Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania no¬ wych pochodnych antybiotyku pleuromutiliny lub pro¬ duktu jej uwodornienia o ogólnym wzorze 1, w którym B oznacza wodór albo grupe o wzorze 2, Rt oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1-6 atomach wegla, grupe kar- 5 balkoksylowa, grupe karbalkoksyalkilowa lub grupe ary- lowa, R2 oznacza grupe alkilowa o 1-5 atomach wegla i Z oznacza bezposrdnie wiazanie C-C lub ugrupowanie - (CH,)n -, w którym n* oznacza liczbe calkowita 1-6, i X oznacza grupe - CH=CH2 lub- CH,-CH3 oraz ich soli. 10 Wytworzonewedlug wynalazku pochodne pleuromutili¬ ny lub produktu jej uwodornienia moga byc w wodzie rozpuszczalne lub nierozpuszczalne. Zarówno rozpusz^ czalne jak i nierozpuszczalne w wodzie pochodne nadaja sie bardzo dobrze jako dodatki do mieszanek gotowych 15 srodków paszowych.Zaleta stosowania pochodnych pleuromutiliny lub pro¬ duktu jej uwodornienia jako dodatku do mieszanek goto¬ wych srodków paszowych polega na tym, ze uwolniona po rozszczepieniu pochodnych w zywym organizmie pleuro- 20 mutilina lub produktjej uwodornienia, w ilosciachzwykle przyjetych w^mieszankach gotowych srodków paszowych, nie zostaje resorbowana i dlatego nie zachodzi zarazenie ciala zwierzecego.Wedlug wynalazku mozna otrzymac pochodne antybio- 25 tyku pleuromutiliny lub produktu jej uwodornienia, pod¬ dajac antybiotyk pleuromutiline lub produkt jej uwodor¬ nienia o ogólnym wzorze 3, w którym X ma wyzej podane znaczenie, reakcji z estrem kwasu izocyjanowego o ogól¬ nym wzorze 4, w którm Rlf R, i Z maja wyzej podane 30 znaczenie i ewentualnie przeprowadzajac otrzymane w ten sposób zwiazki o wzorze 1 w ich sole * Zwiazki o wzorze 1 sa nierozpuszczalne w wodzie, jed¬ nak po selektywnej hydrolizie za pomoca zasad nieorgani¬ cznych, jak np. wodorotlenku sodu, wodoroweglanu sodu lub zasad organicznych, jak np. dwualkilomina, mozna przeprowadzic je w zwiazki rozpuszczalne wwódz e. Przez uwodornienie wyzej wymienionych pochodnych pleuro¬ mutiliny otrzymuje sie w znany sposób odpowiednie po¬ chodne dwuhydropleuromutiliny.Korzystnymi estrami kwasów izocyjanowych sa ester etylowy kwasu izocyjanianopropionowego, ester dwuety- lowy kwasu alfa-izocyjaniano-glutarowego lub ester ety¬ lowy kwasu izocyjaniano-octowego.Wyzej opisana reakcje przeprowadza siewznany sposób.Stosowana dopowyzszychreakcjijakozwiazek wyjscio¬ wy pleuromutiline otrzymuje sih, hodujac w wodnych roztworach pozywek, zawierajacych zródlo azotu i zródlo weglowodanów, drobnoustrójClitop ilus passeckeria- nus (Pil.)Sing. (rodzinaTricholomataceae.rzadAga- ricales, klasa Basidiomycetes), zdeponowanypodnu- merem 3100 w US-Departament of Agricultura (Northern Utilisation Research and Development Division), Peoria, 111., lub jego warianty albo mutanty. Hodowle mozna przeprowadzic w ten sposób, ze wyzej podany drobnous¬ trój poddaje siefermentacji w kulturze wstepnej, zawiera¬ jacej zródlo weglowodanówi azotu,ekstrakt slodowy,a po¬ nadto make fasolowa, ekstrakt drozdzowy, agar, pepton oraz sole mineralnei otrzymana przytym papkefermenta¬ cyjna przenosi sienastepniedla dalszej hodowlido roztwo- 86 06786067 ru