PL82443B2 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Zgloszenie ogloszono: 01.06,1974 Opis patentowy opublikowano: 25.11.1975 82443 KI. 30h, 6 MKPl C12k 1/02 Twórcywynalazku: Helena Oberman, Halina Wosko, Ewa Garstka, Jerzy Meller Uprawniony z patentu tymczasowego: Kutnowskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa", Kutno (Polska) Sposób otrzymywania wysokoaktywnych nizynotwórczych populacji mikroorganizmów Streptococcus lactis Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wysokoaktywnych nizynotwórczych populacji mikro¬ organizmów Streptococcus lactis z wyjsciowej populacji o slabej aktywnosci nizynotwórczej.Wedlug dotychczas znanych sposobów wyizolowanie szczepów nizynotwórczych polega na wydzielaniu frakcji populacji ze srodowisk naturalnych badz na wyizolowaniu klonów metoda rozsiewu na plytce. Otrzymane w ten sposób kultury przechodza szereg etapów uaktywniania poprzez podloza plynne i stale. Jest to jednak sposób malo wydajny, pracochlonny, a przy tym wyniki zaleza od przypadku i sa czesto negatywne.Stwierdzono, ze mozna regenerowac aktywnosc biosyntetyczna szczepu nizynotwórczego w kilkuetapo- wym procesie kierowanej selekcji przy uzyciu czynników chemicznych takich, jak nizyna i N-metylo-N-nitro- zo-IST-nitro-guanidyna. Jako material wyjsciowy zgodnie z wynalazkiem moze sluzyc oslabiona populacja nizy¬ notwórczego szczepu Streptococcus lactis, której ulepszenie cech produkcyjnych odbywa sie na drodze kierowa¬ nej, eliminujacej z populacji osobniki o slabszej aktywnosci nizynotwórczej i prowadzacej do biologicznego wzmocnienia populacji, a zastosowanie N-metylo-N-nitrozo-N'-nitro-guanidyny umozliwia proces indukcji mutacji w populacji drobnoustrojów.Sposób wedlug wynalazku umozliwia otrzymywanie zmienionych populacji ze szczepu Streptococcus lactis, które charakteryzuja sie wysoka aktywnoscia nizynotwórcza i dobra stabilnoscia produkcyjna w okresie co najmniej trzech miesiecy. Ponadto pozwala na otrzymywanie szczepów produkcyjnych do 2500 jednostek nizyny w1 ml hodowli w mleku wciagu przynajmniej 15 generacji. Zgodnie z*wynalazkiem hodowle bakterii nizyno- wych o oslabionej zdolnosci biosyntezy nizyny rozmnaza sie w podlozu mlecznym do uzyskania poczatku stacjonarnej fazy wzrostu, nastepnie po zobojetnieniu mleka do wartosci pH okolo 7,0 oraz po dodaniu cytrynianu sodu oddziela sie osad komórek przez wirowanie, przemywa buforem fosforanowym o wartosci pH = 7,0, po czym roztwarza w buforze fosforanowym o wartosci pH = 7,0 do zawartosci biomasy, wynoszacej 0,3—0,5 mg/ml. Uzyskuje sie w ten sposób zawiesine podstawowa, do której dodaje sie nizyne w ilosci zabezpie¬ czajacej poziom 200-1000 j/ml, korzystnie okolo 500 j/ml, po czym przechowuje ja w temperaturze +4°C wciagu 12 godzin. Po tym czasie dodaje sie N-metylo-N-nitrozo-N'-nitro-guanidyne do uzyskania 0,05-1,0 mg/ml, korzystnie 0,5 mg/ml. Zawiesine bakterii w roztworze nizyny i N-metylo-N-nitrozo-N'-nit-2 82443 ro-guanidyny przetrzymuje sie do 150 minuf, korzystnie 60 minut, w temperaturze 30°C. Bezposrednio lub po przechowaniu w temperaturze +4°C w czasie do 12 godzin, pobiera sie po 1 ml zawiesiny i przenosi do 9 ml sterylnego buforu ochlodzonego do temperatury +4°C o wartosci pH = 7,0. Po dokladnym wymieszaniu rnaterial biologiczny wysiewa sie na agarowe podloze odzywcze. Po hodowli w ciagu 48 godzin w temperaturze 30°C losowo odszczepia sie wyrosniete kolonie i przenosi do chudego sterylnego mleka, z którego po dalszych przesiewach w trzeciej generacji oznacza sie poziom wytworzonej nizyny poprzez dany klon bakterii, stosujac metode rezazurynowa. Sposród najaktywniejszych populacji pierwszego etapu konstruuje sie mieszana populacje wyjsciowa do drugiego etapu, w którym izoluje sie, jak w etapie pierwszym, klony bakterii o podwyzszonej aktywnosci w stosunku do populacji wyjsciowej. Ilosc etapów stosowanych w sposobie wedlug wynalazku zalezy od aktywnosci populacji wyjsciowej. Przy niskich wyjsciowych zdolnosciach biosyntezy nizyny przewiduje sie 3 etapy procesu, natomiast przy populacjach o przecietnej zdolnosci produkcyjnej, wynoszacej okolo 800 j/ml, uzyskuje sie dobre wyniki juz po pierwszym etapie.Ponizszy przyklad wyjasnia blizej istote wynalazku, nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad. Do 