PL53191B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 21.VI.1965 (P 109 671) 6.X.1964 Niemiecka Republika Demokratyczna 10.V.1967 53191 KI. 6 a, 22/07 MKP C 12 d tf/0 UKA CZYTELNIA Urzedu Polentw«ao Peliklil Wspóltwórcy wynalazku: prof. dr Erwin Negelein, dr Franz Noll, Walter Heumann, Gabriele Littmann Wlasciciel patentu: VEB Arzneimittelwerk Dresden, Radebeul (Niemiecka Republika Demokratyczna) Sposób wydzielania z miesni szkieletu ssaków, zwlaszcza królików, wysoko aktywnej piruwatkinazy wolnej od miokinazy Wynalazek dotyczy sposobu wydzielania z mie¬ sni szkieletu ssaków, zwlaszcza królików, wysoko aktywnej piruwatkinazy wolnej od miokinazy.Sposoby wytwarzania piruwatkinazy (PK) by¬ ly juz czesto opisywane. Polegaja one na tym, ze dokladnie rozdrobnione miesnie szkieletu ekstra¬ huje sie woda lub silnie rozcienczonym roz¬ tworem buforowym, a nastepnie ekstrakt zawiera¬ jacy enzym oczyszcza sie przez frakcjonowane stracanie acetonem, alkoholem, siarczanem amo¬ nowym albo przez kombinacje tych sposobów stracania.Przy stosowaniu frakcjonowanego stracania siarczanem amonowym wydajnosc piruwatkinazy jest mala, a poza tym jest ona zanieczyszczona miokinaza, tak ze preparat PK nie moze byc sto¬ sowany do analiz enzymochemicznych. Inny spo¬ sób otrzymywania piruwatkinazy polega na frak¬ cjonowanym stracaniu jej acetonem i nastepnej obróbce zelem fosforanu wapniowego. Przy tym uzyskuje sie preparat piruwatkinazy wolny od miokinazy, lecz o niskiej aktywnosci wlasciwej, wynoszacej zaledwie okolo 3 000 jednostek (we¬ dlug Bucher a). Równiez znane jest kombinowane stracanie enzymu PK siarczanem amonowym i al¬ koholem ale równiez ta metoda daje tylko slabo oczyszczony preparat PK.Wedlug dotychczasowych metod nie mozna wiec otrzymac preparatu PK, o wymaganym stopniu czystosci do celów analizy enzymatycznej, gdyz piruwatkinaza wykazuje zbyt mala aktywnosc wlasciwa albo jest zanieczyszczona szkodliwa mio¬ kinaza.Celem niniejszego wynalazku jest sposób wy¬ dzielania piruwatkinazy o takiej czystosci, azeby nadawala sie do podstawowych badan enzyma¬ tycznych, a zwlaszcza do enzymatyczno-chemiczne- go oznaczania dwufosforanu adenozyny (A.D.P.).Do tego celu preparat musi byc bardzo czysty, a zwlaszcza wolny od miokinazy, poniewaz w obecnosci miokinazy oznaczenie ADP jest nie¬ mozliwe.Stwierdzono, ze z miesni szkieletu ssaków, 15 zwlaszcza z miesni królików, mozna otrzymac pi- ruwatkinaze, wolna od miokinazy, jesli po eks¬ trakcji woda rozdrobnionych miesni otrzymany wyciag podda sie najpierw dwukrotnemu frakcjo¬ nowanemu stracaniu acetonem, otrzymany w ten 20 sposób osad, zawierajacy enzym wysuszy w sta¬ nie zamrozenia, suchy proszek rozpusci w desty¬ lowanej wodzie, roztwór podda dzialaniu ciepla i dalszemu oczyszczaniu. Dalsze oczyszczanie pro¬ wadzi sie przez adsorpcje na zelu fosforanu wap¬ niowego i eluacje piruwatkinazy za pomoca bu¬ forowego roztworu fosforanu, zawierajacego siar¬ czan amonowy. Z eluatu straca sie piruwatkina- ze siarczanem amonowym i w ^koncu krystalizu¬ je z roztworu zawierajacego siarczan amonowy.Otrzymany w ten sposób preparat ma wyzsza 25 30 531913 aktywnosc wlasciwa od dotychczasowych prepa¬ ratów