fermentacyjnego, który zawiera jako zródlo weglowo- ' danów glikoze, a jako zródlo azotu produkt autolizy droz¬ dzy piwnych oraz sole mineralne.Pozakonczeniu fermentacji utworzona przytympleuro- mutiline wyodrebnia sie w znany sposób.Otrzymany w ten sposób antybiotyk pleuromutilina jest latwo rozpuszczalna w alkoholu, eterze, octanie butylu, acetonie, metyloizobutyloketonie, czteroglikolii i chloro¬ formie, trudno rozpuszczalna w wodzie, eterze naftowym i cykloheksanie. Jej temperatura topnienia wynosi 167°C (krystalizowana z mieszaniny H,0 : CAOH = 4:1), skrecalnosc optyczna £dJ"d - +32° (10%-Kwy roztwór w chloroformie). Pleuromutilina ma charakterystyczne maksima w widmie ultrafioletowym w pasmach 205 mu i 293 mu (w eterze), lub 209 mu i 290 mu (w 60%-owym etanolu), oraz charakterystyczne pasma adsorpcyjne w widmie podczerwonym 3400, 3000, 1235 i 1095 cm"1 (pastylki z bromku potasowego) i przy 3570, 3610, 1730, 1740 i 1630 cm'1 (w roztworze w chlorku metylenu).Przez katalityczne uwodornienie pleuromutiliny za po¬ moca odpowiedniego katalizatora, np. katalizatora palla- dowo-weglowego odpowiednim rozpuszczalniku, np. est¬ rze etylowym kwasu octowego, pod normalnymcisnieniem i w tempraturze pokojowej, otrzymuje sie jej dwuhydroz- wiazek.Otrzymane sposobem wedlug wynalazku pochodne an¬ tybiotyku pleuromutiliny oraz produktu jej uwodornienia 0 wzorze 1 stanowia, jak juz wyzej przedstawiono, wartos¬ ciowe dodatki do mieszanek srodków paszowych. Wielka zaletaprzystosowaniupochodnychantybiotykupleuromu- tiliny, jak równiez produktu jej uwodornienia polega na tym, ze nie sa one atakowane przez cialo zwierzecia, a ponadto nie sa atakowne przez pozostale skladniki mie¬ szanek gotowych srodkówpaszowych, jak suche grzybnie, w szczególnosci z produkcji penicyliny, maki z krwi i/lub substancje mineralne i/lub witaminy, a w szczególnosci koncentraty bialkowe, np. maczka rybna.Zawartosc pochodnych antybiotyku pleuromutiliny lub produktu jej uwodornienia o wzorze 1 powinna wynosic na 1 kg mieszanki gotowych srodków pasowych, dla drobiu 2,5- 50 mg i dla swin 10 - 50 mg, w pizeliczeniu na ilosc antybiotyku pleuromutiliny. Cieletom i wolom tucznym mieszanke gotowych srodków paszowych powinnosie po¬ dawac w takiej ilosci, abyzostalo przyjetych dziennie 25- 70 mg substancji czynnej.Przy dodatku wiekszych ilosci pochodnych antybiotyku pleuromutiliny albo produktu jej uwodornienia, w szcze¬ gólnosci ich postaci rozpuszczalnych w wodzie, uzyskuje siekorzystnedzialanieprzeciwko zoopatogenicznychdrob- noustrojom, tak, zemozliwejeststosowanie tychzwiazków w lecznictwie zwierzat.Przyklad I. Wytwarzanie antybiotyku pleuromutiliny.Kulture Clitopilus passeckerianus NRRL 3100 napozywce agarowej splukuje sie wyjalowionym fizjologicznie roz¬ tworem soli kuchennej i 3 ml otrzymanej zawiesiny prze¬ szczepia do 500 ml szerokoszyjnej kolby stozkowej, napel¬ nionej 60 ml jalowego roztworu pozywki.Pozywka do skosów agarowych: maki fasolowej 10,0 g, KHjPO, 0,5 g. 1%-owego roztworu FeCl, 1,0 ml, ekstraktu drozdzowego 0,1 g, ekstraktu slodowego 50,0 g, peptonu 1,0 g, agaru 5,0 g, dopelnic woda destylowana do 1000 ml pH naturalne.Roztwór pozywki fermentacyjnej: glikozy 50,0 g/l, N- autolizatu drozdzypiwnych 1,0 g/l, KH,PO, 1,0 g/l, MgS04. 