Pierwszenstwo: Opublikowano: 20.X.1969 58154 KI. 42 1, 3/06 MKP G 01 . &%\& UKD Twórca wynalazku: dr Anastazy Wronski Wlasciciel patentu: Ministerstwo Obrony Narodowej (Glówne Kwater¬ mistrzostwo Wojska Polskiego), Warszawa (Polska) Sposób rozdzielania aminokwasów za pomoca jonoforezy srednio- napieciowej oraz urzadzenie do stosowania tego sposobu Przedmiotem wynalazku jest sposób rozdziela¬ nia aminokwasów za pomoca jonoforezy srednio- napieciowej oraz urzadzenie do stosowania tego sposobu.Szerokie zainteresowanie przemiana aminokwa¬ sów we wszystkich dyscyplinach medycznych po¬ woduje koniecznosc badania pelnego skladu ami- nokwasowego w plynach ustrojowych i róznych hy¬ drolizatach bialkowych oraz w substancjach biolo¬ gicznych.W tych hydrolizatach lub naturalnych plynach ustrojowych zmieszane sa rozmaite aminokwasy tworzace wieloskladnikowe uklady. Szybkie roz¬ dzielanie tych mieszanin na poszczególne skladniki w celach analitycznych i diagnostycznych nastre¬ cza znaczne trudnosci, a w zidentyfikowaniu i ocenianiu ilosciowym poszczególnych skladników takich substancji i plynów zainteresowanych jest wiele dyscyplin naukowych.Znane dotad metody jonoforetycznego rozdzialu uzupelnione chromatografia podzialowa w celu calkowitego rozdzielenia skladników na pojedyn¬ cze plamki, sa uciazliwe, niezbyt dokladne, czaso¬ chlonne, jak równiez wymagaja skomplikowanych aparatur.Praktycznie biorac, w celu przeprowadzenia roz¬ dzialu aminokwasów, rozwinely sie szczególnie me¬ tody jonoforetyczne. Metody te sa szybsze od me¬ tod czysto chromatograficznych i pewniejsze od¬ nosnie do oceny uzyskanych wyników. Jednakze wszystkie znane metody tego rodzaju wymagaja jak dotad kosztownych urzadzen, sa bardzo ucia¬ zliwe w pracy i wymagaja znacznych nakladów czasu w celu uzyskania ostatecznych wyników.Metody jonoforetyczne daja sie zasadniczo po¬ dzielic na trzy grupy, rózniace sie miedzy soba stosowana wielkoscia przykladanego napiecia i spadku potencjalu.Pierwsza z nich jest metoda niskonapieciowa, stosujaca napiecia do okolo 220 V przy spadku po¬ tencjalu w zaleznosci od dlugosci nosnika do 10 V/cm i stosunkowo niskim natezeniu.Druga z nich jest metoda srednionapieciowa, stosujaca napiecia 220—1000 V i spadki potencja¬ lów wynoszace 10—20 V/cm. Znane te metody wykazuja slaba zdolnosc rozdzielcza do tego stop¬ nia, ze mieszaniny aminokwasów rozdzielaja sie jedynie na kilka stref, zaledwie na 3—5 grup aminokwasowych, co jest zupelnie nieprzydatne dla dokladnej identyfikacji wieloskladnikowych plynów ustrojowych lub biologicznych. Ponadto przeprowadzenie procesu wymaga zbyt duzo czasu.Modyfikacji tych metod w celu uczynienia ich przydatnymi bylo wiele. Jednakze efekty cieplne powstajace w wyniku wysokiego przewodnictwa elektrolitycznego stosowanych elektrolitów zmusza¬ ly do komplikowania aparatury przez stosowanie ukladów chlodzacych. Brak ich z uwagi na duze 30 parowanie elektrolitów na powierzchni nosnika 10 13 20 25 5815458154 powodowal zmiany stezenia elektrolitów, narusza¬ jace równowage stalosci biegu procesu.Stosunkowo najprzydatniejsza okazala sie me^ toda wysokonapieciowa, stosujaca napiecia powy¬ zej 1000 V, dochodzace w zaleznosci od aparatur i stosowanych metod do napiec powyzej 10.000 V, przy spadkach potencjalu na cm dlugosci nosnika dochodzacych do 150 V/cm.Metoda wysokonapieciowa wymaga jednak na¬ dzwyczaj skomplikowanych aparatur wskutek ko¬ niecznosci stosowania wysokosprawnych urzadzen chlodzacych, gdyz