PL59084B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 26.111.1966 Holandia Opublikowano: 1.IY.1970 59084 KI. 6 a, 22/04 MKP C 2« yftl* Wlasciciel patentu: N.V. ORGANON, Oss (Holandia) Sposób oczyszczania preparatów amyloglikozydazy Wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania prepa¬ ratów amyloglikozydazy, okreslonej dalej krótko en¬ zymem.Jest rzecza powszechnie znana, ze enzym ten po¬ chodzenia mikrobiologicznego — znany równiez pod 5 nazwa glikoamylazy, gamma—amylazy i, blednie, maltazy — zdolny jest rozkladac skrobie lub wstep¬ nie zhydrolizowana skrobie na glikoze. Rozklad ten zaczyna sie od nieredukujacego zakonczenia cza¬ steczki. 10 Preparaty tego enzymu z reguly odzyskuje sie z plynu hodowlanego i/lub z materialu komórkowego mikroorganizmów, szczególnie grzybów. Doskona¬ lym zródlem enzymu sa takie gatunki jak Rhizopus, Endomyces i Aspergillus. Szeroko stosowanymi or- 15 ganizmami w przemysle sa gatunki Aspergillus, ta¬ kie jak Aspergillus niger, poniewaz otrzymuje sie z nich enzym z duza wydajnoscia. Jednakze wartosc tych atrakcyjnych zródel zmniejsza fakt, ze wytwa¬ rzaniu pozadanego enzymu prawie zawsze towarzy- 20 szy powstawanie niepozadanej transglikozydazy.Dzialanie transglikozydazy powoduje tworzenie sie (1 -^6) wiazan ^likozydowych z (1 -h^4) wiazan gliko- zydowyeh. Powstajace izo-cukry, takie jak izomal- toza, panoza i izomaltotrioza albo wcale nie moga 25 byc rozlozone przez amyloglikozydaze do glikozy, albo tylko z wielka trudnoscia (J. Biol. Chem. 237.1002/1962).Tworzenie sie izo-cukrów prowadzi wiec do zmniejszenia wydajnosci glikozy, a równoczesnie 30 wykrystalizowanie glikozy ze skoncentrowanych hy¬ drolizatów skrobii jest hamowane przez obecnosc izo-cukrów. Wreszcie obecnosc izo-cukrów powaznie ogranicza iprzydatnosc macierzystych roztworów krystalizatów glikozy ze wzgledu na ich gorzki smak. Stad jest jasne, ze obecnosc transglikozydazy w otrzymywaniu amyloglikozydazy jest wysoce nie¬ pozadana. Bez watpienia najwazniejsza z przyczyn, dla której szczepy Rhizopus uzywane sa do pro¬ dukcji enzymu jest równiez to, ze nie wytwarzaja one transglikozydazy. Wytwarzanie amyloglikozyda¬ zy ze szczepów Rhizopus zwiazane jest jednakze z niedogodnoscia wynikajaca stad, ze otrzymywane wydajnosci sa bardzo niskie w porównaniu z wy¬ dajnosciami uzyskiwanymi ze szczepów Aspergillus.Poza tym prowadzenie wglebnej hodowli szczepów Rhizopus jest bardzo trudne, szczególnie z ,powodu kruchosci grzybni.Czynione byly rózne starania, aby udoskonalic otrzymywanie tego enzymu przez usuniecie transgli¬ kozydazy. I tak brytyjski opis patentowy nr 849.509 omawia metode selektywnej absorbeji transglikozy¬ dazy za pomoca syntetycznych krzemianów mag¬ nezu. Niedogodnoscia tego sposobu jest to, ze jest on trudno powtarzalny.Wedlug opisu patentowego St. Zjedn. Am. nr 3.108.928 transglikozydaza moze byc selektywnie dezaktywowana przez obróbke roztworu w ciagu 1/2 do 24 godzin przy wartosci pH = 9—11. Jed¬ nakze sposób ten wykazuje szereg niedogodnosci. 