Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania nowego, uzytecznego antybiotyku w postaci kompleksu lulb poszczególnych komponen¬ tów alUbo tez ich mieszaniny.Wedlug wynalazku wymieniony wyzej antybio¬ tyk B-5050 wytwarza sie metoda mikrobiologiczna.Wynalazek obejmuje równiez sposoby wyodrebnia¬ nia antybiotyku B-5050 w formie kompleksu lub poszczególnych komponentów, wzglednie ich mie- 10 20 25 30 szaniny. Antybiotyk B-5050 otrzymuje sie w hodo¬ wli drobnoustrojów z rodzaju Streptomyces, zdol¬ nych do wytwarzania tego antybiotyku, w odpo¬ wiedniej pozywce, który to antybiotyk zasadniczo gromadzi sie w brzeczce fermentacyjnej, po czym nastepuje wyodrebnianie produktu koncowego. Te¬ go rodzaju drobnoustrojem jest Streptomyces hy- groscopicus B-5050, wyizolowany przez autorów z próbki gleby w Chichibu, Saitama, Japonia. Cha¬ rakterystyke tego drobnoustroju podano ponizej.W opisie nazwy barw oznaczone „Rdg" sa zgodne z Rodgwaya „Color Standards and Color Nomen- clature". Oznaczenia cech hodowlanych dokonywano w temperaturze 28°C po 14 dnliach hodowM, o ile nie podano inaczej.Wlasnosci morfologiczne szczepu Streptomyces hygroscopiiicus B-5050 sa nastepujace: strzepki spo- ronosne maja ksztalt petelek lub skretów. Kazdy zarodnik jest elipsoidalny lub cylindryczny o wy¬ miarach okolo 0,7 do 1,7 \i na Okolo 0,0 do 1,4 \i o powierzchni gladkiej.Ponizej omówiono wlasnosci hodowlane szczepu.Podloze agarowe Czapka Wzrost: dobry, bezbarwny do bladazóltawo-bra- zowego Grzybnia powietrzna: dobra, aksamitna, biala do Pale 01ive Gray (Rdg. LI, 23" "-f) lub Light OQiive Gray (Rdg. LI, 23" "-d) z czarnymi plamami Grzybnia podstawowa: Smoke Gray (Rdg. XLVI, 21" "-d) 809313 80931 4 Pigment rozpuszczalny: brak Podloze agarowe Czapka z glukoza Wzrost: umiarkowany, bezbarwny Grzybnia powietrzna: umiarkowana, biala do Pa¬ le Drab Gray (Rdg. XLVI, 17" "-f) Grzybnia podstawowa: bezbarwna do Pale Drab Gray (Rdg. XLVI, 17" "-f) Pigment rozpuszczalny: Pale Vinaceous-Fawn (Rdg. XL, 13" "-f) Podloze agarowe Czapka z gliceryna Wzrost: umiarkowany, bezbarwny Grzybnia jiowietrzna: umiarkowana, w postaci proszku, biala do Pale Drab Gray (Rdg. XLVI, lrAtttddMftdrabwv|a: Cream Golor (Rdg. XVI, 19'-f itgment rozpuszczali^: brak Poalóflg 'UJ8TOwe!^uKp|0-asparaginowe ^TinhA^iBiiiLrnnrnTrjy bezbarwny do bladozóltego Grzybnia powietrzna: umiarkowana, biala do sza- rawo-brazowej z czarnymi plamami Grzybnia podstawowa: Cream Color, (Rdg. XVI, 19'-f) do Smoke Gray (Rdg. XLVI, 21" "-d) Pigment rozpuszczalny: brak lub bladozóltawo- -brazowy Podloze agarowe odzywcze Wzrost: umiarkowany, rozprzestrzeniajacy sie, bezbarwny do slabo zóltego Grzybnia powietrzna: umiarkowana, biala Grzybnia podstawowa: Cream Color (Rdg. XVI, 19'-f) Pigment rozpuszczalny: slabo zólty Bulion odzywczy Wzrost: slaby do umiarkowanego, bezbarwny, opadajacy na dno Grzybnia powietrzna: brak Grzybnia podstawowa: brak Podloze agarowe odzywcze z gliceryna Wzrost: dobry, pomarszczony, bezbarwny do sla¬ bo zóltego Grzybnia powietrzna: dobra, biala Grzybnia podstawowa: Cream Buff (Rdg. XXX, 19'-f) Pigment rozpuszczalny: zólty do zloto-zóltego Podloze agarowe odzywcze z glukoza Wzrost: dobry, pomarszczony, bezbarwny do sla¬ bo zóltego Grzybnia powietrzna: dobra, biala do Pallid Mo¬ use Gray (Rdg. LI, 15" "'-f) Grzybnia podstawowa: Sorghum Brown (Rdg.XXXIX, 19" "-i) Pigment rozpuszczalny: Fawn Color (Rdg. XL, 13"") Podloze agarowe ze skrobia Wzrost: slaby, bezbarwny Grzybnia powietrzna: brak lub slaba, biala Grzybnia podstawowa: bladozólta Pigment rozpuszczalny: brak Podloze agarowe z ekstraktem drozdzowym Wzrost: dobry, pomarszczony, bezbarwny do sla¬ bo zóltego Grzybnia powietrzna: dobra, biala Grzybnia podstawowa: Cream Buff (Rdg. XXX, 190-d) Pigment rozpuszczalny: zólty do zloto-zóltego Podloze z jajkiem (hodowla w temperaturze 37°C) Wzrost: umiarkowany, rozprzestrzeniajacy sie Grzybnia powietrzna: umiarkowana o wygladzie proszku, biala 5 Pigment rozpuszczalny: brak Slupek kartofla Wzrost: dobry, zmarszczony, wzniesiony, blado- brazowy Grzybnia powietrzna: slaba, biala do Pallid Mo- io use Gray (Rdg. LI, 15" "'-f) Pigment rozpuszczalny: brak Slupek marchwi Wzrost: dobry, zmarszczony Grzybnia powietrzna: umiarkowana, biala 15 Pigment rozpuszczalny: brak Mleko lakmusowe (hodowla w temperaturze 37°C) Wzrost: w ksztalcie pierscienia, pózniej opadaja¬ cy na dól Grzybnia powietrzna: brak 20 Peptonizuje, nie kioaiguluje Surowica Lófflera (hodowla w temperaturze 37°C) Wzrost: umiarkowany, blyszczacy, bezbarwny Grzybnia powietrzna: brak lub slaba, biala Pigment rozpuszczalny: brak 25 Nie uplynnia Slupek zelatyny (hodowla w temperaturze 24°C po 25 dniach) Wzrost: slaby, ograniczony, bladozólty Grzybnia powietrzna: slaba, biala 30 Nie uplynnia Podloze celulozowe Brak wzrostu Podloze agarowe z maleinianem wapnia Wzrost: umiarkowany, bezbarwny 35 Grzybnia powietrzna: umiarkowana, o wygladzie proszku, biala Grzybnia podstawowa: Buff Pink (Rdg. XXVIII, ll"-d) Pigment rozpuszczalny: Vinaceous, Cinnamon 40 (Rdg. XXIX, 13"-b) Podloze agarowe z tyrosyna Wzrost: umiarkowany, bezbarwny Grzybnia powietrzna: slaba, biala do Light Drab {Rdg.. XLVI, 17" "-b) 45 Grzybnia podstawowa: Drab Gray (Rdg. XLVI, 17" "-d) do Light Drab (Rdg. XLVI, 17" "-b) Pigment rozpuszczalny: brak Podloze agarowe z peptonem Wzrost: slaby, bezbarwny 50 Grzybnia powietrzna: slaba, biala Grzybnia podstawowa: bezbarwna Pigment rozpuszczalny: brak Redukcja azotanów Redukuje azotany na bulionie Czapka oraz na 55 podlozu z peptonem Hydroliza skrobi Strefa wzrostu: 8 do 10 mm Strefa enzymatyczna: 27 do 30 mm.Szczep hodowany na pozywce syntetycznej po- 60 siada grzybnie wegetatywna bezbarwna lub kolo¬ ru bladozóltego do bladobrazowego oraz odzna¬ czax sie brakiem rozpuszczalnego pigmentu, który gdy ewentualnie pojawia sie, posiada zabarwienie Pale Vinaceous-Fawn (Rdg. XL, 13'^-f) lub blado- 63 purpurowe dio bladozóltawo-brazowego.5 80931 6 Grzybnia powietrzna jest najpierw biala, pózniej zabarwia sie na kolor Pale Glive Gray (Rdg.