przy podanych spadkach poten¬ cjalu na cm dlugosci nosnika zachodzi tak szyb¬ kie parowanie elektrolitu buforowego, ze przy naj¬ mniejszej niedokladnosci dzialania aparatury chlo¬ dzacej dojsc moze nawet do zapalenia sie nosni¬ ka. Metody wysokonapieciowe, mimo stosunkowo dobrych zdolnosci rozdzialowych, pozwalaja na ogól uzyskac do okolo 10 stref rozdzialowych, przy czym chromatografia rozdzialowa uzyskanego jo- noforogramu pozostawia jeszcze stosunkowo duzo do zyczenia pod wzgledem wyrazistosci rozdzialu plam.Wedlug wynalazku okazalo sie, ze mozna uzyskac w stosunkowo krótkim czasie wysoki rozdzial aminokwasów wieloskladnikowych plynów ustrojo¬ wych, biologicznych itp. na ponad 10 oddzielnych stref, umozliwiajacy latwa jakosciowa i iloscio¬ wa identyfikacje zwiazków, gdy stosuje sie jono- foretyczna srednionapieciowa metode rozdzialu.Okazalo sie mianowicie, ze wyniki takie mozna uzyskac, gdy stosuje sie do rozdzialu przykladane do elektrod aparatury napiecia 600 V oraz spadki potencjalów na cm dlugosci nosnika wynoszace 15 V/cm. Ponadto okazalo sie, ze waznymi czyn¬ nikami sa nie tylko spadek potencjalu na cm, lecz jeszcze takie czynniki jak: stezenie i niskie pH elektrolitu buforowego.Okazalo sie równiez, ze duze znaczenie dla prze¬ prowadzenia sposobu rozdzialu wedlug wynalazku ma grubosc warstwy miedzy elektroda a zanurzo¬ nym w elektrolicie koncem nosnika. Wymagana dlugosc drogi pradu w elektrolicie osiaga sie przez laczenie wanienek o dlugosci okolo 320 mm kazda kluczami elektrolitycznymi. Najkorzystniejsze efek¬ ty rozdzialu uzyskuje sie przy stosowaniu elektro¬ litu: lodowaty kwas octowy — kwas mrówkowy — woda w stosunku okolo 200 :60 :740 i pH 1,5. Ja¬ ko nosnik stosuje sie w sposobie wedlug wynalaz¬ ku bibule o ustalonej .porowatosci, • jak bibuly Whatmana 1, o stosunku dlugosci do szerokosci 37 X 24 cm. Wazne jest tez wyznaczenie punktu startowego okolo 7 cm od anodowego konca bi¬ buly, w którym to miejscu nanosi sie mieszanine aminokwasów.Srednio proces jonoforezy trwa okolo 190—220 minut, zas w celu rozdzielenia jonoforogramu na poszczególne plamy, proces chromatografowania podzialowego wymaga jeszcze okolo 7 godzin, tak ze czynnosci od chwili naniesienia plam na nosnik wymagaja srednio 10—12 godzin.W przypadku zlozonej mieszaniny aminokwasów po rozdziale jonoforetycznym prowadzi sie dalszy rozdzial tych stref juz przy pomocy ogólnie zna¬ nej chromatografii podzialowej. W tym celu arkusz bibuly, po jonoforetycznym rozdziale, obraca sie o 90°, zawiesza w komorze chromatograficznej i 5 i rozwija aminokwasy technika wystepujaca w kierunku prostopadlym do poprzedniego w roz¬ puszczalniku n-butanol — kwas lodowaty — wo¬ da, najlepiej w stosunku 4:1:1. Po 7 godzinach rozwijania suszy sie bibule w temperaturze poko- io jowej do zaniku zapachu elektrolitu, a nastepnie wywoluje sie plamki aminokwasów przez zanu- * rzenie nosnika z przemieszczonymi plamami w roz¬ tworze ninhydryny. Plamy utrwala sie nastepnie najlepiej za pomoca traktowania ich solami 15 miedzi.Dotad znane urzadzenia do przeprowadzania jo¬ noforezy na pasmach bibuly lub na cienkich war¬ stwach nie nadaja sie do stosowania w sposobie wedlug wynalazku. 