sie 10 ml metanolu i miesza z 530 ml eteru, pozwala osiasc osadowi i odsacza go.Osad oczyszcza sie za pomoca ekstrakcji prze- ciwpradowej Craiga w ukladzie metanol-bufor- -chloroform-czterochlorek wegla (10 : 3 : 5 : 6, bu¬ for jak w przykladzie I punkt 18). Po 450 stop¬ niach wyodrebnia sie substancje, która jest jedno¬ rodna wedlug chromatografii cienkowarstwowej (wspólczynnik K = 0,66). W chromatogramie cien¬ kowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf Z = = 0,40; Rf 45 = 0,42; Rf 100 = 0,32. 11. H-Tre/ tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2- -Asp-NH2-Fen-Asp NH2-Liz/ BOC/-Fen-His-Tre/ /tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal- -Gli-Ala-Pro-NH2. 64 mg Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2- -Asp-NH2 -Fen-Asp-NH2-Liz /BOC/ -Feri-His-Tre/ /tBu/-Fen-Pro-Gln-Tre/ tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal-Gli- -Ala-Pro-NH2 uwodornia sie w 100 ml 80*/t kwasu octowego w obecnosci 16 mg wegla palladowego . (lOtyo Pd) w temperaturze pokojowej, na wstrza- sarce w ciagu 15 godzin, po czym odsacza od ka¬ talizatora, przemywa te sama mieszanina rozpusz¬ czalników i liofilizuje. Otrzymuje sie 54 mg octanu dokozapeptydoamidu. Produkt ten rozpuszcza sie w 10 ml cieplego metanolu i roztwór doprowadza do wartosci PH okolo 7,5 za pomoca kilku kropli 1 N roztworu kwasnego weglanu sodu, po czym miesza z 50 ml 0,1 N roztworu sody o temperaturze 0°. Po osadzeniu sie mlecznego osadu, osad odsa¬ cza sie, przemywa woda i suszy. W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf 43 E = 0,50; Rf 110 = 0,61; Rf 52 = 0,21.92914 43 44 12. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzorze 9. 93 mg Pochodnej peptydu o wzorze 7, 95 mg H-Tre/ tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp-NH2- -Fen-Asp-NH2-Liz /BOC/-Fen-His-Tre/ tBu/-Fen- 5 -Fro-NH2 14 mg H-hydiroksyhyrisztynioiimlidu i 10 -Pro-iNH2, 14 mg H-hydroksybursztynoimidu i 10 ml dwumetyloformamidu miesza sie pod azotem z 15 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu. Mieszani¬ ne reakcyjna miesza sie w temperaturze 40°, lacz- 10 nie w ciagu 20 godzin, przy czym po 2 godzinach dodaje 15 mg dwucykloheksylodiwuimidu, po czym przenosi mieszanine reakcyjna do 300 ml absolut¬ nego eteru, zostawia w ciagu 2 godzin w lodówce, wydzielony osad odsacza, przemywa eterem i w 15 celu dalszego oczyszczenia poddaje ekstrakcji prze- ciwpradowej Craiga w ukladzie metanol-bufor-chlo- roform-czterochlorek wegla (11 : 3 : 6 : 7, bufor jak w przykladzie I punkt 18) stosujac 220 stopni roz¬ dzialu. Czyste frakcje (naczynia 104—121; K = 1,0) 20 laczy sie, odparowuje i uwalnia od octanu amonu w temperaturze 40° pod wysoka próznia. W chro- matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym Rf 45 = 0,60; Rf 96 = 0,59; Rf 100 = 0,32.Przyklad IV. Sposób wytwarzania Na-acetylo- 25 -Kalcytoniny M o wzorze 10. 100 mg Pochodnej peptydu o wzorze 11 zadaje sie w temperaturze 0°, 3 ml 95*/o kwasu trójfluoro- octowego pluczac azotem i po calkowitym rozpu¬ szczeniu pozostawia w ciagu 90 minut w tempera- 30 turze pokojowej. Produkt wytraca sie 50 ml zim¬ nego eteru w temperaturze 0° w postaci zawiesiny, która odwirowuje sie i rozciera osad jeszcze 2 razy z eterem.Produkt wysuszony nad stalym wodorotlenkiem 35 sodu w wysokiej prózni zadaje sie 3 ml wody i w celu przeprowadzenia w postac octanowa, przenosi na kolumne slabo zasadowego wymieniacza jono¬ wego (na przyklad Mercka, 7,5 «mm, 20 cm) zrówno¬ wazona 0,02 N kwasem octowym i eluuje 0,02 N 40 roztworem kwasu octowego. Eluat odparowuje sie w temperaturze 25° pod wysoka próznia a pozo¬ stalosc zadaje woda i liofilizuje. Bialy proszek pod¬ daje sie dla oczyszczenia podzialowi Craiga w ukladzie n-butanol-lodowaty kwas octowy-woda 45 (4:1:5), (objetosc fazowa 3 ml). Po 600 stopniach laczy sie frakcje, które wedlug chromatogramu cienkowarstwowego zawieraja jednolity produkt i odparowuje w temperaturze 25° pod wysoka próz¬ nia, nastepnie dodaje wody i liofilizuje. ^Suszenie 50 nad stalym wodorotlenkiem sodu w wysokiej próz¬ ni w temperaturze pokojowej daje bezpostaciowy proszek.W elektroforezie na „Selecta" (pH 1,9, w ciagu 1,5 godziny, 200 V) produkt wedruje 1,8 cm, przy 55 wartosci pH 4,8 — 1,2 cm. W chromatogramie cienkowarstwowym na „Alox" Rf 52 =0,65; Rf 79 = 0,60; Rf 45 = 0,72; na „Selecta" Rf 45 = 0,55; Rf 101 A = 0,63; Rf 52 = 0,38.Substancje wyjsciowa mozna otrzymac w na- 60 stepujacy sposób: 1. TRI-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe. 9,1 g TRI-Cys/TRI/-OH i 3,2 g H-Gli-Asp-NH2- -Leu-OMe rozpuszcza sie w 60 ml dwumetyloform¬ amidu i mieszajac w temperaturze 0° dodaje 3,7 g 65 dwucykloheksylokarbodwuimidu. Po 15 godzinach w temperaturze 0° odsacza sie dwucykloheksylo- mocznik, przesacz odparowuje do sucha i pozosta¬ losc krystalizuje z chloroformu-eteru naftowego.Temperaitura topnienia 126—130°. W chromattogra- mie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf = 0,27 w ukladzie chloroform-metanol (95:5). 2. H-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe-octan. 1,8 g TRI-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe roz¬ puszcza sie w 16 ml lodowatego kwasu octowego i zadaje w temperaturze pokojowej kroplami 4 ml wody. Po 1 godzinie, w temperaturze pokojowej, dodaje 12 ml wody, odsacza wydzielony tritylokar- binol i przesacz odparowuje do sucha w temperatu¬ rze 40° pod wysoka próznia. Oleista pozostalosc rozpuszcza w Ill-rzed. butanolu i liofilizuje. W wyniku otrzymuje sie bialy proszek, który w chro¬ matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym wykazuje Rf = 0,45 w ukladzie chloro¬ form-metanol (8 :2). 3. Ac-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe.Do 1,02 g H-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe. oc- * tan i 0,9 ml lodowatego kwasu octowego w 15 ml chloroformu dodaje w temperaturze 0° 1,9 suchego dwucykloheksylokarbodwuimidu. Po okolo 10 mi¬ nutach mieszanina reakcyjna zestala sie na papke.Rozciencza sie ja 10 ml chloroformu i miesza w ciagu 4 godzin w temperaturze 0°. Po dodaniu 30 ml eteru naftowego odsacza sie i przekrystalizowu- je osad z goracego chloroformu. Temperatura top¬ nienia 156—158°. W chromatogramie cienkowar¬ stwowym na zelu krzemionkowym Rf = 0,25 w u- kladzie chloroform-metanol (9:1). 4. Ac-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH-NH2. 2,42 g Ac-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe w 21 ml dwumetyloformamidu zadaje sie 3,75 ml wo- dzianu hydrazyny i pozostawia klarowny roztwór w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojowej, po czym chlodzi do temperatury 0° i mieszajac doda¬ je 150 ml wody. Osad odsacza sie, przemywa zim¬ na woda i suszy nad pieciotlenkiem fosforu. Dla oczyszczenia wytraca sie z goracego metanolu. Rf 53 = 0,55 w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym.. Ac-Cys /TRI/ -Gli-Asp-NH2-Leu-Ser/tBu/-Tre /tBu/-Cys /TRI/ -Met-Leu-Gli-OH. 1,44 g Ac-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH-NH2 rozpuszcza sie w 10 ml dwumetyloformamidu i w temperaturze —10° pluczac azotem zadaje 2,5 ml 2,0 N chlorowodoru w octanie etylu i 0,26 ml III- -rzed -azotynu butylu. Po 15 minutach, w tempe¬ raturze —10° dodaje kroplami ochlodzony do tem¬ peratury —10° roztwór 1,02 g H-Ser/tBu/-Tre/tBu/- -Cys/TRI/-M€it-Leu-G!li OH. (sól kwasu octowego^ i 0,84 ml trój etyloaminy w 12 ml dwometylofoTm- amidu tak, aby nie przekroczyc temperatury —10° i miesiza jeszcze w ciagu 1 godizmy w temperaturze —10°, a nastepnie pozastawia w temperaturze 0° na okres 24 godzin. Produkt wytraca sie jako zeli.Mieszanine zateza sie do objetosci okolo 5 ml, wytraca calkowicie za pomoca dodania 20 ml me¬ tanolu, odsacza i przemywa zimnym dwumetylo- formamidem-metanolem (1 :1). Po trzykrotnym roz¬ cieraniu z, zimna woda i wysuszeniu nad stalym wodorotlenkiem sodu, wytraca sie raz z dwumety-92914 45 loformamidu-metanolu, przez co otrzymuje sie tru¬ dno rozpuszczalny produkt w postaci czystej. Rf = = 0,25, w ukladzie chloroform-metanol (8:2) *na zelu krzemionkowym. 6. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 12.Roztwór 410 mg Ac-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu- -Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH w 35 ml dwumetyloformamidu wkrapla sie w tempera¬ turze pokojowej, w atmosferze obojetnego gazu w ciagu 15 minut do intensywnie mieszanego roz¬ tworu 1,0 g jodu w 150 ml metanolu. Po wkrople- niu miesza sie jeszcze w ciagu godziny, po czym ochladza do temperatury 0° i odbarwia roztwór reakcyjny przez dodawanie kroplami 1,0 N roz¬ tworu tiosiarczanu sodu, a nastepnie odparowuje sie metanol w temperaturze 30°, pod cisnieniem obnizonym za pomoca pompki wodnej, a nastepnie pod wysoka próznia (temperatura 30°) do objetosci okolo 10 ml, zadaje 200 ml eteru i dekantuje z nad wytraconej zywicy, rozciera 3 razy eterem i 3 razy woda i suszy nad stalym wodorotlenkiem sodu pod wysoka próznia. Produkt w celu oczysz¬ czenia rozpuszcza sie w chloroformie, saczy i po¬ nownie wytraca z przesaczu heksanem. Rf 70 = = 0,5Ó;r Rf 43 C = 0,35 na zelu krzemionkowym. 7. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 11. 116 mg Pochodnej peptydu o wzorze 12 250 mg H-Tre-/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu/ -Fen-Asp-NH2-Liz-/BOC/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen- -Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal-Ala-Pro- -NH2 i 16 mg N-hydroksybursztynoimidu rozpusz¬ cza sie w 2 ml dwumetyloformamidu i w tempe¬ raturze pokojowej dodaje 30 mg suchego dwucy- klaheksylokarbodwuiimidu i pluczac azotem utrzy¬ muje w ciagu 24 godzin w temperaturze 40°. Na¬ stepnie zestaw ten bez odsaczania dwucykloheksy- lomocznika zageszcza w wysokiej prózni do kon¬ systencji oleju i ten rozciera z metanolem-eterem (1:1) na proszek i odsacza. Produkt oczyszcza sie przez dwukrotne wytracenie z metaniol-u-eteru. Rf 43 E=0,50; Rf 52 A= 0,30; Rf 100=0,32; Rf 107 = =0,65 na zelu krzemionkowym.Przyklad V. Dezamino — Kalcytonina M o wzorze 15. 50 mg pochodnej peptydu o wzorze 14 zadaje sie 0,95 ml stezonego kwasu solnego, pluczac azotem w temperaturze 0°, reakcje prowadzi sie jeszcze w ciagu 5 minut, a nastepnie podlacza naczynie reakcyjne pod wysoka próznie i mieszajac po 5 minutach dodaje 40 ml III-rzed. butanolu i otrzy¬ many produkt liofilizuje. Otrzymuje sie bialy o- bjetosciowy proszek, który w chromatogramie cien¬ kowarstwowym na celulozie wykazuje Rf 45=0,54; Rf 52=0,34; na tlenku glinu Rf 45=0,47; Rf 52=0,61 i Rf 79=0,66.W elektroforezie na celulozie „Selecta" 1440 (pH 1,9, 1,5 godziny, 280 V produkt wedruje 1,8 cm, przy wartosci pH 4,8:1,2 cm w kierunku katody.Substancje wyjsciowa mozna otrzymac jak naste¬ puje: 1. Bmp/TRI/-OH. Rozpuszcza sie 6,37 g swiezo destylowanego kwasu pnmeiikaptoptfopionowego w 100 ml benzenu i dodaje porcjami, w temperaturze 46 0°, pluczac azotem, 25,1 g trójfenylornetami. Po skonczonym dodawaniu usuwa sie chlodzenie lodo¬ we, przy czym z pierwotnie klairownego roztwo¬ ru zaczyna sie wytracac produkt. Po 2 godzinach (mieszanine ochladza sie do temperatury 0°, produkt odsacza i przemywa zimnym metanolem. Przekry- stalizowanie z chlorku metylenu-metanolu ,daje czysty produkt o temperaturze topnienia 200—201°. 2. Bmp/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe. Do miesza¬ lo nego w temperaturze 0° roztworu 2,62 g Bmp/TRI/- -OH i 1,58 g H-Gli-Asp-NH2-Leu- OMe w 30 ml dwumetylioformamiidu dodaje 1,86 g dwucyklohe- ksylokarbodwuimidu. Po 24 godzinach odsacza sde w temperaturze 0° dwucykloheksylomocznik i prze- sacza odparowuje do sucha w temperaturze 40°.Produkt oczyszcza sie przez wytracenie z metano¬ lu. W chroimatogiraimiie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf 45=0,67. 3. Bmp/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH-NH2. 1,06 g Bmp/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe w 30 ml metanolu zadaje sie 3 ml wodzianu hydrazyny. Po 2 godzinach w temperaturze pokojowej po zaszcze¬ pieniu krystalizuje hydrazyd. Po krystalizacji z go¬ racego metanolu otrzymuje sie produkt o tempe- raturze topnienia 190—194°. Rf=0,35 w ukladzie chloroform-metanol (8 :2). 4. Bmp/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/ -Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH. 926 mg Bmp/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH-NH2 w 8 ml dwumetyloformamidu w temperaturze —15° za¬ daje sie 2,21 ml 2,21 N chlorowodoru w octanie etylu i 0,18 ml III-rzed. azotynu butylu. Po 15 mi¬ nutach w temperaturze —10° wkrapla sie, ochlo¬ dzony do temperatury —10°, roztwór 1,38 g H-Ser/ /tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH i 0,7 ml trójetyloaminy w 10 ml dwumetyloformamidu. Mie¬ sza sie jeszcze w ciagu godziny w temperaturze —10° i pozostawia w przeciagu 15 godzin w tem¬ peraturze 0°. Po dodaniu 20 ml metanolu osad od¬ sacza sie, przemywa zimnym metanolem a nastep¬ nie rozciera woda, odsacza i suszy nad soda zraca.Jednolity wedlug chromatografii cienkowarstwowej produkt zawiera w 40Vo sól trój etyloamoniowa. W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krze¬ mionkowym jest Rf=0,55 w ukladzie chloroform- -metanol (7:3).. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 15. 50 Do roztworu 1,4 g Bmp/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu- -Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OHw 150 ml dwumetyloformamidu dodaje sie w.temperaturze pokojowej 0,3 ml 1,0 N roztworu kwasu solnego Po czym otrzymany roztwór wkrapla sie w ciagu 55 30 minut w atmosferze obojetnego gazu do inten¬ sywnie mieszanego roztworu 2,25 g jodu w 500 ml metanolu. Mieszanine miesza sie jeszcze w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej, nastepnie o-/ chladza do temperatury 0° i odbarwia za pomoca 60 wkraplania 1,0 N wodnego roztworu tiosiarczanu sodu. Po dodaniu 1,6 ml 0,5 N roztworu wodoro¬ tlenku sodowego, mieszanine poreakcyjna zateza sie w temperaturze lazni 40° do 20 ml, po czym do¬ daje okolo 400 ml eteru i dekantuje. Pozoa^osc 65 rozciera sie z 20 ml wody, przesacza, plucze ziou^ 4547 92914 48 woda i suszy nad stalym wodorotlenkiem sodu.Produkt oczyszcza sie przez wytracenie z chloro¬ formu — eteru. W chromatogramie cienkowarstwo¬ wym na zelu krzemionkowym Rf 121 A=0,43; Rf 100=0,34/ Rf 43=0,28. 6. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 14. 46 mg pochodnej peptydu o wzorze 15, 81 mg H-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/OtBu Fen-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen-Pro- Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal-Gli-Ala-Pro- NH2, 9,7 mg N-hydroksybursztynoimidu i 13 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu w 2 ml dwumety- loformamidu zostawia sie na przeciag 3,5 godzin w temperaturze 45°. Klarowny roztwór wkrapla sie nastepnie do 40 ml absolutnego eteru w temperatu¬ rze 0° i odsacza wydzielony produkt. Oczyszcza sie przez wytracenie z metanolu-wody. Rf 45=0,38 w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krze¬ mionkowym.Przyklad VI. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzorze 1. ^ 120 mg pochodnej peptydu o wzorze 16 z 3 ml 95% kwasu trójfluorooctowego przechowuje sie w ciagu 1,5 godziny pod azotem w temperaturze po¬ kojowej, po czyrn wytworzony produkt wytraca sie eterem, wolnym nadtlenków. Odsaczony produkt przemywa sie eterem do usuniecia kwasu, a nastep¬ nie rozpuszcza w 0,02 N kwasie octowym, przesacza przez kolumne wymieniacza jonowego (Merck nr II) (slabozasadtrwy, postac octonowa) i liofilizuje eluat, Otrzymany dotriakontapeptyd wedruje w elektrofo¬ rezie na „Selecta" przy wartosci pH 1,9 i 280 .V w ciagu 1,5 godziny 3 cm w kierunku katody, przy wartosci pH 4,8, —1,5 cm. Rf 79=0,45; Rf 52=0,42; Rf 45=0,40 na tlenku glinu (Alox); Rf 52=0,28; Rf 45=0,42; Rf 101 A=0,50 na „Selecta".Substancje wyjsciowa mozna otrzymac w naste¬ pujacy sposób: 1. H-Pro-Ot-Bu. 9,15 g Z-Pro-OtBu w 100 ml me¬ tanolu uwodornia sie w obecnosci 1,0 g wegla palla¬ dowego (10% Pd) w temperaturze pokojowej. Przyj¬ mowanie wodoru zakonczone jest po 30 minutach.Roztwór odsacza sie od katalizatora i odparowuje w temperaturze 30° pod cisnieniem obnizonym za pomoca pompki wodnej. Otrzymany w wyniku olej, wedlug chromatogramu cienkowarstwowego wyka¬ zuje w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf=0,55 w ukladzie chloroform- -metanol (1:1), 2. Z-Ala-Pro-OtBu. 10,32 g Z-Ala-ONP i 5,0 g H- -Pro-OtBu w. 10 ml octanu etylu utrzymuje sie w w temperaturze pokojowej, po czym uzyskany pro¬ dukt rozciera sie z 100 ml octanu etylu, plucze w 50° nasyconym roztworem weglanu potasu i woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje. Otrzymany olej jest jednolity wedlug chromatogramu cienko¬ warstwowego na plytkach z zelem krzemionko¬ wym (Rf=0,65 w ukladzie chloroform-metanol (9 : : 1), produkt przerabia sie bezposrednio dalej. 3. H-Ala-Pro-OtBu. 9,36 g Z-Ala-Pro-OtBu w 100 ml metanolu uwodornia sie w obecnosci 500 mg wegla palladowego (10% Pd), w temperaturze po¬ kojowej. Przyjmowanie wodoru zakonczone jest po 90 minutach. Roztwór odsacza sie od katalizato¬ ra i odparowuje do konsystencji oleju w tempe¬ raturze 30° pod próznia pompki wodnej. Otrzymany olej jest jednolity wedlug chromatogramia cien- kowarstwowego na zelu krzemionkowym. Rf=0,35, w ukladzie chloroform-metanol (1:1). 