- LJ, 23"'"-d) do Pale Drab Gray (Rdg. XLVI, 17" "-f), lub tez, w pewnych przypadkach przechodzi w ko¬ lor czarny. Szczep hodowany na podlozu zawiera¬ jacym bialko jest bezbarwny lub zólty do Fawn Color (Rdg XL, 13"'), lecz nie tworzy pigmentu typu melanoidowego, przy czym szczep ten nie jest chromogenny.Obserwacji wykorzystywania zródel wegla do¬ konano zgodnie z metoda Pridhama i Gottlieba (journal of Bacteriology, tom 59, str. 107, 1948) i wyniki podano w tablicy 1. Czas inkubacji ho¬ dowli — 10 dni w temperaturze 28°C.Tablica 1 Zródlo wegla Erytrytol Adonitol D-Sorbitol i-Inozytol D-Mannitol Dulcytoi D-Ksyloza L-Arabinoza L-Sorboza D-Galaktoza D-Glukoza D-Fruktoza Ramnoza Melibioza Wzrost + + + + + + + + + + + + ± + + ± + + + + + + + + + ± + + + Zródlo wegla Maltoza Sacharoza Laktoza Rafinoza Trehaioza Salicyna Eskulina Inulina D-Mannoza Skrobia Gliceryna Octan sodu Bursztynian sodu Brak (Próba kontrolna) Wzrost + + + + + + + + + + + + + + — | — ± lub + ++ + + + + + + + + + + Objasnienia: + + + wzrost bardzo dobry (obfity) + + wzrost dobry + wzrost umiarkowany ± wzrost slaby — brak wzrostu Obserwacje tego szczepu dokonano metoda kres¬ kowa na podlozu agarowym (Mótoo Shflbata: An- nual Reports of the Takeda Research Laboratories, tom 20, str. 222 i dalsze, 1956), stosujac Bacillus subtilis jako testowy drobnoustrój, na podlozu z agarem odzywczym, sugeruja, ze szczep B-5050 wytwarza fizjologicznie zasadowy antybiotyk. Wy¬ niki prób podano w tablicy 3.Porównujac wlasnosci morfologiczne, hodowlane i fizjologiczne szczepu B-5050 ze znanymi drobno¬ ustrojami, cytowanymi przez S. A. Waksmana w "The Actinomycetes" tom 2, wydanie The Wiliams 5 and Wilkins Co. z roku 1961, nalezy zaznaczyc, ze szczep ten w wiekszosci cech zblizony jest do Streptomyces hygroscopicus, z tym wyjatkiem jed¬ nak, ze miedzy innymi posiada zdolnosc wytwa¬ rzania rozpuszczalnego pigmentu na podlozu syn¬ tetycznym, rozklada celuloze, redukuje azotany. Na podstawie tych obserwacji szczep B-5050 zalicza sie do Streptomyces hygroscopicus. Próbke szczepu zdeponowano w Institute for Fermantation, Osaka, Japonia pod numerem rejestracyjnym IFO-12995.A wiec szczep omawiany w niniejszym opisie od¬ nosi sie do szczepu "Streptomyces hygroscopicus B-5050" lub prosciej okresla sie jako „szczep B-5050". "Streptomyces hygrosoopiieus IFO-12995" oznacza próbke tego szczepu.Widma przeciwbakteryjne szczepu B-5050 poda¬ no w tablicy 2. Otrzymane wyniki odnosza sie do szczepu naniesionego metoda kreskowa na podlo¬ ze z agarem odzywczym wartosci pH=7,0 lub na podloze z agarem odzywczym i gliceryna o warto¬ sci pH=7,0. Hodowle inkubowano w temperaturze 28°C przez 4 dni. Drobnoustroje testowe podane w tablicy 2 doszczepiono do drobnoustroju nanie¬ sionego metoda kreskowa, ponownie inkubowano w temperaturze 37°C przez 18 godzin w przypadku zwyklych bakterii lub przez 40 godzin w przypadku bakterii kwasoodpornych i mierzono dlugosc strefy zahamowania. Jak wynika z tablicy szczep B-5050 silnie hamuje wzrost bakterii gramdodatnich, jak równiez hamuje wzrost Mycoba Tablica 3 Drobnoustrój testowy Bacillus subtilis pH testowego podloza 6 8 Dlugosc strefy hamowania (mm) 15 15 23 23 Tablica 2 Drobnoustrój testowy Escherichia coli Proteus vulgaris Staphyloccoccus aureus (Xx) Bacillus substilis Bacillus cereus Bacillus brevis Sarcina lutea Micrococcus flavus Mycobacterium avium Dlugosc strefy hamowania (mm) Agar odzywczy 0 0 0 0 30 32 0 0 40 40 26 30 31 23 35 39 34 36 Agar odzywczy z gliceryna 0 0 0 0 29 30 29 28 27 2*7 34" 35 34 36 20 23 Objasnienia: (X!): szczep oporny na Oileandomycyne i erytromycyne —: nie badano 20 25 30 35 c 607 80931 8 Zgodnie z niniejszym wynalazkiem drobnoustrój wytwarzajacy antybiotyk B-5060, nalezacy do ro¬ dzaju Streptomyces, szczep B-5060-IFO12995 ho¬ duje sie na podlozu, zawierajacym przyswajalne zródlo wegla, azotu OTaz inne substancje odzyw¬ cze. Podloze moze byc plyimne lub stale, chociaz plynne jest bardziej korzystne. Pozywka zawiera jedno lub wiecej zródel przyswajalnego wegla, takie jak glukoza, sacharoza, maltoza, dekstryna, gliceryna, syrop skrobiowy i inne. Zródlami przy¬ swajalnego azotu sa pepton, maka sojowa, namok kukurydziany, wyciagi miesne, otreby ryzowe, otreby pszenne, mocznik, rózne sole amonowe (na przyklad NH^Cl, NHJNOz, (NHdrfSO*) i inne. Ko¬ rzystne jest stosowanie niewielkich ilosci soli nie¬ organicznych takich, jak chlorek sodowy, fosfo¬ rany lub szczególnie sole wapnia, magnezu, cynku, manganu, zelaza i innych. Ponadto dodawac mozna substancje stymulujace wzrost oraz srodki prze- ciwpienne takie, jak tluszcze, oleje naturalne lub olej mineralny.Szczep wytwarzajacy antybiotyk B-5O50 czesto wytwarza równiez inne antybiotyki. W produkcji antybiotyku B-5050 korzystne jest dokonanie se¬ lekcji szczepu i dobór odpowiedniego podloza ho¬ dowlanego. I tak, na przyklad stosujac szczep B-5050 korzystne jest podloze zawierajace od 3 do 5% zródla wegla i od 1 do 2°/o zródla azotu or¬ ganicznego.Hodowle szczepu mozna przeprowadzic stacjo¬ narnie, choc korzystniejsza jest hodowla podpo- wierzchniowa z równoczesnym mieszaniem i napo¬ wietrzaniem. W tym ostatnim przypadku korzystne jest, gdy wartosc pH podloza wynosi od 6 do 8, korzystnie od 6,8 do 7,4, zas temperatura, w której prowadzi sie hodowle wynosi od 20°C do 43°C, ko¬ rzystnie od 23° do 32°C.Otrzymana w ten sposób brzeczka zawiera kom¬ ponenty antybiotyku B-5050, które mozna wyizo¬ lowac wykorzystujac odpowiednie sposoby uprzed¬ nio juz stosowane do wydzielania z brzeczki fer¬ mentacyjnej metaboliftów tego drobnoustroju.Ze wzgledu na to, ze antybiotyki te sa substan¬ cjami slabo zasadowymi i rozpuszczalnymi w tluszczach, mozna je rozdzielac sposobami wyko¬ rzystujacymi powyzsze wlasciwosci.Poniewaz antybiotyk B-5050 nagromadza sie glównie w fazie plynnej brzeczki, to najpierw usu¬ wa sie z nliej grzybnie, a z przesaczu ekstrahuje sie aktywne zwiazki przy slabo zasadowym pH, za pomoca nie mieszajacego si$ z woda organicznego rozpuszczalnika. Na przyklad przesacz doprowadza sie do wartosci pH = 7^10 i ekstrahuje organicz¬ nym rozpuszczalnikiem niiie mieszajacym sie lulb tez nie calkowicie mieszajacym sie z woda, takim, jak nizsze estry kwasów tluszczowych, np. octan etylu, octan n-butylu; chlorowane alifatyczne we¬ glowodory, na przyklad chloroform, chlorek ety¬ lenu, ketony, na przyklad keton metyloetylowy i keton metyloizobutylowy; aromatyczne weglowo¬ dory, na przyklad benzen, toluen; alkohole, na przyklad n-butanol i inne lub ekstrahuje sie mie¬ szanina dwu lub wiecej rozpuszczalników. Znaj¬ dujaca sie w grzybni pewna ilosc antybiotyków mozna ekstrahowac rozpuszczalnym w wodzie or¬ ganicznym rozpuszczalnikiem, takim jak aceton lub metanol lub tez rozcienczonym wodnym roz¬ tworem kwasu. Tak otrzymane organiczne wyciagi saczy sie, zageszcza w prózni i ekstrahuje czynne komponenty organicznym rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda. Natomiast wyciagi z wod¬ nego roztworu kwasu poddaje sie najpierw sa¬ czeniu, nastepnie doprowadza do pH obojetnego lub slabo zasadowego i ekstrahuje sie organicznym rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda.Aktywne komponenty z brzeczki fermentacyjnej mozna adsorbowac na weglu