PL46864B1 - - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu rozdzielania spi¬ ramycyn I, II i III.W patencie nr 46863 opisano sposób rozdzie¬ lania spiramycyn I, II lub III w aparacie roz¬ dzielczym Craig'a w przeciwpradzie za pomo¬ ca rozpuszczalnika organicznego, który polega na tym, ze mieszanine spiramycyn poddaje sie frakcjonowaniu w aparacie rozdzielczym w prze¬ ciwpradzie, posiadajacym pewna ilosc komó¬ rek, przy zastosowaniu 2 faz, a mianowicie fazy organicznej skladajacej sie z rozpuszczalnika grupy weglowodorów aromatycznych lub chlo¬ rowanych weglowodorów alifatycznych albo aromatycznych i fazy wodnej, skladajacej sie z roztworu buforowego o pH = 6 — 7. Fazy te uprzednio wzajemnie sie nasyca. Mieszanine spiramycyn poddawana rozdzialowi rozpuszcza sie w frakcji organicznej, a frakcjonowanie przeprowadza sie w sposób zwykly, przy czym poszczególne spiramycyny przechodza stopnio¬ wo do fazy wodnej, a po zakonczonym frakcjono¬ waniu, kazda z nich jest umiejscowiona w pew¬ nej ilosci komór.Sposób wedlug wynalazku polega na prze*- prowadzaniu rozdzialu spiramycyn przez chro¬ matografowanie na tlenku glinu, przy czym stosuje sie roztwór, w sklad którego wchodzi mieszanina zasad surowych oraz odpowiedni rozpuszczalnik. Jezeli chce sie rozdzielic zasa¬ de I od zasady II i III korzystne jest wówczas zastosowanie, jako dobrego rozpuszczalnika spi¬ ramycyny weglowodoru aromatycznego (na przyklad benzenu) lub eteru. W przypadku rozdzielania spiramycyny II i III od spiramy¬ cyny I stosuje sie wymywanie wyzej wymie¬ nionym rozpuszczalnikiem, przy czym spiramy- cyna I pozostaje w kolumnie. Z kolumny wy¬ mywa sie ja nastepnie mieszanina benzenu i acetonu, benzenu i alkoholu lub za pomoca alkoholu albo acetonu.W celu rozdzielenia spiramycyny II od spi¬ ramycyny III stosuje sie slaby rozpuszczalnik spiramycyin, jak cykloheksan-weglowodór aro¬ matyczny lub cykloheksan-eter. Wymywanie za pomoca powyzszych mieszanin prowadzi do otrzymania frakcji wzbogaconych w spiramy- cyne III, Spiramycyna II pozostaje w kolumnie i zostaje wyeluowama za pomoca eteru, a na¬ stepnie mieszaniny eteru i acetonu.Przez kilkakrotna chromatografie otrzymuje sie w stanie czystym zasady spiramycyny I, II i III. Z poszczególnych frakcji zasady oddziela sie przez odparowanie rozpuszczalnika .orga¬ nicznego, a nastepnie w przypadku spiramy- cyn II i III przez krystalizacje z rozpuszczal¬ nika grupy weglowodorów aromatycznych, jak na przyklad z benzenu.Jako mieszanine spiramycyn mozna stosowac badz mieszanine surowa trzech spiramycyn, taka jaka otrzymuje sie z bulionów fermenta¬ cyjnych, badz mieszanine spiramycyny II i III otrzymana przez krystalizacje frakcjonowana mieszaniny trzech spiramycyn w weglowodorze aromatycznym, badz lugi macierzyste z tej frakcjonowanej krystalizacji, które sa silnie wzbogacone w spiramycyne I.Spiramycyny I, II i III posiadaja prawie, ze to samo widmo antybakteryjne i1 ta sama aktywnosc, co spiramycyna wyjsciowa. Przez okreslenie „widmo antybakteryjne" rozumiana jest aktywnosc hamujaca produktu w stosunku do okreslonej liczby zarodków zespolu gatun¬ ków drobnoustrojów.Ponizsze przyklady, które nie ograniczaja wynalazku, ilustruja blizej sposób jego prze¬ prowadzenia.Przyklad I. 50 g mieszaniny krystalicznej spiramycyny II i III, otrzymanej z surowej mieszaniny trzech spiramycyn przez frakcjono¬ wana krystalizacje z benzenu o skladzie: spiramycyny II — 56% wagowych spiramycyny III — 44°/o „ rozpuszcza sie w 450 ml mieszaniny z cyklo¬ heksanu i eteru (w stosunku objetoscio¬ wym 2:1) i roztwór