4. Z-Gli-Ala-Pro-OtBu. 1,65 Z-Gli-ONP i 1,09 g H-Ala-Pro-OtBu w 200 ml octanu etylu utrzymuje sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 0° i 20 go- dzin w temperaturze pokojowej, po czym rozcien¬ cza sie octanem etylu, plucze roztworem weglanu potasu w 50°/o nasyconym, woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje. Otrzymuje sie 2,06 g oleju je¬ dnorodnego w chromatogramie cienkowarstwowym Rf=0,8 w ukladzie chloroform-metanol (1:1) na zelu krzemionkowym.. H-Gli-Ala-Pro-OtBu. 2,06 g Z-Gli-Ala-Pro- -OtBu w 30 ml metanolu uwodornia sie w obecnos-' ci 300 mg wegla palladowego (10°/o Pd) w tempera- turze pokojowej. Przyjmowanie wodoru zakonczone jest w ciagu 90 minut. Nastepnie odsacza sie ka¬ talizator a przesacz zateza do objetosci okolo 5 ml i dodaje 10 ml eteru. W ciagu nocy wykrystalizuje produkt. Temperatura topnienia 132—134°; Rf=0,3 w ukladzie chloroform-metanol (1:1) na silikazelu. 6. Z-Wal-Gli-Ala-Pro-OtBu. 3,73 g Z-War-ONP i 2,99 g H-Gli—Ala-Pro-OtBu w 12 ml octanu ety¬ lu miesza sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 0° i 20 godzin w temperaturze pokojowej. Po roz- cienczeniu octanem etylu plucze sie roztworem we¬ glanu potasu w 50% nasyconym i woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje cisnieniem obnizo¬ nym za pomoca pompki wodnej w temperaturze °. Olej przekrystalizowuje sie z metanolu-wody.Temperatura topnienia 73—75°. W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf= =0,42 w ukladzie toluen-aceton (1 :1) i Rf=0,46 w ukladzie chloroform-metanol (9 :1). 7. H-Wal-Gli-Ala-Pro-OtBu. 533 mg Z-Wal-Gli- 40 -Ala-Pro-OtBu w 10 ml metanolu uwodornia sie w obecnosci 300 mg wegla palladowego (10% Pd), w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach przyj¬ mowanie wodoru jest zakonczone. Odsacza sie ka¬ talizator a przesacz odparowuje cisnieniem obnizo- 45 nym za pomoca pompki wodnej w temperaturze ° do uzyskania oleju. Rf=0,52 w ukladzie chloro¬ form-metanol (1 :1) na zelu krzemionkowym. 8. H-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/ /OtBu/-Fen-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His-Tre/tBu/- 50 -Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH. 270 mg Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp /OtBu/-Fen-Asp-NH2-Liz/BOC/-Fen-His/Tre/tBu/- -Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH, roz¬ puszcza sie w 30 ml 80% kwasu octowego i uwS- 55 dornia w obecnosci 50* mg palladowego wegla (10% Pd) az do zakonczenia odszczepienia grupy karbo-, benzoksy. Po odsaczeniu katalizatora roztwór za¬ teza sie w wysokiej prózni w temperaturze 30°, po czym liofilizuje z trzeciorzedowego butanolu. Wy- 60 dajnosc ilosciowa. 9. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 17. 181 mg pochodnej peptydu o wzorze 7 rozpuszcza sie w 1,8 ml czterowodorofuranu wolnego od nad- 65 tlenków i w temperaturze —10° do —15°, prze-92914 49 50 puszczajac przez roztwór azot zadaje 0,017 ml N- -metylomorfoliny i 0,019 ml estru izobutylowego kwasu chloromrówkowego, nastepnie po 10 minu¬ tach* w tej samej temperaturze dodaje roztwór 225 mg, otrzymanej powyzej (punkt 8) pochodnej oktadekapeptydu w 5 ml 95°/o dwumetyloformami- du i 0,02 ml N-metylomorfoliny. Miesza sie jesz¬ cze w ciagu 30 minut w temperaturze —10° i 2 godziny w temperaturze 0°% Za pomoca dodania eteru wolnego od nadtlenków wytraca sie surowy produkt, który rozpuszcza sie ponownie w dwume- tyloformamidzie a nastepnie wytraca, wkraplajac lodowato zimny 0,02N roztwór kwasu solnego. Dwu¬ krotne wytracenie z dwumetyloformamidu-octanu etylu daje czysty produkt. W chromatogramie cien¬ kowarstwowym na zelu krzemionkowym Rf 52 A= =0,43.. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzorze 16. 374 mg wytworzonej powyzej (punkt 9) pochod¬ nej peptydu, 160 mg H-Wal-Gli-Ala-Pro-OtBu, 46 mg hydroksys.ukcyniimddu i 3 ml dwumetyMorm- aimidiu zadaje sie pod azotem, w tamperaituirae po¬ kojowej, 62 mg dwucykloheksyiokarbodwuiimidu i utrzymuje w temperaturze pokojowej w ciagu kilkunastu godzin. Produkt wytraca sie eterem, od¬ sacza, przemywa dobrze eterem i octanem etylu i ponownie rozpuszcza w dwumetyloformamidzie a nastepnie wytraca, wkraplajac do lodowato zim¬ nego 0,05M roztworu kwasu cytrynowego.Przyklad VII. Sposób wytwarzania N*-ace- tylo-Kalcytoniny M. 100 mg Kalcytoniny M — oc¬ tan (lub chlorowodorek) rozpuszcza sie w 5 ml mieszaniny wody z dwumetyloformamidem (2:1), dodaje 77 \il 10% roztworu p-nitrofenylooctanu w dwumetyloformamidzie i doprowadza pH do war¬ tosci 9,1 za pomoca 0,5 M wodnego roztworu trój- etyloaminy. Przy tej wartosci pH nastepuje reak¬ cja, która doprowadza sie do konca w ciagu 1 go¬ dziny przez ciagle utrzymywanie stalej wartosci pH za pomoca trójetyloaminy. Nastepnie dodaje sie 150 |jtl lodowatego kwasu octowego i ekstrahuje 3 razy octanem etylu po 10 ml. Wodna faze odpa¬ rowuje sie do sucha, pozostalosc oczyszcza sie za pomoca podzialu Craiga w ukladzie n-butanol-lo- dowaty kwas octowy — woda (4:1:5) poprzez 170 stopni. Z elementów podzialu nr 109 — 138 (max= =122; K=2,5) po odparowaniu do sucha otrzymuje sie czysta N*-acetylo-Kalcytonine M jako bezposta¬ ciowy, rozpuszczalny w wodzie proszek.W chromatogramie cienkowarstwowym na celu¬ lozie (Selecta) Rf 101 A=0,67; na tlenku glinu („Alox", firmy Camag) Rf 52=0,68.W elektroforezie cienkowarstwowej na plytkach celulozowych (Selecta), 17 V/cm w ciagu 1,5 godzi¬ ny, przy buforze o wartosci pH 1,9 substancja we¬ druje w kierunku katody o 2,6 cm natomiast przy wartosci pH 8,0 przesuwa sie o 0,6 cm w kierunku anody.Przyklad VIII. Sposób wytwarzania mono i dwuacetylo pochodnej Kalcytoniny M. 10 mg Kal¬ cytoniny M w postaci octanu rozpuszcza sie w 2 ml absolutnego dwumetyloformamidu, zadaje 0,5 ml l°/o roztworu p-nitrofenylooctanu w dwumetylo¬ formamidzie, plucze azotem i pozostawia zamkniete naczynie w ciagu 30 minut w temperaturze 40°.Nastepnie dodaje sie 5 ml 2N roztworu kwasu oc¬ towego, ekstrahuje nadmiar octanu p-nitrofenylu i utworzony p-nitrofenol octanem etylu (2X30 ml), odparowuje wodna faze do sucha pod obnizonym cisnieniem, rozpuszcza ponownie w 0,5 ml 95f/» kwasu octowego i liofilizuje. Otrzymany produkt stanowi mieszanine mono- i dwuacetylopochodnej, obok niewielkiej ilosci substancji wyjsciowej. Na- io tomiast pochodna monoacetylowa stanowi miesza¬ nine N«- i Ne — pochodnej, jak wykazuje elektro¬ foreza przy wartosci pH8. • ¦ Rozdzielenie substancji wyjsciowej, zwiazku mo¬ no- i dwuacetylowego przeprowadza sie za pomoca podzialu Craiga, w ukladzie n^butanol — lodowa¬ ty kwas octowy — woda (4:1: 5), albo przy po¬ mocy preparatywnej elektroforezy cienkowarstwo^ wej na plytkach celulozowych (Selecta) przy pH 1,9 (1,5 godziny przy 17 wolt/cm), droga wedrów- ki — patrz nizej. Otrzymana w ten sposób mie¬ szanine obu pochodnych monoacetylowych rozdzie¬ la sie ponownie za pomoca preparatywnej elektro¬ forezy cienkowarstwowej, prowadzonej w ciagu 3 godzin przy 17 V/cm, przy uzyciu buforu o war- tosci pH 8 (bufor: 0,1M roztwór trójetyloaminy na¬ stawiony przy pomocy dwutlenku wegla na pH 8,0.Przy wiekszych ilosciach substancji stosuje sie cia¬ gla beznosnikowa elektroforeze, równiez przy war¬ tosci pH 8. W obu przypadkach zachowuje sie N« — acetylopochodna Kalcytoniny M elektrycznie obo¬ jetnie, podczas gdy N« — acetylopochodna wedru¬ je do anody.Zwiazki wykazuja nastepujace wartosci Rf: Na- acetylo-Kalcytondna M na celulozie „Selecta" Rf 101A=0,67, na tlenku glinu („Alox", firmy Camag) Rf 52=0,68. Ne^acetyio-Kalcytonina ma w obu ukladach te same wartosci Rf co Na-acetyflio-Kalcy^ tonina M (ICalcytonina M wykazuje w tych ukla¬ dach Rf 101A=0,56 i Rf 52=0,62=/ N*,N*-dwuace- 40 tylo-Kalcytonina M wykazuje w obu tych ukladach Rf 101A=0,75 i Rf 52=0,73.W elektroforezie cienkowarstwowej na plytkach celulozowych („Selecta"), dlugosc drogi wedrowa¬ nia N«- i Ne-monoacetylo-Kalcytoniny M=2,6 cm 45 przy wartosci pH 1,9, 90 minut, 17 wolt/cm, dlu¬ gosc drogi zas Na,Ne-dwuacetylo-Kalcytoniny M — w tych samych warunkach wynosi 1,3 cm (Kalcy¬ tonina M — 3,7 cm). Przy wartosci pH 8,0 wedru¬ je Ne-acetylo-Kalcytonina M w ciagu 90 minut przy 50 17 wolt/cm+0,6 cm, podczas gdy N*-acetylo-Kalcy- tonina M (tak samo jak Kalcytonina M) pozostaje w punkcie startowym.Przyklad IX. Opisana w przykladzie I sub¬ stancje wyjsciowa o wzorze 18 mozna otrzymac 55 równiez wedlug nizej podanego sposobu. 1. BOC-Ser-Tre-OBzl. Do roztworu 73,8 g BOC- -Ser-OH • soli dwucykloheksyloamoniowej w 500 ml chlorku metylu dodaje sie 47,0 g H-Tre-OBzl • • HC1 w 300 ml chlorku metylenu, miesza w ciagu 60 lo minut w temperaturze pokojowej, a nastepnie ochladza do temperatury —5°, po czym w tej tem¬ peraturze wkrapla sie roztwór 40,1 g dwucyklohek- sylokarbodwuimidu w 90 ml chlorku metylenu i miesza sie w ciagu 3 godzin w teamperafajanze —5° 65 a nastepnie w ciagu calej nocy w temperaturze51 92914 52 pokojowej. Po odsaczeniu dwucykloheksylomoczni- ka i chlorowodorku dwucykloheksyloaminy wytrza¬ sa sie roztwór, a mianowicie 3 razy 0,1N roztwo¬ rem kwasu solnego, 2 razy 20°/o roztworem soli kuchennej, raz 10% roztworem kwasnego weglanu sodu i 2 razy 20% roztworem soli kuchennej, po czym suszy siarczanem sodu. Roztwór zateza sie do okolo 600 ml, ochladza do temperatury 5° i od¬ sacza dalsza ilosc dwucykloheksylomocznika. Po odparowaniu do siacha, pozostalosc krystalizuje sie z octanu etylu-hekisanu. Temperaltuira topnienia 110- —dll°f [a]20D= —8,5° (c=2 w dwumetyMoirimaimi- dzie; Rf 2=0,33 na zelu krzemionkowym. 