PL66255B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 30.X.1972 66 255 KI. 30h,6 MKP C12k 1/02 UKD Wspóltwórcy wynalazku: Marian Tyc, Teodora Kadzikiewicz, Kazimierz Wozniak Wlasciciel patentu: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa (Polska) Sposób otrzymywania mutantów drobnoustrojów o zwiekszonej zdolnosci wytwarzania antybiotyków Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia mutantów drobnoustrojów o zwiekszonej zdol¬ nosci wytwarzania antybiotyków z grupy polipepty- dów, takich, jak wionycyna lub bacytracyna.Postep w dziedzinie produkcji antybiotyków po¬ lega przede wszystkim na wprowadzaniu do pro¬ dukcji nowych szczepów o zwiekszonej aktywnosci antybiotycznej. W tym celu wykorzystuje sie mu¬ tanty indukowane, które wytwarzaja wielokrotnie wieksze ilosci antybiotyków w porównaniu ze szczepami macierzystymi.Pojawienie sie w obrebie populacji drobnoustro¬ ju osobników o zwiekszonej aktywnosci jest zwia¬ zane ze zjawiskiem zmiennosci której podstawowym zródlem sa mutacje. Mutacje spontaniczne i indu¬ kowane dostarczaja surowego materialu do selek¬ cji szczepów o zwiekszonej zdolnosci wytwarzania antybiotyków. (S. I. Alichanian, Advances in Applied Microbiology 1962, 4.1.).W pierwszym okresie ery antybiotyków selekcja szczepów przemyslowych polegala na poszukiwa¬ niu mutantów spontanicznych. Obecnie metody se¬ lekcji obejmuja mutacje wywolana czynnikami mu¬ tagennymi i nastepujaca po niej selekcje aktyw¬ nych mutantów. Pod wplywem dzialania fizycz¬ nych i chemicznych czynników mutagennych zwiek¬ sza sie w populacji stosunek mutantów o zwiekszo¬ nej aktywnosci do ogólnej liczby osobników, co w konsekwencji stwarza wieksze prawdopodobien¬ stwo znalezienia wartosciowego szczepu. Sposród 2 czynników fizycznych szerokie zastosowanie w se¬ lekcji drobnoustrojów znalazly promienie jonizujace poczawszy od promieni nadfioletowych przez pro¬ mienie Roentgena, a skonczywszy na szybkich elek- 5 tronach. Sposród chemicznych mutagenów najcze¬ sciej stosowane sa iperyty azotowe, etylenoimina, siarczan dwuetylowy, kwas azotawy, nitrozoguani- dyna i inne.Znane sposoby selekcji wysokowydajnyeh mu¬ lo tantów wytwarzajacych antybiotyki sa zmudne, bardzo pracochlonne i wymagaja duzych nakladów finansowych. Schemat selekcji przedstawic mozna nastepujaco: zawiesine komórek drobnoustroju pod¬ daje sie dzialaniu czynników mutagennych, na- 15 stepnie rozsiewa sie komórki na podlozu agaro¬ wym, izoluje losowo wybrane kolonie, okresla aktywnosci wyizolowanych populacji metoda fer¬ mentacji i dokonuje wyboru mutanta.Glówna trudnosc selekcji polega na sposobie 20 wykrywania wsród duzej liczby komórek osobni¬ ków odznaczajacych sie zwiekszona aktywnoscia.Waskim gardlem obecnie stosowanej selekcji jest koniecznosc prowadzenia przez kilka dni fermen¬ tacji glebinowej wszystkich wyizolowanych szcze- 25 pów, celem okreslenia ich aktywnosci. W praktyce ocena duzej liczby szczepów pod wzgledem aktyw¬ nosci antybiotycznej jest trudna, ze wzgledu na istnienie wielu czynników wplywajacych na osta¬ teczny wynik fermentacji (labilnosc mutantów, wa- 30 runki fermentacji, blad metody oznaczenia itd.). 66255? 