20 Znane urzadzenia z dwiema wannami na ele^ ktrolit mialy metalowe elektrody umieszczone na calej dlugosci naczynia lub tez polaczone z wan¬ nami oddzielnymi naczyniami elektrodowymi. W urzadzeniach tych nosnik o róznych ksztalttach i 25 duzych rozmiarach ulozony byl poziomo, opierajao sie cala swa plaszczyzna na gladkiej powierzchni szklanej lub na wielu podpórkach na calej dlugos¬ ci bibuly lub tez byl zawieszony pod róznymi ka¬ tami dla zwiekszenia dlugosci powierzchni roz- 30 dzialu. W takim przypadku konieczne byly urza¬ dzenia z duzymi komorami.Znane dotad urzadzenia wykazuja w zwiazku z tym szereg niedogodnosci, gdyz polaczone z zró¬ dlem pradu stalego o napieciu powyzej 400 V, wy- 35 magaja chlodzenia nosnika i to tym intensywniej¬ szego, im wyzsze jest stosowane napiecie i wyz¬ szy spadek potencjalu na dlugosc nosnika. Urza¬ dzenia chlodzace komplikuja aparature i powiek¬ szaja i tak duze jej rozmiary. Stosunkowo mala 40 pojemnosc wanien przy z koniecznosci duzej obje¬ tosci .aparatury wplywa bardzo niekorzystnie na utrzymanie stalych warunków w czasie procesu jonoforezy. W takich warunkach, przy zastosowa¬ niu dobrze przewodzacego elektrolitu, gdy napie¬ cie przewyzsza 400 V zachodzic moga duze zmia¬ ny stezenia elektrolitu w wannach i zmiany pH, co odbija sie bardzo niekorzystnie na przebiegu jonoforezy.Ponadto przy stosowaniu w tych urzadzeniach wanien z wbudowanymi elektrodami trudno bylo uniknac ujemnego wplywu zjawisk elektrodowych na procesy migracji. W znanych aparaturach klo¬ potliwe bylo równiez zawieszanie bibuly w komo¬ rze. Osadzanie bibuly nawilzonej elektrolitem na gladkiej powierzchni szyby lub plycie z tworzywa sztucznego, wzglednie podparcie pasma bibuly podpórkami rozmieszczonymi na calej jej dlugosci i szerokosci powodowalo duze trudnosci w nano- 60 szeniu wiekszych objetosci materialu badanego, zas podpieranie powierzchniowe, strefowe czy punktowe, powodowalo róznice w zawartosci ele¬ ktrolitu w miejscach stykania sie nosnika z pod¬ pora, co w konsekwencji przyczynialo sie do 65 zmian w przewodnictwie w poszczególnych odcin- 45 50 5558154 6 kach* bibuly. Zdejmowanie bibuly z takich podpór powodowalo czeste uszkodzenia nosnika.Wszystkich tych niedogodnosci pozwala uniknac urzadzenie wedlug wynalazku. Cztery wanny ele¬ ktrolityczne o okreslonej dlugosci i objetosci oraz dwa oddzielne naczynia elektrodowe, w których umieszczone sa pionowo elektrody weglowe, po¬ laczone sa czterema kluczami elektrolitycznymi.Wanny sa osadzone w dwóch statywach, które sa zaopatrzone pod wannami w odpowiednie wgle¬ bienia. W tych wglebieniach osadza sie konce pre¬ tów szklanych sluzacych do zawieszenia bibuly.Szereg wyciec w krawedziach górnych statywu pozwala na dokonanie dowolnej zmiany dlugosci arkusza bibuly wedlug potrzeby. Bibula jest za¬ wieszona w komorze poziomo tylko na dwóch pre¬ tach szklanych, a jej konce sa obciazone dwiema polaczonymi z bibula bagietkami, które zanurza sie w zewnetrznych wannach. Tak wykonane urza¬ dzenie jest bardzo proste w obsludze i zapewnia stalosc procesu rozdzialu.Dzieki ksztaltowi komory rozdzielczej, duzej po¬ wierzchni parowania elektrolitu zawartego na dnie komory jak i w wannach mozna osiagnac w bar¬ dzo krótkim czasie maksymalne wypelnienie urza¬ dzenia parami elektrolitu tak, ze optymalna za¬ wartosc elektrolitu w bibule pozostaje w ciagu calego czasu trwania procesu jonoforezy nienaru¬ szona. Przez takie wykonanie urzadzenia wedlug wynalazku osiaga sie w przeciagu 5-ciu minut maksymalne natezenie utrzymujace sie do konca procesu rozdzialu.Dzieki stosowaniu wanien o odpowiedniej dlu¬ gosci, kluczy elektrolitycznych, wydluza sie droga pradu miedzy brzegami bibuly a elektroda, przez co zapewnia sie optymalny opór