590843 Roztwory fermentacyjne prawie zawsze zawieraja nieprzetworzone cukry i proteiny lub produkty ich rozkladu zdolne do tworzenia — przez reakcje Mail- lard'a przy wartosci pH = 9—11 — brazowych pro¬ duktów kondensacji, co stanowi przeszkode przy produkcji dekstrozy. Ponadto do tego oczyszczania potrzebne sa duze ilosci zasad, poniewaz pod ko¬ niec reakcji wartosc pH staje sie niska, mianowicie okolo 2,5—3,5. Wreszcie w koncowym produkcie tworzy sie znaczna ilosc soli, która trzeba usunac w czasie otrzymywania dekstrozy. Wiadomo, ze en¬ zymy w silnym srodowisku kwasowym, np. ponizej wartosci pH = 2 sa na ogól bardzo nietrwale. Zna¬ nym wyjatkiem jest pepsyna. Co do transglikozy- dazy to wedlug Chem. Abstracts 63,16678a (1965), jest raczej tfwala przy tej wartosci pH.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze mozna oczyszczac preparaty amyloglikozydazowe przez przetrzymywa¬ nie surowego wodnego roztworu enzymu w inkuba¬ torze przy wartosci pH ponizej 2,5, co jprowadzi do inaktywacji transglikozydazy. Doprowadzanie suro¬ wego roztworu enzymu do pozadanej wartosci pH osiaga si^ przez dodawanie kwasu nieczynnego po¬ wierzchniowo.Inaktywacja transglikozydazy zachodzi bez zau¬ wazalnej straty aktywnosci amyloglikozydazy. Spo¬ sób wedlug wynalazku jest wiec prosty i ekono¬ miczny, poniewaz wymaga tylko dodania wystarcza¬ jacej ilosci kwasu, aby otrzymac zadana wartosc pH; pozostale dodatki sa nieistotne. Ilosc tworza¬ cych sie przy tym soli jest znacznie mniejsza niz ,przy zasadowym rozkladzie transglikozydazy, a równoczesnie wielka zaleta wynalazku jest nie- tworzenie sie barwnych produktów kondensacji.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze w pokojowej tem¬ peraturze amyloglikozydaza jest trwala przy war¬ tosci pH okolo 2 w czasie ponad 24 godzin. Poza¬ dana niska wartosc pH osiaga sie za pomoca silnych kwasów. Warunkiem jest oczywiscie, aby uzyty kwas nie mial szkodliwego wplywu na enzym. Stad nieodpowiednie sa kwasy posiadajace aktywnosc powierzchniowa. Konwencjonalnymi kwasami sa, na przyklad, kwas solny, kwas siarkowy, kwas fos¬ forowy, kwas cytrynowy, kwas szczawiowy, kwas octowy i kwas mrówkowy.Znana z brytyjskiego opisu patentowego nr 913705 metoda oczyszczania amyloglikozydazy polega na dodawaniu do jej roztworu wodnego ligniny lub kwasu taninowego, przy wartosci pH = 2—5, ko¬ rzystnie 3—4. Substancje te sa czynnikami wytraca¬ jacymi lub koagulujacymi wobec transglikozydazy.Wytracony osad oddziela sie od roztworu. W prze¬ ciwienstwie do tego, w sposobie wedlug wynalazku nie stosuje sie "dodatkowej substancji pomocniczej, Transglikozydaza zostaje inaktywowana, a nie wy¬ tracona, przy czym korzystny zakres wartosci pH jest ponizej 2.Równiez brytyjski opis patentowy nr 951486 oma¬ wia stosowanie czynnika rafinujacego lub koagulu- jacego, okreslanego równiez jako czynnik wytraca¬ jacy proteine, w celu usuniecia transglikozydazy z wodnego roztworu aonylogldkozydazy przy wartosci pH = 3—5. Wytracony osad oddziela sie. Stosowane koagulanty odznaczaja sie wlasciwosciami po¬ wierzchniowo czynnymi. W odróznieniu od tych me¬ tod, w sposobie wedlug wynalazku, niepotrzebne 59084 ' 4 sa srodki rafinujace, a kwasy o wlasciwosciach po¬ wierzchniowo czynnych sa wyki/uczone. Odpada równiez operacja filtrowania, wsfcultek inaktywacji transglikozydazy, a nie wytracania jej. 5 Preparaty amyloglikozydazowe otrzymane sposo¬ bem wedlug wynalazku wykazuja bardzo korzystne wlasciwosci przy stosowaniu ich do wytwarzania dekstrozy ze skrobii, ewentualnie — po podniesieniu pH do wartosci, przy której enzym wykazuje mak¬ io symalna stabilnosc. We wszystkich preparatach wi¬ doczna byla poprawa rmalksymalnej wartosci D.U, w stosunku do preparatów nie poddawanych obrób¬ ce wedlug wynalazku. We wszystkich przypadkach uzyskuje sie wartosci D.U. wynoszace 98—98,5%. 