PL82595B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: Mallinckrodt Chemical Works, St. Louis (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób oznaczania in vitro substancji fizjologicznie czynnych w plynie ustrojowym Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania in vitro substancji fizjologicznie czynnych zdolnych do wystepowania zarówno w formie zwiazanej i niezwiazanej. Sposób wedlug wynalazku obejmujp mieszanie znaczonej formy substancji czynnej i pomiar substancji znaczonej zwiazanej i niezwia¬ zanej ze srodkiem wiazacym.Wynalazek obejmuje srodki do okreslenia stanu gruczolu tarczycy za pomoca znaczonego odczyn¬ nika T4.TBG skladajacego sie z buforowego roz¬ tworu tyroksyny znaczonej radioaktywnym jodem, surowicy Lkrwi, iz której usuwa sie wiekszosc tyro¬ ksyny i barbitalu normalnej surowicy krwi (liofili¬ zowanej) oraz sorbentu dla tyroksyny.Sposób oznaczania procentu tyroksyny hormo¬ nalnie czynnej w próbce krwi jako wskaznika po¬ ziomu wzglednie wolnej tyroksyny, której znaczona forma jest roztworem znaczonego hormonu tarczy- ny wybranego z tyroksyny i 3,3V-trójjodotyroniny, a którego pierwsza czesc jest roztworem zawieraja- cym tyroksyne z próbki krwi do badania, bedacej istotnie wolna od tyreoglobuliny, a czesc druga jest roztworem zawierajacym nienasycona tyreoglobuline i towarzyszace jej hormony tarczycy z próbki krwi z tego samego zródla, a nastepnie pomiar znaczone¬ go hormonu tarczycy zwiazanego z tyreoglobulina oraz niezwiazanego znaczonego hormon tarczycy.Przeglad prac z tej dziedziny z odnosnikami do literatury zródlowej znajduje sie w Rozdziale I „Protein-bindiing Studies and Radioassays", Radio- 2 izotopy w Medycynie R.L. Hayes, F. A. Goswitz i B. E. P. Murphy, Wydawcy, CONF 671 111, Komi¬ sja Energii Atomowej Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki, 1968. 5 Gruczol tarczycy wytwarza dwa hormony 3,3',5- -trójjodotyronine (T3) i tyroksyne (T4).Niektóre bialka z surowicy w rózny sposób wiaza te hormony tarczycy. Do takich bialek nalezy glo¬ bulina (tyroksyna — zwiazana z globulina, TZG), 10 prealbumiiine (ityroksyna — zwiazana z preaibumi- na, TZPA) i albumina (albumina z surowicy, AS).Pojecie tyroksyna — wiazaca, obejmuje wiazanie zarówno T3 jak i T4 przez te bialka, poniewaz ani T3 ani T4 nie moga byc wydzielone za pomoca 15 podanych miejsc wiazacych. Hormony tarczycy sa w dynamicznej równowadze z tyreoglobulina.Poziom niezwiazanej lub „wolnej" T4 z plazmy ocenia sie na ponizej 0,1% calego bialka zwiazanego z T4 lub w przyblizeniu 2-5 miliimoikrogramoprocent. 20 Szybkosc syntezy i wydzielanie hormonu tarczy¬ cy jest regulowane przez inny hormon, hormon stymulujacy tarczyce (HST) wydzielany przez prze¬ dni gruczol przysadkowy. Przyjmuje sie, ze HST reguluje „lapanie" lub usuwanie jodu z osocza i 25 synteze oraz uwalnianie hormonów tarczycy. Po¬ ziom krazacej T3 i T4 wplywa na szybkosc wydzie¬ lania HST. Kiedy poziomy tych hormonów z osocza sa ponizej normalnych sitezen przysadka jest pobu¬ dzana do wytwarzania i wydzielania HST. HST po- 30 budza wydzielanie hormonu tarczycy, co z kolei 82 59582 595 poprzez proces przeciwny obniza wydzielanie HST przez przysadke.Do oceny dzialania tarczycy, lekarze zazwyczaj stosuja kilka prób klinicznych in vitro. Niektóre z nich pokrótce omawia sie ponizej.Od dawna stosuje sie jako wskazniki podstawowe szybkosc metaboliczna (PSM) i poziom jodu bialko¬ wego (PJB).Próba najszerzej stosowana klinicznie do oceny dzialania tarczycy, jest próba wiazania T3. Za po¬ moca tej próby mierzy sie zdolnosc niektórych bia¬ lek z surowic, przede wszystkim TZG do wchla¬ niania lub wiazania radioaktywnie znaczonej T3 prfea iIl^EPSte^*^ niezajete miejsca wiazace.Pipby wiazSifia *3^)|zwalaja ocenic rozdzial zna¬ cznej T3 pomiedzy Lkladniki z surowicy, a inne cJ}«ninitiMl^C£nqdatnosc do T3.Ifjp&nJkJ stosuje sie nastepujace dla przysiadu: "czefw^ne^ cialka krwi, bialko pokryte weglem drzewnym i wymieniacze jonowe w po¬ staci granulatu, plyty, gebki lub w formie kolum¬ ny.Dokladnosc i prostote próby wiazania T3 opisu¬ je francuski opis patentowy nr 2047211. Kluczem do tego postepowania jest zastosowanie wymienia¬ cza jonowego w postaci stalego wypelnienia, które nie wymaga plukania celeim usuniecia Miezwiazanej T3 i jest latwe do usuniecia z roztworu reakcji, co umozliwia bezposrednie zmierzenie zdomosci wia¬ zacej T3 z surowicy.Próba wiazania T3 pozwala na bezposrednie zmierzenie zdomosci wiazania TZG surowicy w stosunku do znaczonej T3. Wiadomo, ze TZPA nie wykazuje powinowactwa w stosunku do T3. Po¬ winowactwo TZG w stosunku