Sposób selektywnego odzyskiwania trzech dimerycznych alkaloidów z Yinca rosea L. lub ich soli Przedmiotem wynalazku jest sposób selektywne¬ go odzyskiwania nastepujacych trzech dimerycz¬ nych alkaloidów z Vinca rosea L. (Catharanthus roseus G. Don) w postaci zasad lub sold: Vinkaleu- koblastin (VLB; ogólnie znana nazwa: vinblastine, w dalszym ciagu nazywamy winblastyna), Leurosin (VLR; ogólnie znana nazwa: vinleurosine; w dal¬ szym ciagu nazywany winleurozyna) i Leurocristin (VCR; ogólnie znana nazwa: vinoristine; w dalszym ciagu nazywany winkrystyna).W ostatnim czasie farmakolodzy na calym swie¬ cie piracówali z wielka intensywnoscia nad wytwa¬ rzaniem zwiazków o dzialaniu cytostatycznym, na¬ dajacych sie do leczenia chorych na raka. Do naj¬ wazniejszych wyników tych badan nalezy wykry¬ cie dimerycznych alkaloidów otrzymywanych z yin¬ ca rosea L. i wprowadzenie ich do lecznictwa. Pre¬ paraty te, prawie juz od 10 lat okazaly sie stosuii^ kowo najskuteczndejszynl srodkiem stosowanym w klinicznej praktyce w dziedzinie onkologii: Alkaloid winblastyna jest znanym lekiem onko¬ logicznym, który w stosowaniu klinicznym powo¬ duje znaczne zmniejszenie ilosci bialych krwinek.Okazal sie on skuteczny w leczeniu choroby Hod- gkina, ostrej leukemii a takze odpornego Chorio- carcinom [np. Johnson, I. S., Weright, H. P., Svo- boda G.H. i Vlantis, J. Gancer Res. 20, (1960) 10101.Dzialanie alkaloidu winleurozyny jest jeszcze malo znane. Jej zakres dzialania wydaje sie byc taki sam jak u alkaloidu winblastyny [Johnson 10 15 20 25 30 i wspólpracownicy: Cancer Res. 23 (1963) 1390; Antitumoral effects on Vinca rosea alkaloids. Pro- ceeding first symposium of the G.E.A. Excerpta Medica Foundation Amsterdam 1966].Alkaloid winkrystyna zostal opisany wzglednie wyosobniony po raz pierwszy przez G. H. Svobode [Svoboda, G. H.: Alkaloids of Vinca rosea (Catha- ranthus roseus) IX. Extraction and Charactenisation of Leurosidine and Leurocristine, Lloydia 24 (1961) 173—187]. Wkrótce okazalo sie, ze ten nowy alka¬ loid, chociaz pod wzgledem dzialania podobny do wczesniej wykrytej winblastyny, z punktu widze¬ nia farmakologicznego jest znacznie korzystniejszy.W badaniach in vitro alkaloid winkrystyna hamuje mitoze nowych plastycznych komórek w metafazie [np. Cardinali, G., Aboul Enein, M. I. M.: Studies on the Antimitotic Aation of Leuroaristine cristine). Blood 21 (1963) 102]. W stosowaniu kli¬ nicznym alkaloid winkrystyna okazal sie bardziej korzystny w przypadkach ostrej leukemii u dzieci, w porównaniu z dotad znanymi chemoterapeutyka- mi. Podczas gdy przedtem, w wiekszosci przypad¬ ków tej choroby nie mozna bylo uzyskac zadnych wyników leczniczych, to obecnie przy stosowaniu alkaloidu winkrystyny prawie w polowie przypad¬ ków uzyskuje sie pelna remisje [np. Haggard, M. E.: Vinarisrtiine (NSC-67574) therapy for Acute Leuke¬ mie in Children. Canc. Chemother. Rep. 52 (1968) 477] a wiec alkaloid ten ma takze znaczenie w ra¬ towaniu zycia. W chorobach na zlosliwe twarde 8172281722 3 nowotwory u dzieci mozna bylo takze uzyskac w 65 przypadkach na 94 znaczny regres [SeLavry, O, Holland, J. F. i Wolman, I. J.: Canc. Chemother.Rep., 52 (1968) 497].Z punktu widzenia farmakologicznego, z dime- rycznych alkaloidów otrzymywanych z Vinca rosea, winblastyna, winleurozyna i wdnkrystyna sa drugo¬ rzednymi alkaloidami rosliny, to jest sa tymi alka¬ loidami sposród ponad szescdziesieciu obecnych w roslinie, które wystepuja w bardzo malych ilo¬ sciach. Winblastyna i winleurozyna stanowia ra¬ zem tylko 1—2% calosci alkaloidów w roslinie, zas winkrystyna wystepuje zaledwie w stezeniu mniej¬ szym o dwa rzedy wielkosci. Zrozumialym jest wiec, ze oddzialeiHe*4clr ogi innych alkaloidów, odzyska¬ nie^i otrzymanie w ptopniu czystosci odpowiednim dla leku wymaga spqsobu, który jest bardziej skom¬ plikowany niz znanL metody oddzielania alkaloi- dówr .+****. i Znana fia-tóczne^posoby odzyskiwania alkaloidów winblastyny i winkleurozyny a takze winkrystyny [Nobel, R. L. i wspólpracownicy: Ann. N. Y. Acad.Sci. 76, (1958) 882; brytyjski opis patentowy nr. 870 723; opisy patentowe St. Zjedn. Am. nr 3 097131 i 3 205 220; Svoboda, G. H. i wspólpracow¬ nicy: J. Am. Assoc. Sci. ed. 48 (1959) 659; wegier¬ skie opisy patentowe nr 153 200 i 154 715; belgijski opds patentowy nr 624 046], a wszystkie one polega¬ ja na kwasnym lub zasadowym roztwarzaniu su¬ rowca, wzglednie na wstepnej obróbce kwasnej lub zasadowej, na ekstrakcji rozpuszczalnikiem or¬ ganicznym, nie mieszajacym sie z woda, na prze¬ prowadzeniu alkaloidów przy jednej lub dwóch róznych wartosciach pH z wodnego roztwoiru do organicznego rozpuszczalnika i na koniec na chro¬ matograficznym. frakcjonowaniu mieszaniny alka¬ loidów, przeprowadzonej do organicznego rozpusz¬ czalnika.Aczkolwiek w toku dalszej ewolucji te trzy na¬ dajace sie do farmakologicznego stosowania, dime¬ ryczne alkaloidy mozna bylo wydzielic z surowca wymienionymi metodami w lepszej jakosci i z lep¬ sza wydajnoscia, to wielokrotna przemiana fazowa, a glównie skomplikowane rozdzielanie za pomoca chromatografii sprawialy wciaz jeszcze trudnosci przy technicznym stosowaniu tych sposobów. Za¬ sadniczo latwo jest zrozumiec zlozonosc rozdzie¬ lania za