PL56157B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 14.1.1965 (P 106 978) 10.XII.1968 56157 KI. 30 h, 6 MKP Citd/ 9jtó CZYTELNIA ?&óv Patentowego Wlasciciel patentu: Fermentfarma S. p. A. (Buccinasco, Wlochy) Sposób wytwarzania tetracykliny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia tetracykliny na drodze biologicznej przy uzy¬ ciu naturalnego szczepu z rodzaju Streptomyces i jego odmian, zwlaszcza szczepu przydatnego do celów przemyslowych.Szczep ten posiada charakterystyczna wlasci¬ wosc tworzenia tetracykliny w obecnosci jonów chlorkowych nie wytwarzajac jednoczesnie chlo- rotetracykliny. Poniewaz wlasciwosci taksono¬ miczne tego gatunku Streptomyces sa bardzo zbli¬ zone do cech taksonomicznych S. lusitanus opisa¬ nego w patencie NRF nr 1185 771, nazwano go obecnie Streptomyces lusitanus var. tetracyclini 106-T. Ze szczepu macierzystego S. lusitanus var. tetracyclini, przez staranna selekcje przy naswiet¬ laniu swiatlem ultrafioletowym, otrzymano szczep szczególnie przydatny dla celów przemyslowych, który pod nazwa Streptomyces lusitanus var. te¬ tracyclini 106-T i pod numerem NCJB 9500 zde¬ ponowano w National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Szkocja.Znane sa rózne mikroorganizmy sluzace do wy¬ twarzania tetracykliny, jak S. Aureofaciens, S. sayamaensis, S. viridifaciens, S. psammoticus, S. persimilis itd. Jednak szczep nowy S. lusitanus var. tetracyclini 106-T odróznia sie od wymienio¬ nych organizmów tym, ze wytwarza tetracykline z wyjatkowo wysoka wydajnoscia, przewyzszaja¬ ca znacznie wydajnosc produkcyjna kazdego ze znanych gatunków. 2 Fakt, ze S. lusitanus var. tetracyclini 106-T wytwarza tetracykline w obecnosci jonów chlor¬ kowych, ma duze znaczenie przemyslowe, ponie¬ waz tetracyklina pod wzgledem produkcyjnym 5 i handlowym jest najwazniejsza sposród wszyst¬ kich antybiotyków tetracyklinowych, a wytwa¬ rzanie podlozy hodowlanych zawierajacych jony chlorkowe jest znacznie tansze niz wytwarzanie pozywek bezchlorkowych. io S. lusitanus var. tetracyclini 106-T wyodrebnio¬ no w Brive-la-Gaillarde, we Francji, w miejsco¬ wosci zwanej „Miguol". W oparciu o kryteria sys¬ temów klasyfikacyjnych Ettlingera i wspólpra¬ cowników oraz Pridhama i wspólpracowników, 15 stwierdzono, ze gatunek ten jest odrebny od wy¬ zej wymienionych gatunków.Zaleznie od warunków fermentacji S. lusitanus var. tetracyclini 106-T produkuje 9—12 g tetra¬ cykliny w litrze brzeczki fermentacyjnej. (Zgod- 20 nie z miedzynarodowym zwyczajem okreslenie „g/1" w niniejszym opisie odnosi sie do chloro¬ wodorku tetracykliny).S. lusitanus var. tetracyclini 106-T ma proste, do falistych, sympodialnie rozgalezione strzepki, 25 które nie tworza spirali ani okólków, lecz tworza tylko otwarte haczyki. Pod mikroskopem elektro¬ nowym powierzchnia zarodników jest gladka.Ksztalt zarodników jest jajowaty, a ich rozmiary wynosza 0,6—0,8m< na 1,3—1,7|lx. Barwa zarodników 30 w masie jest jasno-szara do oliwkowo-brazowej. 56157 /56157 3 Na okreslonych „bogatych" podlozach nowa od¬ miana Streptomyces wytwarza na ogól bardzo dobrze zarodniki, podobnie jak S. lusitanus (CBS 101-A).Wedlug klasyfikacji Ettlingera S. lusitanus var. tetracyclini 106-T nalezy do grupy: strzepki pros¬ te do falistych, sympodialnie rozgalezione, „gri- seus" do „cinnamoneus", zarodniki gladkie, z pig¬ mentem melaninowym.Wedlug systemu "klasyfikacyjnego Pridhama i y iw^|pólpr^t)wników S. lusitanus var. tetracyclini lS%-iyf&&zy do grupy: „Retinaculum Apertum", szereg'' ^Szartr* do ^oliwkowo-brazowe". '¦ 0. iCelu-pioró^n^nla i zróznicowania S. lusitanus yar. tetracyclini ^10B-T opisano ponizej charakte¬ rystyke hodowlana |na 14 podlozach. Streptomyces iusitanusn^CBS ldl-A); Streptomyces lusitanus yar. tetrtwyelini, *ofr-Tt NCJB 9500; Streptomyces aureofaciens, NRRL 2209 i Streptomyces viridifa- ciehs, ATCC 11969, po 16-dniowej inkubacji w temperaturze 26°C. 1) Podloze 2. namoku z kukurydzy (0,6%) o skla¬ dzie: agar-agar wyciag namokowy kukurydzy 50% glikoza (NH4)2HP04 K2H P04 MgS04-7H20 MnCl2 CuS04 • 5 H20 ZnS04*7H20 woda pH=7 po wyjalowieniu.Grzybnia powietrzna S. lusitanus szara, S. lusitanus var. tetracyclini 106-T — ciemno brazowa, S. aureofaciens — ciemno szara, a S. wiridifaciens^ — szara do prawie czarnej.S. lusitanus var.l tetracyclini 106-T tworzy ciemno brazowy pigment rozpuszczalny w podlozu, nar tomiast pigment S. viridifaciens jest jasniejszy.Wszystkie gatunki wzrastaja dobrze. 2) Podloze z namoku z kukurydzy (0,4%) o takim samym skladzie jak podloze 1) z ta jedynie róz¬ nica, ze zamiast 3 g uzyto 2 g wyciagu namoko- wego kukurydzy. Wzrost wszystkich czterech ga¬ tunków jest podobny jak na podluzu 1), chociaz nieco powolniejszy. 3) Podloze zelatynowe o skladzie: wyciag z miesa pepton zelatyna woda destylowana pH=6,2, przed wyjalowieniem.Wszystkie cztery kultury wzrastaja w podobny sposób. Podloze nie przechodzi w postac ciekla.S. aureofaciens i S. viridifaciens nie wytwarzaja pigmentu rozpuszczalnego, natomiast S. lusitanus wytwarza pigment zólty, a S. lusitanus war. te¬ tracyclini 106-T — zóltawo-brazowy. 4) Podloze dekstrynowe Czapek-Doxa o skla¬ dzie: dekstryna ¦ , . 5 g NaN03 1 g K2HP04 0,5 g 10 3 15 2,5 7,5 1 0,002 g 0,002 g 0,025 g 500 ml jest lekko 1,5 g 2,5 g 80 g 500 ml MgS04 • 7 H20 KC1 FeS04 agar-agar woda destylowana 0,25 g 0,25 g jeden maly krysztal 7,5 g 500 ml pH=6,8, po wyjalowieniu.S. lusitanus i S. lusitanus var. tetracyclini 106-T nie rozwijaja sie na tym podlozu, nato¬ miast S. aoureofaciens i S. viridifaciens tworza grzybnie podstawowa o zóltym zabarwieniu, ty- 10 powa dla tych gatunków wytwarzajacych tera- cykline. 5) Stala pozywka ziemniaczana Stala pozywke ziemniaczana (srednica 1,5 cm, wysokosc 3—6 cm) przemyto 10%-owym roztwo- 15 rem weglanu sodowego i wyjalowiono w .pro¬ bówce z 1,5 ml wody destylowanej.S. aureofaciens i S. viridifaciens wzrastaja dobrze z typowym zloto-zóltym zabarwieniem, charakterystycznym dla tych gatunków, podczas 20 gdy barwa S. lusitanus jest brazowa, a S. lusita¬ nus var. tetracyclini 106-T — ciemno-brazowa. 6) Agar Benneta o skladzie: wyciag; z drozdzy 0,5 g wyciag z miesa 0,5 g 25 zhydrolizowana kazeina 1 g glikoza 5 g agar-agar 10 g woda destylowana 500 ml 30 wartosc pH nastawiono na 7; po wyjalowie¬ niu pH wynosilo 6,2.Wzrost czterech kultur jest podobny jak na podlozach 1) i 2), lecz S. aureofaciens i S. viridi- faciens nie tworza grzybni powietrznej, a zarod- 35 niki S. lusitanus var. tetracyclini 106-T maja „w masie" kolor brazowy, zas w przypadku S. lusitanus — slaby szaro-bialy. S. aureofaciens i S. viridifaciens nie tworza pigmentu rozpusz¬ czalnego, natomiast S. lusitanus i S. lusitanus 40 var. tetracyclini 106-T tworza pigment ciemno brazowy. 