aktywnym, bialym weglu (lub koloidalnych krzemionkach) i innych.Zaadsorbowane czynne zwiazki mozna nastepnie eluowac odpowiednimi rozpuszczalnikami, takimi jak uwodnione alkohole, na przyklad metanol, eta¬ nol; uwodniony aceton, mieszaninami tych roz¬ puszczalników z dodatkiem kwasu, a takze orga¬ nicznymi rozpuszczalnikami, jak na przyklad octan etylu, chloroform i inne.Biorac pod uwage zasadowe wlasnosci antybio¬ tyku B-5050, aktywne zwiazki mozna adsorbowac na kationowych wymieniaczach jonowych, takich jak „Amiberlite IRC-50", „Amberlite IR-120" (pro¬ dukcji Rohm and Haas Co., Stany Zjednoczone Ameryki) lub tez „Dowex 50" (produkcji Dow Che¬ mical, Stany Zjednoczone Ameryki). Adsorbowa- ne na tego rodzaju zywicach czynne zwiazki mozna nastepnie eluowac odpowiednimi rozpuszczalnikami takimi, jak rozcienczony wodny roztwór kwasu lub zasady, wodno-metanolowy roztwór kwasu lub zasady, ewentualnie wodno-acetonowym roztwo¬ rem kwasu lub zaisady, lub tez innymi.Otrzymany organiczny wyciag przenosi sie do wodnego roztworu kwasu, korzystnie po uprzed¬ nim przemyciu woda, sluzacy do tego celu kwasny roztwór moze byc rozcienczonym wodnym roztwo¬ rem kwasu lub tez kwasnym roztworem buforo¬ wym. Nastepnie otrzymany wodny wyciag dopro¬ wadza sie do pH obojetnego lub slabo zasadowego, ponownie ekstrahuje nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem organicznym, jak podano wyzej.Gdy zawartosc czynnych zwiazków w wyciagu organicznym jest stosunkowo duza, antybiotyk B-5050 moze samorzutnie wykrystalizowac po za¬ geszczeniu wyciagu w prózni. W przeciwnym razie do zageszczonego wyciagu dodaje sie niepolarnego organicznego rozpuszczalnika, takiego jak eter naf¬ towy lub n-heksan, co powoduje wydzielenie su¬ rowego antybiotyku B-5050. Sproszkowany pro¬ dukt mozna przekrystalizowac z organicznego roz¬ puszczalnika takiego jak benzen, eter dwuetylowy, octan etylu lub z mieszaniny octanu i n-heksanu, acetonu i n-heksanu, acetonu i wody lub etanolu i wody.Jezeli surowy proszek posiada pewne barwne zanieczyszczenia, mozna je usunac. stosujac wegiel aktywny.W szczególnym przypadku, gdy antybiotyk B-5060 nie zostal otrzymany w wyzej podany sposób w stanie krystalicznym moze byc przeprowadzone dallsze (oczyszczanie na adsorbentach takich, jak zel krzemionkowy lub tlenek glinu. Zaadsorbowane zwiazki mozna eluowac estrami kwasów tluszczo¬ wych, na przyklad octanem metylu, etylu lub n- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6080931 9 10 -butylu, mieszanina rozpuszczalników, na przyklad benzenem i acetonem, benzenem i octanem etylu, benzenem i metanolem, chloroformem i metanolem lub innymi.Antybiotyk B-5050 oraz jego odpowiednie kom¬ ponenty sa substancjami zasadowymi i moga two¬ rzyc odpowiednie sole, na przyklad chlorowodorki, siarczany, winiany, nikotyniany i inne.Ponizej podano ogólne wlasnosci antybiotyku B-5050, otrzymanego sposobem wedlug przykladu VII, zaznaczajac, ze moga sie one nieco róznic od wlasnosci tegoz antybiotyku, otrzymanego sposo¬ bami podanymi w innych przykladach.Temperatura topnienia: 137° do 141°C.Analiza elementarna: po rekrystalizacji z benzenu: C-58,14±0,5°/o, H-7,88±0,3*/o, N-l,73±0,3°/o po rekrystalizacji z octanu etylu: C-57,83±0,5%, H-8,14±0,3°/o, N-l,33±03°/o Ciezar czasteczkowy otrzymany przez pomiar prez¬ nosci pary w osmometrze 88O±90 (w octanie etylu).Skrecalnosc wlasciwa: (a)£4 : —76,4°±8° (c = 1, w etanolu) Reakcje barwne: reakcja Dragendorffa: dodatnia; test na erytromycyne: dodatni, zabarwienie czer- wono-purpurowe podczas, gdy warstwa chloro¬ formowa jest bladonliebieska test na karbomycyne: ujemny Rozpuszczalnosci: latwo rozpuszczalny w metanolu, etanolu, acetonie, octanie etylu, ketonie metylo- woetylowym, chloroformie lub wodnym roztwo¬ rze kwasu; rozpuszczalny w benzenie lub eterze dwuetylowym; trudno rozpuszczalny w n-heksa- nie lub w wodzie.Widma w nadfiolecie: brak charakterystycznego maksimum w metanolu.Widma w podczerwieni: jak pokazano na rysunku fig. 1 (w KBr), a glówne pasma absorpcji w cm—1 sa nastepujace: 3448(s), 2924(ni), 1730(s), 1453(m), 1376(m), 1295(m), 1239(m), 1167(is), 1081(s), 1050(s), 968(m), 912 801(w), 840((w).Uwaga: skróty w nawiasach „vs", „s", „m", „sn", „w" oznaczaja odpowiednio „bardzo silne", „silne", „umiarkowane", „przegiecie" i „slabe". To samo odnosi sie do podanego ponizej opisu widm w pod¬ czerwieni.Jak wspomniano na wstepie omawiany antybio¬ tyk sklada sie z szeregu komponentów, wsród któ¬ rych poznano przynajmniej szesc i sa one zblizone pod wzgledem wlasnosci chemicznych i biologicz¬ nych co zostalo potwierdzone metoda chromato¬ grafii bibulowej lub cienkowarstwowej. Ponizsze dane stanowia przyklady odpowiednich zwiazków.Chromatografia bibulowa Bibula: Toyoroshi nr 50 impregnowana 2% roztwo¬ rem plynnej parafiny w ligroinie.Faza rozwijajaca: 1/15 M roztwór buforu fosfora¬ nowego o wartosci pH = 8,0 wysycony octanem n-butylu.Wykrywanie plam: za pomoca Bacillus subttilis jako drobnoustroju testowego.Wartosci Rf: B-5050-A = 0,32 + 0,06 B-5O50-B = 0,38 ± 0,06 B-5060-C = 0,66 ± 0,05 B-5050-D = 0,72 ± 0,05 B-5060-E = 0,74 ± 0,06 B-5050-F = 0,82 ± 0,05 Chromatografia cienkowarstwowa Warstwa nosna: a) zel krzemionkowy („Spotfilm f" 5 produkcji Tokyo Kasei K. K.Japonia) uprzednio ogrzewany w temperaturze 106°C w cia¬ gu 1 godziny, b) zel krzemionkowy („Kieselgel G" io produkcji Merck A.G., Darm¬ stadt, RFN), c) jak w punkcie b).Faza rozwijajaca: a) mieszanina benzenu i acetonu <3 : 2 objetosciowo), 15 b) mieszanina benzenu i metano¬ lu (10:1 objetosciowo) lecz rozwijanie powtarzano trzy¬ krotnie.Wykrywanie plam: a) stezony kwas siarkowy roz¬ pylany, b) i c) postepowanie jak poni¬ zej 1. 5*/t roztworem molibdenianu fosforu w etanolu spryski¬ wano plytke, po czym su¬ szono w temperaiturze 110QC przez 5 minut; 2. 5f/§ roztworem siarczanu ce¬ ru win kwasie siarkowym spryskiwano plytke i suiszo- no w (temperaturze 110°C przez 5 minut; 3. lOtyo roztworem wodnym kwasu siarkowego spryski¬ wano plytke i suszono w temperaturze 110°C przez 5 mlinirt; 4. stezonym kwasem siarko¬ wymi lub 5% rozworem jodu w chloroformie. 