Sposób wytwarzania winkrystyny o zwiekszonej wydajnosci z czesci roslinnych Vinca Rosea L Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia winkrystyny o zwiekszonej wydajnosci z cze¬ sci roslinnych Yinca Rosea L.Winkrystyna jest nadzwyczaj waznym srodkiem cytostatycznym, który okazal sie zbawienny przy ostrej leukemii w wieku dzieciecym (Haggard M. E.: Cancer Chemother. Reports, 52, 477 (1968)). Zasto¬ sowanie jej w ciezkich chorobach nowotworowych w wieku dzieciecym powodowalo w 60—65% istot¬ ny regres (Selavry, D., Holland, J. F. Welmsu, I. J. Cancer Chemother. Reports, 52 497 (1968)).Wiadomo, ze winkrystyna jest alkaloidem z yin¬ ca rosea L., której ilosc stanowi kilka dziesietnych procenta calkowitej ilosci alkaloidów w roslinie.Z tego wzgledu otrzymywanie winkrystyny z rosli¬ ny nie wchodzi w rachube.Dotychczas nie bylo wiadomo, ze N-desmetylo- winblastyna jako dimer alkaloidu jest zawarita rów¬ niez w Vinca rosea L.Otrzymywanie N-desmetylowirablastyny jest opi¬ sane w przykladzie 1 w opisie patentowym St.Zjedn. Am. nr 3354163. Wedlug tego sposobu czy¬ sty siarczan winkrystyny rozpuszcza sie w 0,1%- -owym wodnym roztworze kwasu siarkowego i roztwór ten o wartosci pH 2,03, ogrzewa do wrze¬ nia w ciagu 18 godzin. Otrzymany klarowny roz¬ twór alkalizuje sie stezonym amoniakiem, ekstrahu¬ je chlorkiem metylenu, ekstrakt odparowuje pod próznia do sucha, pozostalosc zwilza chlorkiem 10 15 30 metylenu i rozpuszcza w eterze. Czesc nierozpu¬ szczalna usuwa sie przez odwirowanie, a pozostaly klarowny roztwór odparowuje pod próznia do su¬ cha. Sucha pozostalosc stanowi 75% winkrystyny w przeliczeniu na wprowadzony sulstrat.Sucha pozostalosc rozpuszcza sie w benzenie, chromatografuje na kolumnie wypelnianej tlenkiem glinu i eluuje mieszanine benzenu z chloroformem.Po rozdziale chromatograficznym otrzymuje sie dwa komponenty.Jednym w wiekszej ilosci, jest N-desimetylowin- blastyna, drugim w mniejszej ilosci, jako produkt uboczny, jes-t desacetylo-N-desmetylowinblastyna.W przykladzie nie jest podany stosunek ilosciowy obu skladników, wspomina sie tylko, ze przy war¬ tosci pH od ponizej 2 wzrasta ilosc produktów de- sacetylowania, a przy wartosci pH od powyzej 2,5 przemiana winkrystyny nie jest calkowita. W przy¬ kladzie 3 wymienionego opisu patentowego obja¬ sniono formylowanie N-desmetylowinblastyny kwa¬ sem mrówkowym w obecnosci bezwodnika kwasu octowego.W ten sposób mozna otrzymana przez deimety- lacje winkrystyny z okolo 50%-owa wydajnoscia N-desmetylowinblastyne ponownie poddac reakcji wymiany na winkrystyne. W dalszej czesci opisu patentowego wymieniono, ze N-desmetylowir£blasty- ne mozna takze otrzymac z winblastyny przez de- metylowanie, które przeprowadza sie za pomoca biologicznego utleniania nadtlenkiem wodoru i en- 82 47182 471 zymem peróksydaza. Odnosnie otrzymywania N-de- ametylowinblastiny z wihblastiny poza tym stwier¬ dzeniem nie podano zadnej informacji.Postep w sposobie opisanym w wymienionym opi¬ sie patentowym polegal na tym, ze najwartosciow- "5 szy alkaloid z Vinca rosea L winkrystyna, po oczy¬ szczeniu za pomoca tych skomplikowanych i z te¬ go powodu wyjatkowo drogich sposobów reduku¬ je sie do N-desmetylowlnblastyny z której odzy¬ skuje sie z powrotem z wydajnoscia tylko okolo 50%. 