7H,0 0,5 g/l, Ca(NO,)t 0,5 g/l, NaCl 0,1 g/l, FeS04. 7H,0 0,05 g/l, dopelnic woda destylowana do 1000 ml, pH przed sterylizacja 6,0. Po 120 godzinach fermentacji w tempera¬ turze : 24°C na wytrzasarce obrotowej oskoku 40 mm i 250 obrotach na minute, zawartosc 500 ml szerokoszyjnej kol- by stozkowej nabiera konsystencji gestej brei. Zniej 10ml stosuje sie do zaszczepienia 2 1 szerokoszyjnej kolby stoz¬ kowej, o pojemnosci 2 1, napelnionej 200 ml powyzszego roztworu jalowej pozywki fermentacyjnej. Hodowle pro¬ wadzi sie w tych samych warunkach,jakprzyprowadzeniu io pierwszego etapu wstepnego. Po uplywie 48 godzin otrzy¬ mana papke fermentacyjna zaszczepia sie wypelniona 10 1wyzej podanegojalowegoroztworupozywki fermentacyj-. nej kadz.fermentacyjna typu New-Brunswick-Submers, wyposazona w uklad przegród. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 120 godzin przy przeplywie powietrza 0,5 1/1 roztworu pozywki na minute i szybkosci obrotowej mie-. szadla tarczowego 350 obrotów na minute. Nastepnie cala zawartosc kadzi fermentacyjnej odparowuje sie do sucha w wyparce prózniowej w temperaturze pokojowej i otrzy- many placek miele sie na drobno. W ten sposób z uzytych 101 roztworu pozywki otrzymuje sie 2 00gsuchegoproszku o zawartosci 5 g pleuromutiliny.Przyklad II. Produkt reakcji pleuromutiliny z estrem etylowym kwasu alfa- izocyjanianopropionowego. 1,0 g (0,007 mola) estru etylowego kwasu alfa-izocyjaniano- propionowego ogrzewa sie z 2,6 pleuromutiliny (0,007 mola) w 25 ml ksylenu w ciagu 5 godzin pod chlodnica zwrotna w temperaturze wrzenia. Rozpuszczalnik odparo¬ wuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc pobie- ra w alkoholu i zadaje roztwór równowaznikowa iloscia alkoholowego roztworuNaOH w temperaturzepokojowej, wskutek czego ester etylowy ulega zmydleniu. Po usunie¬ ciu alkoholu pod zmniejszonymcisnieniem wytraca sie sól sodowa produktu reakcji w bialej, bezpostaciowej formie, Odsacza sie, przemywa eterem i suszy. W ten sposób otrzymuje sie 1,6 g dobrze rozpuszczalnego w wodzie produktu. Zwiazkowi przypisuje sie wzór empiryczny \CMHMOlNNa.Obliczono: N = 2,72%. Znaleziono: N = 2,70%. Ciezar równowaznikowy wolnego kwasu: obliczony 493, znale¬ ziony 488.Przyklad III. Produkt reakcji pleuromutiliny z estrem dwuetylowym kwasu alfa-izocyjanianoglutarowego.W analogiczny sposób jak podano w przykladzie VII, 45 poddaje sie rekcji pleuromutiline z estrem izocyjanowym kwasu glutarowego, przy czym otrzymuje sie produkt bardzo dobrze rozpuszczalny w wodzie. t)la substancji tej ustalono wzór empiryczny CMHM01§NNar Obliczono: N = 2,35%. Znaleziono: N = 2,30%. 50 Przyklad IV. produkt reakcji pleuromutiliny z estrem etylowym kwasu izocyjanianooctowego. Reakcje przepro¬ wadza sie przyzastosowaniu sposobów opisanych w przy¬ kladach nim, przy czym obie grupy -OH pleuromutiliny reaguja, kazda z 1 molem esteru etylowego kwasu izocyja- 55 nianooctowego. Zwiazek tytulowy jest bardzo dobrze roz¬ puszczalny w wodzie i przypisuje mu siewzór empiryczny CMHM0I1N,Nal.Obliczono: N « 4,49%. Znaleziono: N = 4,42%. PL