20 23 35 40 45 50 55 60 Wartosci Rf: B-6050-A B-5060-B B-506O-C B-5060-D B-5050-E B-5060-F (a) 0,48 ± 0,06 0,42 ± 0,05 0,37 ± 0,05 0,32 ± 0,05 0,30 ± 0,05 0,27 ± 0,06 * 0,68 ± 0,05 0,03 ± 0,05 0,57 ± 0,05 0,53 ± 0,05 0,50 ± 0,06 0,43 ± 0,06 ¦ 0,71 ± 0,05 0,66 ± 0,05 0,61 ±0,05 0,55 ±0,06 0,52 ±0,06 | 0,48 ±0,06 W celu wyizolowania lub rozdzielenia powyz¬ szych komponentów na skale przemyslowa, zaleca sie stosowanie chromatografii adsorpcyjnej lub rozdzielczej, ewentualnie rozdzial przeciwpradowy.Ocfcowiedin&m adsorbentem dla chromatografii ad¬ sorpcyjnej jest zel krzemionkowy lub tlenek glinu.Jezeli stosuje sie zel krzemionkowy to eluaeje przeprowadza sie mieszanina niepolarnego i polar¬ nego rozpuszczalnika órgainlicznego tak, aby odpo¬ wiednie komponenty byly eluowane kolejno, w za¬ leznosci od powinowactwa, do niepolarnego roz¬ puszczalnika, to jest antybiotyków B-505O-A, -B -C, -D, -E, -F. Odpowiednim mieszanym rozpusz¬ czalnikiem jako eluentem moga byc mieszaniny11 80931 12 benzenu i octanu etylu, benzenu i acetonu, n- -heksanu i metanolu oraz chloroformu i metanolu.W celu wykorzystania róznic we wspólczynniku miedzy dwie plynne fazy, mozna stosowac kom¬ binacje organicznego rozpuszczalnika lipofilnego, na przyklad octanu etylu oraz wodnego roztworu buforowego. Jezeli stosuje sie roztwór buforowy o wartosci pH = 5,5, to antybiotyki B-50i50-D, -E, -F, moga byc przeprowadzone do tego buforu, na¬ tomiast antybiotyki B-5050-A, -B, -C, pozostaja w fazie organicznej. Antybiotyk B-5050-C moze byc ekstrahowany z fazy organicznej za pomoca roztworu buforowego o wartosci pH = 4,9, nato¬ miast roztworem buforowym o wartosci pH = 4,4 mozna ekstrahowac antybiotyk B-5060-B oraz -C, zas antybiotyk B-506O-A pozostaje w fazie orga¬ nicznej. W ten sposób odpowiednie komponenty moga byc ostatecznie wyizolowane.Nastepnie odpowiednim sposobem izolowania wy¬ mienionych komponentów jest chromatografia roz¬ dzielcza. W metodzie tej nosnikiem fazy stacjonar¬ nej moga byc sproszkowana celuloza lub ziemia okrzemkowa (na przyklad „Gelite" lub „Hyfle Su¬ per Cel", produkowane przez Johns Manville Sa- les Corp., Stany Zjednoczone Ameryki).Komponenty antybiotyku B-5050 posiadaja na¬ stepujace wlasnosci fizyko-chemiczne.Temperatura topnienia (z rozkladem): pomiary wykonano na próbkach rekrystalizowanych z mie¬ szaniny acetonu i n-hefcsanu (1:3 objetosciowo): B-50SO-A : 129° do 132°C B-5050-B : 134° do 136°C B-506O-C : 135° do 138°C B-506O-D : 143° do 146°C B-505O-E : 144° do 149°C B-505O-F : 149° do 154°C Analiza elementarna: B-505O-A: C-59,4O±0,5«/i, H-8,15±0,3°/o, N-l,40±0,3*/o B-5050-B: C-58,67±1, B-5O50M:: C-57,93±l,0«/o, H-8,18±0,5«/o, N-l,69±0,50/o B^505fl-D: C-57,48±l, B-505O-E: C-57,34±l,0*/o, H-8,25±0,5°/o, N-l,34±0,5°/o B-5050-F: C-58,59±0,5°/o, H-7,82±0^/o, N-1,62±0,3% Ciezar czasteczkowy: wszystkie komponenty po¬ siadaja ciezar czasteczkowy w granicach od 800 do 900 zmierzony na drodze pomiaru preznosci pary w osmometrze.Skrecalnósc wlasciwa: B-5050-A : (a)£3 : — 72,3° ± 7° (c = 1, w etanolu) B : (a)^3 : — 71,9° ± 7° (c = 1, w etanolu) ' C : (a)£ : — 76,0° ±8° (c = 1, w etanolu) D: (a)** : — 76,2° ± 8° (c = 1, w etanolu) E : (a) 23 : _ 73,6° ± 7° (c = 1, w etanolu) F: (a) 23 : _ 77,7° ± 8° (c = 1, w etanolu) Reakcje barwne: wszystkie komponenty daja re¬ akcje dodatnia z odczynnikiem Dragendorffa oraz na test erytromycynowy, zas ujemna na test kar- bomycynowy.Rozpuszczalnosc: wszystkie komponenty sa roz¬ puszczalne w metanolu, etanolu, acetonie, ketonie 5 metylowoetylowym, octanie etylu, benzenie, ete¬ rze, chloroformie lub wodnym roztworze kwasu, lecz slabo rozpuszczalne w n-heksanie i wodzie.Widmo w nadfiolecie: wszystkie komponenty nie posiadaja charakteryistycanego maksimum absorp- !0 cji.Widmo w podczerwieni: (w KBr): antybiotyk B-5050-A, jak pokazano na rysunku fig. 2, glówne zas pasma absorpcji w cm-1 sa na¬ stepujace: 15 3448(m), 2941(m), 1739(s), 1458(w), 1374(m), 1294 1188(s), 1167i(s), 1120(in), 1086(s), 1053{s), 1033 971'(m), 917(w), 862 antybiotyk B-5050-B, jak pokazano na rysunku fig. 3, zas glówne pasma absorpcji w om—1 sa na- 20 stepujace: 350Ói(s), 2990 1296 1052i(vs), 1025(vs), 968(m), 916(w), 858i(w), 842{w), antybiotyk B-5050-C, j'ak pokazano na rysunku 25 fig. 4, zas glówne pasma absorpcji w cm-1 sa na¬ stepujace: 3460{s), 2980(s), 2940(s), 1735(vs), 1455(m), 1375(s), 1357i(s), 1295{s), 1270i(s), 1240(m), 1180(sh), 1162(vs), 1080(vs), 10»50(vs), 1028(sh), 1018 30 862 antybiotyk B-5050-D, jak pokazano na rysunku fig. 5, zas glówne pasma absorpcji w cm-1 sa na¬ stepujace: 3440(s), 2946(m), 1735(vs), 1450(m), 1373(m), 1357 35 1296(m), 1274(m), 1237(,s), 1163(s), 1127(m), 1080(s), 1047(vs), 1031(sh), 1012(sh), 972(m), 913(m), 862(w), 843(w), antybiotyk B-5050-E, jak pokazano na rysunku fig. 6, a glówne pasma aosorbcji w cm—1 sa na- 40 stepujace: 3430 1296(,m), 1239(s), 1163(s), 1127(m), 1084(s), 1048(vs), 1032(sh), lOll(sh), 970(m), 914(m), 862'(w), 840(w), antybiotyk B-5050-F, jak pokazano na rysunku 45 fig. 7, a znamienne pasma absorpcji w cm-1 sa nastepujace: 3425(s), 2994(m), 1745(s), 1730{s), 1460 1362(m), 13O0(.m), 1242(m), 1166(s), 1133(ni), 1089(m), 1053(s), 1031(m), 973(w), 919(w), 864(w). 50 Widma przeciiwbakiteryjne antybiotyku B-5050 oraz jego komponentów podano w tablicy 4, przy czym dla dokonania tych pomiarów bakterie ho¬ dowane byly na podlozu z agarem odzywczym, na¬ tomiast gatunki Mycobacterium hodowano na po¬ dlozu agarowym z gliceryna, zas drozdze i inne grzyby hodowano na podlozu agarowym z glukoza.Tablica 4 Najmniejsze stezenie hamujace (mcg/ml) Drobnoustrój testowy Baoillus subfciliis Batflluis cereus Antybiotyk B-5050 | Mieszanina 0,5 1 A | B 0,2 0,5 0,2 0,5 | C | D 0,5 1 1 2 E 2 5 F 1 2 5 |80931 13 14 Drobnoustrój testowy Badllus brevtis Bacillus magaterium Staphylococcus aureus Staphyloccoccus aureus X1 Staphyloococcus aureus xf Sarcina lutea Microccocus flavus Serratia marcescens Escherichia coli Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium avium Mycobacterium avium xS Mycobacterium aviumx4 Mycobacterium smegmaitns Mycobacterium phlei Mycobacterium 60T7 Candida albicans Saccharomyces 1 cerevisiae Penicillium chrysogenum Aspergillus niger Trichophyton | mentagrophytes *¦ cd. tabeli 4 1 Antybiotyk B-5050 Mieszanina 0,5 1 1 50 50 0,2 0,2 100 100 100 100 50 50 50 50 50 50 ioo 100 ioo ioo 100 1 A 0,2 1 0,5 0,5 20 20 0,1 0,1 100 100 ioo ioo 50 • 50 50 50 50 50 — | 1 B 0,2 0,5 0,5 20 20 0,1 0,1 10iO ioo ioo ioo 100 100 100 100 100 100 — | c 0,5 0,5 1 50 50 0,5 0,2 100 100 100 ioo ioo ioo ioo ioo ioo 100 — 1 1 D 5 ¦ 1 2 100 100 0,5 0,5 ioo 100 100 100 100 100 100 100 100 100 — 1 E 10 2 5 ioo 100 0,5 0,5 100 ioo ioo 100 ioo ioo 100 ioo ioo ioo — 1 F 10 2 5 100 100 0,5 0,5 100 100 100 100 100 100 100 100 100 ioo - 1 Objasnienia: xi — szczep oporny na oleandomycyne l erytromycyne x2 — szczep oporny na streptomycyne, chloramfenikol, tetracykldine, olea«ndomy- cyine i eryitromycyne x, — szczep oporny na. dekstromycyne — nde oznaczane Antybiotyk B-5O50 nalezy uznac za nalezacy do grupy antybiotyków makrolidowych ze wzgledu na jego wlasnosci, takie jak barwne reakcje (na przyklad test