i jest wolny od miokinazy.Sposobem wedlug wynalazku postepuje sie na¬ stepujaco: Miesnie szkieletu królika natychmiast po zabi¬ ciu spreparowane w chlodni, posiekane w ozie¬ bionej maszynie do siekania homogenizuje sie z potrójna w stosunku do ich wagi iloscia lodo¬ watej wody destylowanej, nastepnie miesza jedno¬ rodna mase i jednoczesnie chlodzi do tempera¬ tury 0°C w ciagu okolo 1 godziny. Otrzymany lekko metny, rózowo zabarwiony surowy wodny eks¬ trakt odwirowuje sie, po czym straca z niego najpierw" proteinowe substancje balastowe, towa¬ rzyszace'piruwptkinazie, a nastepnie piruwatkina- ze. W tym celu do ekstraktu wprowadza sie pod¬ czas mieszania i chlodzenia tyle oziebionego ace¬ tonu, azeby nie spowodowac wytracenia sie piru- watkinazy. Normalnie wystarczajace jest dodanie 30—35% objetosciowych acetonu. Wytracajacy sie przy tym Osad odwirowuje sie i odrzuca, nato¬ miast z przesaczu przez dalszy dodatek zimnego acetonu w ilosci do okolo 40—50% objetosciowych straca sie osad zawierajacy piruwatkinaze. Od¬ dzielony osad rozpuszcza sie w malej ilosci zim¬ nej wody destylowanej. Z zimnego roztworu po kilkugodzinnym odstaniu wydziela sie osad nie¬ aktywnej proteiny, który odrzuca sie. Enzym (PK) pozostaly w roztworze oczyszcza sie dalej na dro¬ dze drugiego frakcjonowanego stracania acetonem, przy czym korzystne jest, azeby stezenie enzymu w roztworze bylo wyzsze anizeli w przypadku pierwszego stracania. W tym celu stosuje sie mniejsza objetosc cieczy, korzystnie roztwór o ob¬ jetosci wynoszacej okolo 7—10% objetosci suro¬ wego ekstraktu. Po dodaniu acetonu w ilosci oko¬ lo 20—25% objetosciowych wytraca sie nieaktyw¬ ny osad bialka, który odrzuca sie. Po dalszym wprowadzeniu acetonu do zawartosci 30—45% ob¬ jetosciowych wytraca sie enzym PK, który od¬ dziela sie i suszy w stanie zamrozenia. Rózowo zabarwiony suchy produkit jest trwaly przez kil¬ ka dmi. Waga tego proszku wynosi okolo 1% wa¬ gowych w stosunku do wagi uzytych miesni. Su¬ chy proszek rozpuszcza sie nastepnie w zimnej wodzie destylowanej (okolo 1 g suchego proszku w 25 ml wody) d dodaje sie tyle czterooctanu dwu- sodowego etylenodwuaminy (EDTA-NA2) azeby je¬ go stezenie w roztworze wynosila 0,01 mola. Roz¬ twór w trakcie umiarkowanego mieszania przez poruszanie naczynia ruchem kolowym ogrzewa sie szybko w ciagu 7 minut do 56—60°C i nastepnie studzi. Przy tym wytraca sie wieksza czesc zde- naturowanej proteiny towarzyszacej, przede wszy¬ stkim miokinazy, która oddziela sie. Ogrzewanie nie powoduje strat PK.Nastepnie prowadzi sie dalsze oczyszczanie roz¬ tworu, zawierajacego piruwatkinaze przez adsor¬ pcje na zelu fosforanu wapniowego. Szczególnie przydatny okazal sie zel fosforanu wapniowego opisany w „Biochemical preparation" 6, 57 (1958) do otrzymywania „starego, zóltego fermentu" z drozdzy browarnianych. 