pomoca chromatografii poniewaz te trzy dimeryczne alkaloidy winblastyne, winleurozyna i winkrystyne, których ilosc wynosi 1—2% calko¬ witej ilosci ponad 60 alkaloidów obecnych w ro¬ slinie, trzeba zatezyc, potem wydzielic, a w koncu doprowadzic do stopnia czystosci odpowiedniego do stosowania ich jako leku.Rozdzielanie calosci alkaloidów za pomoca chro¬ matografii jest operacja uciazliwa, dlugotrwala i wymagajaca duzej dokladnosci oraz rozdzielczych kolumn chromatograficznych o bardzo duzych wy¬ miarach. Wielkosc urzadzenia chromatograficznego poza duzymi rozmiarami kolumny rozdzielczej cha¬ rakteryzuje sie takze duza iloscia stosowanego do rozdzielania AlaOj. Wedlug wegierskiego opisu pa¬ tentowego nr 154 715 do odzyskania 150 g alkaloidu winblastyny zawartej w jednej tonie surowca po¬ trzeba 240 kg Al^Os. 4 Wynalazek w porównaniu ze znanymi sposobami umozliwia znaczne uproszczenie sposobu wzglednie wykluczenia niedogodnosci polegajacych na wielo¬ krotnej przemianie fazowej i na skomplikowanym 5 rozdzielaniu za pomoca chromatografii, poza tym pozwala na znaczne zmniejszenie wymiarów urza¬ dzenia chromatograficznego i nadto na jednoczesne odzyskiwanie trzech dimerycznych alkaloidów z lepsza niz dotychczas wydajnoscia i o odpowied- 10 niej jakosci. Istota wynalazku polega na tym, ze z mieszaniny surowych alkaloidów, wytworzonej z surowca, oddziela sie bezposrednio sól alkaloidu, skladajaca sie w wiekszej czesci z winblastyny, winleurozyny i winkrystyny, z której w stosunko- 15 wo prosty sposób odzyskuje sie powyzsze sklad¬ niki.W toku badan stwierdzono mianowicie, ze te trzy dimeryczne alkaloidy odzyskac mozna odmien¬ nie od dotychczasowych sposobów, znacznie prost¬ sza metoda jezeli zatezy sie je przed rozdzieleniem chromatograficznym i koncentrat alkaloidowy za¬ wierajacy pozadane dimeryczne alkaloidy w steze¬ niu do okolo 70% podda sie nastepnie chromato¬ grafid. Nalezy wyekstrahowac obojetnym, wodnym roztworem metanolu surowiec bez poddawania go uprzednio lub w czasie ekstrakcji dzialaniu zasad lub kwasów, dzieki czemu z tej delikatnej, latwo rozkladajacej sie masy alkaloidowej otrzymanej so przy przeróbce ekstraktu oddziela sie od przewaza¬ jacej czesci alkaloidów towarzyszacych te trzy di¬ meryczne alkaloidy w postaci soli addycyjnych z kwasami, korzystnie w postaci siarczanów. W ten sposób stezenie tych zwiazków staje sie 30—40 razy wieksze niz w mieszaninach alkaloidowych pod¬ dawanych chromatograficznemu frakcjonowaniu w znanych sposobach. Tym samym rozdzielanie za pomoca chromatografii staje sie o wiele prostsze d mozna je prowadzic przy uzyciu kolumn o wy¬ miarach znacznie mniejszych, poniewaz pozadane dimeryczne alkaloidy oddziela sie od substancji to¬ warzyszacych, wystepujacych tylko w malej ilosci.Korzystne uproszczenie i zmniejszenie wymiarów kolumn przy rozdzielaniu chromatograficznym spo¬ sobem wedlug wynalazku mozna znów najprosciej scharakteryzowac iloscia Al^Oj potrzebna do wy¬ dzielenia mieszaniny alkaloidów otrzymanej z 1 tony surowca, która wynosi w nowym sposobie okolo 20 kg, podczas gdy dotad potrzeba bylo 240 kg. 50 Przedmiotem wynalazku jest wiec sposób selek¬ tywnego odzyskiwania trzech dimerycznych alkaloi¬ dów z Vinca rosea L., mianowicie, winblastyny, winleurozyny i winkrystyny lub ich soli addycyj¬ nych z kwasami, przez wyekstrahowanie surowca 58 wodnym roztworem metanolu, zageszczenie ekstrak¬ tu praktycznie do usuniecia metanolu, zakwaszenie odparowanego roztworu, przesaczenie, wyekstra¬ howanie przy uzyciu rozpuszczalników nie miesza¬ jacych sie z woda, zalkalizowanie fazy wodnej, po- 60 wtórne rozpuszczenie alkaloidów w rozpuszczalni¬ kach organicznych nie mieszajacych sie z woda, odparowanie bezwodnego roztworu do sucha i od¬ zyskanie calosci alkaloidów za pomoca chromato¬ grafii przy uzyciu czesciowo zdezaktywowanego 65 Al2Os.81 5 Sposób, który polega na tym, ze surowiec wyeks- trahowuje sie obojetnym metanolem, po czym uzy¬ skana w znany sposób mieszanine alkaloidów roz¬ puszcza sie w etanolu lub w etanolu zawierajacym maksimum 10% kwasu, nastepnie w przypadku roz¬ tworu etanolowego wykrystalizowuja alkaloidy win¬ blastyne, winleurozyne i winkrystyne w postaci soli addycyjnych z kwasami i po przesaczeniu, zatezona mieszanina soli, zawierajaca jeszcze male ilosci sub¬ stancji towarzyszacych chromatografuje sie przy uzyciu AljO, czesciowo zdezaktywowanego woda, albo w postaci soli addycyjnych z kwasami, albo w postaci uwolnionych zasad, po zalkalizowaniu soli addycyjnych z kwasami, po czym frakcjonuje sie, eluuje, z frakcji eluatu odzyskuje sie alkaloidy win- blastyne, winleurozyne, winkrystyne lub ich sole addycyjne z kwasami, w razie potrzeby oczyszcza i nastepnie ewentualnie poszczególne zasady alka¬ loidów dimerycznych przeprowadza sie w sole ad¬ dycyjne z kwasami, wzglednie z poszczególnych soli dimerycznych alkaloidów wydziela sie alkaloidy.Sposób wedlug wynalazku przeprowadza sie ko¬ rzystnie w nastepujacy sposób: Zmielony surowiec (Vinca rosea L.) ekstrahuje siie kilakrotnoe metanolem zawierajacym 5—20%, a korzystnie 10% wody i przesaczone, polaczone wy¬ ciagi zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do usuniecia praktycznie calego metanolu. Nastepnie