PL87489B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia antygenu Australia z surowicy krwi czlowieka, do celów szczepienia zwierzat. Antygen Australia (Au) (albo antygen zakaznego zapalenia watroby wywolanego przez wirus B) jest bialkiem, które po¬ jawia sie we krwi ludzi, którzy albo choruja na zóltaczke wszczepienna, wzglednie sa jej nosicie¬ lami. Antygen wykrywa sie w surowicy krwi przy pomocy surowic odpornosciowych anty Au. Otrzy¬ muje sie je najczesciej przez szczepienie zwierzat (koni, kóz, królików) przy pomocy oczyszczonych preparatów antygenu Au.Najczesciej antygen Australia otrzymuje sie z krwi na drodze wirowania w ultrawirówce. Przy pomocy wielokrotnego wirowania czasteczek anty¬ genu w tzw. gradiencie gestosci mozna otrzymac preparaty, które sa calkowicie wolne od innych bialek osocza. Metoda ta jest malo przydatna do uzyskania wiekszych ilosci antygenu, niezbednych do szczepienia duzych zwierzat laboratoryjnych. Ze wzgledu na duza zakaznosc antygenu nie jest bo¬ wiem wskazane uzywanie metody wirowania w roz¬ tworze zonalnym, która jako jedyna pozwala na uzyskanie rzeczywiscie duzych ilosci antygenu przy pomocy wirówki. Dlatego do otrzymania antygenu próbowano stosowac inne metody preparatyki, ta¬ kie, jak: saczenie na kolumnach wypelnionych ze¬ lami, chromatografia powinowactwa, trawienie en¬ zymami proteolitycznymi, wytracanie siarczanem amonu, elektroforeza itp. Zadna z tych metod, za- stosowana oddzielnie, z wyjatkiem moze chroma¬ tografii powinowactwa, nie pozwala na uzyskanie rzeczywiscie czystych preparatów antygenu. Zasto¬ sowanie chromatografii powinowactwa z uzyciem surowicy anty-Au do celów preparacji antygenu jest jednak metoda kosztowna i trudna do przepro¬ wadzenia w warunkach przemyslowych, poniewaz wymaga posiadania izolowanych preparatów gamma globuliny, zawierajacych przeciwciala anty-Au. Za¬ stosowanie do chromatografii powinowactwa pelnej surowicy, zawierajacej przeciwciala anty-Au, jest niecelowe, poniewaz antygen adsorbuje sie w spo¬ sób nieswoisty na lipoproteidach. (W. Józwiak and J. Koscielak, Affinity Chromatography of RNA- Containing Preparations of Au Antigen, the Jour¬ nal of Immunol., v. 110, 1151, 1973).W praktyce stosuje sie kombinacje rozmaitych metod preparatyki antygenu, które zastosowane lacznie pozwola na otrzymanie antygenu o zadanych wlasciwosciach i stopniu czystosci. Preparatyka an¬ tygenu Au do celów szczepienia koni wedlug jed¬ nej ze znanych metod (V. J. Cabasso, R. Nieman, D. D. Schroeder, K. A. Hok, R. E. Louie and M. M.Mozen. Preparation and Standardization of an Au¬ stralia Antigen Antibody of Eauine Origin, Applied Microbiology, v. 21, 1017, 1971.) przedstawia sie jak nastepuje: Surowice, zawierajaca antygen Austra¬ lia poddaje sie wstepnemu frakcjonowaniu etano¬ lem wedlug metody Cohna. Otrzymana w ten spo¬ sób frakcje IV przepuszcza sie przez kolumne, wy- 87 48987 489 pelniona 6% agaroza w buforze glicynowo-cytrynia- nowym pH = 7.5. Frakcje bialka, wyplywajaca w pustej objetosci kolumny, zbiera sie i zateza przez ultrafiltracje. Preparat zawiera jeszcze pra¬ widlowe bialka surowicy ludzkiej, na co wskazuje fakt, ze otrzymana po szczepieniu surowice odpor¬ nosciowa nalezy absorbowac az trzema objetoscia- mi prawidlowej surowicy ludzkiej.Celem wynalazku bylo opracowanie sposobu otrzymywania czystego antygenu Australia przy pomocy metody mozliwej do zastosowania w zakla¬ dzie przemyslowym, a nie tylko w laboratorium naukowym. Metoda w najprostrzej juz wersji po¬ zwala na uzyskanie immunogennego preparatu an¬ tygenu, który powoduje powstawanie u koni prze¬ ciwcial anty-Au. Surowica taka zawiera jednak równiez i bialka przeciw prawidlowym skladnikom Osocza ludzkiego i wymaga absorbcji kosztowna surowica ludzka. Przez zastosowanie trawienia pro- naza termicznie denaturowanych preparatów Au mo¬ zna otrzymac antygen, który jest w znacznej mierze wolny od bialek surowicy czlowieka. Calkowite oczyszczenie osiaga sie przez wytracanie bialek su¬ rowicy ludzkiej przy pomocy przeciwcial anty-bial- ka ludzkiego konskiej surowicy odpornosciowej. Dwa ostatnie etapy wykonuje sie przy uzyciu odczynni¬ ków (przeciwcial i enzymów), kowalentnie zwiaza¬ nych z nierozpuszczalnym adsorbentem. Wynalazek dotyczy wiec nie tyle nowych oryginalnych rozwia¬ zan preparatywnych, co doboru i sekwencji poszcze¬ gólnych etapów preparatyki, co pozwala na otrzy¬ manie produktu o wlasciwym stezeniu i zadanej czystosci.Cel ten zostal osiagniety przez opracowanie spo¬ sobu, polegajacego na tym, ze czesciowo oczyszczo¬ ny od bialek surowicy ludzkiej preparat antygenu Au poddaje sie denaturacji technicznej przez 15 mi¬ nut w temperaturze 80°C, a nastepnie po oziebieniu poddaje sie trawieniu pronaza w postaci nierozpu¬ szczalnej, korzystnie sprzegnieta z agaroza, na przyklad Sefaroza (produkt firmy Pharmazia, Up- sala) po czym bialka surowicy ludzkiej obecne w preparacie antygenu Au usuwa sie przez dodawanie przeciwcial anty-bialka surowicy ludzkiej w postaci 40 nierozpuszczalnej, korzystnie sprzegnietych z aga¬ roza, na przyklad Sefaroza.Sposób izolacji antygenu Australia z surowicy ludzkiej wedlug wynalazku przedstawia sie, jak na¬ stepuje: z surowicy, zawierajacej antygen, wytraca sie antygen przy pomocy 45%/NH4/2S04 w tempe¬ raturze 0—4°C. Odwirowuje sie osad przy okolo 3000 obrotów na minute w temperaturze 0°C i nad- sacz odrzuca sie. Osad rozpuszcza sie w wodzie destylowanej. Roztwór przepuszcza sie przez ko¬ lumne, wypelniona Sefadeksem G-200, stosujac ja¬ ko eluent bufor fosforanowy o pH = 7,2 w 0,9% NaCl. Frakcje bialka, wyplywajaca w pustej ob¬ jetosci kolumny, zbiera sie i ogrzewa przez 15 mi¬ nut w temperaturze 80°C. Oziebia sie i poddaje trawieniu pronaza, zwiazana kowalentnie z Sefa¬ roza 4B. Po zakonczeniu trawienia roztwór prze¬ sacza sie przez szklany saczek i zateza przez ultra¬ filtracje. Nastepnie dodaje sie Sefarozy 4B, zawie¬ rajacej przylaczone kowalentnie przeciwciala kon¬ skie anty-bialka surowicy ludzkiej, odsacza sie i proces ten powtarza sie pieciokrotnie. W otrzy¬ manym roztworze, zawierajacym izolowany anty¬ gen Au okresla sie metoda immunodyfuzji miano antygenu Au. Preparat powinien byc calkowicie wolny od prawidlowych bialek surowicy ludzkiej.Immunodyfuzje wykonuje sie w 0,9% zelu agaro¬ wym wobec surowicy, zawierajacej anty-Au w bu¬ forze 0,1 M NaCl, 0,001 M TRIS, 0,001 M EDTA, 0,1% mertiolat, pH doprowadzone do 7,6 przy po¬ mocy HC1. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania antygenu Australia do ce¬ lów szczepienia zwierzat, znamienny tym, ze cze¬ sciowo oczyszczony od bialek surowicy ludzkiej pre¬ parat antygenu Au poddaje sie denaturacji termicz¬ nej przez 15 minut w temperaturze 80°C, a naste¬ pnie po oziebieniu poddaje sie trawieniu pronaza w postaci nierozpuszczalnej, korzystnie sprzegnieta z agaroza taka jak Sefaroza, po czym bialka suro¬ wicy ludzkiej, obecne w preparacie antygenu Au, usuwa sie przez dodawanie przeciwcial anty-bialka surowicy ludzkiej w postaci nierozpuszczalnej, ko¬ rzystnie sprzegnietych z agaroza taka, jak Sefaroza. WDL. 2i?m. 3355. 105. Cena 10 zl PL