66255 3 4 W przypadku szczepów wytwarzajacych anty¬ biotyki poszukiwania ida w kierunku mutantów charakteryzujacych sie zmiennoscia cech iloscio¬ wych. Podlozem cech ilosciowych sa tzw. geny wie¬ lokrotne (poligeny), natomiast podlozem cech ja¬ kosciowych sa geny podstawowe (struktury). Se¬ lekcja szczepów wytwarzajacych antybiotyki doty¬ czy mutantów „ilosciowych" które sa trudne do wykrycia i istotnie róznia sie od mutantów „jakos¬ ciowych".Wysokoaktywne mutanty otrzymuje sie na dro¬ dze selekcji kilkustopniowej, tzn. z niskowydaj- nych szczepów selekcjonuje sie szczepy o wyzszej aktywnosci, z tych ostatnich o jeszcze wyzszej wy¬ dajnosci itd. Krzywa selekcji mutantów sponta¬ nicznych i indukowanych odznaczajacych sie zwiekszona aktywnoscia antybiotyczna wzrasta na poczatku pracy ze szczepami dzikimi (naturalny¬ mi) i wariantami niskowydajnymi.W miare jak drobnoustrój nabywa cech ekono¬ micznie wartosciowych czestotliwosc dalszej muta¬ cji w kierunku zwiekszonej aktywnosci spada i se¬ lekcja czesto nie daje praktycznego efektu. Zjawi¬ sko to tlumaczy sie tym, ze w wyniku mutancji wiele loci zostaje zmutowanych i powstaja nieko¬ rzystne uklady, które wielokrotnie zmniejszaja czestotliwosc pojawienia sie nowych wartosciowych mutantów. Dalsza selekcja mutantów o zwiekszo¬ nej aktywnosci skazana jest wtedy na przypadko¬ wosc (1. C. T. Calam: Progress in Industrial Mi- crobiology, 1964, 5, 1. 2. S. I. Alichanian: Advances in Applied Microbiology, 1962, 4, 1.).Dotychczasowe próby znalezienia prostej metody selekcji, która pozwalalaby na szybkie zróznicowa¬ nie szczepów o duzej aktywnosci nie daly pozytyw¬ nych wyników. Metoda bezposredniego okreslania na podlozach stalych wlasciwosci antybiotycznych pojedynczych kolonii wobec drobnoustroju wrazli¬ wego okazala sie nieprzydatna w selekcji, gdyz nie stwierdzono wspólzaleznosci miedzy wielkoscia stre- . fy zahamowania wzrostu drobnoustroju wzorcowego a zdolnoscia wytwarzania antybiotyku w podlozu plynnym. Nie powiodly sie równiez próby znale¬ zienia zaleznosci miedzy cechami morfologicznymi a zdolnoscia wytwarzania antybiotyku. Wykazano takze, ze uodpornienie szczepów na duze dawki wytwarzanego przez nie antybiotyku nie prowadzi do zwiekszenia wydajnosci.W toku poszukiwania skutecznej metody, która umozliwialaby dalsza selekcje wysokowydajnyeh mutantów wytwarzajacych antybiotyki z grupy po- lipeptydów takie jak wiomycyna lub bacytracyna stwierdzono, ze mozna otrzymac w prosty sposób nowe mutanty o zwiekszonej aktywnosci jezeli sposród duzej liczby kolonii, wyroslych z komórek poddanych dzialaniu czynników mutagennych, izo¬ luje sie metoda replik takie, które nie maja zdol¬ nosci lub wykazuja ograniczona zdolnosc do wyko¬ rzystywania z agarowych podlozy syntetycznych aminokwasów lub ich analogów wystepujacych w czasteczce wytwarzanego przez nie antybiotyku i nastepnie porównuje sie ich aktywnosc antybio¬ tyczna z aktywnoscia szczepu wyjsciowego.