15 Wartosc D.U. oznacza ilosc utworzonych cukrów redukujacych w przeliczeniu na glikoze, podzielona przez ilosc teoretycznie mozliwej do otrzymania gli- kozy przez hydrolize skrobi x 100%.Sposób selektywnego rozkladu transglikozydazy 20 mozna stosowac do plynów hodowlanych zarówno w obecnosci mikroorganizmu wytwarzajacego en¬ zym lub w jego nieobecnosci jak i do koncentratów preparatu enzymowego.Do plynu hodowlanego, zawierajacego lub nieza- 25 wierajacego mikroorganizm wytwarzajacy enzym, lub do koncentratu plynu hodowlanego, dodaje sie kwas podczas mieszania az do osiagniecia pozadanej wartosci pH. Plyn hodowlany lub koncentrat enzy¬ mu przetrzymuje sie w inkubatorze przy uzyskanej 30 wartosci pH w ciagu 15 minut do 24 godzin, zaleznie od wartosci pH, korzystnie w temperaturze ponizej 40° C. Istnieje pewna korelacja miedzy przyjeta wartoscia pH, czasem przetrzymywania w inkuba¬ torze i temperatura. Obecna w preparacie transgli- 35 kozydaza inaktywuje sie szybciej przy nizszej war¬ tosci pH i w wyzszej temperaturze. Z technicznego punktu widzenia wartosc pH okolo 1,9 okazala sie najkorzystniejsza. W zasadzie proces mozna prowa¬ dzic w temperaturze nawet ponizej 0° C, jezeli jako produkt wyjsciowy bierze sie wysoko skoncentrowa¬ na amyloglikozydaze.Ponadto stwierdzono, ze przy duzym stezeniu soli w preparacie, jak np. w przypadku koncentra¬ tów enzymu inaktywacja transglikozydazy oraz Mm równiez amyloglikozydazy przebiega szybciej, aby 45 wiec uniknac strat w aktywnosci amyloglikozydazy nalezy stosowac lagodniejsze warunki, np. krótszy czas przetrzymywania w inkubatorze, wyzsza war¬ tosc pH lub nizsza temperature. W przypadku ste¬ zenia okolo 0,5 molowego jednej lub kilku soli takich jak NH4C1, Nad, CaClg i MgS04 korzystnie przetrzymywanie w inkubatorze prowadzi sie w po¬ kojowej temperaturze w ciagu 6 godzin przy war¬ tosci pH = 2,4. 55 Jezeli dobierze sie odpowiednia kombinacje war¬ tosci pH, czasu przetrzymywania w inkubatorze i temperatury, mozna zlikwidowac ponad 90% [wy¬ kazywanej poczatkowo aktywnosci transglikozy¬ dazy, podczas gdy strata aktywnosci amyloglikozy¬ dazy jest ibardzo niska i dochodzi najwyzej do 5*Ve.Jezeli jako material wyjsciowy stosuje sie plyny hodowlane, najlepsze wydajnoisci otrzymuje sie przez przetrzymywanie w inkubatorze w ciagu okolo 24 godzin przy wartosci ,pH okolo 1,9 w po¬ kojowej temperaturze. 65 Nalezy równiez iwziac pod uwage, ze czesc straty59084 aktywnosci amyloglikozydazy nalezy przypisac inaktywacji 'transglikozydazy, która równiez ma zdolnosc rozkladania sikrobi. (Arch. Bioch. Biphyis. 93, 43 (1961) i wobec tego przyczynia sie do aktyw¬ nosci amyloglikozydazy, co zostalo nizej uzasad¬ nione.Po traktowaniu preparatu enzymowego sposobem wedlug wynalazku, mozna poddawac go obróbce konwencjonalnej polegajacej na doprowadzeniu pH do wartosci, przy której stabilnosc enzymu jest najwyzsza, na ogól do^wartosci pH = 3—6, a ko¬ rzystnie 4,0—4,5. Tak przygotowane preparaty enzy- mowe daja bardzo wysokie wydajnosci przy prze¬ prowadzeniu skrobi w gliikoze konwencjonalnymi sposobami i osiagniecie wartosci D.U. do okolo 98— 98,5°/o.Przetrzymywanie w inkubatorze przy wartosci pH okolo 2,4— sposobem wedlug wynalazku moze rów¬ niez miec miejsce juz w czasie ostatniego stadium fermentacji, w którym tworzy sie