Opublikowano: 22.11.1966 50925 KI. 30 h, 2/20 MKP A 61 k UKD ^OltKA Urzedu P«t«ifowe«c Polskiej RnmwiMlitei i^w Wspóltwórcy wynalazku: mgr Henryk Salwa, mgr Romana Jaworska, mgr Zofia Bury, mgr Wieslaw Lewenstein, inz.Jacek Vaedtke, mgr Anna Czarnocka, Janina Jedrzejuk Wlasciciel patentu: Instytut Farmaceutyczny, Warszawa (Polska) Sposób wyodrebniania cholekalcyferolu z mieszaniny uzyskanej po naswietleniu 7-dehydrocholesterolu Wytwarzanie cholekalcyferolu czyli witaminy D3 polega na naswietlaniu 7-dehydrocholesterolu pro¬ mieniami nadfiolkowymi przewaznie w organicz¬ nym rozpuszczalniku. Mieszanina po naswietleniu zawiera nieprzereagowana czesc substratu i zwia¬ zek izomeryczny przechodzacy w cholekalcyferol pod wplywem ogrzewania, zwany prowitamina Ds lub precholekalcyferolem oraz zanieczyszczenia in¬ nymi izomerami i produktami ubocznych reakcji fotolizy.Wieksza czesc nieprzereagowanego 7-dehydro¬ cholesterolu oddziela sie z mieszaniny wykorzystu¬ jac jego slaba rozpuszczalnosc w alkoholach. Na¬ stepnie precholekalcyferol przeprowadza sie w cho¬ lekalcyferol przez ogrzewanie roztworu. W ten spo¬ sób powstaje mieszanina zawierajaca do 50°/o cho¬ lekalcyferolu, jednakze wydzielenie czystego cho¬ lekalcyferolu z tej mieszaniny jest dosc trudne i skomplikowane.Znane sposoby wyodrebniania cholekalcyferolu z wymienionej mieszaniny polegaja na tworze¬ niu kompleksów cholekalcyferolu z cholesterolem, cholestanolem lub koprostanolem. Przez wprowa¬ dzenie do roztworu drugiego komponentu wytraca sie utworzony kompleks. Dalszym zagadnieniem jest rozklad otrzymanego kompleksu. Znane sa sposoby polegajace na dzialaniu substancji wypierajacych cholekalcyferol z kompleksu przez tworzenie no¬ wego kompleksu z drugim komponentem. Znacznie dogodniejszy sposób wedlug opisu patentowego 10 15 25 30 nr 48332 polega na rozkladzie kompleksu cholekal¬ cyferol — cholesterol na adsorbencie zwlaszcza tlen¬ ku glinowym, z którego po zaadsorbowaniu kom¬ pleksu, eluuje sie selektywnie poszczególne kom¬ ponenty tego kompleksu.Wynalazek polega na wykorzystaniu do wyod¬ rebniania cholekalcyferolu jego zdolnosci do two¬ rzenia kompleksu cholekalcyferol—7-dehydrocho- lesterol. Kompleks ten krystalizuje z mieszaniny zawierajacej oba komponenty zwlaszcza w ilosci równowaznej. Kompleks ten w znanych sposobach rozdzialu nie wydziela sie przede wszystkim dla¬ tego, ze wiekszosc 7-dehydrocholesterolu zostaje wydzielona przed przeprowadzeniem precholekal- cyferolu w cholekalcyferol.Jezeli natomiast pozostawi sie w mieszaninie do¬ stateczna ilosc 7-dehydrocholesterolu, a przez ogrzewanie przeprowadzi sie precholekalcyferol w cholekalcyferol lub jezeli po wydzieleniu w znany sposób 7-dehydrocholesterolu i po przeprowadze¬ niu precholekalcyferolu w cholekalcyferol uzupel¬ nia sie w mieszaninie zawartosc 7-dehydrochole¬ sterolu do ilosci równowaznej z iloscia zawartego w niej cholekalcyferolu, kompleks wydziela sie z duza wydajnoscia.Do rozkladu kompleksu cholekalcyferol—7-dehy- drocholesterol, szczególnie korzystne jest zastoso¬ wanie sposobu adsorpcyjnego analogicznego do spo¬ sobu rozkladu kompleksu cholekalcyferol—chole-* 5092550925 sterol wedlug cytowanego powyzej opisu patento¬ wego.Sposób wedlug wynalazku ma te przewage nad . sposobami znanymi, ze do mieszaniny nie wprowa¬ dza sie substancji obcych i przez to nie kompliku¬ je skladu mieszaniny. W konsekwencji daje to znaczne uproszczenie postepowania i pozwala na odzyskanie 7-dehydrosterolu uzytego na wytworze¬ nie kompleksu.Wedlug wynalazku z mieszaniny po naswietlaniu czesciowo wydziela sie znanym sposobem nieprze- reagowany 7-dehydrocholesterol, usuwajac pod zmniejszonym cisnieniem rozpuszczalnik, w którym prowadzono naswietlanie, i zadajac pozostalosc metanolem, a nastepnie odsaczajac wytracony osad 7-dehydrocholesterolu. Alkoholowy przesacz ogrzewa sie nastepnie celem przeprowadzenia pre- cholekalcyferolu w cholekalcyferol. Po zakoncze¬ niu termoizomeryzacji w przesaczu oznacza sie zawartosc cholekalcyferolu i 7-dehydrocholeste¬ rolu, uzupelniajac w razie potrzeby ilosc tego o- statniego skladnika w roztworze, aby stosunek cholekalcyferol : 7-dehydrocholesterol wynosil 1:1.Nalezy unikac nadmiaru 7-dehydrocholesterolu, gdyz wplywa to ujemnie na wytracanie sie zwiaz¬ ku kompleksowego cholekalcyferolu z 7-dehydro- cholesterolem. Nastepnie roztwór zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do malej objetosci, co powoduje wytracanie zwiazku kompleksowego, który po oziebieniu mieszaniny oddziela sie przez odsaczenie. Otrzymany produkt po wysuszeniu zawiera 42—45% cholekalcyferolu. Stanowi to okolo 85% cholekalcyferolu zawartego poczatko¬ wo w roztworze.Ponadto zawiera on równowazna ilosc 7-dehy¬ drocholesterolu i 10—15°/o zanieczyszczen. Zwiazek kompleksowy poddaje sie rozkladowi na aktyw¬ nych adsorbentach, z których szczególnie przydat¬ nym jest tlenek glinu, przy tym przez odpowied¬ nie przeprowadzenie operacji uzyskuje sie równo¬ czesnie oczyszczenie i wydzielenie poszczególnych komponentów kompleksu.Roztwór benzenowy zwiazku kompleksowego przepuszcza sie przez kolumne z tlenkiem glinu " i eluuje poczatkowo czystym benzenem, a nastep¬ nie mieszanina benzenu i 95%-owego etanolu. Zbie¬ rajac poszczególne frakcje eluatu uzyskuje sie ko¬ lejno: roztwór czystego cholekalcyferolu, roztwór cholekalcyferolu z domieszka 7-dehydrocholesterolu i roztwór 7-dehydrocholesterolu.Wieksza czesc zanieczyszczen pozostaje na ko¬ lumnie. Frakcje eluatu zawierajaca cholekalcyfe¬ rol odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a sucha pozostalosc poddaje sie krystalizacji.Otrzymuje sie krystaliczny cholekalcyferol o tem¬ peraturze topnienia 83—85°.Pr z y k l a d. Roztwór benzenowy 14,4 g 7-de¬ hydrocholesterolu naswietlano promieniami ultra¬ fioletowymi, a nastepnie odparowano pod zmniej¬ szonym cisnieniem az do uzyskania gestej masy.Dodano okolo 100 ml metanolu, wytrzasano przez kilka minut, a nastepnie odsaczono nierozpuszczo- ny 7-dehydrocholesterol przeplukujac go na sacz¬ ku 50 ml metanolu. Po wysuszeniu osad zwrotnego 7-dehydrocholesterolu wazyl 10,4 g. Przesacz wy- sycony azotem w szczelnie zamknietym naczyniu umieszczono w termostacie w temperaturze 36° na 3 doby.Po tym okresie stwierdzono, ze roztwór zawiera 5 okolo 1,6 g cholekalcyferolu i 0,45 g 7-dehydro¬ cholesterolu. Do roztworu dodano 1,15 g 7-de¬ hydrocholesterolu i mieszanine ogrzano az do cal¬ kowitego rozpuszczenia sie dodanej substancji.Nastepnie roztwór zageszczono pocj zmniejszonym 10 cisnieniem do objetosci okolo 30 ml, uzyskujac gesta zawiesine wydzielonego zwiazku kompleksom wego. Mieszanine przetrzymano w lodówce do nastepnego dnia.Po odsaczeniu i wysuszeniu uzyskano 3 g kry- 15 stalicznej substancji o zawartosci (wedlug ozna¬ czen spektrofotometrycznych) 45% cholekalcyfe¬ rolu. Otrzymana substancje rozpuszczono w 70 ml benzenu i przepuszczono przez kolumne (o sred¬ nicy 20 mm) z 80 g tlenku glinu o stopniu III ak- 20 tywnosci wedlug Brockmana. Po przejsciu roz¬ tworu kolumne eluowano czystym benzenem. Po odrzuceniu 150 ml czystego eluatu wyplywajacego z kolumny zebrano frakcje I objetosci 210 ml zawierajaca 1,25 g cholekalcyferolu, nastepnie 25 frakcje II objetosci 180 ml zawierajaca 60 mg cholekalcyferolu i 30 mg 7-dehydrocholesterolu.Nastepnie wymywajac kolumne benzenem z do¬ datkiem 10% etanolu zebrano frakje III zawiera¬ jaca 1,4 g 7-dehydrocholesterolu.Frakcje I odparowano pod zmniejszonym cis¬ nieniem do sucha i pozostalosc poddano krystali¬ zacji z acetonu z dodatkiem wody. Otrzymano 1,05 g krystalicznego cholekalcyferolu o tempe¬ raturze topnienia 83—85°.. Frakcje II polaczono z lugami pokrystalizacyj- nymi z frakcji I, usunieto rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem, sucha pozostalosc roz¬ puszczono w metanolu i po dodaniu 0,2 g 7-dehy¬ drocholesterolu otrzymano 0,4 g zwiazku kom¬ pleksowego cholekalcyferolu z 7-dehydrocholeste- rolem.Z frakcji III po :;runiec? u benzenu i wytrzas- nieciu pozostalosci z' metanolem otrzymano 1,3 g 7-dehydrocholesterolu. PLPublished: November 