wodna pozostalosc zakwasza-sie rozcienczonym kwa¬ sem siarkowym w celu usuniecia skladników towa¬ rzyszacych, nie nalezacych do alkaloidów i odsacza sie powstaly osad. Kwasny wodny roztwór ekstra¬ huje sie kilkakrotnie benzenem, po czym oddzie¬ lona kwasna faze wodna alkalizuje sie, alkaliczny wodny roztwór ekstrahuje sie ponownie kilkakrot¬ nie benzenem az do wydzielenia alkaloidów. Pola¬ czone roztwory benzenowe otrzymane przy ekstrak¬ cji alkalicznych roztworów wodnych odparowuje sie do sucha pod zmniepszonym cisnieniem. W ten sposób otrzymuje sie brazowa, bezpostaciowa mie¬ szanine alkaloidów. Mieszanine te rozpuszcza sie w etanolowym roztworze zawierajacym najwyzej 10% kwasu siarkowego, przy czym jednoczesnie ustala sie wartosc pH roztworu na 4,0—5,0. Roz¬ twór zaszczepia sie krysztalami siarczanów alka¬ loidów dimerycznych i wzbudza sie krystalizacje przez pocieranie Scianek naczynia, po czym pozosta¬ wia sie do wykrystalizowania w temperaturze po¬ kojowej przez okres 2 dni. Wydzielona i odsaczona mieszanine 'krystaliczna skladajaca sie z siarczanów winblaistyny, winleurozyny, winkrystyny i towarzy¬ szacych alkaloidów rozpuszcza sie i bezposrednio chromatografuje. Do rozpuszczenia i eluowania uzy¬ wa sie chlorku metylenu i chloroformu w stosun¬ ku 2:1, a do chromatografowania — kolumny roz¬ dzielcze napelnione AljOj czesciowo zdezaktywowa- nym woda. Frakcje 1—3 zawieraja wieksza czesc obecnych alkaloidów towarzyszacych, a frakcje 2—9 — winblastyne i winleurozyne. Winkrystyna zawar¬ ta jest w miinimalnych ilosciach we frakcji 9, a eluowanie jej konczy sie na frakcji 18. Frakcje zawierajace winblastyne i winleurozyne odparowuje sie do sucha, nastepnie pozostalosc rozpuszcza sie w etanolu i po wykrystalizowaniu winleurozyny z lugu pokrystalizacyjnego wytraca sie etanolowym 722 e roztworem zawierajacym najwyzej 10% kwasu siar¬ kowego winblastyne w postaci siarczanu, odsacza sie ja i nastepnie przekrystalizowuje w celu dalsze¬ go oczyszczania. 5 Frakcje zawierajace winkrystyne odparowuje sie do sucha, rozpuszcza sucha pozostalosc w etanolu i wykrystalizowuje winkrystyne, która w podobny sposób jak wyzej, rozpuszcza sie w rozcienczonym etanolowym roztworze kwasu siarkowego i oczy- 10 szcza przez wytracenie krystalicznego siarczanu.Mozna tez postepowac w ten sposób, ze chroma¬ tografuje sie zasady alkaloidów. W tym przypadku mieszanine krystaliczna skladajaca sie z siarczanów winblastyny, winleurozyny, winkrystyny i towarzy- 13 szacych alkaloidów rozpuszcza sie w wodzie d do¬ prowadza sie wartosc pH roztworu amoniakiem do 8,0—9,0. Z alkalicznego roztworu za pomoca chloro¬ formu ekstrahuje sie .zasady alkaloidów, polaczone roztwory chloroformowe suszy sie nad bezwodnym 20 siarczanem sodowym, przesacza, po czym odparo¬ wuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Mie¬ szanine zasad alkaloidów zawierajaca glównie te trzy alkaloidy dimeryczne rozpuszcza sie w miesza¬ ninie benzenu i chloroformu w stosunku 1 :1 chro- 25 matografirje na kolumnie rozdzielczej na A1208 cze¬ sciowo zdezaktywowanym woda. Do eluowania sto¬ suje sie mieszanine rozpuszczalników o tym samym skladzie. Frakcje 1—10 zawieraja winblastyne i win¬ leurozyne, a frakcje 13—17 zawieraja winkrystyne. so Przeróbke frakcji zawierajacych winblastyne i win¬ leurozyne wzglednie winkrystyne, zidentyfikowa¬ nych na drodze chromatografii bibulowej wzglednie cienko warstwowej prowadzi sie w sposób powy¬ zej opisany. 35 Szczególy sposobu wedlug wynalazku podano w przytoczonych przykladach.Przyklad I. 100 g wysuszonej zmielonej rosli¬ ny Yiinca rosea L. (Catharanthus roseus G. Don) skladajacej sie glównie z lisci wyekstrahowuje 40 sie jeden raz 600 litrami i dwukrotnie stosujac po 400 litrów 90% wodnego metanolu. Przesaczone i polaczone metanolowe wyciagi zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem, praktycznie do usuniecia metanolu, do objetosci 140—150 litrów. 45 Nastepnie zakwasza sie w celu usuniecia róznych wyekstrahowanych zwiazków nie nalezacych do al¬ kaloidów, taka sama objetoscia 5% wodnego kwasu siarkowego do uzyskiwania pH«=2 i powstaly ciemno zabarwiony osad odsacza sie. Przesaczony, 50 kwasny wodny roztwór ekstrahuje sie trzykrotnie stosujac po 500 litrów benzenu, po czym doprowa¬ dza sie wartosc pH oddzielonej kwasnej fazy wod¬ nej zawierajacej alkaloidy do 8,5—9,0 za pomoca stezonego wodnego roztworu wodorotlenku amono- 55 wego. Nastepnie alkaliczny wodny roztwór ekstra¬ huje sie trzy- do czterokrotnie stosujac po 600 li¬ trów benzenu do wyekstrahowania alkaloidów. Pola¬ czone roztwory benzenowe suszy sie bezwodnym siarczanem sodowym lub weglanem potasowym 60 i nastepnie przesaczony roztwór benzenowy odpa¬ rowuje sie pod zmniejszonym , cisnieniem. Otrzy¬ muje sie okolo 700 g brazowej mieszaniny alka¬ loidów.Mieszanine te rozpuszcza sie w etanolu zawiera- 65 jacym najwyzej 10% kwasu siarkowego, przy czym81722 7 nalezy zwrócic uwage, aby wartosc pH roztworu wynosila 4,0—5,0. Roztwór z krysztalami siarczanu winblastyny odparowuje sie, wytracanie sie kry¬ sztalów rozpoczyna sie wkrótce po poskrobaniu scia¬ nek naczynia. Calosc odstawia sie na 2 dni w tem¬ peraturze pokojowej do wykrystalizowania, po czym wytracone