PL50101B1 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- PL50101B1 PL50101B1 PL95602A PL9560261A PL50101B1 PL 50101 B1 PL50101 B1 PL 50101B1 PL 95602 A PL95602 A PL 95602A PL 9560261 A PL9560261 A PL 9560261A PL 50101 B1 PL50101 B1 PL 50101B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- virus
- cells
- environment
- tissue
- incubation
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910000288 alkali metal carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000008041 alkali metal carbonates Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 claims description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 4
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000005786 degenerative changes Effects 0.000 description 2
- 229940049018 mycostatin Drugs 0.000 description 2
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002816 gill Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Pozywke organicz¬ na wzbogaca sie izotoniczna pozywka mineralna np. pozywka Parker'a 199 lub pozywka Hank'a.Mozna równiez stosowac inne znane pozywki umozliwiajace wzrost in vitro zywych komórek lub tkanek.Wskazane jest aby srodowisko hodowlane zawie¬ ralo jeden lub wiecej antybiotyków (np. penicyli¬ na, streptomycyna) w celu zabicia niepozadanych mikroorganizmów, oraz wlasciwy czynnik grzybo¬ bójczy jak na przyklad mykostatyne.Sposobem wedlug wynalazku hodowle wirusa prowadzi sie w obecnosci substancji buforujacej, w srodowisku o wartosci pH = 6,4—7,4. Korzystnie przy pH = 6,8—7,2. 5010150101 W przypadku wprowadzenia jako substancji bu¬ forujacej kwasnego weglanu metalu alkalicznego, zwlaszcza NaHC03, sól te stosuje sie w~srodowisku w stezeniu 0,001—0,01 m, najkorzystniej w steze¬ niu 0,002—0,005 m. Mozna jednakze uzyc innych sub¬ stancji, na przyklad roztworu buforowego fosfo¬ ranu sodowego, którym doprowadza sie pH do wartosci 7,14—7,69 przy koncowym stezeniu tej soli w srodowisku równym 0,05 m.Dq* rozwinietej kultury tkankowej wprowadza sie material zawierajacy przynajmniej jeden szczep wirusa kataru nosa. Zakazony wirusem material, pochodzacy od czlowieka, mozna latwo uzyskac przy przeplukiwaniu nosa lub gardla.Hodowle wirusa przeprowadza sie przy wyzej wartosci pH w temperaturze 30—36°C. lajAiybiiiejsze temperatury sa 31—35°C, korzy- f stniejsze tniedzy 32—34°C. Najlepsze jednak wy- \tt\m niki uzyskuje sie w temperaturze okolo 33°C to f2!^" ')*'*^^gf*ffiiedzy 32,5—33,5°C. W tych warunkach —«•**.— wipyi"*gytaru nosa czlowieka rozmnaza sie kosz¬ tem zywych komórek srodowiska hodowlanego.W "czasie inkubacji pozywka wraz z tkanka lub komórkami powinna pozostawac w ciaglym ruchu, najlepiej przez obracanie naczynia zawierajacego pozywke i material tkankowy. Stwierdzono, ze przy hodowli badanych szczepów wirusa kataru nosa sposobem wedlug wynalazku uzyskuje sie wirus w fazie cieklej srodowiska hodowlanego. Po przeprowadzeniu inkubacji w czasie 2 do 14 dni, lepiej 4—12 dni, najkorzystniej w czasie 6—9 dni faze ciekla zawierajaca wirus oddziela sie od sta¬ lych skladników przez odwirowanie.Jesli substancje wirusowa otrzymana wedlug wynalazku stosuje sie do otrzymywania szczepio¬ nek przeciw katarowi, to nalezy wirus zawarty w fazie cieklej zatezyc na przyklad przez ultrawi- rowanie, dialize lub przez przeprowadzenie przez kolumne jonitowa.Jest rzecza zrozumiala, ze nie wszystkie szczepy wirusa kataru nosa beda rosly w opisanym powy¬ zej srodowisku. Z latwoscia mozna jednak okres¬ lic przydatnosc srodowiska dla hodowli róznych szczepów wirusa kataru nosa. W tym celu badany wirus inkubuje sie jak opisano powyzej, nastep¬ nie material komórkowy pozywki bada sie pod mikroskopem. Wystepienie charakterystycznych zmian degeneracyjnych w komórkach swiadczy o