do T3 jest znacznie wyzsze niz powinowactwo albuminy do tego hor¬ monu, a rozcienczenie surowicy buforem w czasie wykonywania pomiaru powoduje dalsze obnizenie zdolnosci wiazania T3 przez albumine.Kiedy doda sie surowice do roztworu buforowe¬ go znaczonej T3 to zapelnia sie nieobsadzone miej¬ sca wiazace TZG oraz wiaze sie znaczona T3. Nad¬ miar oraz niezwiazana znaczona T3 wiaze sie za pomoca drugiego srodka wiazacego — w tej próbie stosuje sie wymieniacz jonowy w postaci warstwy.Fo usunieciu tej warstwy z roztworu buforowego, ilosc T3 znaczonej TZG mierzy sie bezposrednio, a wyniki wyraza sie jako wskaznik zdolnosci wia¬ zacej tyroksyny (wskaznik TZG) w odniesieniu do normalnej wartosci T3, która wynosi 1,00.Jezeli stezenie TZG (pierwsze srodki wiazace) w surowicy jest normalne, liczba dostepnych lub niezajetych miejsc wiazacych dla wiazania znaczo¬ nej T3 jest odwrotnie proporcjonalna do liczby miejsc wiazacych, zajetych przez T4 i w mniejszym stopniu przez T3. Kiedy dostepnosc T4 dla TZG wiazania wzrasta jak przy nadczynnosci tarczycy, miejsca wiazace sa bez mala calkowicie zajete przez T4, a tym samym mniej miejsc wiazacych dostepnych jest dla zwiazania znaczonej T3.W ten sposób .aktywnosc zwiazana z TZG jest mniejsza niz w normalnej T3 z kontrolnej surowi¬ cy, co wplywa na obnizenie wskaznika TZG. Kiedy dostepnosc T4 dla TZG wiazana obniza isie przy niedoczynnosci tarczycy mniej wiazacych miejsc zajmuje T4, pozostawiajac wiecej miejsc niz nor¬ malnie do wiazania znaczonej T3. Wynikiem jest wzrost Liczby aktywnosci wiazanej z TZG i wzrost wskaznika TWG. 5 Nalezy zauwazyc, ze podczas gdy tradycyjnie do pomiaru wskaznika TZG stosuje sie znaczona T3, to zastosowanie znaczonej T4 jest tak samo wazne.W oparciu o pomiar wskaznika TZG mozna okre¬ slac wskazanie stanu klinicznego tarczycy za po¬ lo moca porównania z zakresami podanymi w ta¬ blicy 1.Te zakresy okresla sie nia podstawie reprezenta¬ tywnych badan pacjentów z obszarów pod róznymi szerokosciami geograficznymi. 15 Tablica 1 20 Zakresy wskaznika TWG Hypertyreoza ponizej 0,87 Eutyreoza 0,87—1,13 Hypotyreoza powyzej 1,13 W 1960 r. R. P. Ekins (Clim, chim. Actwa 5, 453) rozwinal sposób oznaczania tyroksyny z surowicy. 25 Autor podstawe tej próby nazwal „analiza nasy¬ cania". Metode te udoskonalili B. E. P. Murphy i C.. J. Patee (J. Clin. Endocónol., 24, 187 (1964), którzy wprowadzili termin „konkurencyjna ana¬ liza wiazania bialka". 30 Ten sposób podal nastepnie B. E. P. Murphy w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Amery¬ ki nr 3414383 (1968).Sposób Murphy — Pattee ulepszyl nastepnie J. L. Brown, co jest przedmiotem fracuskiego opi- 35 su patentowego nr 2047211.Glówna podstawa ukladu próby T4 Brown'a opiera sie na fakcie, ze TZG z surowicy posiada wzglednie wysokie i wlasciwe powinowactwo do wiazania T4. Kiedy doda sie znaczona T4 do roz- 40 tworu zawierajacego TZG (na przyklad rozcien¬ czone zlozone surowice) zasadniczo cala ilosc T4 zostaje zwiazana z TZG. Jezeli stabilna T4 (na przyklad T4 od pacjenta) doda sie nastepnie do tego znaczonego T4/TZG roztworu, to pewna licz- 45 ba znaczonej T4 .zostanie usunieto z TZG proporcjo¬ nalnie do ilosci" dodanej stabilnej T4. Kiedy do tego ukladu doda sie iinny srodek wiazacy T4 taki jak anionit, to wiaze on znaczona T4, usu¬ nieta z TZG. Ilosc znaczonej T4 usunietej z TZG 50 mozna nastepnie oznaczyc przez porównanie ilosci radioaktywnosci pozostajacej w górnej warstwie roztworu z iloscia pierwotna zmierzona przed do¬ daniem anionitu.Kiedy doda sie podwyzszone ilosci stabilnej T4 55 do znaczonych T4/TZG roztworów i potraktuje sie jak wyzej to aktywnosc pozostajaca w górnej war¬ stwie roztworu, jak stwierdzono, obniza sie prizy kazdym kolejnym podwyzszeniu dodanej ilosci sta¬ bilnej T4. W ten sposób ilosci stabilnej T4 mozna 60 oznaczyc przez porównanie aktywnosci górnej war¬ stwy w nieznanym roztworze z aktywnoscia w górnej warstwie podobnego znanego roztworu.W ce.u zaadoptowania tego postepowania do oznaczenia T4 z surowicy nalezy wydzielic T4 z 65 bialek wiazacych pobranych od pacjenta. Wykonu-82 595 6 je sie to przez denaturacje i wytracanie bialek za pomoca alkoholu. Zdenaturowane bialka uwalniaja wiekszosc (w przyblizeniu 80%) zwiazanej z nimi T4, która mozna wydzielic w górnej warstwie alko¬ holowego roztworu po odwirowianiu mieszaniny.Okreslenie stanu klinicznego tarczycy jako odbi¬ cia w poziomie, tyroksyny z surowicy ustala sie przez odniesienie do sugerowanych zakresów po¬ danych w tablicy 2. Te zakresy okresla sie na podstawie reprezentatywnych badaniach pacjen¬ tów na obszarach