7) Podloze glicerynowo-asparaginowe o skla¬ dzie: gliceryna 5 g* 45 asparagina 0,25 g wyciag z miesa 1 g K2HP04 0,25 g agar-agar 7,5 g woda destylowana 500 ml go pH=6,9, po wyjalowieniu.S. lusitanus i S. aureofaciens nie tworza grzybni powietrznej. S. lusitanus tworzy grzyb¬ nie j barwy brazowej i pigment, podczas gdy S. aureofaciens nie tworzy pigmentu, a jego grzyb- 55 nia jest zóltawo-biala. S. lusitanus var. tetra¬ cyclini 106-T wzrasta dobrze tworzac skapa jasno brazowa grzybnie powietrzna i pigment tej sa¬ mej barwy co pigment S. lusitanus. Natomiast S. viridifaciens tworzy obfita, jasno szara grzyb- 60 nie powietrzna nie wytwarzajac przy tym pig¬ mentu rozpuszczalnego. 8) Podloze Czapek-Doxa o skladzie: NaNOs K2HP04 65 MgS04-7H20 1 g 0,5 g 0,25 g56157 KC1 0,25 g FeS04 jeden maly krysztalek agar-agar 7,5 g woda destylowana 500 ml pH=7,l, po wyjalowieniu.S. lusitanus i S. lusitanus var. tetracyclini 106-T nie wzrastaja na tym podlozu podobnie jak i na wszystkich innych podlozach, które jako jedyne zródlo azotu zawieraja tylko zwiazki nie¬ organiczne. S. aureofaciens i S. viridifaciens wzrastaja dobrze, bez jakiejkolwiek grzybni po¬ wietrznej i wykazuja typowa, jasno zólta barwe. 9) Agar Emersona o skladzie: wyciag z drozdzy 2 g skrobia rozpuszczalna 7,5 g K2HP04 0,5 g MgSÓ4 • 7H2Q 0,25 g agar-agar 10 g woda destylowana 500 ml pH=7, po wyjalowieniu.Na podlozu tym S. lusitanus wzrasta dobrze, ma barwe brazowo-liliowa, wytwarza brazowy pigment rozpuszczalny, lecz nie tworzy grzybni powietrznej. S. lusitanus var. tetracyclini 106-T wzrasta podobnie, lecz tworzy lekka grzybnie po¬ wietrzna barwy oliwkowo-brazowej. S. aureofa- ciens charakteryzuje sie slabym wzrostem bez wytwarzania pigmentu, zas S. viridifaciens wzrasta lepiej i tworzy skapa grzybnie powiet¬ rzna oraz jasno-zólty pigment rozpuszczalny. 10) Pozywka skrobiowa Czapek-Doxa o skla¬ dzie: skrobia rozpuszczalna 5 g NaN03 1 g K2HP04 0,5 g MgS04 • 7H20 0,25 g KC1 0,25 g FeS04 jeden maly krysztalek agar-agar 7,5 g woda destylowana 50fr ml pH=7, po wyjalowieniu.Wyniki odpowiadaja wynikom uzyskanym w przypadku innych pozywek zawierajacych azotan.S. lusitanus i S. lusitanus var. tetracyclini 106-T nie wzrastaja, natomiast S. aureofaciens i S. vi- ridifaciens tworza zólto-pomaranczowa grzybnie podstawowa bez pigmentu i bez grzybni powiet¬ rznej. 11) Mleko lakmusowe pH=6,45, po wyjalowieniu.Wszystkie cztery kultury ^zrastaja powoli w postaci pierscienia wzdluz probówki nie przyswa¬ jajac mleka, ani go nie koagulujac. Wystepuje mala, ale wyrazna róznica wartosci pH podloza, pomiedzy S. lusitanus oraz $. lusitanus var. te¬ tracyclini 106-T, a S. aureofaciens oraz S. viridi- faciens. 12) Pozywka o skladzie: wyciag z miesa 1,5 g pepton 2,5 g agar-agar 7,5 g woda destylowana 500 ml pH=6,8, po wyjalowieniu.Wszystkie kultury sa jednakowe, lecz S. lusi¬ tanus i S. lusitanus var. tetracyclini 106-T wy- 10 15 skladzie: dekstryna NaNOa MgS04-7H20 KC1 dekstroza FeS04 woda destylowana jeden 5 g 1 g 0,25 g 0,25 g 15 g maly krysztalek 500 ml twarzaja rozpuszczalny pigment ciemniejszy niz w przypadku S. aurefaciens i S. viridifaciens. 13) Podloze glikozowo-asparaginowe o skla¬ dzie: glikoza Ig asparagina 0,25 g wyciag z miesa 1 g K2HP04 0,25 g agar-agar 7,5 g woda destylowana 500 ml pH=6,9, po wyjalowieniu.S. lusitanus, S. aureofaciens i S. viridifaciens wzrastaja w^ podobny sposób, tworzac grzybnie powietrzna, przy czym S. lusitanus i S. viridi- faciens wytwarzaja brudny, ciemno-zólty pigment rozpuszczalny. S. lusitanus var. tetracyclini 106-T nie tworzy grzybni powietrznej, zas jego pigment jest taki sam jak w przypadku S. lusitanus. 14) Podloze cukrowo-dekstrynowo-azotanowe o 25 pH=7, po wyjalowieniu. 