krysztaly odsacza sie.Wydajnosc, zaleznie od jakosci surowca wynosi 20—100 g mieszaniny krystalicznej, skladajacej sie z siarczanów winblastyny, winleurozyny i winkry¬ styny oraz z siarczanów alkaloidowych towarzy¬ szacych. Te krystaliczna mieszanine surowych siar¬ czanów alkaloidowych rozpuszcza sie w mieszaninie chlorku metylenu i chloroformu o stosunku 2:1, stosujac 7 ml tej mieszaniny na 1 kg mieszaniny siarczanów alkaloidów. Otrzymany roztwór chroma- tografuje sie na kolumnie wypelnionej stokrotna iloscia AlgOs czesciowo zdezaktywowanego woda, po czym eluuje sie mieszanina chlorku metylenu i chloroformu w stosunku 2 :1. Odbiera sie frakcje po 30—50 ml. Trzy pierwsze frakcje zawieraja przewazajaca czesc alkaloidów towarzyszacych.Winblastyne i winleurozyne otrzymuje sie we frak¬ cjach 2h-9. Winkrystyna znajduje sie w minimal¬ nych ilosciach we frakcji 9 i eluuje sie ja do frakcji 18. Frakcje zawierajace winblastyne i win¬ leurozyne wzglednie winkrystyne, zidentyfikowane na drodze chromatografii bibulowej lub cienko¬ warstwowej rozdziela sie i odparowuje do sucha.Wydajnosc: 15—75 g bezpostaciowej suchej pozo¬ stalosci zawierajacej winblastyne i winleurozyne, wzglednie 0,6—3,0 g suchej pozostalosci zawiera¬ jacej winkrystyne.Sucha pozostalosc zawierajaca winblastyne i win¬ leurozyne rozpuszcza sie w 15-krotnej ilosci wod¬ nego etanolu. Wykrystalizowuje winleurozyna, po czym odsacza sie ja, przemywa i suszy. Wydajnosc: zaleznie od jakosci produktu surowego 5—17 g winleurozyny. Temperatura topnienia 202—205°C.M^^+720 (CHCls).Lugi pokrystaliczne winleurozyny, zawierajace winblastyne rozciencza sie bezwodnym etanolem do podwójnej objetosci i wartosc pH roztworu do¬ prowadza sie etajnolowym roztworem kwasu siar¬ kowego do 4,0. Krystalizacja siarczanu winblastyny rozpoczyna sie juz w czasie dodawania etanolowego roztworu kwasu siarkowego. Krystalizacje prowa¬ dzi sie nastepnie w ciagu 16 godzin w lodówce.Wydajnosc: zaleznie od jakosci produktu surowego 15—70 g surow|ego siarczanu winblastyny.Wysuszony i sproszkowany surowy siarczan win¬ blastyny rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej w 20-krotnej ilosci bezwodnego metanolu i do prze¬ saczonego roztworu dodaje sie czterokrotna obje¬ tosc bezwodnego etanolu. W celu calkowitego wy¬ krystalizowania winblastyny pozostawia sie roz¬ twór w ciagu 16 godzin w lodówce. Po przekrysta- Mzowaniu uzyskuje sie 90-procentowa wydajnosc.Wydajnosc: zaleznie od jakosci produktu suro¬ wego 13—63 g siarczanu winblastyny [«]D28 = —28° (CHClg).W celu zidentyfikowania przeprowadza sie win¬ blastyne w zasade i z niej wytwarza eterowy zwia¬ zek winblastyny przez przekrystalizowanie z eteru. 8 Temperatura topnienia 201—211°C; [«] *• = +42° (CHC13).Bezpostaciowa, sucha pozostalosc w ilosci 0,6— 3,0 g, oddzielona na drodze chromatograficznej 5 i zawierajaca winkrystyne rozpuszcza sie w 10- krotnej ilosci bezwodnego etanolu i wartosc pH roztworu doprowadza sie do 4,0 za pomoca meta¬ nolowego roztworu kwasu siarkowego. W celu cal¬ kowitego wykrystalizowania siarczanu winkrystyny 10 pozostawia sie roztwór na okres 16 godzin w lo¬ dówce. Ilosc odsaczonego surowego siarczanu win¬ krystyny stanowi 60—70% rozpuszczonej bezposta¬ ciowej suchej pozostalosci zawierajacej winkry¬ styne. 15 W celu przekrystalizowania rozpuszcza sie suro¬ wy siarczan winkrystyny w malej ilosci etanolu, po czym dodaje sie czterokrotna ilosc etanolu, po¬ zostawia sie roztwór do wykrystalizowania w lo¬ dówce na 16 godzin i odsacza. Wydajnosc: 0,3—1,5 g siarczanu winkrystyny. Temperatura topnienia 218^220°C.Mozna tez postepowac w ten sposób, ze 0,6—3,0 g bezpostaciowej suchej pozostalosci, oddzielonej na 29 drodze chromatograficznej a zawierajacej winkry¬ styne rozpuszcza sie w dziesieciokrotnej ilosci bez¬ wodnego metanolu i doprowadza do wykrystalizo¬ wania zasady winkrystyny, która oczyszcza sie w taki sam sposób, jak wyzej opisano przez roz- 30 puszczenie w bezwodnym etanolu i wydzielenie w postaci krystalicznego siarczanu.Przyklad II. Surowa mieszanine krystalicz¬ na, otrzymana wedlug przykladu I, skladajaca sie zaleznie od jakosci surowca z 20—100 g siarcza- 35 nów winleurozyny, winblastyny, winkrystyny i al¬ kaloidów towarzyszacych rozpuszcza sie w wodzie i wartosc pH roztworu doprowadza sie amonia¬ kiem do 8,0—9,0. Z roztworu ekstrahuje sie alka¬ loidy czterokrotnie, stosujac po 1 litrze chlorofor¬ mu, polaczone roztwory chloroformowe suszy sie bezwodnym siarczanem sodowym i przesacza, po czym odparowuje sie je do sucha pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Wydajnosc: 16—80 g mieszaniny : zasad alkaloidów. Mase te rozpuszcza sie w trzy- do czterokrotnej ilosci mieszaniny skladajacej sie z benzenu i chloroformu w stosunku 1 :1, po czym chromatografuje na kolumnie wypelnionej okolo czterdziestokrotna iloscia A1^03, czesciowo zdezak¬ tywowanego woda. Jako mieszanine wymywajaca 50 stosuje sie mieszanine benzenu i chloroformu w stosunku 1:1.Po splynieciu pierwszych 2—10 litrów eluatu za¬ wierajacych jedynie male ilosci alkaloidów towa- 55 rzyszacych, odbiera sie frakcje 0,6—3,0 litrowe.Frakcje 1—10 zawieraja winblastyne i winleuro¬ zyne, frakcje 11 i 12 sa juz wolne od winblastyny i