pod róznymi szerokosciami geo¬ graficznymi. r rablica 2 Zakresy calkowitej zawartosci tyroksyny •z surowicy Nadczynnosc gruczolu tarczy¬ cowego ponizej 5,0 ug % Sutyreoza 5.0—13,7 ug % Niedoczynnosc gruczolu tarczy¬ cowego powyzej 13,7 ug % Podatnosc do blednych wyników, w niektórych okolicznosciach przypisywana katalitycznemu roz¬ kladowi frakcji znaczonej T4 w T4/TZG roztworze, usuneli Brown i F. P. Hallett przez dodanie do roztworu czynnika chelatujacego. Ta modyfikacja odczynnika nie powoduje zadnych zmian w podsta¬ wowej teorii i postepowaniu w tym sposobie (w dalszym ciagu opisu sposób okresla sie jako metode Browna).W przyblizeniu 99,95% tyroksyny krazacej jest wiazana przez bialka z osocza, przy czym 0,05% pozostaje w niezwiazanym stanie. Obecnie utrzy¬ muje sie, ze poziom niezwiazanej lub „wolnej" tyroksyny w plazmie jest bezposrednio odpowie¬ dzialny za regulacje metabolizmu komórkowego i wydzielainie* tyrotropimy przysadki (HST). W ten sposób bezposredni pomiar wolnej tyroksyny okre¬ sla stan metaboliczny bardziej dokladnie niz kazda inna pojedyncza próba oceny dzialania gruczolu tarczycowego. Dotychczas metody nadajace sie do pomiaru wolnej tyroksyny stosowaly dialize, ultra- wirowanie lub saczenie zelu polaczone z calkowi¬ tym oznaczenim tyroksyny z surowicy. Te metody oznaczania wolnej tyroksyny sa zlozone i zmudne i nie zostaly zaadaptowane do icodzienaiego uzytku klinicznego.Zasadniczo poziom wolnej tyroksyny reguluje sie stezeniem tyroksyny krazacej (zwiazanej) i po¬ ziomem TZG. Jednakze wspóldzialanie tych obu czynników celem utrzymania normalnego poziomu wolnego hormonu tarczycy jest znacznie bardziej zlozone niz to sugeruje proste stwierdzenie.Przy eutyreozie utrzymanie normalnego poziomu wolnej tyroksyny reguluje sie mechanizmami, któ¬ re stymuluja zmiany w calkowitym poziomie tyro¬ ksyny, aby skompensowac zmiany w poziomie TZG.Wzrost poziomu estrogenu wplywa na uklad re¬ gulatora igruczolu tarczycowego prowadzac do sytu¬ acji, iktóra powoduje znlieksiztoalcone wyniki w po¬ równaniu z wynikami prób wiazania T3 i T4 u 10 surowicy. Takie podwyzszone poziomy estrogenu wystepuja zazwyczaj podczas ciazy lub w czasie leczenia estrogenem, na przyklad w czasie leczenia za pomoca preparatu antyowulacyjmego, który za- 5 wiera estrogen.Nastepujaca kolejnosc dzialania wynika ze wzro¬ stu poziomu estrogenu. (1) Podwyzszone poziomy estrogenu powoduja podwyzszone wytwarzanie TZG. (2) Wynikajaca podwyzszona liczba niena¬ syconych wiazacych miejsc tyroksyny (TZG) wiaze sie z wolna tyroksyna, powodujac obnizenie pozio¬ mu wolnej tyroksyny. (3) Przysadka jest stymulo¬ wana obnizonym poziomem wolnej tyroksyny do wydzielania hormonu tarczycy (HST). (4) Gruczol u tarczycy z kolei, jest stymulowany przez HST do wydzielania tyroksyny. (5) Tyroksyna wiaze sie z TZG do wyrównania poziomu powodujac, ze wolna tyroksyna wraca do normalnego stezenia. Kiedy wystepuje podwyzszenie poziomu estrogenu jak w 20 czasie ciazy lub leczenia estrogenem, ocena kli¬ niczna aktywnosci tarczycy otrzymana z oznaczen próby wiazania T3 wykazuje wzrost nienasyconych miejsc wiazacych TZG, a tym samym niedoczyn¬ nosc tarczycy. Przeciwnie, oznaczenia T4 wykazuja 25 nadczynnosc tarczycy. Jednakze prawdziwy stan kliniczny w tych warunkach eutyreoze okresla nor¬ malny poziom wolnej tyroksyny.W ten sposób, w tym przypadku ani próby wia¬ zania T3 ani T4 z surowcy nie sa adekwatne do korekty oceny klinicznej, chociaz wynik kazdej próby dokladnie odzwierciedla wartosc mierzonej zmiany.W 1965 F. Clark i D. B. Horn (J. Clim. Endocrinol, 35 25, 39—45) wprowadzili metode oceny wskaznika, który jest proporcjonalny do stezenia wolnej T4.Opiera sie to na oznaczeniu PJB i pomiarze wia¬ zania T3.PJB X stosunek wiazania T3 przez zywice = 40 „wskaznik wolnej tyroksyny".Znana jest bezposrednia zaleznosc pomiedzy po¬ ziomem PJB, stosowana przez Clarka i Horna a poziomem T4 z surowicy okreslone zgodnie z po¬ dana wyzej metoda Browna. 45 Z drugiej strony wskaznik TZG wyliczony zgod¬ nie z francuskim opisem patentowym nr 2047211 ujmujacym odwrotnosc zaleznosci Clarka i Horna do stosunku wiazania T3.Jako konsekwencje tych zaleznosci mozna wyli- 50 czyc „wskaznik wolnej T4" ze wskaznika TZG z danych uzyskanych z próby Browna na podstawie nastepujacego wzoru: 30 55 Wskaznik wolnej T4 = Poziom T4 z surowicy (^g%) Wskaznik TZG Chociaz ten „wskaznik wolnej T4" jest liczbowo rózny od „wskaznika wolnej tyroksyny" Clarka i Horna, ale jest równie wazny. 