22, 1966 50925 IC. 30 h, 2/20 MKP A 61 k UKD ^ OltKA of the Office of the Polish RnmwiMlitei i ^ in Inventors: mgr Henryk Salwa, mgr Roman Jaworska, mgr Zofia Bury, mgr Wieslaw Lewenstein, engineer Jacek Vaedtke, Anna Czarnocka, MA, Janina Jedrzejuk Patent owner: Pharmaceutical Institute, Warsaw (Poland) Method of isolating cholecalciferol from a mixture obtained after irradiation with 7-dehydrocholesterol The production of cholecalciferol, i.e. vitamin D3, consists in irradiating 7-dehydrocholesterol with ultraviolet rays, usually in an organic solvent. After irradiation, the mixture contains unreacted part of the substrate and an isomeric compound that changes into cholecalciferol under the influence of heating, called provitamin Ds or precholecalciferol, and contamination with other isomers and by-products of the photolysis reaction. Most of the unreacted 7-dehydro cholesterol is separated from the mixture. it is poorly soluble in alcohols. The precholecalciferol is then converted to the cholecalciferol by heating the solution. In this way, a mixture containing up to 50% of cholecalciferol is formed, but the separation of pure cholecalciferol from this mixture is quite difficult and complicated. Known methods for the isolation of cholecalciferol from said mixture consist in the formation of complexes of cholecalciferol with cholesterol, cholestanol. or coprostanol. By introducing the second component into the solution, the complex formed is precipitated. Another issue is the distribution of the obtained complex. There are known methods involving the action of substances that displace cholecalciferol from the complex by forming a new complex with the second component. A much more convenient method according to the patent description No. 48332 consists in the decomposition of the cholecalciferol-cholesterol complex on an adsorbent, especially alumina, from which, after adsorption of the complex, the individual components of this complex are selectively eluted. utilizing its ability to form a cholecalciferol-7-dehydrocholesterol complex in the recovery of cholecalciferol. This complex crystallizes from a mixture containing both components, especially in an equivalent amount. This complex is not released in the known separation methods, primarily because most of the 7-dehydrocholesterol is released before the conversion of the precholecalciferol to colecalciferol, but if a sufficient amount of 7-dehydrocholesterol is left in the mixture and the precholecalciferol is converted by heating. into cholecalciferol or if, after the separation of 7-dehydrocholesterol in the known manner and conversion of the precholecalciferol to cholecalciferol, the mixture is supplemented with 7-dehydro cholecalciferol to an amount equivalent to the amount of cholecalciferol contained in it, the complex is released with high efficiency. For the decomposition of the cholecalciferol-7-dehydro-cholesterol complex, it is particularly advantageous to use an adsorption method analogous to that for the decomposition of the cholecalciferol-cholecalciferol-5092550925 sterol complex in accordance with the above-cited patent specification. The method of the present invention has this advantage also. by methods known to the fact that no foreign matter is introduced into the mixture and therefore does not complicate the composition of the mixture. As a consequence, it simplifies the procedure considerably and allows for the recovery of the 7-dehydrosterol used in the formation of the complex. According to the invention, after irradiation, the unreacted 7-dehydrocholesterol is partially separated from the mixture in a known manner, removing the solvent in which the irradiation was carried out under reduced pressure, and by feeding the residue with methanol, then filtering the precipitate of 7-dehydrocholesterol. The alcohol percolate is then heated to convert the pre-cholecalciferol to cholecalciferol. After completion of the thermoisomerization in the feed, the content of colecalciferol