ukladu rozdziel¬ czego. Duza objetosc elektrolitu umozliwia wielo¬ krotne prowadzenie rozdzialu bez koniecznosci zmiany elektrolitu po zastosowaniu zmiany w kie¬ runku pradu, przy czym mimo przylozonego na¬ piecia 600 V uklad rozdzielczy nie wymaga chlo¬ dzenia. Jak sie okazuje, temperatura ukladu roz¬ dzielczego podczas przeprowadzania jonoforezy rózni sie maksymalnie od 2—3°C od temperatury otoczenia. Te warunki dzieki odpowiedniemu wy¬ konaniu aparatury pozwalaja uzyskac ostry roz¬ dzial zwiazków na bibule.Obciazenie bibuly bagietkami umieszczonymi w odpowiedniej odleglosci od konców zapewnia ideal¬ ne jej naprezenie w komorze rozdzielczej, przy czym dzieki tym bagietkom latwo usunac nosnik z komory i zawiesic go na tych bagietkach w celu wysuszenia.Suszenie bibuly obciazonej bagietkami pozwala na uzyskanie idealnie równej powierzchni, co ulat¬ wia prowadzenie rozdzialu chromatograficznego.Urzadzenie wedlug wynalazku przedstawione jest w przykladzie wykonania na rysunku, którego fig. 1 przedstawia urzadzenie w widoku z góry, zas fig. 2 — to samo urzadzenie w przekroju poprzecz¬ nym.Urzadzenie sklada sie z komory rozdzielczej 1 w postaci wanny, w której umieszczone sa dwie pary wanienek 2, 3, 4, 5 o dlugosci okolo 320 mm kazda, napelnionych elektrolitem. Na dno wanny 1 wlewa sie warstwe tego samego elektrolitu, tak, by poziom nie dosiegal brzegów wanienek 2, 3* 4, 5. Nad zewnetrznymi wanienkami 2, 5 umiesz- 5 czone sa na statywach 6 prety szklane 7, sluzace do zawieszenia bibuly, nie przedstawionej na ry¬ sunku, której obydwa konce obciaza sie w celu napiecia bibuly szklanymi bagietkami.Wanienki wewnetrzne 3, 4 sa polaczone kluczami io elektrolitycznymi 8 z naczyniami elektrodowymi 9, w których zanurzone sa elektrodyv weglowe 10, polaczone z kolei przewodami elektrycznymi 11 z zaciskami 12. Do elektrod przyklada sie przewody doprowadzajace prad staly, na przyklad z prpstow- 15 nika nie uwidocznionego na rysunku, zasilajacego komore rozdzielcza pradem stalym o napieciu 600 V. Wanienki wchodzace w sklad kazdej pary, to jest wanienki 2, 3 oraz 4, 5 sa polaczone rów¬ niez miedzy soba kluczami elektrolitycznymi 13. 20. Wszystkie klucze wskazane jest wykonac najlepiej o srednicy okolo 7 mm.Sposób wedlug wynalazku przy zastosowaniu wskazanej aparatury nadaje sie do rozdzialu wszel¬ kich plynów ustrojowych, biologicznych, przemy¬ slowych i znajdowac moze szerokie zastosowanie w analizie i diagnostyce lekarskiej, w badaniach laboratoryjnych, farmakologicznych, w przemysle* zwlaszcza organopreparatów, srodków spozywczych, w rolnictwie itp.Nizej przytoczone przyklady przeprowadzenia jo¬ noforezy mieszaniny zwiazków ninhydryno-pozy- tywnych ilustruja sposób postepowania wedlug wynalazku.Przyklad I. Na arkusz bibuly Whatman nr 1 o wymiarach 240—370 mm na punkt statowy w odleglosci 7 cm od anodowgeo konca naniesiono 40 (xl wzorcowej mieszaniny o stezeniu 2 \ig do 6 ^ig na 40 ml zawierajacej mieszanine 20 amino- 40 kwasów wzorcowych. Dno wanny 1 i wanienki 2, 3 oraz 4, 5 wypelniono odpowiednio elektrolitem buforowym kwas octowy lodowaty — kwas mrów¬ kowy — woda w stosunku 200 — 60 — 740 o pH V,5. Nastepnie obciazono arkusz bibuly na obu kon- 45 cach bagietkami i zawieszono na pretach szklanych 7, 7 urzadzenia uwidocznionego na fig. 1 i 2 ry¬ sunku. W komorze rozdzielczej 1 katodowy koniec bibuly przeciwlegly do punktu naniesienia miesza¬ niny zanurzono w elektrolicie w wanience 5. Z chwila dojscia elektrolitu