60 Okreslenie stanu klinicznego gruczolu tarczyco¬ wego, co oddaje sie za pomoca wskaznika wolnej T4, mozna ocenic odnoszac do zakresów podanych w tablicy 3, a które opiera sie na podstawie re¬ prezentatywnego badania pacjentów z obszarów 65 pod róznymi szerokosciami geograficznymi.82 595 8 Tablica 3 Zakresy wskaznika wolnej T4 Nadczynnosc gruczolu tarczycowego ponizej 4,4 Euty^eoza 4,4—15,7 Niedoczynnosc gruczolu tarczycowego powyzej 15,7 W aktualnym pomiarze wolnej T4 „wskaznik wolnej T4" jest niewrazliwy na podawanie estro¬ genów, androgenów, salicylanów, dwufenylohydan- toiny, okresy ciazy oraz nerczyce i inne czynniki powodujace nieprawidlowe wyniki odbijajace sie na zmianach poziomu TZG lub zaburzeniach w jej normalnym wiazaniu.Zazwyczaj pomiar, pojedynczej zmiany nie wy¬ starcza, aby postawic prawidlowa diagnoze stanu gruczolu tarczycowego. Dzieki stosowaniu sposobu wedlug wynalazku doswiadczalnie oznaczona war¬ tosc wolnej T4 oraz wyliczony wskaznik wolnej T4 daja bardzo scisle ustalenia przy minimalnej liczbie prób okreslajacych stan dzialania gruczolu tarczycowego.Wplywy róznych fizjologicznych czynników i leków na badania T4 i T3 i wskaznik wolnej T4 mozna zestawic jak w tablicy 4. estrogenów. Inne aspekty sa czesciowo oczywiste, a czesciowo zostana przedstawione ponizej.Wynalazek jest zatem nastawiony na polepsze¬ nie sposobu nadajacego sie do uzycia w próbach klinicznych, a jednym z osiagniec wynalazku jest podanie sposobu oznaczania czesci tyroksyny hor¬ monalnie czynnej z próbki krwi jako wskaznika poziomu wzglednie wolnej tyroksyny, który wy¬ maga mieszania ze znaczonym odczynnikiem, pierw¬ szego roztworu zawierajacego tyroksyne z próbki krwi, bedacej przedmiotem badania, zasadniczo wolnej od tyreoglobuliny i z drugim roztworem zawierajacym nienasycona tyreoglobuline i pola¬ czone z nia hormony gruczolu tarczycowego z prób¬ ki krwi tego samego pochodzenia, przy czym zna¬ czony odczynnik jest roztworem znaczonego hor¬ monu wybranego z grupy zawierajacej tyroksyne i 3,3^5'-trójjodotyroinine. Czesc znaczonego hormonu gruczolu tarczycowego wiaze sie z nienasycona tyreoglobulina z drugiego roztworu i nastepnie wy¬ konuje sie pomiar 1 znaczonego hormonu zwiaza¬ nego z tyreoglobulina i 2 niezwiazanego znaczonego hormonu gruczolu tarczycowego. Przy korzystnym realizowaniu sposobu znaczonym odczynnikiem jest 25 roztwór znaczonej tyroksyny zwiazanej z tyreoglo¬ bulina.Sposób wedlug wynalazku polega na unowoczes¬ nieniu znanych, polaczonych metod badania. Na przyklad, w jednym ze sposobów wedlug wyna- 10 15 20 Wskaznik T3. TZG T4 ixg% Wskaznik wolnej T4 Okres ciazy/Leczenie estrogenem Hypo-Pregnancy Nerczyca Leczenie androgenem Dwufenylohydantoina Niedoczynnosc tarczycy — leczona Odpowiednie leczenie T3 Wlasciwie wysuszony gruczal tarczycowy Odpowiednia L-tyroksyna Nadczynynosc tarczycy — leczona z odpowiednia kontrola | Akromegalia Tal T4 Podwyzszona Podwyzszona Obnizona Obnizona Obnizona bez zmian Normalna Wysoce normalna Normalna Obnizona blica 4 T3 Podwyzszona Obnizona Obnizona Obnizona Obnizona bez zmian Podwyzszona Obnizona Normalna Obnizona Wskaznik FT4 Normalny Podwyzszony Normalny Normalny Normalny bez zmian Wysoce normalna Wysoce normalna Normalny Normalny Normalna wartosc 0.87— 1.13 5.0 —13.7 4.4 —15.7 Celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonych prób do oznaczania in vitro hormonów, antygenów, steroidów i tym podobnych w cieczach.Przedmiot wynalazku dotyczy ulepszen w od¬ niesieniu do badania dzialania gruczolu tarczyco¬ wego, co jednoczesnie obejmuje zarówno poziom tyroksyny z surowicy i poziom nasycenia tyreo¬ globuliny. Istnieje jeszcze inny aspekt wynalazku dotyczacy sposobu bezposredniego oznaczania czesci tyroksyny hormonalnie czynnej, co obejmuje wskaz¬ nik wolnej tyroksyny i umozliwia dokladne okre¬ slenie stanu gruczolu tarczycowego za pomoca po¬ jedynczej prostej próby, w obecnosci zaklócajacych wplywów takich jak np. podwyzszone poziomy 55 60 65 lazku czesc tyroksyny hormonalnie wspomnianej metody Browna okreslania tyroksyny z surowicy, w której dwa roztwory przyrzadzone z badanej krwi dodaje sie do odczynnika znaczonej T4 TZG.Pierwszy z tych roztworów zawierajacy ok. 80% T4 z próbki surowicy, wolnej od bialek krwi opisal Brown (francuski opis patentowy nr 2047211).Drugi roztwór wedlug wynalazku zawiera z góry okreslona ilosc badanej surowicy. Wedlug rzeczo¬ znawcy zwiazanie T4 przez albumine obniza sie znacznie przy rozcienczaniu, a wiazanie przez pre- albumine inhibituje bufor barbitalu, dajac roztwór, w którym tylko T4 zwiazana z bialkiem jest nasy¬ cona TZG z badanej surowicy.82 595 9 10 Nowy sposób oznaczania procentu tyroksyny hormonalnie czynnej jest polaczeniem