rozwoju badanego szczepu wirusa.Moc otrzymanych preparatów wirusowych moz¬ na okreslic za pomoca testu cytopatologicznego.Stwierdzono, ze cytopatologiczny efekt wywola¬ ny przez aktywne czastki wirusa kataru nosa w kulturze zywych komórek zwierzecych, dostar¬ cza srodków do badania mocy stosowanych prepa¬ ratów. Kiedy inkubacje prowadzi sie zgodnie z wa¬ runkami okreslonymi przez niniejszy wynalazek, efekt cytopatologiczny zakaznych czastek wirusa objawia sie w zmianach degeneracyjnych komórek, w tworzeniu sie tak zwanych blaszek, które z lat¬ woscia dostrzegalne sa pod mikroskopem. Po pew¬ nym okresie trwania inkubacji zaczynaja sie po¬ jawiac w warstwie komórek blaszki, jako wynik dzialania pojedynczych czastek wirusa, którym uprzednio zaszczepiono hodowle. Blaszki te nazy- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 wane sa w opisie blaszkami pierwotnymi....W cza¬ sie inkubacji wirus sie rozmnaza, a reprodukowa¬ ny wirus rozprzestrzenia sie w warstwie komórek, zapoczatkowujac powstanie tak zwanych wtórnych: blaszek. Nalezy podkreslic, ze tylko ilosc pierwot¬ nych blaszek istotnie przedstawia stopien mocy poczatkowo uzytego preparatu wirusa. Na podsta¬ wie obserwacji mikroskopowych moznaojjrficzyc ilosc blaszek pierwotnych, a zatem ustalfc stopien mocy preparatu.Nie mozna ustalic dokladnie odpowiedniego cza¬ su, po uplywie którego trzeba przeprowadzic ob¬ serwacje, aby policzyc pierwotne blaszki. W kaz¬ dym podanym przypadku czas ten bedzie zalezal od uzytego materialu komórkowego, szczepu wi¬ rusa zastosowanego do badan i jego mocy oraz od warunków hodowli. Optymalny czas, po uplywie którego przeprowadza sie obserwacje moze wyno¬ sic od dwóch do dwunastu dni (na przyklad 5 lub 6 dni) po rozpoczeciu inkubacji, lecz doswiadczo¬ ny operator przeprowadzajacy badania bedzis z latwoscia mógl ustalic optymalny czas. W czasie powstawania pierwotnych blaszek, ilosc ich w po¬ równaniu z iloscia blaszek wystepujacych w do¬ swiadczeniu kontrolnym ze standartowa iloscia wirusa, bedzie wskazywala na przyblizony stopien mocy badanego preparatu w stosunku do standar- tu. Oczywiscie, oznaczenie mocy preparatu bedzie wtedy najdokladniejsze, gdy badanie to przepro¬ wadzi sie w momencie kiedy pojawila sie maksy¬ malna ilosc pierwotnych blaszek, a jeszcze nie powstaly blaszki wtórne.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Przygotowuje sie zawiesine ko¬ mórek nerkowych malpy z pierwotnej hodowli tkanki nerkowej malpy. Komórki te rozciencza sie do stezenia okolo 60.000 na ml w srodowisku zawierajacym 5°/o surowicy cielecia, 0,5% hydroli^ zatu laktoalbuminy w roztworze fizjologicznym Hank'a, zawierajacym 0,035°/o kwasnego weglanu sodowego, 100 jednostek na ml penicyliny i lOO^ig streptomycyny. Objetosci po 0,5 ml zawiesiny wprowadza sie do probówek, które inkubowano bez ruchu w ciagu okolo 3 dni. W tym czasie sro¬ dowisko usuwano i zastepowano je 1,5 ml nowej pozywki, zawierajacej 2°/o surowicy cielecia, 0,25°/o laktoalbuminy, kwasny weglan sodowy oraz anty¬ biotyki, jak powyzej. Do kazdej hodowli dodano 0,2 ml wody z przemycia nosa, pobranej od pa¬ cjentów lub ochotników zakazonych szczepem HGP wirusa kataru nosa. Hodowle w probówkach umieszczono w wirujacym bebnie, w inkubatorze o temperaturze 33 °C. Po uplywie okolo 5 dni roz¬ poczela sie degeneracja w warstwie komórek, po okolo 10-ciu dniach degeneracja byla wyraznie widoczna, zas zebrane srodowisko zawieralo duze ilosci wirusa.Przyklad II. Powtórzono przyklad I, lecz uzywajac roztworu buforowego fosforanu sodowe¬ go p pH = 7,2, w takiej ilosci azeby koncowe ste¬ zenie tej soli w srodowisku wynosilo 0,05 m.Ponizej opisano, jak mozna przeprowadzac ba¬ danie mocy preparatów za pomoca testu biologicz¬ nego.50101 6 15 20 Moc preparatów, zawierajacych wirus HGP ba¬ da sie w hodowli tkanek uzywajac drugorzedowej hodowli komórek nerkowych rezusa. Komórki te w ilosciach 30.000—40.000 wprowadza sie do pro¬ bówek stacjonarnych do 0,5 ml pozywki, zawiera- 5 jacej 0,5% surowicy cielecia, 0,5°/o hydrolizatu lak- toalbuminy (LAH) w roztworze fizjologicznym Hank'a, zawierajacym 0,03°/o kwasnego weglanu sodowego oraz 100 jednostek penicyliny, 100 \ig streptomycyny i 20 jednostek mykostatyny na ml. 10 Najlepsze wyniki uzyskuje sie przy uzyciu srodo¬ wiska wykazujacego srednie pH = 7,0—7,4, przy czym wazna jest raczej wartosc pH niz rodzaj za¬ stosowanych jonów, tak ze zamiast kwasnego we¬ glanu sodowego mozna zastosowac roztwór bufo¬ rowy fosforanu sodowego o pH = 7,14—7,69, przy koncowym jego stezeniu w pozywce wynoszacym 0,05 m. Po uplywie okresu hodowli stacjonarnej, trwajacym od 24 do 48 godzin w temperaturze 36°C, usuwa sie srodowisko hodowli i zastepuje sie je 1,5 ml pozywki, zawierajacej 2°/o surowicy cielecia, 0,25% hydrolizatu laktoalbuminy oraz posiadaja¬ cej inne skladniki pierwotnej pozywki w stosun¬ kach okreslonych powyzej.Nastepnie hodowle zaszczepia sie albo bezpo- 25 srednio po, albo w ciagu dnia po zmianie pozywki, scisle okreslona próbka pobrana z preparatu wi¬ rusa badanego na stezenie. Zaszczepione hodowle inkubuje sie w temperaturze 33°C w bebnie obro¬ towym, w warunkach opisanych w przykladzie I. 30 Próby w probówkach badano pod mikroskopem na drugi lub trzeci dzien po inkubacji, przy czym ilosc blaszek pojawiajacych sie w warstwie komó¬ rek byla wprost proporcjonalna do stezenia wi¬ rusa w badanym preparacie. Oczywiscie, przy obli- 35 czaniu blaszek konieczne bylo oznaczenie minimal¬ nej ilosci ognisk z komórkami uszkodzonymi, któ¬ re byly liczone jako blaszka. I tak na przyklad przyjeto, ze uszkodzenie ogniskowe musi zawierac 40 przynajmniej 10 komórek, aby zostalo zanotowane jako blaszka. Konieczne bylo dla celów porównaw¬ czych zastosowanie tego samego systemu liczenia zarówno do badanych preparatów, jak i do stan¬ dartowej ilosci badanego w ten sam sposób wiru- 45 sa. Przy ocenianiu zaobserwowanych wyników mozna umownie pominac próbki, wykazujace nie¬ zwykle wysoka liczbe blaszek, na przyklad 15 lub 18. Stwierdzono, ze po okolo trzech dniach ilosc blaszek zwiekszyla sie. Mozna wiec przyjac, 50 ze te pózniejsze blaszki byly blaszkami wtórnymi.Wykazano takze, ze ilosc blaszek zmniejsza sie, jezeli przed zaszczepieniem srodowiska hodowli wirus HGP zostanie zmieszany ze specyficzna, otrzymana z królika surowica odpornosciowa. Dla¬ tego tez mozna stosowac powyzej opisana metode badan nie tylko jako metode kontrolna przy wy¬ twarzaniu szczepionek, lecz takze w polaczeniu ze specyficzna surowica odpornosciowa do identyfiko¬ wania i kontrolowania szczepów wirusa wlacza¬ nych do szczepionki. Ponadto mozna uzywac tej metody do oceny reakcji antycial na kontrolne szczepionki doswiadczalne, podawane zwierzetom lub ludziom.Zaznacza sie, ze zamiast malpich komórek ner¬ kowych przy oznaczaniu mocy preparatu, mozna zastosowac komórki owodni i ludzkie komórki nerkowe, chociaz w tych przypadkach, blaszki trudno policzyc. Metoda badawcza i sposób wedlug wynalazku mozna atosowac do szczepu PK, HGP i do innych szczepów wirusa kataru nosa czlo¬ wieka. PL
Claims (6)
- Zastrzezenia patentowe 1. Sposób hodowania wirusa kataru nosa na dro¬ dze inkubacji w srodowisku hodowlanym za¬ wierajacym komórki lub tkanke pochodzenia ludzkiego lub malpiego, znamienny tym, ze ho¬ dowle prowadzi sie w srodowisku zawierajacym zywe komórki lub tkanke nerkowa zarodku ludzkiego lub malpia w temperaturze 31—35°C, korzystnie 32,5—33,5°C oraz przy pH = 6,4—7,2, korzystnie przy pH = 6,8—7,2.