winleurozyny. Nastepnie zaleznie od ilosci poda¬ nej mieszaniny krystalicznej, eluuje sie dalej 3—18 60 litrami mieszaniny skladajacej sie z benzenu i chlo¬ roformu w stosunku 1:1, przy czym odbiera sie frakcje po 0,6—3,6 litra. Frakcje 13—17 zawieraja winkrystyne.Przeróbke frakcji zawierajacych winblastyne 65 i winleurozyne wzglednie winkrystyne, zidentyfi-81 722 9 10 kowanych za pomoca chromatografii bibulowej wzglednie cienkowarstwowej przeprowadza sie w sposób podany w przykladzie I. PL PLA method for the selective recovery of three dimeric alkaloids from Yinca rosea L. or their salts. The invention relates to a method for the selective recovery of the following three dimeric alkaloids from Vinca rosea L. (Catharanthus roseus G. Don) as bases or sold: Vinkaleucoblastin ( VLB; generally known name: vinblastine, we continue to call vinblastine), Leurosin (VLR; generally known name: vinleurosine; hereinafter referred to as vinleurosine) and Leurocristin (VCR; generally known name: vinoristine; hereinafter referred to as vincristine) Recently, pharmacologists around the world have been pirating with great vigilance to produce compounds with cytostatic action that could be useful in the treatment of cancer patients. The most important results of these studies include the detection of dimeric alkaloids obtained from yinca rosea L. and their introduction to therapy. These preparations, for almost 10 years, have proved to be the most effective agent in clinical practice in the field of oncology for almost 10 years: Vinblastine alkaloid is a well-known oncology drug which, in clinical use, causes a significant reduction in the number of white blood cells. effective in treating Hodgkin's disease, acute leukemia as well as resistant to Choriocarcinoma [e.g. Johnson, I. S., Weright, H. P., Svoboda G.H. and Vlantis, J. Gancer Res. 20, (1960) 10101 The effect of the vinleurosine alkaloid is still little known. Its spectrum of action appears to be the same as that of the vinblastine alkaloid [Johnson 10 15 20 25 30 and associates: Cancer Res. 23 (1963) 1390; Antitumoral effects on Vinca rosea alkaloids. Pro- ceeding first symposium of the G.E.A. Excerpta Medica Foundation Amsterdam 1966]. The vincristine alkaloid was described or isolated for the first time by G. H. Svobode [Svoboda, G. H .: Alkaloids of Vinca rosea (Catharanthus roseus) IX. Extraction and Charactenization of Leurosidine and Leurocristine, Lloydia 24 (1961) 173-187]. It soon turned out that this new alkaloid, although similar in effect to the previously detected vinblastine, is pharmacologically more advantageous. In vitro studies, vincristine inhibits the mitosis of new plastic cells in metaphase [e.g. Cardinali, G., Aboul Enein, M. I. M .: Studies on the Antimitotic Aation of Leuroaristine cristine). Blood 21 (1963) 102]. In clinical use, the alkaloid vincristine has proved to be more advantageous in cases of acute leukemia in children, compared to chemotherapeutic agents known hitherto. Whereas before that, in most cases of this disease it was not possible to obtain any therapeutic results, now with the use of vincristine alkaloid almost half of the cases achieve complete remission [e.g. Haggard, M.E .: Vinarisrtiine (NSC-67574) therapy for Acute Leukemie in Children. Canc. Chemother. Rep. 52 (1968) 477] so this alkaloid is also of importance in saving life. In diseases of malignant hard 8172281722 3 tumors in children could also be obtained in 65 cases out of 94 significant regression [SeLavry, O, Holland, J. F. and Wolman, I. J. Canc. Chemother. Rep., 52 (1968) 497]. From the pharmacological point of view, from the dimeric alkaloids obtained from Vinca rosea, vinblastine, vinleurosine and vndocristine are the secondary alkaloids of the plant, that is, they are the alkaloids of over sixty present in plants that are present in very small amounts. Together, vinblastine and vinleurosine make up only 1-2% of the total alkaloids in the plant, and vincristine is present only in a concentration that is two orders of magnitude less. It is therefore understandable that the separation of the 4 Clr will produce other alkaloids, recover and obtain a drug-compatible purity requires a process that is more complex than the known method of alkaloid separation. and the known phytochemicals for the recovery of vinblastine alkaloids and vincleurosine as well as vincristine [Nobel, R. L. et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 76, (1958) 882; British patent specification no. 870 723; US patents US Am. No. 3,097,131 and 3,255,220; Svoboda, G. H. and co-workers: J. Am. Assoc. Sci. ed. 48 (1959) 659; Hungarian patents Nos. 153 200 and 154 715; Belgian Patent Document No. 624,046], all of which consist in acidic or alkaline digestion of the raw material, or in an acidic or alkaline pretreatment, extraction with an organic solvent immiscible with water, in carrying out the alkaloids with one or two different pH values from the aqueous solution to the organic solvent and finally on the chromatography. fractionation of the alkaloids mixture converted to an organic solvent. Although in the course of further evolution these three pharmacologically usable, dimeric