10 Otrzymywanie winkrystyny znane jest równiez z opisu patentowego St. Zjedn. Aim. nr 3205220, we¬ dlug którego Virica. rosea L. po wstepnej kwasnej obróbce, ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organi¬ cznym i oczyszcza przez wielokrotne rozpuszczanie 15 w wodzie i rozpuszczalniku organicznym, a nastep¬ nie odparowaniu roztworu do sucha.W ten sposób otrzymana, slabo alkaliczna frakcja alkaloidów o skomplikowanym skladzie, zawiera wszystkich* alkaloidów dimerówych 1—2 %, a w" 20 tym winkrystyny tylko kilka setnych procenta.Rozdziela sie je chromatograficznie iw ten spo¬ sób otrzymuje sie czysta winkrystyne.Postep w sposobie polega, na tym, ze w celu otrzymania kilku setnych procenta czystej winkry- 25 styny z ekstrakcji Vinca rosea L. najpierw chro¬ matografuje sie slabo alkaliczna frakcje alkaloidów o skomplikowanym skladzie,-która nastepnie ekstra- - huje sie w zaleznosci od wartosci pH.Celem wynalazku bylo podniesienie ilosci win- 30 krystyny uzyskiwanej* z Vinca rosea L. za pomoca formylowania naturalnej N-desmetylowinblastyny izolowanej.Wynalazek opieral sie^, na stwierdzeniu wedlug wegierskiego opisu patentowego nr 160967, ze alka¬ loidy dimeryczne z Vinca rosea L. moga byc roz¬ dzielone kwasami z odpowiednio oczyszczonego ekstraktu, na przyklad etanolowyim roztworem kwasu siarkowego, w postaci okolo 70%-owego roz¬ tworu dimerycznego alkaloidów zawierajacego sól addycyjna wzglednie z ekstraktu wzbogaconego i ze ta mieszanina dimerów alkaloidów zawierala obok soli addycyjnych winblastyny z kwasami, soli winleurozyny, winkrystyny i innych dimerów al¬ kaloidów, takze zawierala" nieznana dotychczas w Vinca rosea L N-desmetylowinblastyne po raz pier¬ wszy izolowana z surowca roslinnego. Sformylo- wano mieszanine soli addycyjnych z kwasem za¬ wierajaca okolo 70% alkaloidów dimerycznych lub ewentualnie mieszanine dimerów alkaloidów zasa¬ dowych otrzymanych z soli addycyjnych z kwasa¬ mi i otrzymano takze wystepujaca w stanie natu¬ ralnym w Vinca rosea L N-desmetylowinblastyne w postaci winkrystyny.Wynalazek dotyczy sposobu podwyzszenia wy¬ dajnosci winkrystyny przy jej otrzymywaniu z ekstraktu Vinca rosea L. Sposób ten polega na tym, ze mieszanine dimerów alkaloidów zawiera¬ jaca takze naturalna N-desmetylowinblastyne uzy¬ skana i wzbogacona z czesci roslinnych Vinca rosea eo L., wzglednie otrzymana z tego mieszanine soli addycyjnych z kwasami formyluje sie, a ze sfor- mylowanej mieszaniny winkrystyne uzyskuje sie w znany sposób i ewentualnie przeprowadza w sól addycyjna zkwasem.'" 