30 S. lusitanus i S. lusitanus var. ; tetracyclini 106-T nie wzrastaja na tym podlozu, podczas gdy S. aureofaciens tworzy jasno zólta grzybnie pod¬ stawowa, zas grzybnia podstawowa S. viridi- faciens ma barwe ciemno pomaranczowa. Wyko- 35 rzystanie zródel wegla przez ten szczep w stadium poczatkowym nie mozna bylo okreslic przy zasto¬ sowaniu metody Okhi (Okhi N, Kitasoto Aten.Erop. Med. 25, 209, 1953), poniewaz w obecnosci wylacznie nieorganicznego zródla azotu, S. lusi- 40 tanus nie wzrasta. W tym celu zastosowano me¬ tode Pridhama i Gottlieba, opisana przez ZSich- nera i Ettlingera w Aren. f. Mikrobiol. 26, 307, 1957. Obserwacji dokonywano w 10 dniu.'W po¬ nizszej tablicy zestawiono w celu porównania je- 45 dynie szesc zródel wegla, uznanych przez Zahne- ra i Ettlingera jako charakterystyczne i majace znaczenie dla oznaczania gatunków.Pod wzgledem wykorzystania zródla wegla oraz zgodnie z systemem klasyfikacyjnym Zah- 50 nera i Ettlingera, S. lusitanus var. tetracyclini 106-T i S. lusitanus 101-A naleza do grupy Ule, zas S. aureofaciens naleza do grupy Ilia.Wszystkie szczepy dodatnio wykazuja zuzycie glikozy i dekstrozy ze zródel wegla nietypowych 58 dla klasyfikacji. S. lusitanus var. tetracyclini 106-T i S. lusitanus 101-A, w przeciwienstwie do S. aureofaciens i S. viridifaciens, nie wzrastaja w obecnosci laktozy. Jedyna róznica pomiedzy S. lusitanus var. tetracyclini 106-T i S. lusitanus 60 ldl-A jest to, ze w obecnosci trehalozy pierwszy szczep Tyzrasta silnie podczas gdy szczep drugi — nie wzrasta. S. lusitanus i S. lusitanus var. te¬ tracyclini wzrastaja na celulozie, natomiast S. aureofaciens i S. viridifaciens nie moga wykorzys* 65 tywac* tego zródla wegla.V.56157 Przyswajanie wegla Zródlo wegla ramnoza rafinoza d-ksyloza d-fruktoza 1-arabinoza d-mannitol S. lusita¬ nus cyclini cd var. te 106-T • — (-) (-) — 101-A — — (-) — a o cm t RRL 2 wlasne 2 Q) szczep (badan + + + — S. aureofaci- ens badanie wedlug cd Ci i Ettli .cd Zahnei + + + +/- a ~ 0) C- N 00 O CM N i-l a (2) S 1286, 9 *j DQ O O W CM Benedi NRRL 1288, 2 - do (-) (-) (+) do + + + (-) «-s. co aciens dif * • • S. vin + • ¦ + + + + — brak przyswajania + przyswajanie dodatnie brak danych (—) przyswajanie nieprawodopodobne (+) przyswajanie prawdopodobne +/— przyswajanie dodatnie lub ujemne zalezne od szczepu (1) Zahner u. Ettlinger, Aren. f. Mikrobiol., 26, 307, 1957 (2) Benedict et al., Appl. Microbiol., 3, 1, 1955 (3) Opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 2 886 595.Sposób wedlug wynalazku jest sposobem odpo¬ wiednim do stosowania przemyslowego, w zwiaz¬ ku z czym S. lusitanus var. tetracyclini 106-T jest szczepem wyselekcjonowanym dla celów przemyslowych, a jego badanie taksonomiczne jedynie w zakresie zgodnym z obowiazujacymi obecnie wymaganiami klasyfikacyjnymi jest nie¬ wystarczajace. Z tych powodów zdeponowano w róznych zbiorach hodowli drobnoustrojów S. lu¬ sitanus i S. lusitanus var. tetracyclini w postaci szczepów macierzystych poczatkowo wyodrebnio¬ nych z gleby.W zwiazku z tym podjeto taksonomiczne zróz¬ nicowanie innych znanych gatunków wytwarza¬ jacych tetracykline, w ten sposób, ze porównano ze soba zarówno szczepy pierwotne jak szczepy przemyslowe bedace przedmiotem sposobu wed¬ lug wynalazku.U S. lusitanus var. tetracyclini 106-T nie moz¬ na dokonac oceny wytwarzania pigmentu mela- ninopodobnego, poniewaz wyselekcjonowane róz¬ ne typy szczepów przemyslowych nie wzrastaja wcale, albo tez wzrastaja w stopniu bardzo nie¬ dostatecznym, na pozywce Ettlingera, wytwarza¬ jacej pigment melaninopodobny (wyciag z droz¬ dzy 0,5 g, L-tyrozyna 0,5 g, NaCl 4,25 g, agar 8 g, woda