klasycznej metody wiazania T3 i T4 z surowicy i wykonuje sie go w pojedynczym zbiorniku. Zrozumienie isto¬ ty sposobu ulatwiaja nastepujace wyjasnienia.Nalezy zauwazyc, ze w próbie wiazania T3 miej¬ sca wiazace tyroksyne z bialka, a nie zajete przez T3 lub T4 wylapuja znaczona T3.W metodzie wiazania T4 z surowicy ekstrahuje sie calkowicie T4 z surowicy i powoduje sie usunie¬ cie znaczonej T4 ze znaczonej T4.TZG. Tablica 6 podaje okreslenia stanu stosowanych skladników surowicy i wyniki prób wiazania T3 i T4 z suro¬ wicy w róznych stanach klinicznych.I Eutyreoza Hypotyreoza Hipertyreoza Podwyzszony poziom estrogenu *) imp/min — liczba impulsów w ciagu minuty Nalezy zauwazyc na podstawie danych zamiesz¬ czonych w tablicy, ze w przypadku nieskompliko¬ wanego schorzenia gruczolu tarczycowego wyli¬ czona szybkosc w obu metodach wiazania T3 i T4 z surowicy daje odstepstwo od stanu normalnego w tym samym kierunku, to znaczy surowica przy niedoczynnosci gruczolu tarczycowego daje w obu próbach wysokie udzialy, surowica przy nadczyn¬ nosci daje w obu przypadkach niskie udzialy. W ten sposób polaczone wyniki obu prób wyrazaja istnienie nienormalnego stanu w odniesieniu do funkcjonowania gruczolu tarczycowego.Z drugiej strony zaklócajacy wplyw podwyzszo¬ nych poziomów estrogenu powoduje, ze wyliczenia szybkosci w obu próbach odbiegaja od normy w przeciwnych kierunkach. Ich odchylenia od warto¬ sci normalnych wykazuja wzajemnie wyrównywa¬ nie sie ich sumy i dlatego wykazuja normalny stan w stosunku do dzialania gruczolu tarczycowego.Wyliczony wskaznik wolnej tyroksyny podany przez Clarka i Horna i jego modyfikacje opieraja sie na tej samej zasadzie. Wystepuja tylko róznice arytmetyczne. v Wynalazek pozwala na oznaczenie procentu ty¬ roksyny hormonalnie czynnej jako wskaznika po¬ ziomu efektywnie wolnej tyroksyny próbki suro¬ wicy krwi (lub plazmy) w pojedynczej próbie in vitro wykonanej w prostej nieskomplikowanej ampulce. Staje sie to bardziej jasne w oparciu o nastepujace objasnienie.W pierwszym etapie sposobu wedlug wynalazku ekstrahuje sie T4 (w przyblizeniu 80%) z próbki 5 surowicy i okreslona ilosc ekstraktu dodaje sie do roztworu znaczonego odczynnika T4, TZG.T4 z ekstraktu czesciowo usuwa znaczona T4 z odczynnikiem znaczonego T4.TZG. Zakres usunie¬ cia jest proporcjonalny do poziomu T4 w próbce surowicy.W drugim etapie pewna czesc tej samej suro¬ wicy dodaje sie do tej samej ampulki. Usunieta znaczona T4 z etapu pierwszego zostaje czesciowo zwiazana przez nasycona TZG obecna w czesci su¬ rowicy dodanej w etapie drugim. Ilosc zwiazanej znaczonej T4 zalezy od dwóch czynników: (1) ilo¬ sci znaczonej T4 dostepnej (z etapu 1), (2) ilosci nienasyconej TZG obecnej w dodanej czesci suro¬ wicy (w etapie 2) ilosci nienasyconej TZG obec¬ nej w dodanej czesci surowicy (w etapie 2).Oczywiscie porzadek oraz kolejnosc tych eta¬ pów nie jest stala i wedlug wynalazku moga byc wykonane w odwrotnej kolejnosci oraz porzadku dodawania ekstraktu T4 i surowicy pacjenta za¬ wierajacej nienasycona TZG. Takze stosowany zna¬ czony odczynnik moze byc roztworem znaczonej T4 w buforowanym barbitalu zasadniczo bez TZG oraz moze zawierac znaczona T3 w miejsce znaczonej T4.Wczesniej wykazano, ze znaczona T3 jest trady¬ cyjnie stosowana do oznaczania nienasyconej zdol¬ nosci wiazania bialka z surowicy w stosunku do hormonów tarczycy lecz znaczona T4 mozna pod¬ stawic z dobrym skutkiem.W sposobie wedlug wynalazku wykorzystuje sie to podstawienie, a znaczona T4 dostarcza sie w formie znaczonego T4. TZG w etapie 1.Jest oczywistym, ze wzgledne ilosci surowicy T4 i nienasyconego bialka z surowicy dostarczone w dwóch etapach zaleza od wzglednych objetosci su¬ rowicy reprezentowanych przez ilosci uzyte w obu przypadkach. Pelnowartosciowe wyniki otrzymuje.Tablica 6 Poziom T4 zwiazanej z bialkiem Normalny Normalny Normalny Wysoki Poziom zwiazanej T4 Normalny Niski Wysoki Wysoki Poziom wolnej T4 Normalny Niski Wysoki Normalny Próba wiazania T3 *) (imp/min) Umiarkowana (10 000) Wysoka (15 000) Niska (5 000) Wysoka (15 000) Próba T3 z surowicy *) (imp/min) Umiarkowana (10 000) Wysoka (15 000) Niska (5 000) Niska (5 000) Wskazr wolnej (5 + 6 *) (imp/r 20 000 30 000 10 000 20 000 [Stan kliniczny Poziom T4 zwiazanej z bialkiem Poziom zwiazanej T4 Poziom wolnej T4 Próba wiazania T3 *) (imp/min) Próba T3 z surowicy *) (imp/min) Wskaznik wolnej T4 (5 + 6) I*) (imp/min) 10 zi< ie, nc i ol? 40 45 50 55 60 6582 595 li sie stosujac staly stosunek surowicy w dosc szero¬ kim zakresie. Jednakze stwierdzono doswiadczalnie, ze uklad optymalnej stosowalnosci