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze ko¬ mórki drobnoustroju poddaje sie dzialaniu czynnika mutagennego (np. iperytu azotowego lub promieni UV) i nastepnie wysiewa na plytki Petri'ego z aga¬ rem hodowlanym tak, aby na plytce wyroslo 50 — 100 kolonii. Po inkubacji kolonie przesiewa sie 5 metoda replik na podloze syntetyczne zawierajace jako jedyne zródlo azotu aminokwasy korzystnie tworzace lancuch polipeptydowy w czasteczce wy¬ twarzanego przez drobnoustrój antybiotyku. Kolo¬ nie, które nie wyrastaja lub wykazuja ograniczony wzrost na podlozu syntetycznym zawierajacym do¬ datek odpowiednich aminokwasów izoluje sie z ply¬ tek matrycowych na skosne agary hodowlane i in- kubuje w termostacie.W wyniku tak przeprowadzonej selekcji otrzy¬ muje sie mala grupe populacji stanowiaca drobny odsetek' (np. rzedu 10"3) kolonii replikowanych. Wy¬ izolowane szczepy poddaje sie szczególowym bada¬ niom, gdyz poszukiwane mutanty stanowia tylko pewna czesc wydzielonej grupy, wiekszosc popu¬ lacji wykazuje zmniejszona aktywnosc w porów¬ naniu ze szczepem wyjsciowym. Znalezienie mutan¬ tów o zwiekszonej aktywnosci, wystepujacych w malej grupie populacji, nie nastrecza wiekszych trudnosci. Aktywnosc wyizolowanych szczepów sprawdza sie metoda fermentacji i porównuje z ak¬ tywnoscia szczepu wyjsciowego.Wynalazek objasniaja nizej podane przyklady dotyczace otrzymywania mutantów o zwiekszonej zdolnosci wytwarzania antybiotyków.Przyklad I. Otrzymywanie szczepu o zwiek¬ szonej zdolnosci wytwarzania wiomycyny. Selekcji poddano aktywnego mutanta szczepu Streptomy- ces griseus var. purpureus, który wytwarzal w hodowli glebinowej okolo 2500 j/ml wiomycyny.Próby zwiekszenia aktywnosci tego szczepu zna¬ nymi metodami selekcji nie daly wyniku, chociaz zbadano ponad 1000 populacji otrzymanych z za¬ rodników poddanych dzialaniu czynników muta¬ gennych. Wyjsciowy szczep dobrze asymilowal li¬ zyne, arginine, |3-alanine i seryne z agarowych podlozy syntetycznych.Zarodniki wyjsciowego szczepu zebrano z 8- -dniowej hodowli na podlozu sporulacyjnym i za¬ wieszono w jalowej wodzie destylacyjnej. Przy po¬ mocy perelek szklanych zawiesine zarodników do¬ kladnie homogenizowano i nastepnie saczono przez filtr z waty. Homogenna zawiesine zawierajaca w 1 ml okolo 107 zarodników poddano dzialaniu ipe¬ rytu azotowego, w dawkach wywolujacych inakty- wacje zarodników rzedu 99,9%.Po ekspozycji zawiesine zarodników wysiewano na plytki Petri'ego z podlozem sporulacyjnym w takim rozcienczeniu, aby na plytce wyroslo okolo 70 kolonii. Plytki posiane zawiesina inkubowano w ciagu 5 dni w temperaturze 28°C i nastepnie przeprowadzano przesiew kolonii metoda replik na podloze syntetyczne zawierajace lizyne, arginine lub (3-alariine jako jedyne zródlo azotu. Po replice plytki inkubowano w temperaturze 28°C i obser¬ wowano wzrost kolonii. Te kolonie, które na podlo¬ zu syntetycznym zawierajacym aminokwasy nie wyrosly lub wykazywaly wzrost znacznie ograni¬ czony, izolowano z plytek matrycowych na skosne agary sporulacyjne i inkubowano w temperaturze 28°C w ciagu 9 dni. 15 20 25 30 85 40 45 50 55 605 66255 6 Wyosobnione populacje stanowily drobny odse¬ tek (okolo 10~3) replikowanych kolonii. Aktywnosc antybiotyczna wyizolowanych papulacji sprawdza¬ no metoda fermentacji na trzesawce. Dla celów po¬ równawczych w kazdej serii doswiadczen prowa¬ dzono fermentacje kontrolna przy uzyciu szczepu wyjsciowego. Wszystkie szczepy hodowano w tych samych warunkach, w ten sam sposób i na pozyw¬ kach o jednakowym skladzie. Takie ujecie do¬ swiadczenia pozwolilo na przedstawienie aktywno¬ sci badanych szczepów w procentach w odniesie¬ niu do wydajnosci szczepu wyjsciowego.W