amyloglikozydaza, na przyklad w czasie ostatnich 3 godzin, w wa¬ runkach maksymalnie dostosowanych do warun¬ ków fermentacji, co daje duze korzysci techniczne.Konwencjonalne sposoby okreslenia aktywnosci amyloglikozydazy polegaja na okresleniu ilosci gli- kozy uwolnionej w czasie dzialania amyloglikozy¬ dazy na rozpuszczalna skrobie. Sposób nizej opisany odarty jest na metoclzie okreslenia uwolnionej gli- kozy wedlug Samogyi'ego i Nelson'a (J. Biol. Chem. 195, 19 (19*52).Zgodnie z zaleceniami Miedzynarodowej Unii Biochemicznej jednostke aktywnosci amyloglikozy¬ dazy okresla, sie jako ilosc enzymu tworzaca Ip mol glikozy na minute w warunkach oznaczenia, w tym przypadku przy wartosci pH = 4,5 w temperaturze 40°C. i Oznaczenie przeprowadza sie nastepujaco: 0,8 ml 0.05 M roztworu buforowego octanu sodu o wartos¬ ci pH = 4,5 miesza sie z 1,0 ml roztworu zawiera¬ jacego 0,1% rozpuszczalnej sikrobi. Temperature mieszaniny utrzymuje sie w termostacie na pozio¬ mie 40,0°C + 0,1°C. Nastepnie dodaje sie 0,2 ml roz¬ tworu enzymu, zawierajacego 0,025 do 0,25 U/ml.Po uplywie dokladnie 15 minut dodaje sie 2,0 ml reagentu Samogyi'ego. Nastepnie mieszanine reagu¬ jaca podgrzewa sie we wrzacej wodnej kapieli scisle w ciagu 10 minut. Po schlodzeniu dodaje sie 2,0 ml reagentu Nelsona i po zmieszaniu mierzy sie ekstynkcje powstalego roztworu. Slepa próbe przeprowadza sie przez dodanie najpierw reagentu Samogyi'ego a potem 0,2 ml roztworu enzymu.Znaleziona wartosc porównywuje sie z wartoscia dla standartowego roztworu glikozy, oznaczona tym samym sposobem. Aktywnosc enzymu oblicza sie wedlug nastepujacego wzoru: n.Ee < Aktywnosc= 540 Eg w którym Eg = ekstynkcja standardu glikozy minus oznaczenie bialosci przy 520 m/u Ee = ekstynkcja oznaczenia enzymu mi¬ nus slepa próba przy 520 mj* n = mikrogramy glikozy na 0,2 ml stan¬ dartowego roztworu gjlikozy.Oznaczenie aktywnosci transglikozydazy Oznaczenie oparte jest na tworzeniu sie izomal- tozy i panozy z maltozy, pod wyplywem transgliko- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6 zydazy. Stezenie maflitozy wynosi 5% i zostalo tak dobrane, azeby ponowna synteza izomaltozy z gliko¬ zy powstalej pod wplywem amyloglikozydazy wy¬ stepowala w stopniu nieznacznym.Do 10 ml 5% roztworu maltozy w 0,05 M bufo¬ rowym roztworze octanu sodu w temiperaturze 60°C dodaje sie okolo 12,5 U roztworu amyloglikozydazy, zawierajacego transglikozydaze. Mieszanine reagu¬ jaca przetrzymuje sie w inkubatorze w ciagu 2,5 godziny w temperaturze 60°G. Po dodaniu — dla zatrzymania reakcji — 2 ml 30% (kwasu trójchlo- rooctowego, oddziela sie na chromatogramie bibu¬ lowym 10 ml mieszaniny reagujacej za pomoca mieszaniny n. butanolu, pirydyny i wody w stosun¬ ku 6:4:3, jako ruchomego roztworu.Po wysuszeniu rozwinietego chromatogramu pla¬ my cukru uwidacznia sie za pomoca czulego rea¬ gentu. Odpowiednim odczynnikiem jest acetonowy roztwór azotanu srebra zawierajacy 1 ml nasyconego azotanu srebra w 200 ml acetonu, dopelniony woda destylowana w ilosci, rozpuszczajacej caly osad.Chromatogram zanurzony w reagencie suszy sie, po czym zanurza w 0,5 N roztworze metanolowym wodorotlenku metalu alkalicznego, a nastepnie w ciagu jednej minuty utrzymuje nad para wrzacej wody. Nadmiar reagentu usuwa sie przez przemy¬ wanie 10% roztworem tiosiarczanu sodu w ciagu 20 minut. Utworzone iplamy utrwala sie przez 10 minut 1% kwasem octowym. Wreszcie