65 35 40 50 55 Sposobem wedlug wynalazku, surowa mieazanine siarczanów alkaloidów, których otrzymywanie jest opisane w wegierskim opisie patentowym nr 160967 rozpuszcza sie w mieszaninie kwasu mrówkowe¬ go i bezwodnika octowego, i mieszanine reakcyj¬ na pozostawia do odstania w ciagu kilku, korzyst¬ nie 1—10 minut. W tym czasie zachodzi formylo- wanie N-desmetylowinblastyny znajdujacej sie w mieszaninie siarczanów alkaloidów do winkrystyny.Nastepnie mieszanine reakcyjna podczas chlodze¬ nia przemywa sie okolo 5-ciokrotna objetoscia wo¬ dy, przy czym nalezy oiwaiac aby temperatura wodnego roztworu nie przekroczyla 10°C, korzyst¬ nie 0—5°C. Nastepnie ewentualnie podczas chlodze¬ nia doprowadza^ sie pH kwasnego roztworu do wartosci 8,5—9,0 wodnym roztworem amoniaku. Po czym, ekstrahuje sie wielokrotnie organicznym roz¬ puszczalnikiem korzystnie chlorkiem -metylenu az do calkowitej ekstrakcji. Obydwie fazy rozdziela sie, fazy organicznie laczy sie, suszy i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowuje do sucha. Pozo¬ stalosc o barwie piaskowej zawiera N-desmetylo¬ winblastyne, która zawarta byla w mieszaninie wyj¬ sciowej siarczanów alkoloidów, gotowa w postaci winkrystyny. Te pozostalosc o barwie piaskowej rozpuszcza sie w rozpuszczalniku, korzystnie w eta¬ nolu i zadaje 1%-owym etanolowyim roztworem kwasu siarkowego. Roztwór pozostawiacie do od¬ stania w ciagu pewnego czasu, przy czym wy- krystalizowuje mieszanina formylowanego siarczanu alkoloidu. Odsacza sie ja, przemywa i suszy.Rozdzielanie w opisany sposób otrzymanej mie¬ szaniny siarczanów dimerów. alkoloidów mozna na przyklad przeprowadzic w nastepujacy sposób: substancje rozpuszcza sie w mieszaninie 2:1 chlor¬ ku metylenu i chloroformu i chromatografuje na kolumnie wypelnionej czesciowo dezaktywowanym tlenkiem glinu. Przy tym rozdziale chromatografi¬ cznym siarczan zostaje zwiazany, a frakcje eluatu zawieraja rozdzielone dimery alkaloidów w postaci wolnych zasad. Elucje przeprowadza sie ta sama mieszanina rozpuszczalników w sposób opisany po¬ wyzej.Frakcja pierwsza eswiera alkaloidy towarzyszace, nastepne zawieraja winblastyne i ewentualnie win- leurozyne. Po tym nastepuje frakcja zawierajaca winkrystyne. Rozpuszczone w poszczególnych frak¬ cjach dimery alkaloidów sa identyfikowane za po¬ moca chromatografii bibulowej wzglednie cienko¬ warstwowej. Frakcje, które zawieraja identyczne dimery alkaloidów, laczy sie i korzystnie pod zmniejszonym cisnieniem odparowuje. Rozdzielone od siebie bezpostaciowe dimery alkaloidów — za¬ sad rozpuszcza sie w rozpuszczalnikach korzystnie w etanolu i przeprowadza w siarczany za pomoca 1%-owego etanolowego roztworu kwasu siarkowe¬ go. Otrzymany siarczan winkrystyny zawiera dzie¬ ki temu nie tylko wystepujaca w Vinca rosea L winkrystyne, a oprócz tego jeszcze dodatkowo przez formylowanie wystepujacej w roslinie naturalnej N-desmetylowinblastyny otrzymana winkrystyne.Dalsza istotna cecha sposobu wedlug wynalazku jest, ze po formylowaniu otrzymanej mieszaniny dimerów alkaloidów — zasad bezposrednio, a wiec bez przeprowadzania w siarczan, rozdziela sie je.82 5 W tym przypadku mieszanine dimerów alkaloidów — zasad rozpuszcza sie w benzenie i chromatogra¬ fuje na kolumnie wypelnionej tlenkiem glinu na¬ syconym benzenem. Najpierw eluuje sie benzenem, który rozpuszcza wieksza czesc monomerowych al¬ kaloidów towarzyszacych. Nastepnie eluuje sie da¬ lej mieszanina benzenu