wyniku przeprowadzonej selekcji otrzymano nowe mutanty o zwiekszonej aktywnosci wytwarza¬ nia wiomycyny, które równoczesnie nie wykazywa¬ ly zdolnosci do wykorzystywania jednego lub kil¬ ku wymienionych aminokwasów. W przypadku otrzymania mutanta niezdolnego do asymilacji tyl¬ ko jeclnego aminokwasu przeprowadzano ponownie selekcje, uzywajac nowego mutanta o zwiekszonej aktywnosci jako szczepu wyjsciowego.Postepujac wedlug opisanego sposobu wyizolo¬ wano 32 populacje, wsród których znaleziono 3 no¬ we mutanty o zwiekszonej zdolnosci wytwarzania wiomycyny (5000—6000 j/ml (1 j wiomycyny = = 1 mcg wiomycyny).Przyklad II. Otrzymywanie szczepu o zwiek¬ szonej zdolnosci wytwarzania bacytracyny. Do se¬ lekcji uzyto szczepu z grupy Bacillus subtilis, któ¬ ry w hodowli trzesawkowej wytwarza okolo 235 j/ml bacytracyny.Hodowle szczepu wyjsciowego z grupy Bacillus subtilis odwirowuje sie i bakterie trzykrotnie prze¬ mywa sie jalowym 0,85% roztworem NaCl. Z prze¬ mytych bakterii przygotowuje sie homogenna za¬ wiesine w jalowym 0,85% NaCl zawierajaca w 1 ml okolo 108 komórek. Tak przygotowana zawiesine bakterii poddaje sie dzialaniu iperytu azotowego stosujac dawki wywolujace inaktywacje komórek rzedu 99,99%. Po ekspozycji zawiesine komórek od¬ powiednio sie rozciencza i rozprowadza na plytki z agarem hodowlanym tak, aby na plytce wyroslo okolo 70 kolonii. Inkubacje prowadzi sie w tem¬ peraturze 35°C w ciagu 2 dni.Otrzymane hodowle w postaci pojedynczych ko¬ lonii przesiewa sie metoda replik na podloze syn- 5 tetyczne zawierajace izoleucyne, seryne, kwas aspa¬ raginowy, kwas glutaminowy lub ornityne jako je¬ dyne zródlo azotu. Po przesiewie plytki inkubuje sie w temperaturze 35° w ciagu 2 dni. Kolonie, które na podlozu syntetycznym nie wykazuja wzro¬ stu lub maja wzrost wyraznie ograniczony, izolu¬ je sie z plytek matrycowych na skosne agary ho¬ dowlane i inkubuje w temperaturze 35°C. Aktyw¬ nosc otrzymanych w ten sposób populacji spraw¬ dza sie metoda hodowli na trzesawce i porównuje z aktywnoscia szczepu wyjsciowego.Postepujac wedlug podanego schematu otrzyma¬ no szczep, który nie wykazuje zdolnosci do asymi¬ lacji z podloza syntetycznego izoleucyny i wytwa¬ rza w hodowli trzesawkowej okolo 350 j/ml bacy¬ tracyny (1 j bacytracyny = 18 mcg bacytracyny), co stanowi zwiekszenie aktywnosci antybiotycznej okolo 50% w porównaniu ze szczepem wyjsciowym. PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób Otrzymywania mutantów drobnoustrojów o zwiekszonej zdolnosci wytwarzania antybiotyków z grupy polipeptydów takich jak wiomycyna lub bacytracyna przez dzialanie czynników mutagen¬ nych, znamienny tym, ze komórki drobnoustroju wytwarzajacego antybiotyk po zmutowaniu wysie¬ wa sie na agarowe podloze hodowlane, inkubuje w termostacie, wyrosniete kolonie replikuje na podloze syntetyczne zawierajace jako jedyne zró¬ dlo azotu aminokwasy, korzystnie tworzace lan¬ cuch polipeptydowy w czasteczce wytwarzanego przez drobnoustrój antybiotyku, ponownie inkubu¬ je w termostacie, izoluje z plytek matrycowych te kolonie, które nie wyrastaja lub maja ograniczo¬ ny wzrost na podlozu syntetycznym i porównuje sie metoda fermentacji aktywnosc antybiotyczna wyizolowanych populacji z aktywnoscia szczepu wyjsciowego. 20 25 30 35 PL PL