PL84084B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia roztworów .wirusa pomoru swin.Znane sa sposoby otrzymywania w wiekszej ilosci wirusa pomoru swin przez rozmnazanie wirusa w hodowlach komórkowych. Sposób taki opisuje: Lang, R. Leftheriotis E. Mackowiak, C. w C. R.Akad. Sci. (France) 251, 1993 (1960) i P. Carmenes, M. W. Swangard, O. Arabruster w Panorama Vet. 1968 7677. Stosowane dotychczas sposoby mozna po¬ dzielic na 2 glówne grupy.—. Rozmnazanie wirusa w hodowli komórkowej typu hodowli w jednej warstwie komórek, przy czym stosuje sie swiezo spreparowane komórki od¬ powiednich narzadów zwierzat (kultura komórek pierwotnych) lub linii komórek, które rozmnaza sie przez wiele pokolen. Po uformowaniu sie gestej warstwy komórek zakaza sie je wirusem pomoru swin i po kilku dniach odbiera sie wirus ze srodo¬ wiska w którym sie nagromadzil.— Rozmnazanie wirusa w zawiesinowych hodo¬ wlach komórek. Zawiesine komórek otrzymuje sie albo z jednowarstwowej hodowli komórek lub bez wstepnej hodowli bezposrednio ze swiezo ubitych zwierzat. Komórki, znajdujace sie w zawiesinie, zakaza sie wirusem bez uprzedniego ich rozmnaza¬ nia i sluza one nastepnie do rozmnazania wirusa.Opisane sposoby wymagaja specjalnej techniki i wystarczaja do wytwarzania wirusa w ilosciach, potrzebnych do produkcji szczepionek przeciwko po¬ morowi swin, zawierajacych zywy wirus. Czas 2 przezycia tych komórek po zakazeniu wirusem wy¬ nosi 2—5 dni. Wstepna hodowla komórek jest pra¬ cochlonna i droga i nalezy ja prowadzic na biezaco, w przypadku zapotrzebowania na duze ilosci wiru- sa. Sposób ten jest za drogi do otrzymywania du¬ zych ilosci wirusa, stosowanych po zatezeniu do otrzymania inaktywowanych szczepionek.Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia roztworów wirusa pomoru swin na drodze in- io fekcji organów swiezo ubitych zwierzat podczas hodowli w zawiesinie, polegajacy na tym, ze tcha¬ wice zdrowych swin ubojowych odbiera sie bez¬ posrednio po zabiciu w warunkach aseptycznych i inkubuje sie w temperaturze 35—37°C w pozywce, do której wprowadzono w celu zakazenia organów przed inkubacja 50 000—150 000 MLP wirusa po¬ moru swin na 40 tchawic, odbiera sie co 4 dni po¬ zywke, przechowuje sie ja w temperaturze 4°C i zastepuje swieza pozywka, nie zawierajaca wi- rusa, i po 20 dniach lub po 5-krotnej wymianie pozywki zywotne jeszcze organa odrzuca sie i ozna¬ cza sie stezenie wirusa w odebranych polaczonych inkubowanych pozywkach i ewentualnie zateza sie pozywki.Tchawice do inkubacji wprowadza sie takze w postaci pojedynczych rozdzielonych pierscieni, a inkubacje w pozywce prowadzi sie przy zastoso¬ waniu powolnego mieszania i napowietrzania ste¬ rylnym powietrzem, zawierajacym 5% C02.W odróznieniu od licznych innych rodzajów wi-84 084 3 rusa, wirus pomoru swin normalnie nie jest cyto- patogenny i dlatego moze sie rozmnazac przez dluz¬ szy caly czas przezycia narzadu w jego hodowli.Tchawice swinskie mozna otrzymac w warunkach sterylnych w wiekszych ilosciach w rzezniach i ko¬ mórki ich tkanek po umieszczeniu w odpowiednim cieklym srodowisku utrzymuja sie przy zyciu przez 2—3 tygodnie. Dla otrzymywania wirusa nalezy tylko odbierac w regularnych odstepach czasu od zakaze¬ nia pozywke, zawierajaca wirus i zastepowac ja swieza pozywka. Tchawica jest w rzezni odpadem poubojowym i mozna ja tam uzyskac w duzej ilo¬ sci. Po zuzytkowaniu zakazonego narzadu w ciagu 2—3 tygodni po zakazeniu mozna go latwo zastapic.Przy przeprowadzaniu sposobu wedlug wynalazku nalezy postepowac nastepujaco: Zamykalne naczynia ze szkla, aluminium lub nierdzewnej stali o po¬ jemnosci 4 litrów sterylizuje sie w zwykly sposób i wypelnia sie 2 litrami buforu fosforanowego o wartosci pH = 7,2, zawierajacego na 1 litr 1 X 1°° jednostek penicyliny G (sól sodowa) i 1 g dwu- hydrostreptomycyny. W rzezni pobiera sie tchawice u swiezo ubitych swin i uwalnia sie od nadmiaru tkanki lacznej. Narzad przemywa sie dwukrotnie sterylna woda i wklada sie do naczyn w warunkach mozliwie najbardziej sterylnych. Kazde naczynie zawiera 30—40 narzadów. Po natychmiastowym przeniesieniu do laboratorium usuwa sie septycznie pozostalosci tkanki lacznej i stosuje sie do hodowli tkankowej czesci tchawicy, lezace miedzy pierw¬ szym pierscieniem ponizej