erytromycynowy), rozpuszczalnosci (na przyklad lipofilny i zasadowy), widma w pod¬ czerwieni (na przyklad wartosci Vc-0 lub Vc-0-), widma przeciwbakteryjne, na przyklad róznice w najmniejszym stezeniu hamujacym miedzy szcze¬ pem opornym na erytromycyne i oleandomycyne, a szczepem Staphylococcus aureus i inne.Sposród antybiotyków makrolidowych antyldLo- tyk B-505O wyróznia sfte tym, ze posfiada makstLmum absorpcji przy dlugosciach fal 225, 230, 240 lub 280—290 mu Erytromycyna i oleandomycyna maja stosunkowo slabe maksimum absorpcji w grani¬ cach 280—290 mjA, lecz róznia sie od antybiotyku B-5050 widmami absorpcji w podczerwieni, cieza¬ rem czasteczkowym, temperatura topnienia i in¬ nym.Znane sa antybiotyki makrolidowe karbomycy- na, relomycyna, tylocyna, które sa wytwarzane przez Streptomyces hygroscopicus, jednak ich mak¬ simum absorpcji znajduje sie odpowiednio przy dlugosci fali 238, 282 i 289 mu i wyraznie róznia sie od antybiotyku B-5050. Z powyzszego wynika, ze antybiotyk B-5050 stanowi nowa grupe, jak równiez jest nowym kazdy z jego komponentów.Ponizsze przyklady wyjasniaja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Do 2 kolb Sakaguchi o pojem¬ nosci 2000 ml wprowadza sie po 500 ml pozywki posiewowej I stadium o pH = 7,0 zawierajacej 2*/o glukozy, 3% rozpuszczalnej skrobia, !•/• maki 35 40 55 60 sojowej, l§/o namoku kukurydzianego, 0,5§/« „Po- lypepton" (nazwa fabryczna hydrolizatu kazeiny, produkcji firmy Daigo Nutritive Chemicals, TJtd., Osaka, Japonia), 0,3*/o chlorku sodowego, 0i3°/t we¬ glanu wapnia oraz wode. Calosc poddaje sie wy¬ jalowieniu, po czym zaszczepia sie pozywke szcze* pem Streptomyces hygrosoopdcus IFO-12995, po¬ branym ze skosu agarowego, na którym bjrl on hodowany co najmniej przez 4 dni i inkubowarijr w temperaturze 28°C. Naczynia z zaszczepiona po¬ zywka poddaje sie wytracaniu przy 115 obrotach/ /minute i skoku 10 cm w ciagu 48 godzin i w tem¬ peraturze 28°C. W rezultacie otrzymuje sie okolo 10O0 ml brzeczki, która jest nastepnie uzyta jako hodowla posiewowa I stadium.Hodowle te wprowadza sie do okolo 1001 po¬ zywki hodowlanej o wartosci pH = 7,0* uprzednio wyjalowionej i znajdujacej sie w tanku ze stali nierdzewnej o pojemnosci 200 1. Pozywka hodo¬ wlana ma sklad nastepujacy: 3,0*/o glukozy, 0,5Vo namoku kukurydzanego, l,0§/o odtluszcznej maki sojowej, 0,5°/« chlorku sodowego, 0,5V« siarczanu magnezu, 0,#/o weglanu wapnia oraz wode. Ho¬ dowle prowadzi sie w ciagu 24 godzin w tempera¬ turze 28°C wprowadzajac powieftrze w ilosci 100 1 na minute i wytrzasajac przy 200 obrotach/minute Do tanku ze stali nierdzewnej o pojemnosci 2000 1, zawierajacym 1000 1 wyjalowionej pozywki hodowlanej, o tym samym skladzie co poprzednio wspomniana pozywka hodowlana, przenosi sie 1Ó0 1 otrzymanej powyzej hodowli posiewowej II sta¬ dium. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 66 go¬ dzin w temperaturze 28°C, wprowadzajac 1000 180931 15 16 powietrza na minute z równoczesnym mieszaniem przy 120 obrotach/minute. W trakcie inkubacji do- , daje sie srodek przeciwpienny „Aotocol" (produkcji Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia) w ilosci okolo 0,05% w stosunku do ilosci pozywki.Otrzymana brzeczka fermentacyjna posiada dzia¬ lanie przeciwbakteryjne rzedu 350 jednostek roz- cienczeniowych w stosunku do Bacillus substilis drobnoustroju testowego.Brzeczke saczy sie i otrzymuje 950 1 przesaczu, który doprowadza sie do wartosci pH = 8,5 za pomoca 2 n wodnego roztworu NaOH, po czym ekstrahuje octanem etylu w ilosci 300 1. Oddzielo¬ na warstwe octanu etylu przemywa sie woda i ekstrahuje dwukrotnie po 70 1 0,005 n kwasem solnym. Polaczone wodne wyciagi doprowadza sie do wartosci pH = 8,5 rozcienczonym wodnym roz¬ tworem amoniaku i ponownie ekstrahuje dwukrot¬ nie iloscia po 45 1 octanu etylu. Polaczone wyciagi przemywa sie woda, odwadnia, zageszcza w próz¬ ni do objetosci 50 ml, dodaje 750 ml n-heksanu, otrzymujac 95 g surowego antybiotyku B-5050 mie¬ szaniny w postaci proszku. Produkt ten rozpusz¬ cza sie w 450 ml benzenu w trakcie ogrzewania.Nastepnie dodaje sie 2 g wegla aktywnego, ogrze¬ wa, saczy, przesacz oziebia, otrzymujac 19 g mde- szanliny antybiotyku B-5050 w postaci bezbarwnych igiel. 10 g krystalicznego antybiotyku B-5050 miesza¬ niny rozpuszcza sie w 50 ml octanu etylu i podaje na kolumne wypelniona 459 g zelu krzemionkowego (produkcji Merck A.G., RFN, o granulacji od 0,05 do 0,2 mm). Eluacje przeprowadza sie mieszanina octanu etylu i benzenu (2 :1 objetosciowo). Pierw¬ sze 000 ml eluatu zageszcza sie do sucha i pozo¬ stalosc rozpuszcza w goracym benzenie. Po pew¬ nym czasie nastepuje wydzielenie Ig bezbarwnych krysztalków, bedacych glównie antybiotykiem B- -5050uA Kolumne eluuje sie jeszcze 4 1 mieszaniny octa¬ nu etylu i benzenu, a nastepnie 3 1 octanu etylu.Eluaty te zageszcza sie w prózni do sucha i roz¬ puszcza w goracym benzenie. Po pewnym czasie wydziela sie 550 mg bezbarwnych krysztalów, sta¬ nowiacych glównie antybiotyk B-5050-F. 500 mg krysztalów stanowiacych glównie anty¬ biotyk B-5050-A rozpuszcza sie w 1,5 ml octanu etylu i przeprowadza chromatografie na kolumnie wypelnionej 50 g zelu krzemionkowego. Nastepnie eluuje sie mieszanina octanu etylu i benzenu (1:1 objetosciowo) zbierajac poszczególne frakcje. Kazda frakcje bada sie na obecnosc aktywnych zwiazków za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym produkcji Merck A.G., RFN, pod nazwa „HF254" stosujac, jako faze rozwijajaca, mieszanine benzenu i acetonu (3 :2 objetosciowo).Frakcje, które zawieraly wylacznie antybiotyk B- -5050-A jako skladnik aktywny, zageszcza sie w prózni do sucha. Po krystalizacji z benzenu otrzy¬ muje sie 88,5 mg antybiotyku B-5O50-A w postaci bezbarwnych pryzmatów. 