otrzymuje sie, kiedy staly stosunek A/B w przyblizeniu wynosi 21, a w którym A oznacza objetosc surowicy wyrazona za pomoca stalego udzialu T4 i B oznacza objetosc surowicy wyrazona czescia dostarczajaca nasycona TZG. Jak wykazano ten stosunek moze zmieniac sie w szerokim zakresie na przyklad w przyblizeniu pomiedzy 10:1, a 30:1.Jest zrozumiale, ze oznaczenia „znaczona T4" i „znaczona T3" stosowane tutaj sa przeznaczone do okreslenia hormonów w formie, w której mozna je zidentyfikowac za pomoca znaczonych atomów i ich ilosci. Takimi atomami moga byc na przy¬ klad izotopy radioaktywnych atomów dajace sie identyfikowac i mierzyc poprzez ich radioaktyw¬ nosc, atomy trwalych pierwiastków wyrózniajace sie ciezarem atomowym normalnie nie wystepu¬ jacym takie jak np. C-13, dajacy sie okreslic za pomoca spektroskopii masowej, itp. lub atomy inne¬ go pierwiastka, który chemicznie jest podobny do pierwiastka normalnie obecnego w hormonie.Dzieki sposobowi wedlug wynalazku jest mozli¬ wym wykonanie bezposredniego oznaczenia pro¬ centu tyroksyny hormonalnie czynnej w obecnosci znieksztalcajacych wplywów takich jak podwyz¬ szone poziomy estrogenu, czyli dokladnego okre¬ slenia stanu dzialania gruczolu tarczycowego. W tym wzgledzie próba sposobu wedlug wynalazku daje dokladne i pewne wyniki, kiedy wykonana jest na próbach krwi z bardzo chorych pacjentów i pacjentów, których krew nie zawiera TZG, pod¬ czas gdy standardowe próby T3 i T4 daja w ta¬ kich przypadkach mylne wyniki. Próba sposobu wedlug wynalazku daje takie same wyniki, jak próby wczesniej stosowane, jednakze w przypadku pacjentów cierpiacych na T3 tyreotoksykoze (tok¬ syczna nadczynnosc tarczycy wynikajaca z podwyz¬ szonych poziomów T) wszystkie próby wykazuja eutyreoze.Próba sposobu wedlug wynalazku jest takze przydatna do oznaczania w plynach ustrojowych innych ligandów lub fizjologicznie czynnych sub¬ stancji takich jak steroidy, antygeny, przeciwciala i zelazo, które sa zdolne do istnienia w formie zwiazanej i niezwiazanej. Srodkiem wiazacym w takich ukladach jest substancja, zwykle bialko, która ma powinowactwo do co najmniej jednego takiego ligandu lub substancji fizjologicznie czyn¬ nej i w ten sposób prowadzi do utworzenia kom¬ pleksu ligand — srodek wiazacy. Na przyklad, pró¬ be wedlug sposobu mozna zastosowac do oznacza¬ nia steroidów takich jak kortyzol z plazmy oraz do oznaczania zelaza zawartego w plazmie. W ten sposób kortykosteroid kory jeden z wazniejszych hormonów steroidów wydzielanych przez kore nadnercza jest wiazany z nosnikiem bialka, steroi¬ dem kory wiazacym globuline (SWG) oraz trans- kortyne. Podobnie, zelazo z plazmy jest przeno¬ szone przez transferyne (zelazo wiazace globuline), która zachowuje sie jak beta globulina. W czasie ciazy na przyklad wzrastaja poziomy steroidów ko¬ ry wiazace globuline i transferyne. 12 Sposób wedlug wynalazku ilustruja nastepujace przyklady.Przyklad I. Znaczony odczynnik T4.TZG jest buforowany rozcienczonym roztworem normalnej 5 surowicy zawierajacej barbital i tyroksyne znaczo¬ na jodem — 125. Otrzymywanie tego roztworu opi¬ sali J. L. Brown i F. P. Hallett.Do 78 ml surowicy dodaje sie 1850 ml roztworu buforowego barbitalu o ph 8,6 zawierajacego 2,39% 10 barbitalu sodowego i 0,7% azydku sodowego (zabez¬ pieczajacy mikrobiologicznie). pH ustala sie za po¬ moca kwasu solnego. Dodaje sie mala ilosc radio¬ aktywnej T-4 (w przyblizeniu 0,13 mc), która sluzy jako wskaznik do wykrywania ilosci sladowych 15 przy oznaczaniu sprawnosci ekstrakcji.Kolumne do ekstrakcji przygotowuje sie stosujac wystarczajaca ilosc wymieniacza jonowego do od¬ powiedniej szklanej kolumny, aby objetosc zloza wynosila 1000 ml, a szybkosc przeplywu w przy- 20 blizeniu 10 ml na minute. Do tego celu odpo¬ wiednia jest zywica typu mocnej czwartorzedowej zasady amoniowej. Na przyklad dobrze nadaje sie zywica handlowa oznaczona „Amberlit IRA-400" (produkowana przez Rohm and Haas Company), 25 ale takze mozna stosowac inne zywice, a mianowi¬ cie anionity i kationity.Zywice wprowadza sie do kolumny w postaci papki wodnej i przez caly czas nad zywica utrzy¬ muje sie warstwe wody. Kolumne laczy sie ze 30 zbiornikiem zawierajacym roztwór surowicy, który ma byc ekstrahowany i rozpoczyna sie przeplyw surowicy przez kolumne. Okresowo pobiera sie próbki 1 ml eluatu i mierzy sie jej radioaktywnosc, a tym samym mierzy sie sprawnosc ekstrakcji. 