chromato¬ gram splukuje sie woda w ciagu 1 godziny. Aktyw¬ nosc transglikozydazy oznacza sie przez zmierzenie plamy panozy na chromatogramie metoda densyto- metryczna i porównanie ze standardem.Wartosc D.U. oznaczono nastepujaco: do okolo 30% hydrolizatu skrobi, przygotowanego konwen¬ cjonalnym sposobem przez przeprowadzenie hydro¬ lizy skrobi rozcienczonym kwasem solnym lub alfa-amylaza dodawano okolo 3—10 jednostek amy¬ loglikozydazy na gram skrobi. Po doprowadzeniu wartosci pH do 4,0 roztwór skrobi dalej hydrolizo- wano w ciagu 50—65 godzin w temperaturze 60°C.Przy zakonczeniu hydrolizy zmierzono zawartosc glikozy, przez oznaczenie zawartosci cukrów reduk¬ cyjnych metoda Samogyi'ego i Nelson'a (J. Biol.Chem. 195, 19 (1952), co pozwolilo obliczyc war¬ toscD.U. " Przyklad I A. Do 400 ml przesaczu z ho- . dowli Aspergillus niger, zawierajacego 46,5 U/ml enzymu dodano stale mieszajac 1,5 N kwas solny az do osiagniecia wartosci pH = 1,88 i przetrzymy¬ wano w pokojowej temperaturze. W ciagu 24 godzin pobrano pewna liczbe próbek, z których oznaczono aktywnosc amyloglikozydazy i transglikozydazy.Nizej podana tablica wykazuje, ze po 24 godzinach pierwotnie wykazywana aktywnosc transglikozyda¬ zy zostala zmniejszona o 90%. 60 65 Okres czasu (godziny) 0 1.50 3 4.50 6 16 24 Aktywnosc amylo¬ glikozydazy w% 100 100 98 96 95 95 S5 ( Aktywnosc trans¬ glikozydazy w % 100 98 78 57 41 20 1059084 B. Otrzymany Sfposobem opisanym pod A prze¬ sacz z hodowli o wartosci pH=l,88 doprowadzono 2N amoniakieim do wartosci pH = 4,5. 150 g skrobi ziemniaczanej zhydrolizowano wstepnie alfa-amyla- za w 250 g wody, w temperaturze 80°C do wartosci D.U. okolo 10. Po ogrzaniu w autoklawie w tem¬ peraturze 135° w celu inaktywacji alfaamylazy, do¬ dano, 50 ml roztworu buforowego z octanu sodu o wartosci pH = 4,0. Nastepnie dodano 12 ml nie traktowanego preparatu enzymu, którego wartosc pH byla równiez doprowadzona 2N amoniakiem do 4,5. Do takiej samej ilosci wstepnie hydrolizowanej skrobi dodano 13,6 ml preparatu enzymowego pod¬ danego obróbce sposobem opisanym pod A. Kazda z tych dwóch mieszanin zawierala Okolo 525 U.Mieszaniny przetrzymywano w temperaturze 60°C w ciagu 64 godzin, po czym oznaczono wartosc D.U.Przed traktowa- Po traktowaniu niem kwasem kwasem i 10 15 20 Wartosc D.U. j 95,2 PL PL PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oczyszczania preparatów amyloglikozyda- zy, znamienny tym, ze wodny roztwór amylogliko- zydazy doprowadza sie do wartosci ipH ponizej 2,5 za pomoca nieczynnego powierzchniowo kwasu i 10 przetrzymuje w inkubatorze do uzyskania inakty- wacji transglikozydazy, obecnej w roztworze jako zanieczyszczenie.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wod- 5 ny roztwór amyloglikozydazy doprowadza sie do wartosci pH okolo 1£9.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze o- czyszczeniu poddaje sie plyn z hodowli mikroorga¬ nizmu. 10

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze plyn hodowlany doprowadza sie do wartosci pH okolo 1,9 i przetrzymuje w inkubatorze w ciagu 24 go¬ dzin.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze kon- 15 centrat amyloglikozydazy zawierajacy jedna lub kilka soli takich jak chlorek amonu, chlorek sodu, chlorek wapnia i siarczan magnezu w stezeniu mo¬ lowym okolo 0,5 doprowadza sie do wartosci pH = = 2,4 i przetrzymuje w inkubatorze w ciagu 6 go¬ dzin. PL PL PL