z chloroformem w stosun¬ ku 2:1 i ha koniec mieszanina benzenu z chloro¬ formem w stosunku 1:1. Obróbka frakcji nastepuje w powyzej opisany sposób.Naturalna N-desmetylowinblastyna wystepuja¬ ca w Vinca rosea L. moze byc uzyskana na przyklad w nastepujacy sposób: surowa mie¬ szanine siarczanów alkaloidów, których otrzymy¬ wanie opisane jest w wegierskim opisie patento¬ wym nr 160967, rozpuszcza sie w okolo 40-tokrot- nej ilosci wody, pH wodnego roztworu doprowa¬ dza sie amoniakiem do wartosci £,5—9,0 i ekstrahu¬ je wielokrotnie rozpuszczalnikiem organicznym, korzys-tnie chlorkiem metylenu, do calkowitego wyekstrahowania alkaloidu. Fazy rozdziela sie, fa¬ zy organiczne laczy sie, suszy i odparowuje do su¬ cha pod zmniejszonym cisnieniem.W ten sposób otrzymuje sie mieszanine bezpo¬ staciowych dimerów alkaloidów -4 zasad, które rozpuszcza sie w niepolarnym rozpuszczalniku, ko¬ rzystnie w benzenie i chromatografuje na kolum¬ nie zawierajacej tlenek glinu nasycony benzenem.Eluuje sie mieszanina benzenu z chloroformem 3:1.Frakcje po 100 ml zawierajace rozpuszczone alka¬ loidy identyfikuje sie za pomoca cienkowarstwo¬ wej chromatografii lub bibulowej. Pierwsza frak¬ cja zawiera czesc alkaloidów towarzyszacych i win¬ blastyne, nastepne zawieraja N-desmetylowinbla- styne, a dalsze winkrystyne. Frakcje, które zawie¬ raja N-desmetylowinblastyne, laczy sie - i pod zmniejszonym cisnieniem odparowuje. N-desmety- lowinblastyne rozpuszcza.sie w polarnym rozpusz¬ czalniku, korzystnie w etanolu i poddaje reakcji z 1%-owym etanolowym roztworem kwasu siarko¬ wego otrzymujac siarczan N-desmetylowinblastyny.Roztwór pozostawia sie do odstania w itrakcie któ¬ rego krystalizuje produkt.W przeciwienstwie do dotychczas znanych spo¬ sobów, sposób wedlug wynalazku stanowi postep, poniewaz znajdujaca sie w Vinca rosea L. natural¬ na N-desmetylowinblastyna, która po raz pierw¬ szy zostala -zidentyfikowana i wyizolowana z ma¬ terialu roslinnego moze byc bezposrednio przepro¬ wadzona w winkrystyne.Postep sposobu wedlug wynalazku w porówna¬ niu z metodami opisanymi w opisie St. Zjedn. Am. nr 3205220 i wegierskim opisie nr 160967 wynika z przedstawionej ponizej tabeli, dane zawarte w tabeli sa w przeliczeniu na ilosci winkrystyny, któr ra mozna uzyskac z roslin identycznej jakosci.Przyklad I. 3,85 g surowej mieszaniny siar¬ czanów alkaloidów, rozpuszcza sie w mieszaninie 35 ml 98%-owego kwasu mrówkowego i 5,75 ml bezwodnika octowego i .pozostawia do odstania w ciagu 5 minut. Nastepnie roztwór przelewa sie do 150 ml wody o temperaturze 0—5°C i podczas chlo¬ dzenia doprowadza pH do wartosci 8,5—9,0 za po¬ moca amoniaku ewentualnie ochlodzonego i ekstrahuje wielokrotnie porcjami po 300 ml chlorku 471 6 Tabela Wg opisu St. Zjedn. Am. nir 3205220 Wg opisu wegierskiego nr 160967 Sposobem wg wynalazku < Siarczan winkrystyny mg/kg surowca roslinnego- 4 6,5 ', ¦¦ 10,8 15 metylenu az do ujemnej reakcji na alkaloidy, Po¬ laczone i odwodnione fazy chlorku metylenu ^od¬ parowuje sie do sucha pod: zmniejszonym cisnie¬ niem. -' - -,.