100 ml wstepnie oczysz¬ czonego przez obróbke cieplna roztworu, zawie¬ rajacego enzym rozciencza sie 350 ml roztwo- 53191 4 ru buforowego o wartosci pH=6,8 zawierajacego w 1 1 okolo 0,06 mola fosforanu. Roztwór ten za¬ daje sie zelem fosforanu wapniowego (w ilosci odpowiadajacej okolo 4,5 g suchej substancji). Pi- 5 ruwatkinaza zostaje zaadsorbowana na zelu fos¬ foranu wapniowego, podczas gdy miokinaza zo¬ staje w roztworze. Preparat PK zawarty w od¬ dzielonym zelu wymywa sie na zimno W ciagu okolo pól godziny roztworem zawierajacym w 1 io litrze 0,2 mola buforu fosforanowego i 1,6 mola siarczanu amonowego. Z eluatu straca sie enzym roztworem siarczanu amonowego, o stezeniu oko¬ lo 2,8 molowym. Osad, który stanowi prawie czy¬ sty preparat enzymu, oddziela sie i rozpuszcza 15 w malej ilosci wody. Piruwatkinaze krystalizu¬ je sie z 0,05 molowego buforowego roztworu octa¬ nu o wartosci PH okolo 5,2, który korzystnie po¬ winien zawierac 11 mg proteiny na 1 ml roztwo¬ ru oraz stezenie 1,9 molowe siarczanu amonowe- 20 go, przez powolne, stopniowe podwyzszanie ste¬ zenia siarczanu amonowego na skutek dodawania stezonego roztworu siarczanu amonowego. Ko¬ rzystna dla krystalizacji okazala sie temperatura okolo 42°C, poniewaz preparat PK jest trudniej 25 rozpuszczalny na goraco niz na zimno. Preparat PK mozna ewentualnie przekryslalizowac zacho¬ wujac wyzej podane warunki.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie bar¬ dzo czysta piruwatkinaze, która wykazuje aktyw- 30 nosc wlasciwa 9 000 jednostek (wedlug Biichera) na mg proteiny. Wydajnosc w odniesieniu do za¬ wartosci PK w ekstrakcie z miesni wynosi okolo 20%. 35 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wydzielania z miesni szkieletu ssaków, zwlaszcza królików, wysoko aktywnej piruwatki- nazy wolnej od miokinazy przez ekstrakcje roz¬ drobnionych miesni królika, za pomoca wody, frak- 40 cjonowane stracanie enzymu acetonem, dalsze oczyszczanie przez adsorpcje na zelu fosforanu wapniowego i eluacje roztworem buforowym i wy¬ tracanie produktu siarczanem amonowym, zna¬ mienny tym, ze do ekstraktu wodnego wprowadza 45 sie 30—35% objetosciowych acetonu, wytracajac przy tym substancje balastowe, po usunieciu któ¬ rych do ekstraktu wprowadza sie dalej aceton w ilosci 40—50% objetosciowych, przy czym wy¬ traca sie piruwatkinaza, która rozpuszcza sie 50 w takiej ilosci wody, azeby otrzymac roztwór o 7—10% pierwotnej objetosci, ponownie traktuje acetonem przez wprowadzenie najpierw 20—25% objetosciowych acetonu, wytracenie substancji ba¬ lastowych i oddzielenie ich, a nastepnie dalsze 55 wprowadzenie do roztworu acetonu w ilosci 35—45% objetosciowych, co powoduje wytracanie sie piruwatkinazy, po czym osad oddziela sie, su¬ szy w stanie zamrozenia, a nastepnie rozpuszcza w 0,01 molowym roztworze czterooctanu dwuso- 60 dowego etylenodwuaminy i ogrzewa do tempera¬ tury 56—60°C w ciagu 7 minut, chlodzi, oddzie¬ la wytracone substancje balastowe, a roztwór po rozcienczeniu roztworem buforu zawierajacym 0,006 mola/l fosforanu i o pH=6,8 oczyszcza dalej 65 przez adsorpcje na zelu fosforanu wapniowego53191 5 6 i piruwatkinaze eluuje 0,2 molowym roztworem ciencza roztworem buforu octanowego o pH = 5,2 buforu fosforanowego o pH= 6,8 i o zawartosci 1,6 i o zawartosci 1,9 mola/l siarczanu amonowego mola/l siarczanu amonowego, po czym wytraca ja i wytraca stopniowo przez dodawanie nasyconego z eluatu okolo 2,8 molowym roztworem siarczanu roztworu siarczanu amonowego, amonowego, rozpuszcza w malej ilosci wody, roz- PL