wodociagowa 500 ml).Poczatkowo wyodrebnione szczepy S. lusitanus i S. lusitanus var. tetracyclini (szczepy macie¬ rzyste szczepów uzywanych w celach przemyslo¬ wych) sprawdzano zwlaszcza na tym podlozu.S. lusitanus na podlozu tyrozynowym wytwarzal w ciagu 2 dni czerwonawy pigment (najprawdo¬ podobniej skladajacy sie z hallochromu albo 5,6-dwuhydroksyindolu), który powoli utlenial sie 5 na pigment ciemny, nie zmieniajacy swojej bar¬ wy przy zmianach wartosci pH.Krzywa absorpcji w ultrafiolecie wyekstraho¬ wanego pigmentu jest identyczna z opisana przez Schmidliego (Helv. Chim. Acta, 38, 1078, 1955) io krzywa dla pigmentu melaninowego. S. lusitanus var. tetracyclini wytwarza po 3—4 dniach bez¬ posrednio czarny pigment (bez posredniego pig¬ mentu czerwonego), który pod kazdym wzgledem odpowiada „syntetycznej" melaninie, otrzymanej 15 przez utlenianie DOPA[p-3,4-dwuhydroksy-feny- lo)-a-alaniny].Zarówno S. lusitanus jak i S. lusitanus var. tetracyclini 106-T wytwarzaja na podlozu tyra- zynowym pigment melaninopodobny, chociaz od- 20 bywa sie to dwiema róznymi drogami, podczas gdy ani S. aureofaciens ani S. viridifaciens nie wytwarzaja pigmentu melaninopodobnego na zad¬ nej z tych dróg.Szczep macierzysty szczepu S. lusitanus var. 25 tetracyclini na okreslonych podlozach, jak na przyklad na agarze tyrozynowym Ettlingera, ma zdolnosc wytwarzania przetrwalników.S. lusitanus 101-A i S. lusitanus var. tetracyc- - lini 106-T, jak równiez ich szczepy macierzyste 30 wzrastaja w temperaturze 50°C. Ani w przypad¬ ku S. lusitanus, ani w przypadku S. lusitanus var. tetracyclini nie obserwowano okólek, pod¬ czas gdy u dojrzalych kultur zarówno S. aureo¬ faciens jak i S. viridifaciens okólki znajdowano 35 czesto.W ponizszej tablicy zestawiono najwazniejsze róznice taksonomiczne pomiedzy S. lusitanus i S. aureofaciens. 45 50 55 60 65 Cecha rozróznia¬ jaca Morfologia strzep¬ ków Barwa zarodni¬ ków „w ma¬ sie" Wytwarza¬ nie pig¬ mentu melani¬ nowego na pod¬ lozu tyrozy¬ nowym S. lusitanus var. tetra¬ cyclini 106-T rozgalezie¬ nie sympo- dialne; brak okólek cinnamo- neus do griseus ujemne (szczep ma¬ cierzysty: dodatnie) S. lusitanus CBS 101-A rozgalezie¬ nie sympo- dialne; brak okólek cinnamo- neus do griseus ujemne (szczep ma¬ cierzysty: dodatnie) S. aureofa¬ ciens rozgalezie¬ nie mono- podialne; okólki wystepuja cinereus ujemneC. d. tabl Cecha rozróznia¬ jaca Wykorzy¬ stanie nieorga¬ nicznych zródel azotu Wykorzy¬ stanie zródel wegla wg Zahnera I i Ettlin- gera S. lusitanus var. tetra¬ cyclini 106-T ujemne nalezy do grupy Ule - S lusitanus CBS 101-A ujemne nalezy do grupy nie S. aureofa- ciens dodatnie nalezy do grupy Ilia Porównanie to wykazuje, ze (w dopuszczalnym zakresie wariacji gatunku) S. lusitanus var. te- tracyclini 106-T rózni sie niewiele od wytwarza¬ jacego chlorotetracykline S. lusitanus (CBS 101-A), natomiast róznice wystepuja wyraznie i sa znacz¬ ne miedzy S. lusitanus var. tetracyclini i S. aureofaciens lub S. viridifaciens.Jedyna róznice miedzy szczepami macierzysty¬ mi i S. lusitanus 101-A albo S. lusitanus var. te¬ tracyclini 106-T stanowi to, ze strzepki obu szcze¬ pów macierzystych naleza do grupy „Spira", pod¬ czas gdy w przypadku S. lusitanus 101-A — na¬ leza do grupy „Rectus flexibilis", a w przypadku S. lusitanus var. tetracyclini 106-T — do grupy „Rectinaculum apertutm". Jednak u wszystkich czterech szczepów strzepki sa rozgalezione sympo- dialnie.Posrednim dowodem odrebnosci gatunkowej S. lusitanus var. tetracyclini 106-T od S. aureo¬ faciens