PL58475B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 13. VIII. 1965 Stany Zjednoczone Ameryki Opublikowano: 30. X. 1969 58475 KI. 30 h, 6 MKP C 12 k s\oo UKD Wlasciciel patentu: Merck and Co., Inc., Rahway (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania szczepionki przeciw swince Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia szczepionki przeciw swince, zawierajacej osla¬ biony zywy wirus swinki. Na skutek oslabienia, wirus swinki zawarty w szczepionce nie wywoluje reakcji klinicznych lub wywoluje te reakcje tylko w niewielkim stopniu, natomiast w wysokim stop¬ niu powoduje w ludzkim organizmie wytwarzanie przeciwcial przeciw wirusowi swinki i tym samym stanowi istotna ochrone przed infekcja wirusem i przed choroba.Swinke, podobnie jak i odre, zwykle traktuje sie jako jedna z mniej powaznych chorób okresu dzieciecego. W typowym przypadku klinicznym tak jest istotnie. Jednak w przypadkach klinicz¬ nie nietypowych, konsekwencje infekcji wirusem swinki moga byc ciezkie, a nastepstwa choroby moga byc równie niszczace jak i w przypadku odry z komplikacjami.W typowym przypadku swinki ostry etap go¬ raczkowy nastepuje po 18—21 dniowym okresie inkubacyjnym. Zasadniczymi objawami klinicznymi sa: goraczka wraz z jednostronnym lub dwustron¬ nym opuchnieciem przyusznym, a niekiedy i po¬ wiklania, obejmujace gruczol podzuchwowy i gru¬ czol podjezykowy.Infekcji wirusem swinki zwykle towarzyszy wi¬ remia jak równiez moga nastapic powiklania w szeregu takich organów i ukladów jak epidi- dymis, stercz, jajniki, watroba, trzustka, sledzio¬ na, tarczyca, nerki, blednik uszny, oczy, grasica, 10 15 25 30 osierdzie, gruczoly piersiowe i centralny system nerwowy. Do najwazniejszych objawów chorobo¬ wych naleza: encephalitis, encephalomyelifcis, za¬ palenie nerwów twarzowych, trójdzielczego lub ocznych, aseptyczne zapalenie opon mózgowych (0,5—10% przypadków), scleritis, pancreatitis pro¬ wadzace niekiedy do cukrzycy oraz architis lub ovaritLS prowadzace niekiedy do atrofii i nieplod¬ nosci. U dzieci powazne komplikacje wystepuja rzadko. Znacznie grozniejsze niebezpieczenstwa to¬ warzysza infekcji u ludzi doroslych, którzy unik¬ neli tej choroby w dziecinstwie.Bezkomplikacyjna swinka u dzieci wyczerpuje i meczy rodziców i powoduje dluzsza absencje w szkole. Natomiast swinka z komplikacjami, za¬ równo w wieku dzieciecym jak i doroslym moze miec zakres od lekkich dolegliwosci z pozornym wyzdrowieniem, az do zniszczenia i spowodowa¬ nia niewydolnosci podstawowych systemów orga¬ nizmu, co moze spowodowac smierc lub trwale kalectwo.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia szczepionki przeciw swince, zawierajacej osla¬ biony zywy wirus swinki i powodujacej powsta¬ wanie w organizmie ludzkim przeciwcial przeciw wirusowi swinki, bez równoczesnego wywolywa¬ nia ciezkich objawów choroby. Sposób ten polega na tym, ze zjadliwy wirus swinki izoluje sie i ho¬ duje przeprowadzajac co najmniej 10, a korzyst¬ nie 15 kolejnych pasazy w zaplodnionych jajach 5847558475 3 kurzych otoczonych skorupa, powodujac