chromatografuje sie na kolumnie z tlenku glinu (ciezar tlenku glinu: 600 g, srednica kolumny: 35 mm). Chromato- gram rozwija sie najpierw za pomoca miesza¬ niny cykloheksanu i eteru, nastepnie kolejno za pomoca eteru i mieszaniny eteru i acetonu (w stosunku objetosciowym 1:1).Przebieg chromatografii streszcza ponizsza ta¬ bela, w której sklad poszczególnych frakcji eluatu okresla sie za pomoca chromatografii przeprowadzonej na papierze Whatman'a nr 1, impregnowanym roztworem buforowym o pH=9 (Na2HPOi • 12H20 — 23,8 g/litr) przy zastoso¬ waniu, jako rozpuszczalnika rozwijajacego faze lekka ukladu cykloheksanu metyloizobutyloke- tonu i wody (w stosunku objetosciowym 85:15:25). Stosowano technika splywowa z roz¬ winieciem w 4 godzinach w temperaturze 25°C, po czym produkt zbadano na drodze biologicz¬ nej na plycie z zelatyny z posiewem bakterii B. Subtilis.Numer frakcji 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Sklad rozpusz¬ czalnika cykloheksan- eter (2:1) objetosciowo „ „ » a a a a a a a a a eter „ n eter-aceton (l:l"objet.). a a Objetosc 2000 200 100 100 300 500 1400 500 500 % 500 1000 1000 ml a ii „ ii a ii ii ii ii t l ii Calosc wyciagu suchego 0,1 g 1,5 g 6,0 g 5,6 g 6,0 g 1,8 g 3,0 g 0,9 g . 4,7 g 2,0 g 7,0 g 7,4 g S k l a d Spiramycyna II — — slady 15% 30% 50% 60% 70% 80% 80% 85% 95% III — — 95% 85% 70% 50% 40% 30°/o 20% 20% 15% slady — 2 —Francje 3 zateza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem, a pozostalosc suiszy i krystalizuje z 12 ml benzenu. Otrzymuje sie w ten sposób 4 g spi- ramycymy III w postaci krystalicznej zasady.Przyklad II. 50 g spiramycyny w postaci za¬ sady w stanie surowym rozpuszcza sie w 500 ml benzenu, a roztwór chromatografuje sie na ko¬ lumnie zawierajacej 750 g tlenku glinu (sredni¬ ca kolumny 40 mm). Po przejsciu roztworu benzenowego chromatogram rozwija sie za po- 1 benzen 800 ml 2 „ 500 „ 3 „ 500 „ 4 „ 500 „ 5 benzen-aceton (1:3 objetosciowo) 400 „ 6 „ „ 400 „ 7 „ 400 „ 8 „ „ 800 „ Frakcje 6, 7 i 8 zebrano razem i zatezca o pod zmniejszonym cisnieniem. Uzyskana zasa¬ de wysuszono na lazni w prózni (40°C — 20 go¬ dzin— 1 mm Hg), przy czym otrzymano spira- mycyne I o nastepujacych danych: temperatura topnienia (w bloku Maauenna) .... 133 —134°C (a) r zu (c = l% w metanolu) ... —94° Traktowanie w tych samych warunkach frakcji 12 z nastepujaca po tym krystalizacja daje 5,8 g spiramycyny II krystalicznej, w po¬ staci zasady. moca benzenu, przez co zostaje calkowicie wyeluowana spiramycyna II i III. Nastepnie stosuje sie do rozwiniecia chromatogramu mie¬ szanine benzenu i acetonu (1:3 objetosciowo), w efekcie czego zostaje wyeluowana spiramy¬ cyna I. 5 g 9 g 7 g 2 g 5 g 8 g 3 g 1 g 10% 10% 20% 50% 80% 100% 100% 100% 30% 35% 40% 30% 10% — — — 60% 55% 40% 20% 10% — — — widmo nadflolkowe w roztworze etanolowym E l0/o przy 232 mM- ..... 318 1 cm Chromatografia na papierze przeprowadzona, jak w przykladzie poprzednim wykazuje, ze zasada ta zawiera jeden skladnik charaktery¬ zujacy sie Rf = 0,04.Charaktrystyki otrzymanych produktów Temperatura topnienia (w bloku Maauenna) 20 (a) (c = 1% w metanolu) Widmo nadfiolkowe (w roztworze etanolowym) 1% E " przy 232 mu 1 cm Chromatografia na papierze Spiramycyna II 130 — 132° — 85° 305 jeden jedyny produkt 0,15 Spiramycyna III 128 —130° — 82° 325 jeden jectyny produkt 0,22 Przebieg chromatograficzny streszczony jest w ponizszej tabeli.Numer frakcji Sklad rozpusz¬ czalnika Objetosc Calkowity ekstrakt suchy Sklad Spiramycyna I U III — 3 —Za pomcca ponownej chromatografii miesza¬ niny podstawowej