35 Radioaktywnosc eluatu powinna wynosic 10% lub mniej w stosunku do surowego roztworu.Do w przyblizeniu 8 ml powyzszego buforu barbi- talowego dodaje sie wystarczajaca ilosc (0.215 g EDTA-Na2) dwusodowego EDTA, aby otrzymac ste- 40 zenie 0,1 mg dwusodowego EDTA na 1 ml eluatu z kolumny (ekstrahowany roztwór surowicy). EDTA wykauzje korzystna rozpuszczalnosc przy lekkim ogrzaniu. Po schlodzeniu do temperatury pokojo¬ wej roztwór ten dodaje sie do eluatu kolumny 45 (roztwór ekstrahowanej surowicy). Nastepnie do eluatu dodaje sie w przyblizeniu 0,27 mc radio¬ aktywnej tyroksyny. Ekstrahowany roztwór surowi¬ cy nastepnie korzystnie przepuszcza sie przez filtr 0,22. 50 Wówczas odmierza sie objetosc (11,580 ml) roz¬ tworu buforu barbitalu zawierajacego 0,1 mg dwu¬ sodowego EDTA na ml równa 6-krotnej objetosci eluatu. Ten roztwór nastepnie dodaje sie do eluatu uzyskujac 6-krotne rozcienczenie eluatu. Otrzymany 55 odczynnik posiada pH w przyblizeniu 8,6 i stezenie dwusodowego EDTA 0,1 mg/ml.Przyklad II. Roztwór T4 z surowicy wyko¬ nuje sie biorac do badania okolo 10 ml krwi i koa- guluje sie. Oddziela sie surowice i 1,0 ml tej suro- 60 wicy wkrapla sie do 2 ml 95% etanolu umieszczo¬ nego w probówce do wirówki. Zawartosc dokladnie miesza sie za pomoca miksera o wysokiej szyb¬ kosci, aby zdenaturowac bialka z surowicy. Na¬ stepnie mieszanine alkoholowa odwirowuje sie, az 65 wytracone bialko sie osadzi na dnie probówki82 595 13 14 (2000—2500 obrotów na 4—5 minut). Otrzymana górna warstwa roztworu alkoholowego wolna od bialka zawiera w przyblizeniu 80% calej zawar¬ tosci tyroksyny w próbce.Czesc surowicy do badania (0,20 ml) dodaje sie do 4,0 ml buforu barbitalowego pH 8,6 (otrzyma¬ nego jak podano przy otrzymywaniu znaczonego odczynnika T4.TZG). Ten roztwór dostarcza nie¬ nasycona TZG z surowicy przed próba. Zamiast roztworu buforowanego mozna stosowac tylko roz¬ twór wodny i mniejsze ilosci surowic 5 lub 10 ^1.Przyklad III. Przy kazdym wykonaniu próby w dokladnie ten sam sposób jak próbe badanej surowicy obrabia sie surowice kontrolna z pomi¬ nieciem otrzymywania (kontrola) roztworów suro¬ wicy T4 i TZG. Kontrolna surowica jest handlowo dostepna normalna surowica zawierajaca normalne poziomy T4 i TZG.Okreslona ilosc roztworu surowicy T4 (0,30 ml) dodaje sie do 4,0 ml znaczonego odczynnika T4, TZG zawartego w ampulce. Ampulke zamyka sie korkiem i roztwory dokladnie miesza sie. Nastepnie okreslona ilosc (0,10 ml) roztworu surowicy TZG dodaje sie do mieszaniny roztworu odczynnika T4.Wycinek wymieniacza jonowego dodaje sie do ampulki zawierajacej mieszanine trzech roztworów.Korzystna zywica jest anionit oznaczony „AR-111", produkowany przez Ionics, Inc, Watertown, Massa¬ chusetts.Po dodaniu wycinków zywicy ampulki zawiera¬ jace mieszaniny i kontrolne surowice korkuje sie i wiruje w temperaturze pokojowej przez dokladnie jedna godzine.Do tego celu bez klopotu mozna stosowac han¬ dlowa wirówke.Poniewaz pochlanianie radioaktywnej tyroksyny przez zywice jest funkcja czasu rotacji istotne jest, aby czas rotacji byl taki sam dla badanej i kon¬ trolnej próbki. Pod koniec jednogodzinnej rotacji usuwa sie wycinek zywicy za pomoca kleszczy i wyrzuca.Nastepnie okresla sie stezenie znaczonej tyroksy¬ ny przy uzyciu licznika. Nastepnie zbiera sie mi¬ nimum 10.000 impulsów do kazdej ampulki. Wów¬ czas wylicza sie wskaznik, który oznacza procent tyroksyny hormonalnie czynnej wedlug nastepuja¬ cego wzoru: Impulsy/minute surowicy badanej — tlo Impulsy/min. surowicy kontrolnej — tlo : stosunek tyroksy¬ ny hor¬ monalnie czynnej Stan hormonu tarczycy próbek surowicy od 209 pacjentów ocenia sie przy uzyciu sposobu opisa¬ nego uprzednio przez Bettingera i wspólpracowni¬ ków. Poza tym stosuje sie próbe wiazania T3 i pró¬ be Browna dla T4 z surowicy jak równiez pro¬ cent tyroksyny hormonalnie czynnej opisana wyzej.Wskaznik wolnej T4 wylicza sie takze na podsta¬ wie konwencjonalnych badan. Oprócz tego stan dzialania tarczycowego kazdego pacjenta ocenia sie klinicznie. Cala liczbe pacjentów poddanych badaniu dzieli sie na piec podgrup w oparciu o hi¬ storie choroby, obserwacje kliniczna i wyniki prób: 10 15 30 35 40 45 50 (1) nieskomplikowana eutyreoza (128) (2) nieskomplikowana hypotyreoza (9) (3) nieskomplikowana hipertyreoza (14) (4) stan wyrównania czynnosci gruczolu tarczyco¬ wego w okresie ciazy (37) (5) stan wyrównania czynnosci gruczolu tarczyco¬ wego przy leczeniu estrogenem (21).Razem 209.W grupie 128 pacjentów z nieskomplikowana euty¬ reoza wszystkie próby i wskaznik wolnej T4 wyka¬ zaly u pacjentów eutyreoze z wyjatkiem czterech pacjentów, u których stwierdza sie hypotyreoze na podstawie próby surowicy T4 i dwóch pacjentów, u których stwierdza sie hipertyreoze na podstawie wskaznika wolnej T4.W grupie 9 pacjentów z .nieskomplikowana