350 mg krystalicznej substancji, zawierajacej glównie antybiotyk B-5O50-F poddaje sie chroma¬ tografii na zelu krzemionkowym w ilosci 50' g w taki sposób, jak wyzej. Kolumne eluuje sie naj¬ pierw 700 ml mieszaniny octanu etylu i benzenu (2 :1 objetosciowo), a nastepnie mieszanina octanu etylu i benzenu (3 : 1 objetosciowo). Frakcje bada sie na obecnosc komponentów za pomoca chroma- 5 tografii cienkowarstwowej jak poprzednio. Frakcje, w których znajduje sie wylacznie antybiotyk B- -5O50-F laczy sie i zageszcza w prózni do sucha.Pozostalosc krystalizuje sie otrzymujac 75,6 mg antybiotyku B-5050-F jako bezbarwne pryzmaty.Przyklad II. Do czterech naczyn Sakaguchi o pojemnosci 2000 ml dodaje sie po 500 ml wyja¬ lowionej pozywki posiewowej o tym samym skla¬ dzie jak podano w przykladzie I, nastepnie za¬ szczepia sie szczepem Streptomyce hygroscopicus IFO-12995, po czym inkubuje w ten sam sposób, jak w przykladzie I otrzymujac hodowle posiewo- wa I stadium.Do tanku ze stali nierdzewnej, pojemnosci 500 1 dodaje sie 200 1 pozywki hodowlanej o tym samym skladzie, jak w przykladzie I i poddaje wyjalo¬ wieniu w temperaturze 121°C w ciagu 20 minut.Nastepnie pozywke te szczepi sie dodajac do niej 2 1 hodowli posiewowej I stadium, otrzymanej jak wyzej. Inkubuje sie w ciagu 24 godzin w tempera¬ turze 28°C wprowadzajac 200 1 powietrza na mi¬ nute i mieszajac przy 200 obrotach/min. 200 1 tak przygotowanej hodowli posiewowej II stadium przenosi sie do 400 1 pozywki hodowlanej o tym samym skladzie, znajdujacej sie w tanku ze stali nierdzewnej o pojemnosci 6000 1. Inkubuje sie 48 godzin w temperaturze 28°C wprowadzajac 2400 1 powietrza na minute i mieszajac przy 180 obrotach/minute. W czasie inkubacji stosuje sie „Actocol" jako srodek przeciwpienny.Brzeczke fermentacyjna saczy sie otrzymujac 4000 1 przesaczu, który doprowadza sie do war¬ tosci pH = 9 za pomoca 2 n roztworu NaOH, ekstrahuje 1330 1 octanu etylu, przemywa woda, otrzymujac ostatecznie 1052 1 wyciagu octanowego.Wyciag ten zageszcza sie w prózni do objetosci 100 1 doprowadzajac do wartosci pH = 4,0 kwa¬ sem fosforowym, po czym ekstrahuje sie dwu¬ krotnie po 50 1 1,5 m wodnym roztworem KHgP04.Polaczone wyciagi doprowadza sie do pH = 8,5 rozcienczonym wodnym roztworem amoniaku i ekstrahuje 50 1 octanu etylu. Wyciag octanowy przemywa sie woda, odwadnia i zageszcza w próz¬ ni do konsystencji syropu. Po dodaniu 3 1 n-he¬ ksanu otrzymuje sie 330 g surowego proszku. 300 g surowego proszku rozpuszcza sie w 1,1 1 benzenu w trakcie ogrzewania i roztwór oziebia otrzymujac 117 g krystalicznej substancji zawierajacej glównie antybiotyk B-5050^C, -D i -E (krysztaly I).Z drugiej strony wyciag octanowy, który byl ekstrahowany roztworem fosforanu jest poddany ponownie dwukrotnej ekstrakcji przy uzyciu po 50 1 0,02 n kwasu siarkowego. Wodne wyciagi la¬ czy sie, doprowadza do wartosci pH = 8,0, roz¬ ciencza wodnym roztworem amoniaku i ekstrahuje trzykrotnie 30 1 octanu etylu. Wyciagi octanowe laczy sie, przemywa woda, odwadnia i zageszcza w prózni do konsystencji syropu. Nastepnie dodaje sie 1,5 1 n-heksanu i otrzymuje 160 g surowego proszku. 150 g tego proszku krystalizuje sie z go¬ racego benzenu otrzymujac 72,5 g krystalicznej 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6017 80931 18 substancji skladajacej sie glównie z antybiotyku B-5050-A oraz B-5050-B wraz z niewielka iloscia antybiotyku B-5050-C („krysztaly II"). Chromato¬ grafie cienkowarstwowa „krysztalów II" przepro¬ wadza sie w ten sam sposób, jak w punkcie a) lub c), podanym przy oznaczaniu komponentów an¬ tybiotyku B-5050 mieszaniny, co daje d:wie plamy o wartosciach Rf 0,48 i 0,54 dla sposobu wedlug punktu a) oraz wartosci Rf 0,66 i 0,71 dla sposobu wedlug punktu c). 2 g „krysztalów II" rozpuszcza sie w 20 ml oc¬ tanu etylu, po czym dodaje 14 ml benzenu. Roz¬ twór ten poddaje sie chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym (produkcji Merck A.G.RFN, granulacja od 0,05 do 0,2 mm), który uprzed¬ nio zostal zwilzony mieszanina równych objetosci benzenu i octanu etylu. Eluacje przeprowadza sie najpierw mieszanina octanu etylu i benzenu (1:1 objetosciowo) zbierajac 200 ml, a nastepnie mie¬ szanina octanu etylu i benzenu (3 :2 objetosciowo) zawierajac frakcje posiadajace aktywnosc przeciw- bakteryjna w stosunku do Bacillus substilis. Frak¬ cje, które zawieraly analogiczne komponenty byly laczone zageszczane i po krystalizacji z benzenu dawaly 435 mg krystalicznego antybiotyku B-5050- -A oraz 185 mg krystalicznego antybiotyku B-5O50- -B. 10 g „krysztalów I" rozpuszcza sie w 50 ml oc¬ tanu etylu i dodaje 250 ml benzenu. Roztwór ten chromatografuje sie na 400 g zelu krzemionikowego w sposób jak wyzej. Kolumne eluuje sie najpierw 3 1 mieszaniny octanu etylu i benzenu (1 : 1 obje¬ tosciowo), a nastepnie mieszanina octanu etylu i benzenu (2 : 1 objetosciowo), otrzymujac frakcje po 500 iml. Frakcje, które otrzymano przy uzyciu pierwszej mieszaniny (rozpuszczalników, zawieraja antybiotyki B-5050-A i B-5050-B. Pierwsza frakcja otrzymana przy uzyciu drugiej mieszaniny zawiera antybiotyki B-5050-B oraz B-5O50i-C, druga frakcja zawiera antybiotyki B-505O-C oraz B-5060-D, trze-" cia frakcja zawiera antybiotyki B-5050-D oraz B- 5050-E, zas ostatnia frakcja zawiera antybiotyki B-505O-E oraz B-5050-F. 2 g krystalicznej substancji otrzymanej z frakcji zawierajacej antybiotyki B-5O50-B oraz B-5050^C rozpuszcza sie ponownie w 15 ml octanu etylu i dodaje 10 ml benzenu. Roztwór ten poddaje sie chromatografii kolumnowej na 250 g zelu krze¬ mionkowego przeprowadzajac eluacje mieszanina octanu etylu i benzenu (3 :2 objetosciowo). Odbiera sie frakcje objetosci po 20 ml. Frakcje, które za¬ wieraja te same komponenty laczy sie, zageszcza i krystalizuje z benzenu lub z mieszaniny octanu etylu i n-heksanu, otrzymujac 85 mg krystalicznego antybiotyku B-5050i-B., 940 mg krystalicznego an¬ tybiotyku B-5050-C oraz 75 mg krystalicznego an¬ tybiotyku B-5050-D.W ten sam sposób 1,2 g frakcji zawierajacej antybiotyki B-5050-D oraz B-5050-E poddaje sie chromatografii kolumnowej na zelu krzemionko¬ wym otrzymujac 600 -mg krystalicznego antybioty¬ ku B-5O50-E. Frakcja, która otrzymano po frakcji zawierajacej antybiotyk B-5050-B oraz B-5O50-C, zawiera antybiotyk B-5050-C jako glówny kompo¬ nent. 770 mg surowych krysztalów, otrzymanych z tej frakcji, rozpuszcza sie w 5 ml acetonu i roz¬ twór ten poddaje chromatografii kolumnowej na 100 g zelu krzemionkowego, w sposób wyzej po¬ dany, otrzymujac 220 mg krystalicznego antybioty- 5 ku B-5050MT.Pr z y k l a d III. 400 1 przesaczu z brzeczki fer¬ mentacyjnej, otrzymanej w glównej fermentacji, opisanej w przykladzie II doprowadza sie do war¬ tosci pH = 8,0 i ekstrahuje octanem etylu w ilosci io 1/3 objetosci. Wyciag octanowy zageszcza sie do objetosci okolo 100 1, przemywa 50 1 wody i ekstra¬ huje trzykrotnie po 50 1 1/3 m wodnym roztworem KH2P04, po uprzednim doprowadzeniu do war¬ tosci pH = 3,0 kwasem fosforowym. Polaczone 15 wodne wyciagi doprowadza sie do wartosci pH = = 9,0—10 dodajac 8 m wodny roztwór amoniaku, po czym ekstrahuje 75 1 octanu etylu. Wyciag oc¬ tanowy przemywa sie trzykrotnie 25 1 wody, za¬ geszcza do objetosci okolo 1,5 1 i dodaje okolo 30 1 20 n-heksanu, z którego po krystalizacji z benzenu otrzymuje sie 272 g krystalicznego produktu be¬ dacego antybiotykami B-5050.W niniejszym sposobie uzycie 0,2 n wodnego roztworu kwasu octowego zamiast roztworu 25 KH2P04, daje identyczne wyniki. 