jest fakt, ze powstala w trakcie fermen¬ tacji barwa calej brzeczki pofermentacyjnej nie zawierajacej chlorotetracykliny, znacznie rózni sie od barwy opisanej w opisie patentowym St.Zjedn. Am. nr 3092 556 dla S. aureofaciens.Spektrofotometryczny wspólczynnik odbicia po¬ fermentacyjnej brzeczki z hodowli S. lusitanus var. tetracyclini 106-T oznaczono przy dlugos¬ ciach fali od 400—700m//, w kuwetkach szklanych 1 cm, przy uzyciu weglanu magnezowego jako wzorca. Wspólczynniki odbicia (R) oraz odpowia¬ dajace im dlugosci fal nanoszono liniowo na wy¬ kres, otrzymujac w wyniku charakterystyczna krzywa refleksji. Nastepnie przez punkty na na krzywej, odpowiadajace 400 m^ i 5501*1^, przeprowadzono linie prosta i zmierzono pionowa odleglosc miedzy ta prosta i krzywa refleksji dla 420 mp i 430 m^u. Wartosci te oznaczono isymbo- lami AR420 lub AR430. W przypadku S. aureo¬ faciens zgodnie z opisem patentowym St. Zjedn.Am. nr 3092 556. A R420 jest zawsze wieksza od A R430, natomiast w przypadku S. lusitanus var. tetracyclini 106-T A R420 jest zawsze mniejsza mimo, iz brzeczka z hodowli S. lusitanus var. 10 15 20 25 30 56157 10 tetracyclini 106-T nie zawiera wykrywalnych ilosci chlorotetracykliny (ponizej 50 mcg/1).Istotny fakt, ze S. lusitanus var. tetracyclini 106-T wytwarza o 2—5 g tetracykliny w litrze wiecej niz wynosi — znaleziona w literaturze -r-' najwyzsza produkcyjnosc mikroorganizmów wy¬ twarzajacych tetracykline, wskazuje posrednio na odrebnosc tego gatunku. To zwiekszenie produk¬ cyjnosci stanowi istotny techniczny postep w wy- twarzanu tetracykliny.Stwierdzono, ze aczkolwiek zarówno S. lusita¬ nus jak i S. lusitanus var. tetracyclini hydroli- zuja skrobie — to uzycie gotowego produktu hy¬ drolizy skrobi umozliwia zwiekszenie ilosci zród¬ la wegla na litr brzeczki, znajdujacego sie do dyspozycji, przy czym jednoczesnie ma miejsce znaczny wzrost wydajnosci produkcyjnej (aktyw¬ nosci antybiotycznej) na litr sfermentowanej brzeczki.Najkorzystniejsze wyniki uzyskuje sie z pro¬ duktem hydrolizy, który zawiera nie wiecej niz 20% niezhydrolizowanej skrobi kukurydzianej i nie wiecej niz 20% dwu-i monosacharydu, przy czym reszte to jest 60% stanowia oligosacharydy.Taki pólhydrolizat skrobi mozna dodawac w ilos¬ ci do 65 g/l nie powodujac nadmiernego wzrostu lepkosci podloza. Jezeli zas — dla porównania — dodaje sie 65 g/l, albo nawet znacznie mniejsza ilosc skrobi zytniej, powoduje to niemal zesta¬ lenie sie podloza, co z kolei uniemozliwia pro¬ wadzenie fermentacji glebinowej.Wydajnosci tetracykliny w takich warunkach wynosza na ogól powyzej 12 g/l. Zwiekszenie ilosci zródel wegla umozliwia z drugiej strony nikniecie stosowania oleju smakowego jako zród¬ la wegla, bez zauwazalnego obnizenia wydajnosci.Pienienie sie brzeczki mozna wówczas regulowac przy uzyciu malej ilosci slikonu jako srodka przeciwpiennego.Pozywka wodna sluzaca do przemyslowej fer¬ mentacji z hodowli S. lusitanus var. tetracyclini 106-T zawiera przyswajalne zródla organicznego azotu, wegla oraz sole mineralne, lacznie z chlor¬ kami, które przyspieszaja wzrost mikroorga¬ nizmu.Jako zródlo azotu mozna stosowac hydrolizat kazeiny, wyciag ze slodu jeczmienia lub kuku¬ rydzy, wyciag namokowy kukurydzy, maczke arachidowa, sojowa itp. Nieorganiczne azotany sa nieprzydatne.Jako zródlo wegla mozna stosowac rózne we- glodowany jak glikoza, dekstoza, maltoza, treha- loza, skrobia, hydrolizat skrobiowy, dekstryna, tluszcze zwierzece lub roslinne albo kwasy tlusz¬ czowe.Ilosci poszczególnych skladników w pozywkach podaja przyklady.Dodatek N,N' - dwubenzyloetylenodwuaminy (DBED) w postaci octanu lub mleczanu w ilosci 0,01—1,5 g/l powoduje wzrost wydajnosci w po¬ równaniu z jednoczesnie prowadzonymi próbami porównawczymi bez dodatku DBED, Zwiazek ten dodaje sie do brzeczki w róznych porcjach pod¬ czas procesu fermentacji. Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 24^30°C, przy jednoczesnym 35 40 45 50 55 eo 6511 mieszaniu i silnym napjowietrzaniu (0,1—40 obje¬ tosci powietrza na 1 objetosc brzeczki na mi¬ nute, zaleznie od fazy procesu).Konieczny dla uzyskania najwyzszej wydaj¬ nosci C7«\s fermentacji, wynosi od 96—150 godzin, zaleznie od warunków prowadzonego procesu.Sposób wytwarzania tetracykliny wedlug wy¬ nalazku jest selektywny, to jest po zakonczeniu fermentacji brzeczka nie zawiera uchwytnych ilosci chlorotetracykliny. / Po zakonczeniu procesu fermentacji, czynny skladnik podstawowy ekstrahuje sie i oczyszcza w sposób opisany w opisie patentowym NRF nr 1185 771. Dokladny opis postepowania przy oczy¬ szczaniu zawieraja przytoczone przyklady.Produkt koncowy, który otrzymuje sie w pos¬ taci chlorowodorku tetracykliny, posiada naste¬ pujace wlasciwosci fizyczne i chemiczne: rozklad przy okolo 240°C; skrecalnosc wlasciwa (a) JJ - 258 (C=0,5 w 0,1 n HC1; bardzo dobra rozpusz¬ czalnosc w wodzie, metanolu i etanolu. Sklad elementarny trójwodzianu zasady odpowiada wzorowi C2*H24N208 • 3 HjO; temperatura topnie¬ nia 170—175°C z rozkladem.Wszystkie wlasciwosci fizyczne, chemiczne i biologiczne otrzymanego produktu, zarówno w postaci zasady jak iw postaci chlorowodorku, odpowiadaja opisanym w literaturze cechom te¬ tracykliny.Szczególnie cenna zaleta sposobu wedlug wy¬ nalazku w przemyslowym zastosowaniu S. lusi- tanus var. tetracyclini 106-T jest to, ze uzyskuje sie bardzo wysokie wydajnosci przy bardzo nis¬ kich kosztach podloza hodowlanego.Ponizsze przyklady sluza do objasnienia spo¬ sobu wedlug wynalazku, lecz nie stanowia jego ograniczenia.Przyklad I. Wszystkie podloza hodowlane sporzadza sie na wodzie wodociagowej. 1 1 wy¬ jalowionego podloza ma nastepujacy sklad: wyciag namokowy kukurydzy 50%-owy 10 cukier 10 CaCOs 1 (NH4)2HP04 2 2 56157 12 * przy mieszaniu i napowiet- g g g g g 0,25 g KH2P04 , MgS04-7H20 woda dopelniona do (pH=6,4, po wyjalowieniu) 1000 ml Jeden litr podloza hodowlanego szczepiono w kolbie 1 ml zawiesiny dojrzalych zarodników S. lusitanus var. tetracyclini 106-T w roztworze fizjologicznym chlorku sodowego i trzymano przez 36 godzin w temperaturze 26°C w trzesaw- ce obrotowej.Nastepnie, otrzymana 36-godzinne hodowle zaszczepiono podloze o skladzie: wyciag namokowy kukurydzy 50%-owy 35 g CaCOs 13 g cukier 5 g woda dopelniona do (pH—6*,7, po wyjalowieniu) 1000 ml znajdujace sie w fermentatorze wstepnym o pojemnosci 150 1.Fermentacje prowadzono przez 24 godziny w 10 :o 25 30 35 40 45 50 55 60 65 temperaturze 26°C rzaniu. s W koncu powyzsza 24 godzinna szczepionka wegetatywna zaszczepiono podloze o skladzie: wyciag namokowy kukurydzy 50%-owy 28 g CaC03 14 g skrobia 38 g (NH4)2S04 5,7 g NH4C1 1,5 g MnS04-4H20 0,05 g CoCl2 • 6H20 0,0002 g ZnS04 0,05 g maczka arachidowa 25 g olej smakowy 35 g woda wodociagowa do (pH=6,7—6,8, po wyjalowieniu) 1000 ml i w fermentatorze o pojemnosci 6000 1 prowa¬ dzono fermentacje przez 24 godziny w tempera¬ turze 30°C doprowadzajac powietrze z szybkos¬ cia 1,5 1/1 na minute. Z kolei temperature obni¬ zono do 26°C, a napowietrzanie zwiekszono po¬ woli w ten sposób, ze pod koniec 140-ej godziny