hypo¬ tyreoza wszystkie próby i wskaznik wolnej T4 wy¬ kazuja u pacjentów hypotyreoze z wyjatkiem jed¬ nego pacjenta, u którego w oparciu o próbe wiaza¬ nia T4 stwierdza sie eutyreoze.W grupie 14 pacjentów z nieskomplikowana hi¬ pertyreoza wszystkie próby i wskaznik wolnej T4 wykazuja u pacjentów hipertyreoze z wyjatkiem jednego pacjenta, u którego w oparciu o próbe wiazania T4 stwierdza sie eutyreoze i dwóch pa¬ cjentów z eutyreoza, co stwierdza sie na podstawie wskaznika wolnej T4.W grupie 37 pacjentek w ciazy z eutyreoza tylko u jednej na podstawie próby wiazania T3 stwier¬ dza sie eutyreoze, a u pozostalych w oparciu o te próbe stwierdza sie hypotyreoze. W oparciu o pró¬ be z T4 u czterech pacjentek stwierdza sie hiper¬ tyreoze podczas gdy u pozostalych 33 badanych pacjentek poziomy T4 z surowicy byly w wiekszosci przypadków podwyzszone, ale w ramach zakresu dla tej próby. Natomiast wskaznik wolnej T4 i sto¬ sunek efektywnej tyroksyny potwierdzaja u wszyst¬ kich 37 pacjentek eutyreoze.W grupie 21 pacjentów z eutyreoza, a otrzymuja¬ cych estrogen, w oparciu o próbe wiazania T3 tylko u trzech pacjentów stwierdza sie eutyreoze, a u po¬ zostalych 18 hypotyreoze. W oparciu o próbe z T4 u 3 pacjentów stwierdza sie hipertyreoze, a u pozo¬ stalych 18 pacjentów poziomy T4 z surowicy byly w wiekszosci przypadków podwyzszone, ale w za¬ kresie dla eutyreozy przewidzianym dla tej próby.W oparciu o wskaznik wolnej T4 i procent ty¬ roksyny hormonalnie czynnej wedlug wynalazku u wszystkich 21 pacjentów stwierdza sie eutyreoze.Wedlug wynalazku wskazania stanu klinicznego gruczolu tarczycowego co znajduje odbicie przy uzyciu procentu tyroksyny hormonalnie czynnej, mozna ocenic przez odniesienie do zakresów poda¬ nych w tablicy 7.Tablica 7 60 li Zakresy stosunku tyroksyny hormonalnie czynnej Hipertyreoza ponizej 0,85 Eutyreoza 0,85—1,15 Hypotyreoza powyzej 1,1 S W oparciu o powyzsze stwierdza sie, ze osiagnie¬ to kilka zalozen wynalazku i inne korzystne wy¬ niki.82 595 15 Material podany w powyzszym opisie traktuje sie jako ilustrujacy, lecz nie ograniczajacy zakresu wynalazku. PL PL

Claims (9)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oznaczania in vitro substancji fizjolo¬ gicznie czynnych w ,plynie ustrojowym zdolnych do wystepowania zarówno w formie zwiazanej i niezwiazanej, znamienny tym, ze miesza sie zna¬ czona czesc substancji czynnej z pierwsza czescia plynu zawierajacego substancje czynna, z której pobiera sie znana czesc srodka wiazacego sub¬ stancje czynna i druga czesc plynu zawierajaca nienasycony srodek wiazacy te substancje czynna, a nastepnie mierzy sie znaczona substancje zwia¬ zana ze srodkiem wiazacym lub niezwiazana sub¬ stancje znaczona.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako srodek wiazacy stosuje sie wystepujacy na¬ turalny wewnetrzny srodek wiazacy substancje fi¬ zjologicznie czynne.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie znaczona forme roztworu znaczonego hormonu tarczycy wybranego z tyroksyny oraz 3,3,'5'-trójjodotyroniny, przy czym pierwsza czesc jest roztworem zawierajacym tyroksyne z badanej próbki krwi i wolnej od tyroksyny wiazacej glo¬ buline, a druga czesc jest roztworem zawierajacym 16 nienasycona tyroksyne wiazaca globuline i jej to¬ warzyszace hormony tarczycy z próbki krwi z tego samego zródla, a nastepnie, mierzy sie znaczony hormon tarczycy zwiazany z tyroksyna wiazaca 5 globuline oraz niezwiazany znaczony hormon tar¬ czycy.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze stosuje sie znaczony odczynnik zawierajacy roztwór znaczony tyroksyny zwiazanej z tyreoglobulina. 10

5. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze stosuje sie znaczony odczynnik zawierajacy bufo¬ rowany roztwór radioaktywnej tyroksyny i suro¬ wice krwi, z której wydobywa sie wiekszosc natu¬ ralnie wystepujacej tyroksyny. 15

6. Sposób wedlug zastrz. 3—5, znamienny tym, ze stosuje sie hormon tarczycy w znaczonym od¬ czynniku zawierajacej jod-125 i jod-131.

7. Sposób wedlug zastrz. 3—6, znamienny tym, ze stosuje sie mieszanine znaczonego odczynnika, 20 a pierwszy i drugi roztwór utrzymuje sie w kon¬ takcie z wymieniaczem jonowym przez z góry okreslony czas, potrzebny do pomiaru.

8. Sposób wedlug zastrz. 3—7, znamienny tym, ze stosuje sie okreslony stosunek objetosci surowi- 25 cy krwi reprezentowanej przez roztwór pierwszy i objetosci surowicy krwi reprezentowanej przez roztwór drugi.

9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze stosunek wynosi 10:1 i 30:1, korzystnie 21:1. PZG Bydg., zam. 1645/76, nakl. 130+20 Cena 10 zl PL PL