- 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w czasie inkubacji pozywke i tkanke lub ko¬ mórki wprawia sie w ruch obrotowy.
- 3. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2, znamienny tym, ze do srodowiska hodowlanego wprowadza sie kwasny weglan alkalicznego metalu, zwlaszcza kwasny weglan sodowy, do osiagniecia jego stezenia w srodowisku wynoszacego 0,001 m — 0,01 m, korzystnie 0,002—0,005 m.
- 4. Sposób wedlug zastrz. 1—3, znamienny tym, ze do srodowiska hodowlanego wprowadza sie- jeden lub wiecej antybiotyków.
- 5. Sposób wedlug zastrz. 1—4, znamienny tym, ze do srodowiska hodowlanego wprowadza sie czynnik grzybobójczy.
- 6. Sposób wedlug zastrz. 1—5, znamienny tym,, ze stosuje sie tkanke lub material komórkowy wy¬ stepujacy w postaci jednej warstwy komórek rosnacej na pozywce. PL
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL50101B1 true PL50101B1 (pl) | 1965-08-15 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rothfels et al. | An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro | |
| Koch | The etiology of tuberculosis | |
| Fenner et al. | A short description of the poxvirus group (vaccinia and related viruses) | |
| Rosenkranz et al. | The effect of hydroxyurea on virus development: II. Vaccinia virus | |
| Van Rooyen et al. | The optimal conditions for the multiplication of Neethling-type lumpy skin disease virus in embryonated eggs | |
| Nicholson et al. | An established cell line from the Atlantic salmon (Salmo salar) | |
| Ward et al. | Naturally-occurring Sendai virus infection of athymic nude mice | |
| Davies et al. | The quantitative estimation of pinocytosis using radioactive colloidal gold | |
| Boorman et al. | Peritoneal macrophage alterations caused by naturally occurring mouse hepatitis virus | |
| Karpas et al. | Canine tracheobronchitis: isolation and characterization of the agent with experimental reproduction of the disease | |
| Hoorn | Respiratory viruses in model experiments | |
| Tyrrell et al. | Some properties of a strain of SV17 virus isolated from an epidemic of conjunctivitis and rhinorrhoea in monkeys (Erythrocebus patas) | |
| Michaels et al. | Fine structural observations on cell death in the epidermis of the external gills of the larval frog, Rana pipiens | |
| Scholtissek et al. | Characteristics of an influenza mutant temperature-sensitive for viral RNA synthesis | |
| Mackay | Tissue culture studies of sheep pulmonary adenomatosis (jaagsiekte): II. Transmission of cytopathic effects to normal cultures | |
| Haywood et al. | Effects of an imprinting procedure on RNA polymerase activity in the chick brain | |
| PL50101B1 (pl) | ||
| Hoerl et al. | Plasma membrane vesiculation: A cellular response to injury | |
| Silverstein et al. | Restricted replication of adenovirus type 2 in mouse Balb/3T3 cells | |
| Giuma et al. | Potential of Nematoctonus conidia for biological control of soil-borne phytonematodes | |
| Vigier | Effect of agar, calf embryo extract, and polyanions on production of foci of transformed cells by Rous sarcoma virus | |
| Chopra et al. | Morphology of Simian Foamy Viruses, With Particular Reference to Virus Isolated From Spontaneous Tumor of o Rhesus Monkey | |
| Williams | Growth and titration of louping-ill virus in monolayer tissue culture of pig kidney | |
| US3432595A (en) | Melanoma cell line of canine origin,its propagation and use,and vaccines derived therefrom | |
| Mazzola et al. | Electron microscope studies of Anaplasma marginale in an Aedes albopictus culture system |