2. H-Ser-Tre-OBzl • TFA • 65,7 g BOC-Ser-Tre- -OBzl rozpuszcza sie w 100 ml 90% kwasu trój- fluorooctowego i pozostawia roztwór w ciagu go¬ dziny w temperaturze 20°, a nastepnie mieszajac wkrapla sie do 1000 ml suchego eteru, miesza w ciagu godziny i pozostawia w ciagu nocy w tempe¬ raturze —10°. Powstaly osad odsacza sie i 3 razy plucze suchym eterem, po czym suszy w prózni pod obnizonym cisnieniem nad stalym wodorotlenkiem sodu. Otrzymuje sie produkt o temperaturze top¬ nienia 128—129°; Rf 7=0,65; Rf 4=0,50 na zelu krzemionkowym. 3. BOC-Leu-Ser-Tre-OBzl • 52,5 g H-Ser-Tre- -OBzl • TFA rozpuszcza sie w 145 ml dwiimetylo- formamidzie i dodaje w temperaturze 0° roztwór 48,0 g BOC-Leu-ONP, nastepnie dodaje 21 ml trój- etyloaminy i 0,75 ml lodowatego kwasu octowego, po czym miesza w ciagu 3 godzin w temperaturze 0° i w ciagu nocy w temperaturze pokojowej. Po dodaniu 2,1 litra octanu etylu roztwór wytrzasa sie, kolejno 2 razy z woda, 2 razy z 0,1N roztworem kwasu solnego, 2 razy J0% roztworem soli kuchen¬ nej, 8 razy 20% roztworem weglanu potasu, 2 razy % i raz 30% roztworem soli kuchennej. Roztwór po wysuszeniu siarczanem sodu zateza sie do okolo 1,4 litra. W ciagu nocy wykrystalizowuje w lodów¬ ce chroniony trójpeptyd o temperaturze topnienia 114—116°; [ dzie; Rf 2=0,25 na zelu krzemionkowym. 4. H-Leu-Ser-Tre-OBzl • TFA. 46,1 g BOC-Leu-Ser-Tre-OBzl rozpuszcza sie w 92,5 ml 90% kwasu trójfluorooctowego i pozostawia w ciagu godziny w temperaturze 20°, po czym mie¬ szajac dodaje, suchego eteru (925 ml), miesza jesz¬ cze w ciagu godziny w temperaturze 0° i pozosta¬ wia na noc w temperaturze —10°. Powstaly osad odsacza sie, przemywa 3 razy suchym eterem i su¬ szy pod obnizonym cisnieniem nad stalym wodoro¬ tlenkiem sodu. Otrzymuje sie produkt o tempera¬ turze topnienia 168—171°; Rf 7=0,80 (na zelu krze¬ mionkowym).. BOC-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-OBzl. ,8 g BOC-Asp-NH2-OH szlamuje sie w 208 ml acetonitrylu, dodaje 22,7 g odczynnika K, Wood- warda i miesza w ciagu 30 minut w temperaturze ° po czym mieszajac, wkrapla 12,6 ml trójety lo¬ aminy tak, aby temperatura nie przekroczyla +32°, ochladza do 20° i miesza w tej temperaturze jeszcze w ciagu 50 minut. Prawie klarowny roztwór ochla¬ dza sie do temperatury 0° i dodaje równiez do roz¬ tworu 39,1 g H-Leu-Ser-Tre-OBzl • TFA i 10,5 ml trójetyloaminy w 257 ml dwumetyloformamidu ochlodzonego równiez do temperatury 0°. Zestala¬ jaca sie mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu nocy w temperaturze pokojowej, ochladza do tem¬ peratury —10° i miesza jeszcze w ciagu 2 godzin w temperaturze —10°, po czym odsacza krystalicz¬ ny osad i plucze pochodna tetrapeptydu zimnym afcetoniitryilem, octanem etylu i 3 razy woda, az do usuniecia chlorku. Otrzymany produkt przekrystali- zowuje sie z 370 ml dwumetyloformamidu, 3,7 ml io lodowatego kwasu octowego i 370 ml acetonitrylu.Temperatura topnienia 225—226°; [a]20D= —36° (c = =2 w dwumetylotformamidzie); Rf 6=0,85 (ma siM- kazelu). 6. H-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-OBzl • TFA • 32 g BOC-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-OBzl rozpuszcza sie w 192 ml 90% kwasu trójchlorooctowego i pozostawia w ciagu 45 minut w temperaturze 20°, po czym roztwór zateza sie do objetosci okolo 40 ml, do¬ daje mieszajac 400 ml eteru i miesza w ciagu 20 minut w temperaturze 35° pod chlodnica zwrotna.Nastepnie krystaliczna zawiesine ochladza sie do temperatury —10° i pozostawia na noc w tempe¬ raturze —10°. Osad odsacza, przemywa 3 razy ete¬ rem i suszy w prózni nad soda zraca pod obnizo- nym cisnieniem nad stalym wodorotlenkiem sodu otrzymujac produkt o temperaturze topnienia 125— —127°; Rf 4=0,33 (na zelu krzemionkowym). 7. BOC-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-OBzl • 26,3 g H-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-OBzl • TFA rozpuszcza sie w 100 ml dwumetyloformamidu, ochladza do temperatury 0° i kolejno dodaje 7,5 ml trójetylo- aminu, 0,54 ml lodowatego kwasu octowego oraz roztwór 14,4 g BOC-Gli-ONP w 100 ml dwumety¬ loformamidu, miesza w temperaturze pokojowej az do zestalenia mieszaniny i pozostawia na 2 dni.Nastepnie mieszajac dodaje sie 300 ml octanu ety¬ lu i pozostawia na noc w temperaturze —10°. Osad odsacza, plucze 2 razy octanem etylu i 2 razy ete¬ rem, miesza w ciagu pól godziny z 200 ml wody, 40 odsacza, plucze woda i suszy pod obnizonym cis¬ nieniem. Temperatura topnienia 227—228°; [ = —23° (c=2 w dwumetyloformamidzie); Rf 9 = =0,50 (na zelu krzemionkowym). 8. BOC-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-OH • 17,0 g 45 BOC-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-OBzlrozpuszcza sie w 340 ml dwumetyloformamidu, przy ogrzewaniu i po ochlodzeniu do temperatury pokojowej dodaje 3,4 g wegla palladowego (10% Pd) i uwodornia. Po 4 godzinach redukcja jest zakonczona. Po odsacze- 50 niu katalizatora, roztwór odparowuje sie w wyso¬ kiej prózni. Trzykrotne rozcieranie z eterem daje wedlug chromatogramu cienkowarstwowego jedno¬ rodny pentapeptyd o temperaturze topnienia 181— —1£3°; [a]20D= -^16,5° (c=2 w dwumetyloformami- 55 dzie); Rf 7=0,65 (na zelu krzemionkowym). 9. BOC-Gli-Asp-NH2-LeurSer-Tre/Cys/Bzl/-N2H2- -Z. 9,2 g H-Cys/Bzl/-N2H2-Z • HC1 rozpuszcza sie w 300 ml swiezo destylowanego dwumetyloform- 60 amidu, dodaje 12,2 g BOC-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser- -Tre-OH i miesza w% temperaturze pokojowej az do rozpuszczenia, nastepnie roztwór ochladza sie do temperatury 0°, dodaje 3,28 ml trójetyloaminy i 4,88 g N-hydroksybursztynoimidu w 100 ml dwu- 65 metyloformamidu, ochladza do temperatury —2253 i dodaje roztwór 4,36 g dwucykloheksylokarbodwu- imidu w 30 ml dwumetyloformamidu i miesza sie w ciagu 1 godziny w temperaturze —22°, po czym powoli podnosi sie temperature i miesza jeszcze w ciagu 3 dni w temperaturze pokojowej, odsacza wytracony dwucykloheksylomocznik i roztwór od¬ parowuje w wysokiej prózni do sucha. Pozostalosc miesza sie z mieszanina octanu etylu i 5% roztwo¬ ru kwasu cytrynowego, odsacza osad, plucze woda, suszy pod obnizonym cisnieniem, miesza z suchym eterem, odsacza i suszy pod wysoka próznia. Tem- peraituira topnienia 173^178°, [a]20D= —26,5° (c=2w dwumetyloifoirmaimidzie); Rf l=0,2il (na zelu krze¬ mionkowym).. H-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-Cys/Bzl/-N2H2- -Z • TFA • 13 g BOC-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-Cys/ /Bzl/-N2H2-Z rozpuszcza sie w 130 ml 90% kwasu trójfluorooctowego i pozostawia roztwór w ciagu 2 godzin w temperaturze 22°. Potem odparowuje sie roztwór, miesza pozostalosc 3 razy eterem i suszy pod obnizonym cisnieniem nad stalym wodoro¬ tlenkiem sodu. Otrzymuje sie produkt o tempera¬ turze topnienia 159—161°. Rf 6=0,63 (na zelu krze¬ mionkowym). 11. BOC-Cys/Bzl/-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-Cys/ /Bzl/-N2H2-Z • 6,69 g BOC-Cys/Bzl/-OSU i 12,2 g H- -Gli-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-Cy s-/Bzl/-N2H2-Z 1,22 TFA rozpuszcza sie w 100 ml dwumetyloformamidu.Z roztworu 150 mM trój etyloaminy w 100 ml dwu¬ metyloformamidu wkrapla sie, mieszajac, tyle trój- etyloaminy, az mieszanina reakcyjna wykaze na wilgotnym papierku indykatorowym wartosc pH 6,4. Roztwór miesza sie w ciagu 3 dni w tempera¬ turze pokojowej, po czym odparowuje do sucha pod wysoka próznia. Pozostalosc miesza sie z 300 ml octanu etylu, nastepnie 3 razy z mieszanina 150 ml octanu etylu i 30 ml 5% roztworu kwasu cytry¬ nowego, odsacza, suszy pod obnizonym cisnieniem i krystalizuje z dwumetyloformamidu — octanu etylu. Temperaitura topnienia 191—193°; [a]20D = = —31,5° (c=2 w dwumetyloformamidzie); Rf 8= =0,35 (na zelu krzemionkowym). 12. BOC-Cys-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser-Tre-Cys- -N2H8- • 6 g BOC-Cys-/Bzl/-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser- -Tre-Cys/Bzl/-N2H2-Z rozpuszcza sie w temperatu¬ rze —40° w 700 ml suchego cieklego amoniaku i mieszajac dodaje sie w temperaturze wrzenia amoniaku 973 mg sodu w ten sposób, aby zabarwie¬ nie mieszaniny reakcyjnej bylo tylko jasnoniebies¬ kie. Po 25 minutach redukcja jest zakonczona. Mie¬ sza sie jeszcze w ciagu 10 minut przy zachowaniu niebieskiego zabarwienia, nastepnie dodaje 2,4 ml lodowatego kwasu octowego i odparowuje pod wy¬ soka próznia (okolo 1 mmHg) do sucha. Pozostalosc miesza sie z 12 ml wody, 3,2 ml lodowatego kwasu octowego i 20 ml octanu etylu w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°, odsacza osad, plucze 2 razy 10 ml 1% roztworu kwasu octowego i raz 10 ml octa¬ nu etylu i suszy w wysokiej prózni. Rf 5 = 0,65 (na zelu krzemionkowym). 13. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzorze 19 • 1,0 g BOC-Cys-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser- -Tre-Cys-N2H8 rozpuszcza sie w 100 ml dwumetylo¬ formamidu i 500 ml wody, zawierajacej 1,23 ml HC1 i roztwór doprowadza sie do wartosci pH 6,8 54 za pomoca 3,7 ml 0,43N roztworu KOH. Utrzymu¬ jac te wartosc pH, mieszajac wkrapla sie w ciagu 90 minut równoczesnie 247 ml 0,01 M roztworu ze- lazicyjanku i 4,9 ml 0,43N roztworu KOH, miesza jeszcze w ciagu 90 minut w temperaturze pokojo¬ wej, a nastepnie nastawia wartosc pH roztworu na 4,0 za pomoca 0,7 ml lodowatego kwasu octowego i miesza roztwór z 50 ml Dowex — 2-XB w postaci octanowej, potem z 13 ml Dowex-50 W-XB, (postac H+), odsacza i odparowuje do sucha. Pozostalosc rozpuszcza sie w 50% trzeciorzedowym butanolu, liofilizuje i suszy w wysokiej prózni. Produkt za¬ wiera okolo 15% octanu potasu i jest jednorodny w chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym; Rf 5=0,63; Rf 6=0,70; Rf 7=0,75. . 14. H-Leu-Gli-OEt • HC1 • 14 g Z-Leu-Gli-OEt ^ (otrzymanego wedlug J.R. Vaughan i R.L. Osato, J.Am.Chem.Soc.73, 5553 (1951) rozpuszcza sie w 150 ml absolutnego etanolu, zadaje 11,5 ml 6,9 N roz- tworu HC1 w etanolu i uwodornia w. obecnosci 2,8 g palladowego wegla (10% Pd). Po godzinie od¬ sacza sie katalizator i przesacz odparowuje pod ob¬ nizonym cisnieniem w temperaturze lazni 40°. Po¬ zostalosc jest olejem, który przerabia sie bezposred- nio dalej. Rf 1=0,50 (na zelu krzemionkowym).. BOC-Met-Leu-Gli-OEt • 10,5 g BOC-Met-N,H, w 100 ml dwumetyloformamidu zadaje sie w tem¬ peraturze 0° 14,8 ml HC1 w czterowodorofuranie (5,39N; 80 mM), po czym w temperaturze —20° dodaje 5,4 ml azotynu izoamylu i po 5 minutach w tej samej temperaturze dodaje sie wstepnie ochlodzony roztwór 10,1 g H-Leu-Gli-OEt • HO i 16,9 ml trójetyloaminy w 100 ml dwumetyloform¬ amidu. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w cia- gu 3 dni w temperaturze 0°, po czym wydzielony chlorowodorek trójetyloaminy odsacza i przesacz odparowuje pod wysoka próznia do sucha. Pozosta¬ losc rozpuszcza sie w octanie etylu i plucze kolejno 3 porcjami rozcienczonego kwasu cytrynowego, 3 40 porcjami rozcienczonego roztworu kwasnego wegla¬ nu sodu i woda. Otrzymany po suszeniu i odparo¬ waniu ' roztworu surowy produkt krystalizuje sie z octanu etylu-heksanu. Temperatura topnienia 118^119°; [a]20T= —30° (c=2 w dwumetyloforana- 45 midzie); Rf 1=0,72 (na zefou krzemionkowym). 16. BOC-Met-Leu-Gli-OH • 9,98 g BOC-MetrLeu- -Gli-OEt rozpuszcza sie w 300 ml metanolu i w ciagu 45 minut w temperaturze pokojowej wkrapla sie 57 ml 0,59N roztworu lugu sodowego i miesza 50 jeszcze w ciagu 1 godziny, nastepnie roztwór na¬ stawia sie na pH 7 za pomoca 0,68N roztworu HC1 i odparowuje do sucha. Pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu i wodzie i doprowadza pH do war¬ tosci 2 za pomoca 0,68N roztworu HC1. Faze wodna 55 wytrzasa sie octanem etylu. Polaczone fazy octanu etylu plucze roztworem soli kuchennej, suszy i od¬ parowuje, a pozostalosc krystalizuje z octanu ety¬ lu-heksanu. Temperatura topnienia 137—138°; _ [a]20D= —31° (c=2 w dwumetyloformamidzie); Rf 60 7=0,74 (na zelu krzemionkowym). 17. H-Met-Leu-Gli-OH • 6,9 g BOC-Met-Leu-Gli- -OH rozpuszcza sie w 70 ml 90% TFA i pozostawia w ciagu godziny w temperaturze 20°, po* czym roz¬ twór odparowuje sie i mieszajac dodaje 150 ml ete- 65 ru a nastepnie pozostawia na noc w temperaturze92914 55 —10°. Wytworzony osad odsacza sie i ponownie miesza z 100 ml eteru, odsacza, przemywa 2 razy eterem i suszy pod próznia obnizonym cisnieniem nad stalym wodorotlenkiem sodu. Otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 134—135°; Rf 7=0,52 (na zelu krzemionkowym). 18. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzorze 18 800 mg pochodnej peptydu o wzorze 19 (zawierajacej 15*/o octanu potasu) szlamuje sie w 15 ml dwumetyloformamidu i mieszajac w cia¬ gu 15 minut w temperaturze 45°, przy czym czesc zawiesiny przechodzi do roztworu. Nastepnie mie¬ szanine reakcyjna ochladza sie do temperatury 0° i dodaje najpierw 1,45 ml HC1 w czterowodorofu- ranie (2,0N), oziebia do temperatury —20° i dodaje 0,114 ml azotynu izoamylu. Po 10 minutach, w tem¬ peraturze —20°, dodaje 0,24 ml trój etyloaminy a na¬ stepnie wstepnie ochlodzony roztwór 431 mg H- -Met-Leu-Gli-OH i 0,57 TFA w 5 ml dwumetylo¬ formamidu. Wkrapla sie tyle rozcienczonej trój ety- loaminy z roztworu trój etyloaminy w dwumetylo- formamidzie, az wilgotny papierek indykatorowy wykaze pH 6. Metny roztwór pozostawia sie w cia¬ gu 3 dni w temperaturze 0°, po czym odsacza po¬ wstaly osad, przesacz odparowuje pod obnizonym cisnieniem do sucha i pozostalosc miesza 3 razy z 10Vt roztworem kwasu cytrynowego. Wytworzony produkt odsacza i suszy pod obnizonym cisnie¬ niem. Rf 6=0,68; Rf 7=0,75 (na zelu krzemionko¬ wym).Przyklad X. N«-palmitoilo-Kalcytonina M o wzorze 20. 171 mg pochodnej peptydu o wzorze 21 zadaje sie ml lodowato zimnego, analitycznie czystego, ste¬ zonego kwasu solnego, miesza w temperaturze 0° az do rozpuszczenia (okolo 2 minut) i pozostawia roztwór w ciagu 8 minut w temperaturze 0°, pod azotem, po czym uwalnia od rozpuszczonego gazo¬ wego HC1 za pomoca 1 minutowego obnizenia cis¬ nienia do wartosci 0,01 tor, po czym dodaje 100 ml trzeciorzedowego butanolu i liofilizuje. Otrzymuje sie 138 mg chlorowodorku N*-palmitoilo-Kalcytoni- ny M w postaci bezbarwnego proszku, który w chromatografii cienkowarstwowej na tlenku glinu („Alox") wykazuje Rf 45=0,52, Rf 52=0,76. Pro¬ dukt w tescie wedlug Kumara w stosunku do Kal- cytoniny M wykazuje wyraznie przedluzone dzia¬ lanie.Stosowany jako material wyjsciowy chroniony amid Na-palmitoilodotriakontapeptydu mozna otrzy¬ mac w nastepujacy sposób: 1. Palmitynian p-nitrofenylu (Pal-ONP=ester p- -nitrofenylowy kwasu heksadekanowego). Do 5,0 g p-nitrofenylu w 60 ml mieszaniny chloroformu z ete¬ rem (1:1) chlodzac lodem dodaje sie najpierw 9,4 g chlorku palmitylu a nastepnie 5,0 ml trójetyloami¬ ny. Po 2 godzinach gotowania pod chlodnica zwrot¬ na rozpuszcza sie w octanie etylu i plucze faze or¬ ganiczna 0,5N roztworem weglanu potasu i woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje. Po krystali¬ zacji z mieszaniny eteru etylowego z eterem nafto¬ wym otrzymuje sie platki o temperaturze topnie¬ nia 64^-65°. . 2. Palmitoilo-Cys/TRI/-Gh-Asp-NH2-Leu-OMe • • 1,32 g H-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe i 780 mg 56 palmitynianu p-nitrofenylu rozpuszcza sie w swiezo destylowanym dwumetyloformamidzie i pozostawia w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej. Po odparowaniu rozpuszczalnika produkt rozpuszcza sie i wytraca metanolem otrzymujac zwiazek w postaci chromatograficznie czystej (chromatografia cienkowarstwowa). 3. Palmitoilo-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH- -NH2. Do 1,35 g palmitoilo-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2- io -Leu-OMe w 40 ml metanolu dodaje sie 4,0 ml wo- dzianu hydrazyny i roztwór otrzymuje w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, a nastepnie za- teza w wyparce rotacyjnej w temperaturze 25° do objetosci okolo 20 ml i dodaje 150 ml 0,5N kwasu octowego. Wytracony produkt odsacza sie, przemy¬ wa zimna woda i suszy nad stalym wodorotlenkiem sodu. W chromatogramie cienkowarstwowym wy¬ kazuje produkt na zelu krzemionkowym Rf 100= =0,45. 4. Palmitoilo-Cys-/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser/ /tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-Het-Leu-Gli-OH. 1,08 g Palmitoilo-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH- -NH2 w 10 ml dwumetyloforamidu w temperaturze —15° zadaje sie 1,5 mi 2,0 NHC1 w octanie etylu i 0,17 ml trzeciorzedowego azotynu butylu i po 15 minutach wkrapla sie. w temperaturze —10° ozie¬ biony do temperatury —10° roztwór 980 mg H-Ser/ /tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH i 0,56 ml trójety- loaminy w 10 ml dwumetyloformamidu. Nastepnie mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w ciagu 1 go¬ dziny w temperaturze —10° i 15 — godzin w tem¬ peraturze 0°, po czym dodaje 30 ml metanolu, od¬ sacza wytracony produkt, przemywa zimnym me¬ tanolem i suszy w temperaturze 40° pod wysoka próznia. Otrzymany proszek rozciera sie 3 razy z woda stosujac po 10 ml, a nastepnie stalym wo¬ dorotlenkiem sodu. Po wytraceniu z dwumetylo- formamidu-metanolu otrzymuje sie produkt chro¬ matograficznie czysty. 40 5. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 22.Roztwór 670 ml Palmitoilo-Cys/TRI/-Gli-Asp- -NH2-Leu-Ser/ tBu/-Tre/ tBu/-Cys/ TRI/-Met-Leu- -Gli-OH w 50 ml dwumetyloformamidu, w tempe- 45 raturze pokojowej, wkrapla sie w atmosferze obo¬ jetnego gazu, w ciagu 20 minut do intensywnie mie¬ szanego roztworu 1,0 g jodu w 150 ml metanolu, po czym miesza jeszcze 1 godzine, a nastepnie od¬ barwia roztwór w temperaturze 0° za pomoca 50 wkraplania IN wodnego roztworu tiosiarczanu sodu.Klarowny roztwór zateza sie najpierw pod cisnie¬ niem obnizonym za pomoca pompki wodnej, a na¬ stepnie w wysokiej prózni w temperaturze 30° do okolo 10 ml, zadaje 200 ml miesizantiny z eterco-ete- 55 rem naftowym (1:1) i dekantuje. Pozostalosc po krótkim suszeniu pod cisnieniem obnizonym za po¬ moca pompki wodnej rozciera 3 razy woda po 10 ml i suszy nad stalym wodorotlenkiem sodu. W ' celu oczyszczenia produkt podaje sie wytraceniu 60 z mieszaniny chloroformu eterem naftowym. W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krze¬ mionkowym Rf 53=0,50. 6. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 21. 65 Do roztworu 418 mg peptydu o wzorze 23 290 mg57 92914 58 chronionego amidu dokezapeptydu opisanego w przykladzie II pod 44 i 110 mg N-hydroksyburszty- noimidu w 15 ml swiezo destylowanego dwumety- loformamidu mieszajac dodaje sie przy ogrzewaniu do temperatury 45°, 135 mg dwuheksylokarbodwu- imidu i miesza jeszcze 3 godziny w temperaturze 45°, w atmosferze azotu a nastepnie dodaje jeszcze raz po 70 mg N-hydroksybursztynoimidu i dwucy- kloheksylokarbodwuimidu i miesza 4,5 godzin w temperaturze 45°, po czym oziebia do temperatury 0° i wlewa do 300 ml lodowato zimnego eteru wol¬ nego od nadtlenków eteru.Po 12 godzinach odsacza wytracony osad w tem¬ peraturze 0°, przemywa eterem i suszy pod obni¬ zonym cisnieniem w temperaturze 40°. W celu oczyszczenia produkt rozpuszcza sie w mieszaninie metanolu z chloroformem (1:1) i poddaje chroma¬ tografii wstepujacej na kolumnie "Sephadex" LH20 o wymiarach 110X4,2-cm, odbierajac frakcje po 3 ml, które bada sie w chromatogramie cienkowar¬ stwowym na plytkach z zelem krzemionkowym Rf 52A=0,62.Przyklad XI. Sposób wytwarzania N«-laury- lo-Kalcytoniny M o wzorze 24. 7 mg pochodnej peptydu o wzorze 25 dodaje sie mieszajac do 0,42 ml lodowato zimnego, analitycznie czystego stezonego HC1 i miesza w atmosferze azotu w ciagu 10 minut w temperaturze 0°. Nastepnie w celu usuniecia rozpuszczonego gazowego HC1 pozo¬ stawia w ciagu minuty w temperaturze 0° i pod cisnieniem 0,01 tor, dodaje 6 ml trzeciorzedowego butanolu a nastepnie mieszanine liofilizuje. Otrzy¬ muje sie 5 mg chlorowodorku Na — laurylo-Kalcy- toniny M.W ukladzie testowymi podanym przez Kumara i innych (J. Endocrinology, 33469/1965) produkt wy¬ kasuje przedluzone dzialanie w stosunku do Kal- cyitoniny.Substancje wyjsciowa mozna otrzymac w naste¬ pujacy sposób: 1. Laurynian p-nitrofenylu (Laurylo-ONP = ester p-nitrofenylowy kwasu dodekanowego.Zwiazek ten otrzymuje sie wedlug sposobu po¬ danego w przykladzie X dla palitynianu p-nitrofe¬ nylu, stosujac 5,0 g p-nitrofenolu i 7,2 g chlorku laurylu. 2. Laurylo-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe • 1,5 g laurynianu p-nitrofenylu i 1,65 g H-Cys/TRI/-Gli- -Asp-NH2-Leu-OMe w 25 ml dwumetyloformamidu pozostawia w ciagu 24 godzin w temperaturze po¬ kojowej. Odparowanie rozpuszczalnika i wytrace¬ nie z metanolu daje jednolity produkt w chromato¬ gramie cienkowarstwowym. Rf 53=0,60 na zelu krzemionkowym. 3. Laurylo-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-NH-NH2 • • 1,0 g Laurylo-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-OMe w 40 ml metanolu i 4 ml wodzianu hydrazyny prze¬ prowadza sie w hydrazyd w temperaturze pokojo¬ wej w ciagu 24 godzin; Produkt wyodrebnia sie za pomoca odparowania roztworu i wytracenie z 0,5N kwasem octowym. Rf 100=0,40 na zelu krzemion¬ kowym. 4. Laurylo-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser/tBu/- -Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH • 1,42 g laury- lo-Cys/TRI/Gli-Asp-NH2-Leu-NH-NH2 rozpuszczo¬ nego w 10 ml dwumetyloformamidu w temperatu¬ rze —15° zadaje sie 1,38 ml 2N HC1 w octanie etylu i 0,14 ml trzeciorzedowego azotynu butylu. Do mie¬ szaniny reakcyjnej utrzymywanej 15 minut w tern- peraturze —10°, dodaje sie roztwór 965 mg H-Ser/ /tBu/-Tre/tBu/-Cys/TRI/-Met-Leu-Gli-OH i 0,525 ml trójetyloaminy w 10 ml dwumetyloformamidu, ochlodzony uprzednio do temperatury —10° i po¬ zostawia w ciagu godziny w temperaturze —10° a nastepnie 15 godzin w temperaturze 0°„ Produkt wydzielony z roztworu reakcyjnego w postaci zelu wytraca sie calkowicie przez dodanie 20 ml meta¬ nolu, odsacza i rozciera 3 razy woda po 10 ml, a nastepnie suszy nad stalym wodorotlenkiem sodu i w celu oczyszczenia rozpuszcza w goracym me¬ tanolu.. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 26.Do mieszanego roztworu 1,0 g jodu w 150 ml metanolu, w temperaturze pokojowej, w ciagu 20 minut wkrapla sie 700 mg Laurylo-Cys/TRI/-Gli- -Asp-NH2-Leu-Ser/ tBu/-Tre/ tBu/-Cys /TRIAMet- Leu-Gli-OH w 50 ml dwumetyloformamidu, w at¬ mosferze gazu i miesza jeszcze w ciagu 1 godziny.W celu usuniecia nadmiaru srodka utleniajacego wkrapla sie w temperaturze 0°, 1 N roztwór tiosiar¬ czanu sodu a nastepnie odparowuje roztwór pod obnizonym cisnieniem za pomoca pompki wodnej, po czym zateza pod wysoka próznia do objetosci okolo 10 ml. Produkt wytraca sie za pomoca 200 ml mieszaniny eteru z eterem naftowym (1:1) i po wyodrebnieniu i wysuszeniu rozciera osad 3 razy z woda, suszy nad stalym wodorotlenkiem sodu i w celu dalszego oczyszczenia wytraca z miesza- nliny chloroformu z eterem naifitowym. 6. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 25.Miesza sie mieszanine 35 mg chronionego dokoza- peptydu otrzymanego wedlug przykladu II (punkt 44). 24 mg pochodnej peptydu o wzorze 24, 6 mg N-hydroksybursztynoimidu i 0,8 ml dwumetyloform¬ amidu miesza sie w ciagu 1 godziny, w atmosfe¬ rze azotu, w temperaturze 50°, po czym dodaje 6 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza na¬ stepnie 2 godziny, pod azotem w temperaturze 50°, ponownie dodaje po 3 mg N-hydroksybursztyno¬ imidu i dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza jeszcze w ciagu 8 godzin w temperaturze 50°, w at¬ mosferze azotu. Nastepnie mieszanine reakcyjna wlewa sie do 60 ml eteru wolnego od nadtlenków i w ciagu 18 godzin utrzymuje w temperaturze 0°, odsacza drobny osad, suszy pod obnizonym cisnie¬ niem w temperaturze 40°. Otrzymuje sie 30 mg su^ rowego chronionego amidu Na-laurylo-dotriakonta- peptydu.Produkt w celu oczyszczenia rozpuszcza sie w mieszaninie metanolu z chloroformem (1:1) i pod¬ daje chromatografii wstepujacej na kolumnie wy¬ pelnionej Sephadex LH 20 (1,5X30 cm) przygotowa¬ na ta sama mieszanina. Odbiera sie frakcje po 3 ml, odparowuje je osobno i bada na czystcSc przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej na plyt¬ kach z zelu krzemionkowego. Rf 52 A = 0,55.Otrzymuje sie 15 mg oczyszczonego chronionego amidu dotriakontapeptydu. 40 45 50 55 6059 92914 60 Przyklad XII. Sposób ^wytwarzania Kalcyto- niny M o wzorze 5. 32 mg pochodnej peptydu o wzorze 6 uwalnia sie od grup ochronnych wedlug sposobu podanego w przykladzie II. Otrzymany octan Kalcytoniny M zachowuje sie w chromatografii cienkowarstwowej i elektroforezie tak samo, jak produkt opisany w przykladzie II. W chromatografii cienkowarstwowej na tlenku glinu „Alox" (firmy Camag) Rf 52 = 0,48; Rf 45 = 0,41, Rf 79 = 0,55, zas na celulozie (gotowe plytki Selecta S + S nr 1440) Rf 101 A = 0,54; Rf 45 = 0,40.W elektroforezie na celulozie (gotowe plytki Se¬ lecta nr 1440) droga wedrówki do katody przy 280 V, przy wartosci pH 9, 10 wynosi w ciagu 1,5 godziny 4,0 cm, zas przy wartosci pH 4,85 wyno¬ si 4,2 cm.Chroniony amid dotriakontapeptydu o Wzorze: 1. BOC-Cys /TRI/ -Gli-Asp-NH2-Leu-Ser/ tBu/- -Tre/ tBu/-Cys /TRI/ -Met-Leu-Gli-Tre/ tBu/-Tyr/ /tBu/-Tre/tBu/-Gln-NH2-Asp/ OtBu/-Fen-Asp-NH2- -Liz /BOC/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen-Pro-Gln-NH2-Tre /tBu/-Ala-Ilen-Gli-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 stosowany jako substancja wyjsciowa mozna otrzymac w na¬ stepujacy sposób: 125,6 mg BOC-Cys/TRI/-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser/ /tBu/-Tre/ tBu/-Cys /TRI/-Met-Leu-Gli-OH i 189,0 mg H-Tre/ tBu/-Tyr/ tBu/-Tre/ tBu/-Gln-NH2-Asp/ /OtBu/-Fen-Asp-NH2-Liz /BOC/ -FearHis-Tre/tBu/- -Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/ -Ala-Ilen-Gli-Wal-Gli- -Ala-Pro-NH2 szlamuje sie z 31,4 mg. N-hydroksy- bursztynoimidu w 2,5 ml N,N-dwumetyloformami- du, w atmesferze azotu, po czym dodaje 37 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu w 1 ml dwumety- loformamidu i miesza w ciagu 4,5 godzin w tem¬ peraturze 45°. Nastepnie mieszanine reakcyjna, mie¬ szajac, wlewa sie do 250 ml absolutnego eteru, od¬ sacza klaczkowaty osad i przemywa eterem. Otrzy¬ muje sie 314 mg produktu trudno rozpuszczalnego w metanolu.W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu (krzemionkowym Rf 100 = 0,51, Rf 107 = 0,77; Rf 52 A = 0,56; Rf 43 E = 0,65. 2. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 28. 219 mg chronionego amidu dotriakontapeptydu wytworzonego powyzej (punkt 1) rozpuszcza sie w cieplym dwumetyloformamidzie i po ochlodze- ndu do temperatury pokojowej wkrapla sie w cia¬ gu 30 minut do roztworu 124 mg resublimowanego jodu w 30 ml metanolu. Po dwukrotnym pluka¬ niu dwumetyloformamidem stosowanym w ilos¬ ci po 2,5 ml miesza sie jeszcze 1 godzine w tempe¬ raturze pokojowej i nastepnie w temperaturze 0°, wkrapla powoli 1,25 ml 1 N wodnego roztworu tio¬ siarczanu sodu az do prawie zupelnego odbarwie¬ nia roztworu. Nastepnie dodaje sie 0,05 ml wod¬ nego roztworu wodorotlenku sodowego i odparowu¬ je pod obnizonym cisnieniem do objetosci okolo V8. Roztwór wlewa sie, mieszajac, do 450 ml eteru wolnegró od nadtlenków i odsacza osad.Pozostalosc po odsaczeniu poddaje sie bezposred¬ nio przeciwpradowemu podzialowi w ukladzie me- tanol-bufor-chloroform-czterochlorek wegla (11: 3 : :6:7), stosujac bufor o skladzie podanym w przy¬ kladzie I, punkt 18. Po 280 stopniach rozdzialu sub¬ stancja znajduje sie w naczynkach 100 do 132. Sub¬ stancje wyodrebnia sie i poddaje ponownemu roz¬ dzialowi w tym samym ukladzie stosujac 560 stop- ni rozdzialu. Zlokalizowany przy pomocy chroma¬ tografii cienkowarstwowej produkt wyodrebnia sie (K = 0,69) i uwalnia od octanu amonu w tempe¬ raturze 40° pod wysoka próznia.W chromatogramie cienkowarstwowym na sili¬ lo kazelu Rf 52 A = 0,4; Rf 100 = 0,35; Rf 87 = 0,66; Rf 43 E = 0,59.Przyklad XIII. Chroniona Kalcytonine M sto¬ sowana w przykladzie II jako substancje wyjsciowa . mozna zbudowac z fragmentów 1—28 + 29—32 w nastepujacy sposób: 1. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 17. 860 mg pochodnej peptydu o wzorze 7, w 7 ml awumetylolormamidu zadaje sie w temperatur 0° 0,1 ml trójetyloaminy i 29i2 mg trójchdiorooctaniu pieciochlorofenylu, miesza 1 godzine w temperatu¬ rze 0° w atmosferze azotu, po czym dodaje 1,627 g H-Tre/ tBu/ -Tyr/ tBu/ -Tre/ tBu /-Gln-NH2-Asp/ /OtBu/ -Fen-Asp-NH2-Liz /BOC/ -Fen-His-Tre/tBu/- -Fen-Pro-Gln-NH2-Tre/tBu/-Ala-Ilen-Gli-OH i wy¬ tworzonej z 1,75 g pochodnej karbobenzoksy, we¬ dlug sposobu podanego w przykladzie I punkt 49, przez uwodornienie w 80% kwasie octowym, 0*09 ml trójetyloaminy i 7 ml dwumetyloformamidu i miesza w ciagu nocy w temperaturze pokojowej.Wytracony przez wkroplenie lodowato zimnego 0,02 N kwasu solnego surowy produkt oczyszcza sie przy pomocy przeciwpradowego podzialu w ukla¬ dzie metanol-bufor-chloroform-czterochlorek wegla (11:3:6:7) stosuje sie bufor jak w przykladzie I punkt 18. Wspólczynnik podzialu K = 0,8. Frakcje zawierajace pochodna oktapeptydowa laczy sie, za- teza do malej objetosci i liofilizuje z trzeciorzedo¬ wego butanolu. Czysty produkt wykazuje w chro- 40 matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym Rf 45 = 0,33, Rf 100 = 0,35 i Rf 115 = = 0,48. 2. Sposób wytwarzania pochodnej peptydu o wzo¬ rze 29. 45 50 mg pochodnej peptydu o wzorze 17 i 27 mg H-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 wedlug przykladu II, punkt 42 rozpuszcza sie w 1 ml dwumetyloformamidu i do roztworu dodaje 2,9 mg N-hydroksybursztynoimidu i 8,3 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza 50 roztwór w ciagu 2 godzin w atmosferze azotu, na¬ stepnie dodaje sie ponownie 1,7 mh H-hydroksy- bursztynoimidu i 5,5 mg dwucykloheksylokarbo¬ dwuimidu (oba rozpuszczone w dwumetyloformami¬ dzie po 0,1 ml) i miesza dalej w ciagu 3 godzin 55 w temperaturze 45°. Klarowny roztwór wlewa sie do 50 ml eteru, odsacza, suszy, rozciera z mala ilo¬ scia wody, odsacza i wytraca jeszcze wilgotny pro¬ szek z metanolu-wody. W ten sposób oddziela sie zawarty w surowym produkcie nadmiar pochodnej 60 tetrapeptydowej. Otrzymana chroniona Kalcytoni¬ na M wykazuje wartosci Rf podane w przykla¬ dzie II, punkt 45.Odszczepienie grup ochronnych przeprowadza sie wedlug sposobu podanego w przykladzie II. Otrzy- 65 mana wolna Kalcytonina M zawiera slady po-92914 61 62 chodnej sulfotlenkowej, poza tym jest czysta. Ak¬ tywnosc biologiczna produktu wynosi 80 E (jedno¬ stek) na mg. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o hipo- kalcemicznym dzialaniu okreslonych ogólnym wzo¬ rem 1, w którym linia przerywana laczaca pierw¬ szy i siódmy aminokwas oznacza wiazanie dwu- siarczkowe, R oznacza atom wodoru lub ewentu¬ alnie zacylowana grupe aminowa, Y oznacza reszte L-asparaginy lub reszte kwasu L-asparaginowego, X oznacza reszte L-glutaminy lub reszte kwasu L- -glutaminowego, jak i ich soli addycyjnych z kwa¬ sami i kompleksów ze zwiazkami metali, znamien¬ ny tym, ze poszczególne aminokwasy oznaczone ko¬ lejnymi numerami ilustrujacymi ich umiejscowie¬ nie w 1—32 sekwencji peptydu o wzorze 1, takie jak L-cysteina, desamino-L-cysteina lub N-acylo- -L-cysteina (1), glicyna (2), L-asparagina lub kwas L-asparaginowy (3), L-leucyna (4), L-seryna (5), L- treonina (6), L-cysteina (7), L-metionina (8), L-leu¬ cyna (9), glicyna (10), L-treonina (11), L-tyrozyna (12), L-treonina (13), L-glutamina lub kwas L-gluta- minowy (14), kwas L-asparaginowy lub L-asparagi- na (15), L-fenyloalanina (16), L-asparagina lub kwas L-asparaginowy (17), L-lizyna (18), L-fenyloalanina (19), L-histydyna (20), L-treonina (21), L-fenyloala¬ nina (22), L-prolina (23), L-glutamina lub kwas L- -glutaminowy (24), L-treonina (25), L-alanina (26), L-izoleucyna (27), glicyna (28), L-walina (29), gli¬ cyna (30), L-alanina (31) i amid L-proliny (32), ewentualnie w postaci ich aktywowanych pochod¬ nych takich jak estry, azydki lub mieszane bezwod¬ niki, poddaje sie kondensacji przy oslonieciu ich grup funkcyjnych, takich jak grupy karboksylowe, aminowe i merkaptanowe, w znany sposób, przy czym kondensacje poszczególnych aminokwasów prowadzi sie wedlug wyzej okreslonej kolejnosci, az do uzyskania peptydu 1—32 lub kondensuje sie ze soba wytworzone uprzednio mniejsze jednostki peptydowe, jak zwlaszcza 1—6, 7—10, 11—16, 17— 20, 21—28, i 29—32, az do uzyskania sekwencji 1— 32 z tym, ze po wytworzeniu sekwencji 1—10 lub 1—32 wytwarza sie mostek dwusiarczkowy 1—7, za pomoca utleniania i otrzymany amid dotriakonta- peptydu o wzorze 1 ewentualnie przeprowadza sie w jego sól addycyjna z kwasem lub kompleks ze zwiazkiem metalu.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencje 1—10, stanowiaca dekapeptyd o wzorze BpC-Cys-Gli-Asp-NH2-Leu-Ser /tBu/ -Tre /tBu/- -Cys-Met-Leu-Gli-OH, w którym BOC oznacza grupe III-rzed-butyloksykarbonylowa, a t-Bu ozna¬ cza grupe eteru III-rzed-butyioweao, poddaje sie kondensacji z seKwencja 11—32, stanowiaca amid dekozapeptydu o wzorze H-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre /tBu/-Glu /NH2/ -Asp /OtBu/ -Fen-Asp /NH2/ -Liz /BOC/-Fen-His-Tre/tBu/ -Fen-Pro-Glu /NH2/ -Tre ^tBu/-Alia-Iileu-Gli-Wail-Gli-Aila-Pro-NH2, w którym grupy oslaniajace jak tBu i BOC maja wyzej po¬ dane znaczenie, w obecnosci dwucykloheksylokar- bodwuimidu po czym odiszezepia sae gmipy oslania¬ jace, za pomoca stezonego kwasu solnego lub kwasu trójfluorooctowego i otrzymuje peptyd o wzorze 1, w którym linia przerywana miedzy 1 i 7 amino¬ kwasem oznacza wiazanie dwusiarczkowe, symbol R oznacza grupe NH2, symbol X w polozeniach 14 i 24 oznacza reszte L-glutaminy, symbol Y w po¬ lozeniach 3 i 17 oznacza reszte L-asparaginy, a Y w polozeniu 15 oznacza reszte kwasu L-asparagi¬ nowego. 10 15 20 25 30 #92914 S CHz R- ci-i-CO-gLi-Y-Leu-Ser-Tre-Cys-MGt-Leu-qli-Tre-Tyr-Tre-X-Y- -Fen-Y-Lii-Fen-His-Tre-Fen-Pro-X-Tre-Ala-]leu-gli-Wal-qli-Ala- 1* 17 18 19 20 21 22 2* 2« 25 2* » 2« 29 » V -Pro-NH2 32 Wzór i H- Cys- Gli-(Asp-NH2)- Leu-Ser-Tre-Cys- Met- Leu -GLi-Tre- -Tyr-Tre-(6lu-NH^-Asp-Fen-(Asp-NHa)- Liz Fen-His-Tre- -Fen-Pro-(6lu-NH^- Tre-Ala-lleu-GLL-Wal-GU- Ala-Pro-OH Wzór 2 s- I CH, R-CH-C0-6U-(Asp-NH2)-Leu-Ser-Tre-Cys-0H Uzór 3 s CH2 R-CH-C0-GU-^sp-NH2)-Leu-Ser-'Ve-Cys-A Nior 4 H-Cys-GU-(Asp-NH2)-Leu-5er-Tre-Ci|S-Met-Leu-6ll-Tre-Tyr-Tre- - (6lu- NH2)- Asp-Fen-(Asp- NH2)-Liz- Fen-His-Tre-Fen- Pro- (Glu- NH2)- -Tre-Ala- lleu-Gli- Wbl-Gli- Ala- Pro- NH2 Wzór 592914 BOC—Cys—6U—(Asp—NH2)—Leu—Ser/lBu/—Tre/tBu/—Cys—Met—Leu— -Gli—Tre/tBu/-Tyr/tB^Tre/lBu/-(Glu-NH2VA3p/0tBy-Fen-(Asp-NH2,)-Li2-/B0C/ —Fen—His—Tre/teu/—Fen—Pro—(Glu—NH2)—Tre^Bu/—Ala—lleu—GU— —Wal—GU—Ala—Pro—NH2 Hwr6 BOC—Cys—GlHAsp-NH^-Leu—Ser/tBi^-Tre/lBuZ—Cys—Met—Leu—GU—OH h/zór 7 H—Cys—Gli—(Asp—NH2)-Leu—Ser—Tre—Cys—Met-Leu—Gli—Tre—Tyr— Tre—(Glu-NH2)-Asp-NH2—Fen-(Asp-NH2)-Liz—Fen—His—Tre—Fen— Pro-(Glu-NH2)-Tre—Ala-lleu—Gli -Wal-Gli—Ala—Pro—NH2 Mzór 8 BOC—Cys-GU-(Asp-NH2)-Leu—Ser^Bu/—Tre^Bu/—Cys—Met—Leu—GU— Tre^Bu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/—(Glu—NH2)-(Asp-NH2KFen-(Asp-NH2)-Li2/ fe0C/—Fen—His—Tre/^Bu/—Fen—Pro—(Glu—NH2)—Tre/iBu/-Ala—lleu—GU— Wal—GU—Ala—Pro—NH2 Uzór 992914 Ac—Cys—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser—Tre—Cys—Met—Leu—Gli—Tre—Tyr- Tre—(Glu—NH2)—Asp—Fen—(Asp-NH2)-Liz—Fen—His—Tre—Fen—Pro— -(Glu-NH2)—Tre—Alo—lleu—Gli—Wal—Gli—Ala—Pro—NH2 