alkaloids could be separated from the raw material with the above-mentioned methods in better quality and with better yield, many the phase conversion, and mainly the complicated separation by chromatography, still caused difficulties in the technical application of these methods. In principle, it is easy to understand the complexity of the separation by chromatography because the three dimeric vinblastine alkaloids, vinleurine and vincristine, which amount to 1-2% of the total amount of more than 60 alkaloids present in the plant, must be concentrated and then isolated. and finally to a degree of purity suitable for use as a drug. Separation of all the alkaloids by chromatography is a laborious, time-consuming and demanding operation requiring high accuracy and resolution chromatography columns with very large dimensions. The size of the chromatographic device, in addition to the large size of the separating column, is also characterized by the large amount used for the separation of AlaOj. According to Hungarian Patent No. 154,715, for the recovery of 150 g of vinblastine alkaloid contained in one ton of raw material, 240 kg of Al. The invention, compared to the known methods, makes it possible to significantly simplify the process or eliminate the disadvantages of multiple phase transformation and complicated separation by chromatography, furthermore it allows a significant reduction in the size of the chromatographic device and, moreover, the simultaneous recovery of three dimeric alkaloids from better than before and of a suitable quality. The essence of the invention consists in the fact that the alkaloid salt is directly separated from the mixture of crude alkaloids obtained from the raw material, which consists mainly of vinblastine, vinleurine and vincristine, from which the above components are recovered in a relatively simple manner. In the course of the research it was found that these three dimeric alkaloids can be recovered differently from the previous methods, a much simpler method if they are melted before the chromatographic separation and the alkaloid concentrate containing the desired dimeric alkaloids in a concentration of up to about 70% will be subject to then chromatographide. The raw material must be extracted with an inert, aqueous solution of methanol without subjecting it to the action of bases or acids before or during the extraction, so that the delicate, easily decomposing alkaloid mass obtained in processing the extract is separated from most of the alkaloids accompanying these three di ¬ tones. the meric alkaloids in the form of acid addition salts, preferably in the form of sulfates. In this way, the concentration of these compounds becomes 30 to 40 times greater than in the alkaloid mixtures subjected to chromatographic fractionation in known methods. The separation by chromatography thus becomes much simpler and can be carried out with much smaller columns, since the desired dimeric alkaloids are separated from the accompanying substances, which are only present in a small amount. In the case of chromatographic separation according to the method according to the invention, it is once again most simple to characterize the amount of Al required for the separation of the alkaloids mixture obtained from 1 ton of raw material, which in the new process amounts to about 20 kg, whereas so far, 240 kg were required. The subject of the invention is therefore a method of selectively recovering three dimeric alkaloids from Vinca rosea L., viz., Vinblastine, vinleurosine and vincristine or their acid addition salts, by extracting the raw material with an aqueous methanol solution, concentrating the extract practically to remove methanol, acidify the evaporated solution, filter, extract with water-immiscible solvents, make the water phase alkaline, redissolve the alkaloids in organic solvents that do not mix with water, evaporate the anhydrous solution to dryness and recovery of all the alkaloids by chromatography using partially deactivated 65 Al2Os81 5 A method in which the raw material is extracted with inert methanol and then the mixture of alkaloids obtained in a known manner is dissolved in ethanol or in ethanol with a maximum of 10% acid, then in the case of ethanolic solution o the vinblastine, vinleurosine and vincristine alkaloids crystallize in the form of acid addition salts, and after filtering, the concentrated salt mixture, still containing a small amount of accompanying substances, is chromatographed with AljO, partially inactivated with water, or in the form of acid addition salts, or in the form of liberated bases, after basification of the acid addition salts, followed by fractionation, elution, recovery of vinblastine, vinleurosine, vincristine alkaloids or their acid addition salts from the eluate fraction, purify if necessary, and then optionally the individual alkali bases The dimeric ¬ loids are converted into acid addition salts, or the alkaloids are separated from the individual dimeric alkaloids. The method according to the invention is preferably carried out as follows: The ground raw material (Vinca rosea L.) is extracted several times with methanol