¦¦¦•- Uzyskuje sie 3,1 g bezpostaciowej mieszaniny di- 20 merów alkaloidów — zasad o barwie piaskowej, w której uprzednio wymieniona N-desmetylowinbla- styne przcz fonmylowanie przeprowadza sie w go¬ towa winkrystyne! Mieszanine rozpuszcza5 sie w etanolu i oddziela, przez dodanie* 1% -owego etano- 25 lowego roztworu kwasu siarkowego. Otrzymuje sie 2,46 g krystalicznej mieszaniny siarczanów dime¬ rów alkaloidów.Krystaliczna mieszanine siarczanów dimsrów al¬ kaloidów rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny ctilo- 30 rek metylenu-chloroform w stosunku 2:1 i roztwór chromatografuje na kolumnie wypelnionej 250 g tlenku glinu czesciowo dezaktywowanego woda dzieki czemu po pierwsze zwiazane sa grupy siar¬ czanowe; po drugie rozdzielane wolne alkaloidy — 35 zasady, eluuje sie mieszanina rozpuszczalników.Dimery alkaloidów eluowuje sie z kolumny w postaci wolnych zasad. Zbiera sie frakcje po 50 ml.Frakcje 1—3 zawieraja alkaloidy towarzyszace, frakcje 4—9 winblastyne i ewentualnie znajdujaca 40 sie winleurozyne. Winkrystyna znajduje sie w 9 frakcji. Jej elucja konczy sie we frakcji 18. Frak¬ cje zawierajace, zidentyfikowane za pomoca chro¬ matografii bibulowej wzglednie cienkowarstwowej, winblastyne, winleurozyne i winkrystyne, rozdzie- 45 lone, odparowuje sie do sucha.Otrzymane bezpostaciowe dimery alkaloidów — zasad przeprowadza sie w siarczany sposobem opi¬ sanym powyzej. Z frakcji 4—9 otrzymuje sie 2,0 g siarczanu winblastyny, z frakcji 9—18 0,25 g su¬ rowego siarczanu winkrystyny, który przekrystali- zowuje sie z mieszaniny 1:4 metanolu z etanolem. [a]D*° = +11—12°C (c = 1; woda) Rf = 0,30 (pojawia sie z zywym niebieskim zabar¬ wieniem).Zwiazek identyfikuje sie w podczerwieni. Przy 5,94 |mjn ukazuja sie silne pasma absorpcji, porów¬ nywane z widmem podczerwieni winblastyny: Badania chromatograficzne przeprowadzono za 0. pomoca chromatografii cienkowarstwowej stosu¬ jac jako adsorbent tlenek glinu firmy G. Merek.Jako srodek rozwijajacy stosuje sie chloroform, zawierajacy 0,5% metanolu, wywoluje sie stezo¬ nym kwasem fosforowym zawierajacym 1%'siar¬ ka czanu cerowo-amonowego.I 82 471 8 Przyklad II. Z 3,1 g mieszaniny bezposta¬ ciowych dimerów alkaloidów— zasad o barwie piaskowej otrzymanej jak w przykladzie I oddzie¬ la sie wfrifolastyne i winkrystyne za pomoca chro¬ matografii. Mieszanine alkaloidów — zasad rozpu- 5 szcza sie w 15 ml benzenu i roztwór chromatogra- fuje na kolumnie, zawierajacej 150 g tlenku glinu o III aktywnosci nasyconego benzenem* Najpierw eluuje sie 400 ml benzenu, przy czym zbiera sie 50 ml frakcje. Wieksza czesc alkaloidów towarzy- io szacych zostaje wyekstrahowana benzenem.Nastepnie eluiuje sie dalej 450 ml mieszaniny 2:1 benzenu z chloroformem przy czym ekstrahuje sie pozostale jeszcze monomery alkaloidów i znaj¬ dujaca sie tylko w niewielkich ilosciach winleuro- u zyne. Przez elucje. nastepnymi 450 mi mieszaniny 2:1 benzenu z chloroformem uzyskuje sie winblas- tyne. Na koniec eluuje sie 1500 ml mieszaniny 1:1 benzenu z chloroformem przy czym ekstrahuje sie zwiazana jeszcze z adsorbentem winkrystyne. » Rozdzielone za pomoca