stopniowe oslabienie wirusa, który nastepnie rozmnaza sie w temperaturze 30—38dC w kulturze zawierajacej tkanke 9—11-dniowego zarodka kurczecia. W ostat¬ niej fazie procesu z oslabionego, zywego wirusa wytwarza sie szczepionke.Wyodrebnianie i adaptacje zjadliwego wirusa do dalszej hodowli prowadzi sie w kulturze z za¬ rodka kurczecia, stosujac jako zródlo wirusa ma¬ terial kliniczny, na przyklad tampony z gardla osób chorych na swinke lub wirus uprzednio ho¬ dowany w zaplodnionych jajach kurzych. Inku¬ bacje zakazonych kultur prowadzi sie w tempe¬ raturze 30—34°C, korzystnie w temperaturze 32°C, albo w temperaturze 35—38°C, korzystnie 36°C.Typowe metody wyodrebniania sa nastepujace.Metoda pierwsza polega na wyodrebnianiu wi¬ rusa w zaplodnionych jajach kurzych z materialu klinicznego, to jest od osób chorych na swinke.Druga metoda polega na wyodrebnianiu wirusa w kulturze tkankowej z zarodka kurczecia, w oparciu o material kliniczny.Wyodrebniony i zidentyfikowany wirus swinki wprowadza sie do szklanych kolb, zawierajacych kultury tkankowe z zarodka kurczecia. Kultury te sporzadza sie z posiekanych i poddanych dziala¬ niu trypsyny, w przyblizeniu 10-dniowych zarod¬ ków kurczecia. Srodowiskiem kulturowym moze byc dowolne medium podtrzymujace wzrost ko¬ mórek, na przyklad tak zwane medium 199, z do¬ datkiem surowicy cielecej. Medium 199, opisane szczególowo w opisach patentowych Stanów Zjed¬ noczonych Ameryki nr 3 143 470 i nr 3 249 504, za¬ wiera aminokwasy, witaiminy, niebialkowe czyn¬ niki wzrostowe, cukry i sole nieorganiczne oraz ewentualnie antybiotyki, na przyklad penicyline lub streptomycyne.Po wprowadzeniu wirusa, zakazone kultury pod¬ daje sie inkubacji w kolejnych pasazach w tem¬ peraturze 30—38°C, w ciagu róznych okresów czasu, przy czym wirus rozmnaza sie i ulega oslabieniu. Plyny zawierajace wirus gromadzi sie i przechowuje w stanie zamrozonym lub w tem¬ peraturze odpowiednio niskiej, aby zachowac za¬ kazne wlasciwosci preparatu. Kolejne pasaze prze¬ prowadza sie stosujac rozcienczony material za¬ rodnikowy i w róznych okresach dokonujac wie¬ lokrotnie zbiorów. Okreslanie sily dzialania za¬ kaznego przeprowadza sie przy uzyciu kultury HeLa albo kultury tkankowej z nerki malpy lub z zarodnika kurczecia.Stwierdzono, ze wirus swinki zebrany po po¬ wtarzanym pasazu seryjnym nie dziala patogeni¬ cznie na malpki i gryzonie, u ludzi nie wywo¬ luje reakcji klinicznych lub reakcje te sa bardzo slabe, natomiast .powoduje znaczna produkcje przeciwcial. Dzialanie wirusa utrwala sie za po- pioca (odpowiednich stabilizatorów takich jak sacharoza, albumina ludzka, glutamina, fosforany oraz ich mieszaniny. Po okresleniu sily dzialania, partie hodowlana rozdziela sie do ampulek prze¬ znaczonych do uzytku. Produkt mozna przecho¬ wywac i rozprowadzac w stanie zamrozonym lub najkorzystniej w stanie liofilizowanym.Wynalazek jest blizej wyjasniony w nizej po¬ danych przykladach.Przyklad I. Material posiewowy otrzymuje sie pierwsza z dwóch wyzej podanych metod. 