krtani (Larynz) i ostat¬ nim pierscieniem powyzej rozwidlenia (Bifurcatio Tracheae). Czesc te bez dalszego rozdrobnienia wprowadza sie do pozywki, skladajacej sie z 70% bulionu PPLO, 10% wyciagu drozdzowego, 1% glu¬ kozy, 20% swiezej surowicy konskiej, 0,005% czer¬ wieni fenolowej oraz 1000 jednostek penicyliny G (sól sodowa) i 1 mg/m/l dwuhydrostreptomycyny.Bulion PPLO otrzymuje sie w sposób nizej po¬ dany. Gotuje sie 250 g serca bydlecego w 1 litrze destylowanej wody. Po filtracji w celu oddzielenia resztek miesa rozpuszcza w przesaczu 10 g peptonu bakteryjnego i 5 g NaCl. Doprowadza sie lugiem sodowym do wartosci pH = 7,8.W próbie na zywotnosc narzadu oddziela sie lo¬ sowo pojedyncze pierscienie tchawicy i pojedynczo umieszcza sie w naczyniu do hodowli. Za pomoca prostego mikroskopu, stosowanego przy pracach w hodowli komórkowej, mozna obserwowac ruch rzeskowy epitelu. Jak dlugo daje sie zaobserwowac samodzielny ruch, narzad mozna stosowac do roz¬ mnazania wirusa. Wskazane jest jednak zastapie¬ nie narzadu nowym najpózniej po 3 tygodniach poniewaz, jak stwierdzono, obniza sie w tym czasie wydajnosc wirusa.Nizej podane przyklady przedstawiaja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. W wyzej opisanym naczyniu o po¬ jemnosci 4 litrów, wykonanym ze stali nierdzewnej, umieszcza sie 30 tchawic, pobranych w rzezni. Po usunieciu tkanki lacznej cale tchawice umieszcza sie w butelkach Povitzkiego z pozywka tak, ze na PZG Bydg., zam. 4 kazda butelke o pojemnosci ogólnej 1500 ml przy¬ padaja 3 tchawice w 150 ml pozywki. Do pozywki przed jej rozlaniem dodaje sie 80000 MLD (MLD = srednia dawka smiertelna) wirulentnego wirusa pomoru swin. Butelki inkubuje sie przez 4 dni w temperaturze 36°C, pozywke zlewa sie w warunkach sterylnych i utrzymuje sie w temperaturze -|-40C.Do kazdej butelki wprowadza sie 150 ml swiezej pozywki, nie zawierajacej wirusa i inkubuje sie io ponownie przez 4 dni. Nastepnie zabieg powtarza sie do uzyskania pieciu zbiorów pozywki z wirusem i po 20 dniach od infekcji narzady wykazuja jeszcze ruch rzeskowy, pomimo to odrzuca sie je. Zbiory wirusa laczy sie, otrzymujac ogólem 7500 ml.Za pomoca reakcji immunofluoroscencyjnej stwierdza sie stezenie wirusa, które wynosi 104,3 jednostek infekcyjnych w 1 mililitrze.Przyklad II. Wedlug przykladu I zbiera sie i oczyszcza 30 tchawic. Do pozywki przed inku- bacja wprowadza sie 60000 MLD wirusa pomoru swin. Nastepnie tchawice rozdziela sie na pojedyn¬ cze pierscienie i dysperguje sie w 1,5 litra pozywki.Pozywka znajduje sie w fermentatorze, zaopatrzo¬ nym w mieszadlo i doprowadzenie gazu, który in- kubuje sie w temperaturze 36°C. Ciecz miesza sie przy 30 obrotach /minute przy jednoczesnym wpro¬ wadzaniu 2 litrów/minute powietrza z 5% do¬ mieszka COi. Po 4 dniach srodowisko, zawierajace wirus, odsacza sie i zastepuje swiezym. Narzady inkubuje sie dalej zmieniajac pozywke co 4 dni.Odprowadzone srodowiska laczy sie i utrzymuje w temperaturze 4°C. Po 5 odbiorach organy odrzuca sie, chociaz wykazuja one pod mikroskopem ruch rzeskowy. Roztwór, zawierajacy wirus, wykazuje stezenie wynoszace 104,0 jednostek infekcyjnych na 1 mililitr, oznaczone za pomoca immunofluoro- scencji. PL PL PL PL PL

Claims (2)

1. Z astrzezeni a patento we 40 1. Sposób otrzymywania roztworów wirusa po¬ moru swin przez infekcje organów swiezo ubitych zwierzat podczas hodowli w zawiesinie, znamienny tym, ze tchawice zdrowych swin ubojowych odbie_ 45 ra sie bezposrednio po zabiciu w warunkach asep- tycznych i inkubuje sie w temperaturze 35—37°C w pozywce, do której wprowadzono w celu zakazenia organów przed inkubacja 50 000—150 000 MLD wi¬ rusa pomoru swin na 40 tchawic, odbiera sie co 50 4 dni pozywke, przechowuje sie ja w temperaturze 4°C i zastepuje sie swieza pozywka, nie zawierajaca wirusa i po 20 dniach lub po 5-krotnej wymianie pozywki zywotne jeszcze organa odrzuca sie i ozna¬ cza sie stezenie wirusa w odebranych polaczonych 55 inkubowanych pozywkach i ewentualnie zateza sie pozywki.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze tchawice dzieli sie na pojedyncze, pierscienie, a in- 60 kubuje sie w pozywce przy powolnym mieszaniu i napowietrzeniu sterylnym powietrzem, zawieraja¬ cym 5% CO2. 644/76, nakl. 110+20 Cena 10 zl PL PL PL PL PL