na odleglosc 7 cm od punktu startowego zanurzono z kolei anodowy ko¬ niec pasma bibuly w wanience 2.Po nawilzeniu bibuly prowadzono rozdzial przy spadku napiecia 15 V/cm w ciagu 210 minut. Po 55 zakonczeniu procesu rozdzialu bibule wysuszono do zaniku zapachu elektrolitu buforowego. Tak uzyskany jonoforogram zanurzono w 0,3%-owym roztworze ninhydryny w acetonie. Po odparowaniu acetonu jonochromatogram pozostawiono w tern- 60 peraturze 40°C przez 3 godziny w suszarce, az do uzyskania barwnych plam produktów reakcji z ninhydryna, które to plamy utrwalono nastepnie solami miedzi. Uzyskano obraz 8 stref aminokwa-* sów rozdzielonych na te strefy wedlug ponizszej 65 ^blicy. 25 30 35 5058154 Tal blica f Strefy 1 A Om Liz 1 B ' 1 Arg His P-Ala • c Gli D | E a-Ala Wal Ser Leu F | G Tre Met Glu Cys Fen Asp Cyt H GluNH2 Tyr Tiy Objasnienia skrótów: Orn — Ornityna Liz — Lizyna Arg — Arginina His — Histydyna (3-Ala — P-Alanina Gli — Glicyna a-Ala — a-Alanina Wal — Walina Ser — Seryna Leu — Leucyna Tre— Treomina Glu — Kwas glutaminowy Cys — Cysteina Fen — Fenyloalanina Asp — Kwas asparaginowy GluNH2 — Glutamina Tyr — Tyrozyna Try— Tryptofan Próba przeprowadzona z ta sama mieszanina aminokwasów znana metoda srednionapieciowa przy napieciu 400 V w polu elektrycznym o spad¬ ku potencjalu 10 V/cm i natezeniu 0,5 mA/cm da¬ la jonoforogram o czterech pasmach, przy zasto- ' sowaniu buforu weronalowego o pH 8,4.Przyklad II. Zastosowano arkusz bibuly Whatman nr 1 podobnie jak w przykladzie I i proces jonoforetyczny prowadzono w identycznych jak w tym przykladzie warunkach. Uzyskany jonc- forogram po zakonczeniu procesu rozdzialu ele- ktroforetycznego wysuszono w dygestorium do za¬ niku zapachu elektrolitu.Jonoforogram obrócono o 90° i zawieszono w komorze chromatograficznej, przy czym rozwijano jonoforogram technika wstepujaca w rozpuszczal¬ niku n-butanol — kwas octowy lodowaty — woda w stosunku 4:1:1. Po 7 godzinach rozdzialu bi¬ bule wysuszono, a nastepnie wywolano i utrwa¬ lono poszczególne zwiazki przez zanurzenie bibuly w 0,3°/« acetonowym roztworze ninhydryny. Uzys¬ kane barwne plamy utrwalono solami miedzi.Chromatografowanie trwalo 7 godzin. Uzyskano 19 oddzielnych plamek pozwalajacych latwo ziden¬ tyfikowac 25 aminokwasów wzorcowych, które roz¬ miescily sie w stosunkowo znacznych od siebie odstepach na arkuszu bibuly.Jonoforogram uzyskany przy zastosowaniu zna¬ nej metody srednionapieciowej dal przy tej samej ilosci skladników mieszaniny tylko 11 plamek i to wspólnych dla kilku aminokwasów, po znacznie dluzszym czasie.Sposobem wedlug wynalazku uzyskuje sie roz¬ dzial mieszaniny aminokwasów podobny do roz¬ dzialów uzyskiwanego przy pomocy wysokonapie¬ ciowej jonoforezy, a nawet wyrazniejszy. W po¬ lo 15 20 25 30 35 40 45 50 55 00 równaniu z wysokonapieciowa jonoforeza sposób ten pozwala jednak na zastosowanie bardzo taniej i latwo dostepnej aparatury, jest prosty, nie wy¬ maga duzych powierzchni uzytkowych pomieszczen, drogiego zabezpieczenia, jak chlodzenie, nie wy¬ maga obslugi przez wysokokwalifikowanych pra¬ cowników, a zuzycie energii elektrycznej jest mi¬ nimalne.W porównaniu z chromatografia podzialowa.Sposób wedlug wynalazku skraca czas badania, daje wieksza rozdzielczosc mieszanin zlozonych, lepsza powtarzalnosc wyników, jest dokladniej¬ sza w ocenie ilosciowej, umozliwia usuniecie wie¬ lu zwiazków towarzyszacych z uwagi na rozmiesz¬ czenie aminokwasów w drugiej polowie tego sa¬ mego arkusza bibuly. PL