containing 5— 20%, preferably 10%, of water and filtered, combined crude oil The balance is thickened under reduced pressure until virtually all of the methanol has been removed. The aqueous residue is then acidified with dilute sulfuric acid to remove non-alkaloids accompanying components and the resulting precipitate is filtered off. The acidic aqueous solution is extracted several times with benzene, then the separated acidic aqueous phase is made alkaline, the alkaline aqueous solution is extracted again several times with benzene until the alkaloids are separated. The combined benzene solutions obtained by extracting the alkaline aqueous solutions are evaporated to dryness under reduced pressure. In this way a brown, amorphous mixture of alkaloids is obtained. This mixture is dissolved in an ethanolic solution containing at most 10% of sulfuric acid, while the pH of the solution is simultaneously adjusted to 4.0-5.0. The solution is seeded with crystals of dimeric alkaloids sulfates and crystallization is induced by rubbing the walls of the vessel and allowed to crystallize at room temperature for 2 days. The separated and drained crystalline mixture consisting of vinblaistine sulfates, vinleurosine, vincristine and associated alkaloids is dissolved and chromatographed directly. For dissolution and elution, methylene chloride and chloroform in the ratio of 2: 1 were used, and for chromatography - separation columns filled with AljOj partially deactivated water. Fractions 1-3 contain most of the adjunct alkaloids present, and fractions 2-9 contain vinblastine and vinleurosine. Vincristine is contained in minimal amounts in fraction 9, and its elution ends at fraction 18. The fractions containing vinblastine and vinleurosine are evaporated to dryness, then the residue is dissolved in ethanol and, after crystallization of vinleurosine from the post-crystallization solution, it is precipitated with ethanolic solution 722 Vinblastine sulfate, containing at most 10% of sulfuric acid, is filtered off and then recrystallized for further purification. 5 The vincristine-containing fractions are evaporated to dryness, the dry residue is dissolved in ethanol and the vincristine crystallizes out, which, in a similar manner as above, is dissolved in dilute ethanolic sulfuric acid and purified by precipitation of the crystalline sulphate. that the bases of the alkaloids are chromatographed. In this case, the crystalline mixture consisting of vinblastine sulfates, vinleurosine, vincristine and the associated alkaloids is dissolved in water and the pH of the solution is adjusted to 8.0-9.0 with ammonia. The alkaline bases are extracted from the alkaline solution with chloroform, the combined chloroform solutions are dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and then evaporated to dryness under reduced pressure. The alkaloid base mixture containing mainly these three dimeric alkaloids is dissolved in a 1: 1 mixture of benzene and chloroform in a 1: 1 chromatography column on A1208 partially deactivated water. A mixture of solvents of the same composition is used for the elution. Fractions 1-10 contain vinblastine and vin leurosine and fractions 13-17 contain vincristine. The working up of the fractions containing vinblastine and vinyurosine or vincristine, identified by paper or thin layer chromatography, is carried out as described above. Details of the method according to the invention are given in the following examples. Example 1 100 g of dried ground Yiinca rosea L. plant (Catharanthus roseus G. Don) consisting mainly of leaves are extracted with 40 once with 600 liters and twice with 400 liters each 90 % aqueous methanol. The filtered and combined methanol extracts are concentrated in vacuo until virtually no methanol has been removed, to a volume of 140-150 liters. It is then acidified to remove various extracted non-alkaloids, the same volume of 5% aqueous sulfuric acid to achieve pH ≤ 2 and the resulting dark colored precipitate is filtered off. The filtered, acidic aqueous solution is extracted three times with 500 liters of benzene each, and the pH of the separated acidic aqueous phase containing the alkaloids is adjusted to 8.5-9.0 with a concentrated aqueous solution of ammonium hydroxide. The alkaline aqueous solution is then extracted three to four times, using 600 liters of benzene each to extract the alkaloids. The combined benzene solutions are dried with anhydrous sodium sulfate or potassium carbonate 60 and then the filtered benzene solution is evaporated under reduced pressure. About 700 g of a brown mixture of alkaloids is obtained. This mixture is dissolved in ethanol with a sulfuric acid content of at most 10%, it must be ensured that the pH value of the solution is between 4.0 and 5.0. The solution with the vinblastine sulfate crystals is evaporated and the precipitation of the crystals begins shortly after scraping the walls of the vessel. The whole is left to crystallize for 2 days at room temperature, then the precipitated crystals are filtered off. The yield, depending on the quality of the raw material, is 20-100 g of a crystalline mixture consisting of vinblastine, vinleurosine