5 Dziewiecio-jedenastodniowe zarodki kurczecia po¬ zbawia sie glów i konczyn i drobno sieka w wa¬ runkach scisle aseptycznych, po czym rozdrobniona tkanke wielokrotnie przemywa sie roztworem Hanks'a. Nastepnie przemyta tkanke poddaje sie io dzialaniu trypsyny w ciagu 2—3 godzin w tempe¬ raturze 36°C, przy czym stosuje sie 0,25% tryp¬ syny (Difco 1 :250) w solankowym roztworze bu¬ forowym. Zawiesine trypsynowanych komórek filtruje sie przez sterylne plótno serowarskie 15 o dwóch gestosciach i nastepnie odwirowuje w ciagu 5 minut przy 1500 obr/min.Zebrane komórki ponownie przeprowadza sie w stan zawiesiny w medium wzrostowym, w celu ich policzenia. Jako medium wzrostowe stosuje 20 sie medium 199 z dodatkiem 2% gamma — suro¬ wicy cielecej, ogrzanej do temperatury 56°C w ciagu 30 minut 50 mcg/ml neomycyny. Kultury w szklanych kolbach hoduje sie przy zawartosci 350 000 zdolnych do zycia komórek w 1 ml. Po 25 48—72, a korzystanie po 60 godzinach inkubacji w temperaturze 36°C, kultury te mozna uzyc do pasazu seryjnego lub do wytwarzania szczepionki.Kultury oparte na tkance z zarodka kurczecia sporzadza sie w szklanych kolbach stosujac jako 30 medium wzrostowe medium 199, zawierajace 2°/o pozbawionej aktywnosci surowicy cielecej. Po uplywie 3—4 dni od rozpoczecia hodowli, odciaga sie medium wzrostowe aseptycznie, przemywa kultury czterokrotnie roztworem Hanks'a w por- 35 cjach po 100 ml i szczepi, stosujac 2,5 ml rozcien¬ czonej kultury posiewowej wirusa swinki na 1 kolbe. Nastepnie dodaje sie 70 ml medium 199 zawierajacego 10% odpowiedniego srodka stabi¬ lizujacego dzialanie zakazne wirusa, po czym 40 kultury poddaje sie inkubacji w temperaturze 32°C.Do medium wzrostowego i podtrzymujacego wprowadza sie neomycyne w takiej ilosci, aby jej stezenie wynosilo 50 mcg/ml. Wielokrotnych zbio- 45 rów dokonuje sie w odstepach 2—4-dniowych, przy czym kultury zasila sie swieza pozywka podtrzymujaca, która zawiera wyzej wspomniany stabilizator. Przeprowadza sie 10 kolejnych pa¬ sazy, wszystkie w temperaturze okolo 32°C. 5f Oznaczanie dzialania zakaznego dokonuje sie w kulturze HeLa lub tkankowej z nerki malpy.Kazdy zbiór gromadzi sie w warunkach aseptycz¬ nych w sterylnym zbiorniku i pobiera próbki w celu sprawdzenia sterylnosci mikrobiologicznej 55 zas pozostalosc zamraza w mieszaninie oziebia¬ jacej suchy lód — alkohol. Przed selekcja zbioru lub zbiorów dla sporzadzania szczepionki plyny zawierajace wirus przechowuje sie w temperatu¬ rze —70°C w elektrycznej zamrazarce. 60 Selekcji tej dokonuje sie po zebraniu wyników z okreslania dzialania zakaznego, wytypowany material wyjmuje sie z zamrazarki i doprowadza do odtajania, po czym pobiera sie próbke do ba¬ dania kontrolnego i okreslenia czy material jest 65 bezpieczny. Reszte plynu klaruje sie i ponownie58475 6 pobiera próbke do sprawdzenia na malpach czy material jest bezpieczny. Z kolei do plynu dodaje sie dodatkowego odpowiedniego stabilizatora, roz¬ lewa do osobnych fiolek i suszy. Po zakonczeniu suszenia, fiolki kapsluje sie i uszczelnia. Szcze¬ pionke odtwarza sie przez dodanie do fiolki ste¬ rylnej wody.Próby na ludziach. Dawke szczepionki