chromatografii bibulowej wzglednie cienkowarstwowej eluaty odparowuje sie do sucha. Otrzymuje sie 2,6 g bezpostaciowej wimblastyny — zasady z której otrzymuje sie siarczan metoda opisana w przykladzie I. Otrzy- 25 muje sie 2,2 g krystalicznego siarczanu wiobiasty- ny.Przy odparowaniu eluatów zawierajacych win¬ krystyne otrzymuje sie 0,32 g bezpostaciowej win- krystyny — zasady z której jak w przykladzie la otrzymuje sie siarczan.Wydajnosc: 0,27 g surowego siarczanu wimkry- styny.Wydajnosc po przekrystalizowaniu z mieszaniny 1:4 metanolu z etanolem wynosi 0,21 g siarczanu 3S wimkrystyny. Stale fizyczne produktu sa identy¬ czne jak w przykladzie L , Przyklad III. Otrzymywanie N-desmety- lowinblastyny. 6 g surowej mieszaniny siarczanów dimerów alkaloidów, rozpuszcza sie w 100 ml wo- *o dy, alkaliHUJe rozcienczonym amoniakiem i ekstrahuje 3X100 ml chlorkiem metylenu az do pozbawienia alkaloidów, Obie fazy rozdziela sie, laczy fazy organiczne i odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. W ten sposób otrzyma- 45 je sie 4,5 g bezpostaciowego dimeru alkaloidu — zasady, Który rozpuszcza sie w 15 ml benzenu. Roz¬ twór chromatografuje sie, stosujac jako adsorbent tlenek glinu o aktywnosci HI nasycony benzenem.Dimery alkaloidów eluuje sie w nastepujacy spo- 50 sob: winblastyne ekstrahuje sie 3000 ml mieszani¬ ny 3:1 benzenu z chloroformem. Zbiera sie frak¬ cje po 100 ml i zidentyfikuje, dimery alkaloidów w poszczególnych frakcjach za pomoca chromato¬ grafii cienkowarstwowej wzglednie bibulowej. 55 Frakcje 1—9 zawieraja czesc alkaloidów towarzy¬ szacych i winblastyne.Frakcje 10—24 zawieraja N-desmetylowinblasty- ne. Frakcje odparowuje sie do sucha otrzymujac sucha pozostalosc stanowiaca 0,35 g surowej N-desmetylowinblastyny.N-desmetylowinblastyne rozpuszcza sie w bezwod¬ nym metanolu i 1%-owym eterowym roztworem kwasu siarkowego wydziela siarczan desmetylo- winblastyny, który odsacza sie, przemywa i suszy.Otrzymuje sie 0,26 g surowego siarczanu N-des- metylowinblastyny, który przekrystalizowuje sie z mieszaniny 1:4 metanolu z etanolem.Wydajnosc: 0,24 g siarczanu N- blastyny.Z otrzymanej soli uwalnia sie N-desmetylowin- blastyne — zasade. Izolowana N-desmetylowimbla- styne identyfikuje sie nastepujacymi danymi: [a]D*- +15^° (c = 1, chloroform) Temperatura topnienia: 210—215°C (Boetius) UV widmo absorpcyjne siarczanu N-desmetylowin- blastymy: 211 258 286 294 310 8 46,504 11,300 10,740 9,065 4,995 Charakterystyczne dlugosci fal N-desmetylo- wiablastyny w .podczerwieni: 35,60, 3440, 3000, 2956, 2940, 2930, 2870, 2830, 2785, 1740, 1620, 1597, 1495, 1487, 1455, 1430, 1416, 1390, 1368, 1328, 1294, 1252, 1235, 1195, 1164, 1140, 1126, 1112, 1075, 1060, 1035, 1006, 998, 975, 954, 915.Przy chromatografowaniu na tlenku glinu, przy zastosowaniu mieszaniny 99,5:0,5 chloroformu z metanolem jako eluauta, stosujac do wywolywa¬ nia stezony kwas fosforowy zawierajacy 1% siar¬ czanu cerowo-amoncwego, pojawia sie N-desme- tylowinblastyna przy Rf = 0,60 charakteryzujaca sie poczatkowo plama pomaranczowa pózniej prze¬ chodzaca w lila. PL PL