400 ml chudego jalowego mleka wprowadza sie 3-procentowe inokulum, otrzymane uprzednio na drodze hodowli mikroorganizmów ze szczepu Streptococcus lactis na chudym mleku w tempera¬ turze 30°C wciagu 12 godzin. Hodowle prowadzi sie w temperaturze 30°C wciagu 12 godzin przy mieszaniu elektromagnetycznym. Po tym czasie uzyskuje sie poczatek stacjonarnej fazy wzrostu, hadowle zobojetnia sie sterylnym 20-procentowym roztworem wodorotlenku sodu do uzyskania wartosci pH = 7,0, dodaje 1-procen¬ towy roztwór cytrynianu sodu, calosc dobrze miesza i osad komórek bakteryjnych odwirowuje w ciagu 15 minut przy okolo 4000 obrotów na minute. Osad komórek dwukrotnie przemywa sie buforem fosforanowym o wartosci pH = 7,0 i nastepnie roztwarza w tym buforze do uzyskania zawartosci suchej substancji, wynoszacej 0,45 mg/ml, a nastepnie pobiera 150 ml uzyskanej zawiesiny, zwanej zawiesina podstawowa, po czym dodaje 75 mg standartowej nizyny w proszku o mocy 106 j/g, dokladnie miesza i pozostawia w temperaturze +4°C wciagu 12 godzin. Po tym czasie do podstawowej zawiesiny wprowadza sie N-metylo-N-nitrozo-N'-nitro-guani- dyne w ilosci, dajacej stezenie 0,5 mg/ml, i miesza elektromagnetycznie, a nastepnie w czasie do 150 minut w okreslonych odstepach czasu przenosi po 1 ml do 9 ml buforu fosforanowego, schlodzonego do temperatury +4°C, przy wartosci pH = 7,0, z którego mikroorganizmy wysiewa sie na optymalna pozywke agarowa, stosujac w miare potrzeby rozcienczenia w schlodzonym buforze fosforanowym o wartosci pH = 7,0. Plytki inkubowano 48 godzin w temperaturze 30°C. Nastepnie z kolonii, które wyrosly, wyizolowano 103 klony bakterii i przenie¬ siono je do chudego sterylnego mleka, z którego po otrzymaniu skrzepu, przeszczepiono dwukrotnie wszystkie populacje na chude sterylne mleko. Sprawdzono zdolnosc nizynotwórcza wyizolowanych klonów bakterii, których aktywnosc nizynotwórcza wahala sie w granicach 950—1500 j/ml podczas, gdy aktywnosc nizynotwór¬ cza szczepu wyjsciowego nie przekraczala 550 j/ml. Stabilnosc wyselekcjonowanych szczepów byla dobra wciagu trzech miesiecy. Szczep wyjsciowy, zastosowany do izolacji klonów nizynotwórczych w pierwszym etapie, po uplywie 3 miesiecy hodowli laboratoryjnej produkowal jedynie okolo 150 jednostek nizyny w 1 ml hodowli na mleku.W celu uzyskania populacji o aktywnosci nizynotwórczej, przekraczajacej 2000 j/ml konstruuje sie mie¬ szane populacje wyjsciowe, na przyklad po selekcji z najlepszych populacji i dalej postepuje, jak powyzej opisano. Tabelka zawiera zestawienie wyników, uzyskanych w drugim i trzecim etapie selekcji.Etap selekcji Drugi Trzeci Czas dzjalania N-metylo-N-nitrozo N-nitroguanidyny 30 minut 60 minut 90 minut 30 minut 60 minut 90 minut 120 minut Liczba wyizolowanych klonów 39 39 39 32 30 30 30 Liczba klcnów o a do 1000 30 25 29 13 9 8 3 ktywnosci nizynotwórczej jednostek/ml do 1500 9 11 5 8 6 11 10 do 2000 brak . 2 4 9 14 10 15 powyzej 2000 brak 1 1 2 1 1 282443 3 Wszystkie wyizolowane szczepy w pierwszym, drugim i trzecim etapie selekcji posiadaly aktywnosc trwale podwyzszona, co wykazano w hodowlach laboratoryjnych, które prowadzono w ciagu 3—4 miesiecy. Szczep wyjsciowy, zastosowany do izolacji nizynotwórczych w pierwszym etapie, po trzech miesiacach hodowli labora¬ toryjnej produkowal jedynie okolo 150 jednostek nizyny w 1 ml hodowli na mleku. PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania wysoko aktywnych nizynotwórczych populacji mikroorganizmów Streptococcus lactis, znamienny tym, ze do zawiesiny nizynotwórczych bakterii Streptococcus lactis o zawartosci biomasy 0,3—0,5 mg/ml, uzyskanej na poczatku stacjonarnej fazy wzrostu hodowli w mleku, wprowadza sie nizyne w ilosci 200-1000 j/ml, korzystnie 500 j/ml, dodaje N-metylo-N-nitrozo-N'-nitro-guanidyne w ilosci, daja¬ cej stezenie 0,05-1,0 mg/ml, korzystnie 0,5 mg/ml, i przy mieszaniu calosc przetrzymuje w czasie do 150 minut, korzystnie 60 minut, a nastepnie material biologiczny wyizolowuje sie bezposrednio lub po przechowaniu w temperaturze +4°C w czasie do 12 godzin.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze izolacje materialu biologicznego prowadzi sie jednoetapowo lub w kilku etapach, przy czym z najaktywniejszych populacji jednego etapu wybiera sie populacje wyjsciowa do nastepnego etapu. PL PL