19 g tak otrzymanego antybiotyku B-5050 roz¬ puszcza sie w 75 ml acetonu i poddaje chroma¬ tografii na kolumnie wypelnionej 800 g zelu krze¬ mionkowego. Kolumne eluuje sie 3000 ml miesza- 30 niny octanu etylu (1:1 objetosciowo), otrzymujac 725 g krystalicznej substancji skladajacej sie glówr nie z antybiotyku B-5050-A i B^505O-B. Nastepnie kolumne eluuje sie mieszanina octanu etylu i ben¬ zenu (2:1 objetosciowo). Z pierwsza frakcja o 35 objetosci 1100 ml postepuje sie analogicznie, otrzy¬ mujac 2,22 krysztalów zawierajacych glównie an¬ tybiotyk B-5050-B i B-5050-C. Z nastepnej frakcji objetosci 2001 ml otrzymuje sie 0^90 g krysztalów skladajacych sie glównie z antybiotyku B-505O-C. 40 z kolejnej frakcji o objetosci 3O0 ml otrzymuje sie 1,4 mieszaniny zawierajacej glównie antybiotyki B-5050/-C i B-5050-D. Z ostatniej wreszcie frakcji pojemnosci 600 ml otrzymuje sie 1,09 g kryszta¬ lów, zawierajacych glównie antybiotyk B-5050-D 45 i B-5050-E. Kolumne eluuje sie jeszcze przy uzy¬ ciu 600 ml mieszaniny octanu etylu i benzenu (3 :1 objetosciowo) uzyskujac 0,645 g krysztalów, za¬ wierajacych glównie antybiotyki B-5050-D oraz B-5O50-E. Kolejna eluacja kolumny przy uzyciu 50 1600 ml octanu pozwala otrzymac 2,00 g kryszta¬ lów, zawierajacych glównie antybiotyk B-5O50uF.Otrzymane powyzej 7,25 g krysztalów zawieraja¬ cych antybiotyki B-5060-A oraz B-5O50-B, rozpusz¬ cza sie w 40 ml acetonu i chromatografuje na ko- M lumnie wypelnionej 400 g zelu krzemionkowego.Po eluacji mieszanina octanu etylu i benzenu (1:1 objetosciowo), uzyskuje sie 1,5 g krystalicznego antybiotyku B-5050-A oraz 0,65 g krystalicznego antybiotyku B-5060-B. oo Poprzednio otrzymane 2,22 g krysztalów zawie¬ rajacych glównie antybiotyk B-5050-C rozpuszcza cza sie w 20 ml acetonu i chromatografuje na ko¬ lumnie wypelnionej 300 g zelu krzemionkowego.Po eluacji mieszanina benzenu i acetonu (3:1 85 objetosidiowo) otrzymuje sie 0,398 g krystalicznego19 80931 20 antybiotyku B-5050-B, zas po nastepnej eluacji mieszanina benzenu i acetonu (2 :1 objetosciowo), otrzymuje sie 0,268 g krystalicznego antybiotyku B-5050-C.Otrzymane poprzednio 0,90 g krysztalów, zawie¬ rajacych glównie antybiotyk B-5050-C rozpuszcza sie w' 5 ml acetonu i poddaje chromatografii na kolumnie wypelnionej 100 g zelu krzemionkowego.Po eluacji mieszanina octanu etylu i benzenu (2:1 objetosciowo) uzyskuje sie 0,258 g krystalicznego antybiotyku B-5050-C. 1,40 g krysztalów zawierajacych antybiotyki B- -5050-C i B-5O50-D rozpuszcza sie w 10 ml acetonu i poddaje chromatografii na kolumnie wypelnio¬ nej 150 g zelu krzemionkowego. Po eluacji mie¬ szanina benzenu i acetonu (2: 1 objetosciowo) otrzymuje sie 0,596 g krystalicznego antybiotyku B-5O50^C oraz 0,187 g krystalicznego antybiotyku B-5050-D. 1,99 g krysztalów zawierajacych antybiotyki B- -5O50-D oraz B-5050-E rozpuszcza sie w 30 ml ace¬ tonu i poddaje chromatografii na kolumnie wypel¬ nionej 300 g zelu krzemionkowego. Po eluacji mie¬ szanina benzenu i acetonu (2:1 objetosciowo) uzyskuje sie 0,304 g krystalicznego antybiotyku B-5060-E. 2,09 g krysztalów zawierajacych glównie anty¬ biotyk B-5050-F rozpuszcza sie w 15 ml acetonu i poddaje chromatografii na kolumnie wypelnionej 250 g zelu krzemionkowego. Po eluacji mieszanina octanu etylu i benzenu (3:1 objetosciowo) otrzy¬ muje sie 0,585 g krystalicznego antybiotyku B- -5050-F.Przyklad IV. 120 ml n-heksanu 80 ml dwu- chlorku etylenu, 30 ml metanolu oraz 6 ml wody mliesza sie i pozostawia do rozdzielenia warstw.W 6 ml warstwy dolnej rozpuszcza sie 1 mg czer¬ wieni chlorofenolowej, dodaje 5 g „Celitu", zwlasz¬ cza „Celitu 535", a nastepnie 100 ml oddzielonej warstwy górnej. Calosc miesza sie energicznie i wprowadza chlorowodór do momentu, az wskaz¬ nik zmieni barwe z fioletowej na zólta. Zawiesina ta powoli przechodzi przez kolumne szklana wy¬ pelniona „Celtem". 25 mg krysztalów antybiotyku B-5060', otrzyma¬ nego wedlug przykladu III, rozpuszcza sie w 0,4 ml otrzymanej poprzednio fazy górnej i roztwór ten podaje sie na przygotowana, jak wyzej, ko¬ lumne wypelniona Celitem 535. Kolumne te roz¬ wija sie przy uzyciu górnej fazy tak, aby aktywne komponenty zostaly rozdzielone i mogly byc obser¬ wowane jako fioletowe warstwy. Dalsza eluacja pozwala otrzymac frakcje zawierajace w kolejnosci antybiotyki B-5050-Aj -B, -C, -E, -F. Z poszcze¬ gólnych frakcji otrzymuje sie krystaliczne antybio¬ tyki, a mianowicie 4 mg antybiotyku B-5050-A, 3 mg antyboityku B-5050-B, 5 mg antybiotyku B- -5O50-C, 4 mg antybiotyku B-5O50-D oraz B-5050-E i 2 mg antybiotyku B-505(UF.Przyklad V. W ten sam sposób, jak w przy¬ kladzie I, przygotowuje sie hodowle posiewna przy uzyciu Streptomyces hygroscopicus IFO-12995.Kolby stozkowe pojemnosci 200 ml, w których znajduje sie po 50 ml wyjalowionej pozywki szcze¬ pi sie po 2 ml Jiodowli posiewowej. Pozywka ho¬ dowlana zawiera 3°/o glukozy, 0,5°/o namoku ku¬ kurydzianego, l°/o odtluszczonej maki sojowej, 0^/a chlorku sodu, O,05°/o siarczanu magnezu, O,l°/o K2HP04, 0,05tyo chlorku potasowego, 0,3°/o weglanu 5 wapnia oraz wode, przy czym wartosc pH dopro¬ wadza sie do 7,0. Fermentacje prowadzi sie na obrotowej trzesawce w temperaturze 26°C w ciagu 96 godzin. Otrzymany przesacz brzeczki posiada aktywnosc przeciwbakteryjna rzedu 350 jednostek io rozcienczonych wobec Bacillus subtilis. 1,6 1 przesaczu brzeczki doprowadza do wartosci pH = 7,8 i ekstrahuje 800 ml octanu etylu, a na¬ stepnie 600 ml. Polaczone wyciagi przemywa sie woda i ekstrahuje dwukrotnie po 600 ml 0,002 n 15 kwasem solnym. Wodne wyciagi laczy sie, zobo¬ jetnia do wartosci pH = 7,0—8,0 0,1 n wodnym roztworem NaOH i ponownie ekstrahuje dwukrot¬ nie po 500 ml octanu etylu. Wyciagi octanowe przemywa sie woda, odwadnia bezwodnym siar- 20 czanem sodu i zageszcza w prózni. Po dodaniu 30 ml n-heksylu otrzymuje sie 59 mg surowego proszku, który rozpuszcza sie w goracym benze¬ nie, pozostawia na pewien czas i otrzymuje 15 mg antybiotyku B-5050 w postaci bezbarwnych igiel. 25 Przyklad VI. Po 2 ml hodowli posiewowej, otrzymanej w taki sam sposób, jak w przykla¬ dzie I, szczepi sie kolby stozkowe, pojemnosci 200 ml z zawartoscia po 50 ml pozywki hodowlanej, której sklad jest taki sam, jak podano w przykla- 30 dzie I. Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 28°C na obrotowej trzesawce w ciagu 96 godzin.Przesacz otrzymanej w ten sposób brzeczki posiada aktywnosc przeciwbakteryjna rzedu 350 jednostek rozcienczeniowych wobec Bacillus subtilis. 