and 7-dehydrocholesterol is determined, adding if necessary the amount of this last component in the solution so that the ratio of cholecalciferol: 7-dehydrocholesterol is 1: 1. Avoid excess 7-dehydrocholesterol. as this has a negative effect on the deposition of the 7-dehydro-cholesterol complex of cholecalciferol. The solution then thickens under reduced pressure to a low volume, which causes the precipitation of the complex compound, which is separated by filtration after cooling the mixture. The product obtained after drying contains 42-45% of cholecalciferol. This represents about 85% of the cholecalciferol initially contained in the solution. In addition, it contains an equivalent amount of 7-dehydro cholesterol and 10-15% of impurities. The complex compound is decomposed on active adsorbents, of which alumina is particularly suitable, whereby, by appropriate operation, purification and separation of the individual components of the complex are simultaneously achieved. The benzene solution of the complex is passed through the column of aluminum oxide "and eluted initially with pure benzene, and then with a mixture of benzene and 95% ethanol. Collecting the individual fractions of the eluate, the following are obtained: pure cholecalciferol solution, cholecalciferol solution with 7-dehydrocholesterol admixture and 7-dehydrocholesterol solution. Most of the impurities remain on the column. The eluate fraction containing the cholecalciferol is evaporated under reduced pressure, and the dry residue is crystallized. A crystalline cholecalciferol with a melting point of 83-85 ° is obtained. Pre-cycl d. Benzene solution 14 4 g of 7-dehydro cholesterol were irradiated with ul then evaporated under reduced pressure until a thick mass was obtained. About 100 ml of methanol was added, shaken for a few minutes and then the undissolved 7-dehydrocholesterol was filtered off by washing it through a filter bag with 50 ml of methanol. After drying the 7-dehydrocholesterol reflux precipitate weighed 10.4 g. The nitrogen saturated filtrate in a tightly closed vessel was placed in a thermostat at 36 ° for 3 days. After this period it was found that the solution contained about 1.6 g of cholecalciferol and 0 45 g. 7-dehydro-cholesterol. 1.15 g of 7-dehydro cholesterol was added to the solution, and the mixture was heated until the added substance was completely dissolved. The solution was then concentrated by vacuum to about 30 ml, yielding a thick suspension of the isolated complex compound. The mixture was kept in the refrigerator until the next day. After draining and drying, 3 g of a crystalline substance was obtained, with a content (according to spectrophotometric determinations) of 45% of cholecalciferol. The material obtained was dissolved in 70 ml of benzene and passed through a column (diameter 20 mm) of 80 g of alumina of activity stage III according to Brockman. After the solution had gone through, the column was eluted with pure benzene. After discarding 150 ml of pure eluate flowing from the column, fractions I volume 210 ml containing 1.25 g of colecalciferol were collected, then 25 fractions II volume 180 ml containing 60 mg colecalciferol and 30 mg 7-dehydrocholesterol. Then eluting the column with benzene with an addition of 10% In ethanol, fraction III containing 1.4 g of 7-dehydrocholesterol was collected. Fraction I was evaporated to dryness under reduced pressure and the residue was crystallized from acetone with the addition of water. 1.05 g of crystalline colecalciferol with a melting point of 83 ° -85 ° C were obtained. Fractions II were combined with the recrystallization liquors from fraction I, the solvent was removed under reduced pressure, the dry residue was dissolved in methanol and after adding 0.2 g. 7-dehydrocholesterol was obtained 0.4 g of a complex compound of cholecalciferol with 7-dehydrocholesterol. From fraction III after: 1.3 g of 7-dehydrocholesterol were obtained from benzene and shaking the residue with methanol. PL