fermentacji szybkosc jego wynosila 4 1/1 na mi¬ nute.Po 140 godzinach fermentacji otrzymano 11,1 g tetracykliny w litrze brzeczki; chlorotetracykliny nie mozna bylo wykryc (ponizej 50 mcg/1).Przyklad II. Postepuje sie podobnie jak w przykladzie I, lecz do produkcyjnego podloza ho¬ dowlanego dodaje sie dwuoctanu N,N'-dwubenzy- loetylenodwuaminy w ilosci 0,5 g/l, w czterech równych porcjach na poczatku fermentacji, po 36, 72, i 98 godzinach fermentacji. Po 140 go¬ dzinach otrzymuje sie tetracykline w ilosci 12,3 g/l.Przyklad III. Brzeczke pofermentacyjna otrzymana w przykladzie I zakwasza sie 25%- -owym kwasem siarkowym do wartosci pH=l,5, saczy sie przez filtr obrotowy, po czym grzybnie ekstrahuje sie dwukrotnie woda o pH do 1,5. Do polaczonych przesaczy dodaje sie 18 kg „Verse- ne" (wersenian, srodek tworzacy rozpuszczalny kompleks) i 16,5 kg dwuootanu DBED a nastep¬ nie 12%-owym amoniakiem powoli nastawia war¬ tosc pH na 9,7. Po 3 godzinnym mieszaniu od¬ sacza sie osad skladajacy sie zasadniczo z za¬ nieczyszczonego kompleksu DBED — tetracykli- na, który ma wzór DBED-Ca (tetracyklina)2.Nastepnie wilgotny osad przeprowadza sie mie¬ szajac, w postac zawiesiny w wodzie,' która za¬ kwasza sie 10%-owym wodnym roztworem kwasu szczawiowego do wartosci pH 1,5. Roztwór prze¬ sacza sie i 10%-owym wodnym roztworem wo¬ dorotlenku sodowego doprowadza do wartosci pH=5,8. Wytraca sie tetracyklina w postaci za¬ sady. Osad odsacza sie, przemywa i suszy pod próznia w temperaturze 65°C. Rzeczywista wy¬ dajnosc, odniesiona do aktywnosci, wynosi 83,5%.Przyklad IV. Postepuje sie w sposób opi¬ sany w przykladzie III, lecz zamiast DBED do¬ daje sie 16 kg N,N'-dwubenzyloetylenodwuaminy (C6H5-CH = N-CH2-CH2-N = CH*C6H5) przy wartosci pH=6. Wydajnosc uzyteczna odniesiona do aktywnosci, wynosi 86% (produkt w postaci za¬ sady).56157 13 31 14 Przyklad V. Postepuje sie podobnie jak w przykladzie I, lecz podloze hodowlane w fermen- tatorze produkcyjnym zastepuje sie podlozem o skladzie: wyciag namokowy kukurydzy 50%-owy CaCOs pólhydrolizat skrobi, który zawiera nie wiecej niz 20% niezhydrolizowanej skrobi kukurydzianej i nie wiecej niz 20% mono-i dimerów; jako reszte — oligomery / (NH4)2S04 NH4C1 MnS04-4H20 CoCl2 • 6 H20 ZnS04 FeS04 maczka arachidowa olej smakowy olej arachidowy (pH 6,7—6,8) Wydajnosc koncowa wynosi 12,2 g/l. Chloro- tetracykliny nie mozna wykryc (ponizej 50 mcg/1).Z krzywej refleksyjnosci dla brzeczki pofermen¬ tacyjnej otrzymano AR42o = 18 i AR430=92,4. 63 5,7 1,5 0,05 0,002 0,05 0,04 25 28 4 g g g g g g g g g g 15 20 14 Przyklad VI. Postepuje sie jak w przykla¬ dzie V, lecz stosuje sie podloze nie zawierajace ani oleju smalcowego, ani oleju arachidowego.Tworzenie sie piany reguluje sie za pomoca sili¬ konowego srodka przeciwpiennego. Po 136 godzi¬ nach fermentacji wydajnosc wynosi 10,1 g/l. W brzeczce nie wykryto chlorotetracykliny.Przyklad VII. 40 ml wyjalowionego podloza hodowlanego, o skladzie podanym w przykla¬ dzie I dla fermentacji produkcyjnej, w 300 ml kol¬ bie Erlenmayera zaszczepia sie rozwijajacymi sie zarodnikami S. lusitanus var. tetracyclini 106-T i umieszcza na trzesawce obrotowej, w tempera¬ turze 28°C, na okres 7 dni. Wykresla sie krzywa refleksyjnosci dla brzeczki pofermentacyjnej i wy¬ licza wartosci A R. Znaleziono: A R^ = 3,8 i A R430 = 34,2. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania teracykliny na cfrodze biosyntezy, znamienny tym, ze do biosyntezy sto¬ suje sie szczep Streptomyces lusitanus var. tetra¬ cyclini 106-T, PL