frakcji 1 i 2, polaczonych wedlug techniki wskazanej w przykladzie T, mozna uzyskac zasady spiramycyny II i ITI w stanie czystym, w postaci krystalicznego produktu.Przyklad III. 25 g zasady wzbogaconej w spi- ramycyne I rozpuszcza sie w 125 ml eteru, a roztwór chromatografuje sie w kolumnie na tlenku glinu (waga tlenku glinu 500 g, srednr- ca kolumny 28 mm). Po przejsciu roztworu eterowego chromatogram rozwija sie eterem, co ma za zadanie wyeliminowanie splramycyn II i III, po czym sipiramycyne I wymywa sie przez przepuszczenie przez kolumne mieszani¬ ny eteru i acetonu (w stosunku objetoscio¬ wym 1:1). Przebieg chromatografii jest przed¬ stawiony w ponizszej tabeli.Numer frakcji 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sklad rozpusz¬ czalnika eter „ „ „ „ a eter-aceton (1:1 objetosciowo) i ii » ii ii ii Objetosc 800 ml 200 „ 200 „ 200 „ 200 „ 500 „ 400 „ 400 „ 400 „ 400 „ Calosc wyciagu suchego 0,4 g 4,0 g 2,4 g 1,6 g 1,0 g 0,5 g 1,1 g 4,9 g 2,9 g 1,0 g I 36% 60 78% 90% 90% 100% 100% 100% 100% Sklad (x) Spiramycyna H III 30% 22% 12% slady „ — — — — 34% 18% 10% slady „ — — — — (x) oznaczono chromatografie papierowa w wa¬ runkach poprzednio okreslonych.Frakcje 7, 8, 9 i 10 zbiera sie, zateza pod zmniejszonym cisnieniem, a uzyskana zasade suszy w prózni (40°C, przez 20 godzin, cisnie¬ nie 1 mm Hg).Otrzymuje sie zasade spiramycyny I o na¬ stepujacych cechach: temperatura topnienia (w bloku Maauenna) .... 133 —135°C 20 (<*) D (c = l% w metanolu) . . . —94° widmo nadfiolkowe (roztwór etanolowy) 1% E 1 cm przy 232 m^i 316 Chromatografia przeprowadzona na papierze, jak w przykladizie 1, wykazuje, ze produkt za¬ wiera tylko jeden skladnik charakteryzujacy sie cecha Rf = 0,04.Mieszaniny spiralnycyn zastosowane w przy¬ kladach I i III otrzymuje sie z surowej mie¬ szaniny trzech spiramycyn w sposób nastepu¬ jacy: surowa mieszanine trzech spiramycyn poddaje sie krystalizacji frakcjonowanej z ben¬ zenu. Otrzymane krysztalki przekrystalizowuje sie ponownie dwa razy z benzenu. Koncowe krysztalki stanowia mieszanine skladajaca sie z 56% spiramycyny II i z 44% spiramycyny III.Z lugów macierzystych z pierwszej krystali¬ zacji, po zageszczeniu i oddzieleniu nowych krysztalków, otrzymuje sie przesacz, z którego po odparowaniu otrzymuje sie zasade silnie wzbogacona w spiramycyne I, stosowana w przykladzie III. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób rozdzielania spiramycyn I, II i III, znamienny tym, ze roztwór surowej mieszani¬ ny trzech spiramycyn w weglowodorze aro¬ matycznym lub eterze, jako rozpuszczalniku chromatografuje sie w kolumnie na tlenku gli¬ nowym, po czym kolumne eluuje tym samym rozpuszczalnikiem i zbiera pierwsze przesacze, zawierajace spiramycyne II i III, a pozostala w kolumnie spiramycyne I wymywa mieszani¬ na rozpuszczalników, jak benzen - aceton, ben¬ zen - alkohol lub samym alkoholem, lub samym — i —acetonem, przy czym do pierwszych przesaczy dodaje sie slabego rozpuszczalnika spiramycyn, jak cykloheksan - weglowodór aromatyczny lub cykloheksan - eter i roztwór ten chromatogra- fuje w drugiej kolumnie na tlenku glinu, po czym kolumne eluuje sie najpierw tym samym rozpuszczalnikiem i zbiera przesacze wzboga¬ cone w spiramycyne III, a nastepnie z ko¬ lumny wymywa sie spiramycyne II, najpierw eterem, a potem mieszanina eteru i acetonu, a roztwory poszczególnych spiramycyn odpa¬ rowuje, przy czym spiramycyne II i III oczysz¬ cza sie jeszcze przez rekrystalizacje z weglo¬ wodoru aromatycznego. Rhóne — Poulenc S. A. Zastepca: inz. J. Felkner rzecznik patentowy PL