and vincristine sulphates and alkaloids sulphates. companions. This crystalline mixture of crude alkaloid sulfates is dissolved in a 2: 1 mixture of methylene chloride and chloroform, using 7 ml of this mixture per kg of alkalooid sulfate mixture. The resulting solution is chromatographed on a column packed with a hundred times the amount of AlgOs partially inactivated with water, then eluted with a 2: 1 mixture of methylene chloride and chloroform. Fractions of 30-50 ml are collected. The first three fractions contain the major part of the associated alkaloids. Vinblastine and vinleurosine are obtained in fractions 2h-9. Minimal amounts of vincristine in fraction 9 are eluted into fraction 18. The fractions containing vinblastine and vinleurosine or vincristine, identified by paper or thin-layer chromatography, are separated and evaporated to dryness. Yield: 15-75 g of amorphous dry residue containing vinblastine and vinleurosine, respectively 0.6-3.0 g of dry residue containing vincristine. The dry residue containing vinblastine and vinleurosine is dissolved in 15 times the amount of aqueous ethanol. Vinleurosine crystallizes, then it is filtered off, washed and dried. Yield: 5-17 g of vinleurosine, depending on the quality of the crude product. Melting point 202-205 ° C. M @ 8 + 720 (CHCl 3). Vinblastine-containing crystalline liquors are diluted with anhydrous ethanol to twice the volume and the pH value of the solution is adjusted to 4.0 with ethanol sulfuric acid solution. Crystallization of vinblastine sulfate begins with the addition of the ethanolic sulfuric acid solution. The crystallization is then carried out for 16 hours in a refrigerator. Yield: depending on the quality of the raw product, 15-70 g of raw vinblastine sulfate. The dried and powdered raw vinblastine sulfate is dissolved at room temperature in 20 times the amount of anhydrous methanol and four times the volume of anhydrous ethanol is added to the filtered solution. In order for the vinblastine to crystallize completely, the solution is left for 16 hours in the refrigerator. After recrystallization, a 90% yield is obtained. Yield: depending on the quality of the crude product, 13-63 g of vinblastine sulfate [] D28 = -28 ° (CHClg). For identification, vinblastine is carried out in principle and from there. produces the ether compound of vinblastine by recrystallization from ether. Mp 201-211 ° C; [«] * • = + 42 ° (CHCl 3). The amorphous, dry residue of 0.6-3.0 g, separated by chromatography 5 and containing vincristine, is dissolved in 10 times anhydrous ethanol and the pH value of the solution is adjusted to 4.0 with a methanolic solution of sulfuric acid. In order to completely crystallize the vincristine sulfate 10, the solution was left in the refrigerator for 16 hours. The amount of drained crude vincristine sulfate is 60-70% of the dissolved amorphous dry vincristine residue. For recrystallization, the crude vincristine sulfate is dissolved in a small amount of ethanol, then four times the amount of ethanol is added, the solution is allowed to crystallize in a refrigerator for 16 hours and drained. Yield: 0.3-1.5 g of vincristine sulfate. Melting point 218-220 ° C. It can also be done so that 0.6-3.0 g of an amorphous dry residue, separated by chromatography and containing vincristine, is dissolved in ten times the amount of anhydrous methanol and brought to crystallization of vincristine base which is purified in the same manner as described above by dissolving in anhydrous ethanol and isolating as crystalline sulfate. Example II. The crude crystalline mixture obtained according to example 1, consisting, depending on the quality of the raw material, of 20-100 g of vinleurine sulphates, vinblastine, vincristine and accompanying alkaloids are dissolved in water and the pH value of the solution is adjusted with ammonia to 8.0-9.0. The alkaloids are extracted from the solution four times using 1 liter of chloroform each, the combined chloroform solutions are dried over anhydrous sodium sulphate and filtered and evaporated to dryness under reduced pressure. Yield: 16-80 g of a mixture of alkaloid bases. This mass is dissolved in three to four times the amount of a 1: 1 mixture of benzene and chloroform, and then chromatographed on a column packed with about forty times the amount of Al ^ 03, partially de-activated with water. A 1: 1 mixture of benzene and chloroform is used as the leaching mixture. After the first 2 to 10 liters of eluate, containing only a small amount of accompanying alkaloids, have been drained off, fractions from 0.6 to 3.0 liters are collected. -10 contain vinblastine and vinleurine, fractions 11 and 12 are now free from vinblastine and vinleurine. Then, depending on the quantity of the crystalline mixture given, the elution is carried out with 3 to 18 liters of 60 liters of a mixture consisting of benzene and chloroform in a ratio of 1: 1, 0.6-3.6 liter fractions being collected. Fractions 13-17 contain vincristine. The processing of the fractions containing vinblastine 65 and vinleurosine or vincristine, identified by paper or thin-layer chromatography, is carried out as described in example I. EN EN