zawie¬ rajacej oslabiony wirus swinki otrzymalo poza- jelitowo okolo 150 dzieci, które uprzednio nie chorowaly na swinke. W ciagu miesiaca od szcze¬ pienia wszystkie dzieci zareagowaly wyraznym odczynem przeciwcialowym. Przy tym w zalez¬ nosci od szczepu wirusa swinki i ilosci pasazy w zaplodnionych kurzych jajach lub w kulturze tkankowej zarodka kurczecia, u dzieci wystapily bardzo slabe objawy kliniczne choroby lub w ogóle objawy te nie wystapily.Przyklad II. Powtarza sie tok postepowania opisany w przykladzie I z tym, ze inkubacje przeprowadza sie w temperaturze 36°C.Przyklad III. Postepuje sie w sposób po¬ dany w przykladzie I, lecz stosujac posiew wi¬ rusa swinki otrzymany druga z wyzej opisanych metod.W celu oslabienia wirusa mozna dokonac wie¬ cej lub mniej pasazy wirusa w kulturze tkanko¬ wej z zarodka kurczecia. Mozna równiez prze¬ prowadzic to seryjnymi pasazami w zaplodnionych jajach kurzych. Taki tok postepowania ilustruja ponizsze przyklady, w których ZJK oznacza za¬ plodnione jaja kurze, zas KTZK oznacza kulture oparta na tkance zarodka kurczecia. Szczególnie dobre wyniki uzyskuje sie w warunkach poda¬ nych w przykladach Va i Vb.Przyklad IV. 36°C + 1 KTZK w Przyklad V. 36°C + 10 KTZK w Przyklad Va. 36°C + 2 KTZK w Przyklad Vb. 36°C + 2 KTZK w 3 ZJK w temperaturze temperaturze 36°C. 10 ZJK w temperaturze temperaturze 36°C. 10 ZJK w temperaturze temperaturze 36°C. 15 ZJK w temperaturze temperaturze 36°C.Przyklad VI. 20 ZJK w temperaturze 36 °C + 2 KTZK w temperaturze 36°C.Przyklad VII. Bezposrednie wyodrebnie¬ nie z KTZK w temperaturze 36°C + 1 KTZK w temperaturze 32 °C.Przyklad VIII. Bezposrednie wyodrebnie¬ nie z KTZK w temperaturze 36°C + 10 KTZK w temperaturze 32°C. 10 Przyklad IX. Bezposrednie wyodrebnienie z KTZK w temperaturze 36°C + 1 KTZK w tem¬ peraturze 36°C.Przyklad X. Bezposrednie wyodrebnienie z KTZK w temperaturze 36°C + 10 KTZK w tem- 15 peraturze 36 °C.W celu oslabienia wirusa swinki szczególna uwage poswiecono w niniejszym opisie dziesieciu pasazom seryjnym poprzez KTZK, lecz zrozumia¬ lym jest, ze dla oslabienia wirusa wystarczyc 20 moze takze i mniejsza liczba pasazy. Równiez pojedyncza inkubacja w KTZK pozwala uzyskac wirus, który w organizmie ludzkim wywoluje produkcje przeciwcial z jednoczesnym obnizeniem symptomów choroby. Kolejne pasaze po pierwszej' 25 hodowli w KTZK powoduja dalsze oslabienie wirusa. ¦'¦:¦ PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 30 1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciw swince, zawierajacej oslabiony zywy wirus swinki, znamienny tym, ze zjadliwy wirus swinki hoduje sie przeprowadzajac co naj- 35 mniej 10 kolejnych pasazy w zaplodnionych jajach kurzych, co powoduje stopniowe osla¬ bianie wirusa, a nastepnie rozmnaza sie go w temperaturze 30—38°C, w kulturze zawie¬ rajacej tkanke 9—11-dniowego zarodka kur- 40 czecia.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przeprowadza sie 15 kolejnych pasazy zaplod¬ nionych jajach kurzych i dwukrotny zabieg rozmnazania w kulturze zawierajacej tkanke zarodka kurczecia. PL PL PL