35 1,8 1 przesaczu brzeczki doprowadza sie do war¬ tosci pH = 8 i ekstrahuje dwukrotnie po 400 ml octanu etylu, przemywa woda, odwadnia i za¬ geszcza w prózni. Po dodaniu 30 ml n-heksanu otrzymuje sie 210 mg surowego proszku, który roz- 40 puszcza sie ogrzewajac w 15 mi benzenu, pozo¬ stawia na pewien czas i otrzymuje 59 mg krysz¬ talów antybiotyku B-5050.Przyklad VII. 900 1 przesaczu brzeczki otrzy¬ manej w ten sam sposób jak w przykladzie I prze- 45 rabia sie równiez tak samo jak w przykladzie I, otrzymujac 70' g surowego antybiotyku B-5050. An¬ tybiotyk ten rozpuszcza sie w mieszaninie octanu etylu i benzenu (2:1 objetosciowo), poddaje chro¬ matografii na kolumnie wypelnionej 2,1 kg zelu so krzemionkowego. Nastepnie kolumne eluuje sie mieszanina octanu etylu i benzenu (2 :1 objetoscio¬ wo), bezbarwne frakcje laczy i zageszcza do sucha.Otrzymana tak pozostalosc rozpuszcza sie w 350 ml goracego benzenu, pozostawia na pewien czas 65 i otrzymuje 7 g antybiotyku B-5050 w postaci bezbarwnych igiel.Przyklad VIII. 800 ml przesaczu brzeczki, otrzymanego wedlug przykladu VI, doprowadza sie do wartosci pH = 7,6 i podaje na kolumne wypel- 60 niona 40 ml Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas Co., USA). Kolumne najiplierw przemywa sie 200 ml destylowanej wody, a nastepnie eluuje 200 ml 30*/o wodnego roztworu metanolu otrzymujac bra¬ zowy eluat, który nie wykazuje aktywnosci prze- 66 ciwbakteryjnej. Kolumne eluuje sie 500 ml 80*/o80*3! 21 22 wodnego roztworu metanolu, uzyskujac frakcje za¬ wierajaca wiekszosc aktywnych komponentów.Frakcje te zageszcza sie w prózni az do usuniecia metanolu pozostalosc doprowadza sie do wartosci pH = 7,5—8,5 i ekstrahuje dwukrotnie po 100 ml 5 octanu etylu. Polaczone wyciagi octanowe prze¬ mywa sie woda, odwadnia i zageszcza w prózni.Po dodaniu n-heksanu otrzymuje sie 53 mg suro¬ wego antybiotyku B-5050, który rozpuszcza sie w goracym benzenie, pozostawia na pewien czas io i otrzymuje 17 mg krystalicznego zwiazku.Przyklad IX. 1 g „krysztalów I" otrzyma¬ nych wedlug przykladu. II, rozpuszczonych w 100 ml octanu etylu, ekstrahuje sie trzykrotnie po 100 ml roztworu buforowego Srensena jo wartosci pH m kolejno 5,5, 4,9 oraz 4,4 (zawierajacym 0,1 m roz¬ twór cytrynianu dwusodowego). Kazdy eksirat do¬ prowadza sie do wartosci pH = 9,5 rozcienczonym roztworem amoniaku i ekstrahuje polowa obje¬ tosci octanu etylu. Frakcje octanowa przemywa sie 20 woda, odwadnia, zageszcza w prózni i pozostawia sie do krystalizacji. Z frakcji otrzymanej za po¬ moca roztworu buforowego o wartosci pH = 4,9 otrzymuje sie 365 mg antybiotyku B-506O-C.Z roztworu octanu etylu, pozostalego po ekstrak- 2* cji wymienionymi roztworami buforowymi, otrzy¬ muje sie 110 mg krysztalów zawierajacych glównie antybiotyk B-5050-A oraz B-5050-B. Z frakcji eks¬ trahowanej roztworem buforowym o wartosci pH = 4,4 uzyskano 165 mg krysztalów zawieraja- 30 cych glównie antybiotyki B-5060-B oraz B-505O-C, zas z frakcji ekstrahowanej roztworem buforowym o wartosci pH = 5,5 otrzymano 320 mg kryszta¬ lów zawierajacych glównie antybiotyki B-5050-C, -D, -E,-F. 35 Przyklad X. 10 g „krysztalów II" otrzyma¬ nych wedlug przykladu II i rozpuszczonych w 1 ml octanu etylu ekstrahuje sie roztworem bufo¬ rowym Sorensena najpierw o wartosci pH — 4,9 dwukrotnie po 800 ml, a nastepnie tymze roztwo- *o rem o wartosci pH = 4,4 czterokrotnie po 1 1.Frakcje o tej samej wartosci pH laczy sie, dopro¬ wadza do pH = 9,5 rozcienczonym roztworem amoniaku i ekstrahuje polowa objetosci octanu etylu. Wyciagi octanowe przemywa sie woda, od- 45 wadnia i zageszcza w prózni, po czym pozostawia do krystalizacji. Odpowiednie frakcje przerabia sie w ten sam sposób, jak w przykladzie IX. Frakcja octanu etylu, która pozostaje po ekstrakcji roztwo¬ rami buforowymi, zawiera 4,2 g krystalicznej sub- m stancji, skladajacej sie glównie z antybiotyku B- -506O-A. Z frakcji, które byly ekstrahowane roz¬ tworem buforowym o wartosci pH = 4,4 otrzymu¬ je sie 3,8 g krysztalów zawierajacych glównie an¬ tybiotyk B-5O50-B, zas z frakcji ekstrahowanych ss roztworem buforowym o wartosci pH = 4,9 uzy¬ skuje sie 1,3 g krysztalów, zawierajacych glównie antybiotyki B-5050-B oraz B-5O50-C.Niezaleznie od tego czy antybiotyk B-5050 jest mieszanina, czy pojedynczym komponentem, posia- da silne dzialanie przeciwbakteryjne, w szczegól¬ nosci przeciwko bakteriom Gramdodatnim i odzna¬ cza sie wyraznie niska toksycznoscia dla zwierzat stalocieplnych, wlaczajac w to ludzi. Na przyklad srednia dzialajaca dawka (EDM) antybiotyku B- w -5050 dla myszy zakazonych Staphylococcus aureus wynosi 640 mg/kg per os. Natomiast srednia dawka toksyczna (LDM) dla myszy nie moze byc oznaczona ze wzgledu na zbyt niska toksycznosc i moze byc wyrazona tylko jako „wyzsza niz 10.000 mg/kg per os." Szczurom podawano dziennie per os 1 kg/kg antybiotyku B-5050 w ciagu jednego miesiaca. Nie stwierdzono dostrzegalnych róznic miedzy grupa kontrolna zwierzat a grupa testowa, zas badanie anatomopatalogiczne organów wewnetrznych i wnetrznosci u szczurów testowych nie wykazalo istotnych zmian.Stafylokoki sa ropotwórczymi bakteriami powo¬ dujacymi uszkodzenie, na przyklad w postaci owrzodzen zwykle na skórze. Nowy zwiazek wy¬ tworzony sposobem wedlug wynalazku jest uzy¬ teczny w postaci preparatów stosowanych zew¬ netrznie w leczeniu tego rodzaju infekcji u ssa¬ ków, w tym równiez u ludzi. Nastepujace prepa¬ raty wykorzystywane sa do stosowania zewnetrz¬ nego w infekcjach wywolanych przez Staphylecoc- cus aureus.Do 1 g lanoliny wprowadza sie jeden z nastepu¬ jacych skladników: po 20 mg antybiotyku B-5050- -A, B-5050-B lub B-5050-C, lub po 50 mg antybio¬ tyku B-506O-D, B-5060-E, B-5O50^F, albo tez 20 mg krystalicznego antybiotyku B-5050 mieszaniny, otrzymanego wedlug przykladu I, badz 20 mg „krysztalów H", otrzymanych wedlug przykladu II.Mieszanine uciera sie z odpowiednia iloscia bialej wazeliny, tak, aby otrzymac 10 g masci.Masc te stosuje sie na skóre w takiej ilosci, aby pokryc miejsce owrzodzone, przy czym mozna sto¬ sowanie to powtarzac szereg razy dziennie.Ze wzgledu na bakteriobójcze i bakteriostatyczne wlasnosci zwiazku wedlug wynalazku, moze on byc uzyteczny na przyklad do odkazania aparatury szpitalnej i innych, która jest narazona na zakaze¬ nie patogennytma bakterdaimi Gramdodatnimi, wraz¬ liwymi na omawiany antybiotyk. Odkazanie prze¬ prowadza sie przez spryskiwanie lub przemywanie roztworem na przyklad metanolowym, etanolowym i wmymi, zawierajacym jeden z nastepujacych an¬ tybiotyków: 20 mcg/ml antybiotyku B-5050-A lub w tych samych ilosciach antybiotyk B-5050-B, B- -5O50-C, 50 mcg/ml antybiotyku B-5050-D albo w tych samych ilosciach antybiotyk *-5050-E, B- -5060-F, badz 20 mcg/ml krystalicznego antybio¬ tyku B-5050 mieszaniny otrzymanej wedlug przy¬ kladu I, albo „krysztalów II" otrzymanych wedlug przykladu II. PL PL