Uzór. 10 Ac—Cys—Gli-(Asp-NH2)-Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu^Cys—Met-Leu—Gli-Tre/ /tBu/-Tyr^Bu/-Tre/tBu/-(Glu-NHz)—Asp/0tBu/-Fen—Asp—NH2—Liz/B 0C/-Fen- -His—Tre/^Bu/—Fen-Pro—(Glu—NH2)-Tre/tBu/—Ala—lleu—Gli—Wol— —Oli—Ala—Pro—NH2 klzór 11 Ac—Cys—Gli—(Asp-NH2)-Leu—Ser/tBu/-Tre/lBy-Cys—Met—Leu—Gli—OH k/zór. 12 Bmp—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser—Tre—Cys—Met—Leu—Gli—Tre—Tyr—Tre— -(Glu—NH2)—Asp-Fen-(Asp-NH2)—Liz-Fen—His-Tre—Fen—Pro-|3lu-NH2)- Tre—Alo—lleu—Gli—Wal~Gli—Ala—Pro—NH2 k/zór. 692914 Bmp—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser^Bu/—Tre/iBu/—Cys—Met—Leu—Gli—Tre/lBa/— -Tyr/tBu/—Tre/tBu/-(Glu-NH2)~Asp/0tBu/—Fen/-(Asp-NH2)-Liz/BOC/— —Fen—His—Tre/tBu/—Fen—Pro-(Glu—NH2)—Tre/tBu/—Ala—Ileu—GIH Wal— —Gli—Ala—Pro—NH, mór. 1 Bmp—Gli—(Asp-NH2)-Leu—Ser/tBu/—Tre/tBu/—Cys—Met—Leu—Gli—OH mór 15 BOC—Cys—Gli—(Asp- NH2)-Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys—Met— Leu—Gli— —Tre/teu/—Tyr/tBu/—Tre/lBu/-(Glu-NH2)—Asp/OtBu/— Fen—(Asp—NH2)— —Liz/BOC/-Fen—His-Tre -/tBu/-Fen—Pro—(Glu—NH^— Tre/tBu/-Ala— —Ileu—Gli—Wal—Gli—Ala—Pra—OtBu mór. 16 BOC—Cys—Gli-(Asp—NH2)-Leu—Ser/tBu/—Tre/iBu/—Cys—Met-Leu—Gli —Tre/rBu/,-Tyr/tBu/-Tre//tBu/-(Glu-NH2)-Asp/0tBu/Fen— (Asp—NH2)-|_iz /BOC/—Fen—His—Tre/tBu/—Fen—Pro-(Glu—NH2)—Tre/tBu/—Ala—Ileu —Gli—OH Uzór. 1792914 BOC—Cys—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser—Tre—Cys—Met—Leu—Gli—OH Uzór. 18 BOC—Cys—Gli—(Asp-NH2)—Leu—Ser—Tre—Cys—N2H3 Uzór. 19 NS-Polmitoilo—Cys—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser—Tre—Cys—Met—Leu—Gli— —Tre—Tyr—Tre—(Glu—NH2)—Asp—Fen—(Asp—NH2)—Liz—Fen—His—Tre-Fen- -*Pro-(Glu—NH2)-Tre—Ala—lleu—Gli—Wol—Gli—Ala—Pro—NH2 Uzór. 20 NS—Palmitoilo—Cys—Gli—Asp—NH2—Leu—Ser^Bu/—Tre/tBu/—Cys—Met— —Lou—Gli—Tre/lBu/-Tyr^Bu/-Tre/tBu/-(Glu—NH2)—Asp/0tBu/—Fen— -fAsp—NH2)—Liz/BOC/-Fen—His— Tre/tBu/-Fen— Pro—(Glu—NH2)-Tre /tBu/—Ala—lleu—Gli—Wal—Gli—Ala—Pro—NH2 Uzór. 21 Polmitoilo-Cys-Gli-fAsp—NH2)-Leu—Ser/tBu/-Tre/tBu/—Cys—Met- —Leu—Gli—OH Uzór. 2292914 N«—Polmitoilo—Cys—6li—(Asp—NH2)—Leu—Ser/^Bu/—Tre/tBu/—Cys— —MeT—Leu—Gli—OH Wzór. 23 NS—Lourylo—Cys—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser—Tre—Cys—Met—Leu— —Gli—Tre—Tyr—Tre—(Glu—NH2)—Asp—Fen—(Asp—NH2)—Liz—Fen— —His—Tre-Fen-Pro-(Glu-NH2)—Tre—Ala—llee—Gli—Wol—Gli—Ala— —Pro—NH, Wzór 2 NS—Laurylo—Cys—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser/tBu/—Tre/lBu/—Cys-Met—Leu— —Gli—Tre/teu/—Tyr/teu/—Tre/teu/—Glu—NH2—Asp/d Bu/—Fen— Asp—NH2— -Liz/BOC/—Fen—His—Tre/tBu/-Fen—Pro—(Glu—NH2)—Tre/tBu/—Ala— —Ileu—Gli—Wal—Gli—Ala—Pro—NH2 Wzór 25 uourylo—Cys—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser/tBu/—Tre/tBu/—Cys-MeH.eu-Gli-OH Wzór?6 NS—Lourylo—Cys—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser/iBu/—Tre/tBu/—Cys—Met— —Leu—Gli—OH Wzór 2?92914 BOC—Cys—Gli—(Asp—NH2)—Leu—Ser/tBu/-Tre/tBu/—Cys—Met—Leu—Gli- —Tre/tBu/-Tyr/tBu/—Tre/tBu/—Glu—NH2—Asp/otBu/—Fen—(Asp—NHj)— —Liz/lBu/—Pen—His—Tre/tBu/—Fen—Pro—(Glu—NH^Tre/tBu/—Ala— —Ileu—Gli—Wal—Gli—Ala—Pro—NH2 iJzór $' BOC—Cys—Gli—(Asp—NH2)-Leu—Ser/tBuZ-Tre/tBu/—Cys—Met—Leu—Gli— —Tre/^BuZ-Tyr/tBu^Tre/tBu/—(Glu—NH2)-Asp/0tBu/-Fen—(Asp—NH2)- —Liz/BOC/—Fen—His—Tre/tBu/—Fen—Pro—(Glu—NH2)—Tre/tBu/—Ala— V —Ileu—Gli—Wal—Gli—Ala—Pro—NH2 Uiór 29 1 2 3 osn A leu 5 ser 6 tr 7 cys "lnu 8 met 3 leu 10 4lL AB^OHBOC-OHBOC-OHH-N^-ZBOC-OH H-ONB BO^OH BOC-OH BOC-OH H-OBzl B0C^-N2H2-Z BOC-^-ONB BOC-^-OBzl C D E F G HBOC: BOC- BOC- BOC- H- Bzl Bzl IBOC-^— Bzl J GBOC SH KBOC^ LBOC^= 1 H— D-5) 1) N2H2-Z H- -N2H2Z -N2H3 -ONB -ONB BOC BOC H Bzl D -5) H— D-5) 1)-5) ONB -ONB -N2H3 H gzi Bzl _J . SH _i— 5 6 Schemat 7 8 OBzl -OBzi -OBzl -OBzl -OBzl -OB* -OH -OH 1092914 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ptf oli osn leu aer tr cus met teu Qli flBOCHDH Z-OH BOC-OH BOC-OH BOC-OH H-OBzl BOC-OH BOC-OH BOC-OH H-OBzl B BOC ^5) OBzl BOC ^ OBzl C H OBzl H -OBzl D BOC -^ OBzl BOC ^ OBzl E H— OBzl H OBzl F BOC ^ OBzl BOC-1^ ^ OBzl 6 H OBzl H OBzl H Z OBzl I H OH DB0CSL___ 3L5) lQH ^Bzl Bzl ^ KBOCJ ¦ u OBzl SH SH LBOC¦ ' OH aaoc/ - * oh 1234 5 67 8 9 10 Sch«mat 2 1234 567 89 10 cus oli osn leu ser tr cus met leu gli " iDl tRTi +Rii TRI ABCCOH Z-OH Z-ONP H-OMe DPC^OH H-^-OMe TRH-OH BOC-OH Z-OH H-OMe ti tBu tBu _ f)_s) „L1 B Z ^—OMeDPCJ LOMe Z—]L^L-OMe C H tBu tBu OMeDPC1 ^N,H, H OMe i2n3 D Z ^ OMe BOC ^ OMe E H— OMe H -OMr F TR.TRI 4 _0M TRI G HJ OH Hboc^ 4 OMeOPC^^-^ ^ OM TRI tBu tBu *J M u UJ 1— TRI I BOC^- NoH3 HJ l ' OH TRI i) ^ 3 tBu tBu TRI nil 3BOC-1 - l ' ' OH ygnr?" — ? ** ? OH < 2 3 < sL, 36 7 B 3 1092914 123 4 5 6 7 89 10 cus oli osn leu ser \r cus met leu qU TRI tBu tBu TRI ABGCm Z-OH Z-ONP H—OMeDPC^OH DPCLOH TRI^OH BX-OH Z-OHH—OMe B Z—3 OMe Z h5) OMe C H OMe H— OMe D Z ^~5) OMe BOC -^ OMe E. TD1H - OMe Tni H OMe FBOC™ & ohe TRI^ § -OMe GBOC— N2H3 H™ OMe TRITRI 5 1 m i ,,TRI n DPC1BU TRI t-5) MtBu TRI i tBu tBu TRI D-5) H DPC-^ ^ ^ OMe I H» 2! omj £—ga_rg ts K Hf" g g W* L TO1 „&_&_! oh MBOC^ " IBu IBu T^ ^ NBOC/ ^ i!LZ oh 123 4 567 8 910 Schemat 4 123 4 5 6 7 8 3 10 cus gli osn leu ser tr cus met leu cjLi TRI tBu tBu TR' A TRlkJH Z-OH Z-ONP H-OMeDPC^ H^OMe TRWH BOC-OH Z—H H-OMe 8 z ^—OMe C H OMe D Z— OMe E H OMe TRI 4 F TRI-1— =* OMe TRI G 14^- OMe TRI HAcH OMe . Ac^ ^H3H'BU 'BU—TRI M «**<« « qh 3AcTRI 1*- f* TRL _0H XAc^ 1* ^Bu -OH 5 6 7 8 9 10 Schemat 592914 123 4 5 6 7 8910 . cus oli osn leu ser tr cus met leu oli TRI tBu tBu TRI A BOC1^ Z-OH Z-ONP 0-OMe DPC^OH H^OMe TRI^OTIe BOC-OH BOC-OH H—OMe B DPcP-^Ale hfS* B0C-^C*te JBu tBu. C ; DPC-—^N2H3 Rnp l)-5) H OH; IBu tBu a TRI BOC^ OMe D DPCl '—S LoneBOC— OH tBu tBu TRI E DPGJ—' LrjH h OH TRI ink nn£Q tBu tBu TRI FB0CJ JOkFtgW m2h3 H' ' 'OH &BOCIm * _JBa_JBu_ TR. HBOC/ ^U "1» 7QH .BOC/ ^ ^U 7 3) w 123 45 6 7 8 9 10 5ch 123 4 5 67 89 10 cus oli osn leu ser lr cus met leu oli Bzl Bzl ABC)C%UBC)C B BOC-^^^OBzl H OEt C H— OBzl BOC •$¦ OEt D BOC ^ OBzl BOC- OH E H—— OBzl H- OH F BOC 2ML5) 0BZ1 G H OBzl H BOC— ^ OBzl 3 BOC ^ §zl0Bzl K Rzi H ^ lr0Bzl LBOC-5? 3 PiLoBzl MBOC OH NBOC/ 'OH OBOC/ ==z ^ OH 123 4 5 6 7 8 9 10 Schemat 792 914 123 4 5 6 7 89 10 cgs oli osn leu ser tr cgs met leu di ABX^UBX^B0COHEOC-0hPBXHHH-0Bzl H-Pty^ZBOCly^Z OBt B BOC-^^^OBzl H OBt C H OBzl BOC OBt D BOC 3 OBzl BX- OH E H^T^ 0Bzl H OR F BX 2ML5) 0Bzl G H OBzl H BOC ^ OBzl I BX — —OH _ . D BOC ^ —^N2H2-Z k H 1| N2H2-Z LBOC— ^NgHg-Z MBOC NgHg N BOC/ / N2H3 OBOC7 L OH 123 4 567 89 10 Schemat 8 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3132 tr tur tr gin osp ft osn liz fe his tr fe pro gin tr ola ile gli wal git ala pro k Z^WH-^ 8He B Z^ -& OH C Z-S^-^H, H^ » GH D ZJ&- *-^ &- OH [tButButButBu^ BOC tBu tBu E Z F z hDPC N2H3H-^ E "- OH IButButButBu 1) BOC tBu tBu g|H 7 tButButButBu BOC tBu tBu 4)5 DPC tButButButBu BOC }Bu tBu 11 12 13 14-15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3t Schemat 9 J ^ NH2 NH, 13292 914 11 12 13 14 15 16 Jr tur tr gli osp ffc_ OtBu OH Z^-OH Z^-OH Z—ONP Z-^ONP H OMe yftEu tBu tBu A DPC nu 7^—m 7 OtBu 3) B Z1 * OMe OtBu C H* —OMe *\ OtBu D "Z ^ 1- OMe OtBu E H —' OMe tBu 3\ OtBu F ZJ ^ ' OMe tBu OtBu 6 HJ ' OMe tBu tBu OtBu H Z-1 l- 1 OMe „I*! 2" OtBu 17 18 19 20 osn liz fe his -OMe jD£CU _J 1 1 OMe 7 tBu tBu tBu OtBu :nftH ' ' L N,Ha urui 11 12 13 14 15 16 ^ 3 Schemat /O BOC A Z—ONP Z^ONP H—OMe H—OMe B Z-? & OMe BOC C Z-1 N2H3 BOC ,\ D ZJ ^ OMe BOC E 1^— OMe BOC o\ F Z 1 *¦ OMe BOC S Z ' N2H3 Schemat 1192914 A B C D E F 6 H I D K Z L H - S tBu tBu tBu j 21 22 fe Z- H- .2) 22 23 pro 24 gin L 26 da 27 ile 28 JiLL -OH Z—ONP Z^OH Z—ONP Z—OH H—OMe Z-^-OMe H OMe Z 3L OMe H ¦ OMe 2) -OH -OH 2) Z- H- tBu tBu tBu tBu
3. 3. ) tBu tBu tBu 24 Schemat 25 26 /2 27 28 -OMe -OMe -OH -OH -OH -OH -OH A B C D E F 6 29 wal 30 gli Z—ONP Z—OH Z- H- Z- H- 3) 31 qLq 32 pro -ONP 3) D-5) H NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH, Schemat '392914 11 12 13 14 15 16 17 18 19 tr tyr tr gin asp fe asn liz fe OtBu ~ BOC A Z-OHBOCOHHHDNBH^WsBKZ^OH H—OMe Z—ONP Z^OH H—OBzl B BOC-^—ONB -Ofcl c H ONB Z?^ W, H?°C OH o z 4—ow z ?5L^—oh E Z NA H 59? _oh F Z ^-N2H2-B0CZ?^ * 892 OH „9"" ?oc_ G Z N2H3 HJ ^ OH 1) OtBu BOC H z * * l^_- OH | 11 12 13 W 15 16 17 18 19 2 Schemat K 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 his tr fe pro gli tr ola ile gli wal gli olo pro A Z-N2H2 Z-N2H3 20NP Z-OHrlN2H2-BOCBX-N2H3Z-0HZONPrH)riB Z-ONP Z-ONP Z-OHH-OtBu B Z-^-N2H2-BOC Z-^-OMe Z-^OtBu C H N2H2BOC H OMe H OtBu D Z ^—N2H2B0C Z ^—OMe Z ^ OtBu E H N2H2-B0C H OMe H OtBu F 7 ^ N2H2B0CB0C ^ OMeZ ^ OtBu 6 H N2H2-BOCB0C OHZ OH HZ 1 N2H2BOC Z 2) NH2 NH2 I Z -N2H3 H -NH2 3 BOC $4$ Nh2 K H — NH2 L"Z— * NH2 MH SchemQl j5 NH2 20 21 22 23 24- 25 26 2 28 29 30 31 3292914 ERRATA wiersz 18, lam 2 jest: wac na róznych pozytkowych, powinno byc: wac na róznych pozywkach, Drukarnia Narodowa Zaklad Nr 6, zam. 475/77 Cena 10 zl PL