PL441003A1 - Preparat białkowy do zastosowania w zwalczaniu nosemozy u pszczoły miodnej oraz sposób otrzymywania tego preparatu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest preparat białkowy wyizolowany z materiału biologicznego zakażonego chorobotwórczymi zarodnikami Nosema spp., takiego, jak martwe pszczoły padłe z powodu takiego zakażenia, znajdujący zastosowanie do zwalczania nosemozy u pszczoły miodnej, groźnej choroby prowadzącej do masowego umierania całych rodzin pszczelich. Przedmiotem zgłoszenia jest też sposób otrzymywania tego preparatu.

Description

Preparat bialkowy do zastosowania w zwalczaniu nosemozy u pszczoly miodnej oraz sposób otrzymywania tego preparatu Przedmiotem \\')'nalazku jest preparat bialkowy wyizolowany z materialu biologicznego zakazonego chorobotwórczymi zarodnikami Nosema apis i Nosema ceranae,, takiego jak np., martwe pszczoly padle z powodu takiego 1..akazenia, znajdujacy :zastosowanie do zwalczania nosemozy u pszczoly miodnej (Apis mellifera), groznej choroby prowadzacej do masowego umierania calych rodzin pszczelich oraz sposób otrLymywania tego preparatu.

Wynalazek rozwiazuje problem techniczny w postaci uzyskania naturalnego preparatu bialkowego, hamujacego cykl rozwojowy zarodników NosemQ spp. w jelitach pszczól, wskutek inicjacji przeciwcial odpornosciowych skierowanych przeciwko temu grzybowi, co obok zabiegóv,: sanitarno-hodowlanych, stanowi podstaw~ w zapobieganiu i zwalczaniu nosemozy, a takze \\'Zmocnieniu rodzin pszczelich.

Znane z opisów patentowych EP 3504969 oraz US 20200113920 preparaty, znajdujace zastosowanie w zwalczaniu nosemozy, nic zabezpieczaja pszczól przed ich zakazeniem. W patencie US 20160287684 ujawniono metody zapobiegania róznym chorobom, czy poprawie zdrowia rodzin pszczelich~ jednakze kompozycje takie nie sa nakierowane na zapobieganie nosemozy. Z kolei opis patentowy WO 2017017313 dotyczy kompozycji znajdujacej zastosowanie jako szczepionka w zapobieganiu chorobie drobnoustrojowej lub infekcji owadów, ale jego skutecznosc w zapobieganiu nosemozy u pszczól jest niska. Inny wynalazek ujawniony w opisie patentowym US 20150328253 dotyczy preparatu opartego na otrzymywanym z glonów polisacharydzie siarczynowym, dedykowany jest zwalczaniu mikrosporydioz u ludzi lub zwierzat. Preparat ten wykazuje zwiekszenie odpornosci u kregowców, jednakze ze wzgledu na odmienna budowe ukladu odpornosciowego u owadów. nie jest skuteczny do 7.llpobiegania nosemozy u pszczól.

PL 441003 A1 2/16lsmieJe klika donie,;;ien patentowvch, tak np. I S 008X2242n. { t\ 15055114.

C\J 10111%07 ... EP 141604Q c/.y v.:n 15:~5.-;1 na temat prep,1Pl<•\\ do .1;:1„tnsnv.ama \V z·vrk?'.aniu i ;1.ap0hi.:gar:il' no'. 0emPZ; ·,a pnmo,~q kchnohrii interf~·n:nrji R~ A Zna:ie ;- '\T<. opi.,Ó\\' spor,cb:· z..apcbicrani;.;. .,~\~a!czar.ia noc;cmnzy u p;;zc,.-ól pdcgaja nil v,yci~Laniu w: 1 bran) eh bcnóv, Xosl!ma ',pp. ZJ pl1moca k0nstruktó,\ ul!.:t)..:,·nyd1 iub ;,;,a~,K;,;,;,;k kv1a:,ó,i. nc.1klc.:;nuv,)..:h (nr. ')iR>;,\s. 1niRN:,~ .. n~ ~hR\jA~i, któn.: sa funkc,1011ainic zwi4Ldr11.: L biaikdmi p,.;n;,;t(u_ia1.ymi i--u,Ih>ri,,~ Mi:tody ·,akit: wicli.q :.-;ie z hm1e~n10sc:ia u,.y..:ia ~p~c~ !ic:zm eh tedmik otr:,)m;v-.ani.i i 0Cl.)SZ..:iania genów. u samu idea aplik(mania ps:,,czo\om p:-eparatów na baLi~ modyilkiJwan:)ch µenety(.'.znil: ?wiazków ,1es1. d 1 slusyina . .1 uwagi na Je.i wplyw na .1akok prnluktów psz,·z~hd, pr1e;,nacmn\ch dla iudz; i m,dria d,1 po\\S?erhriei akctpi 11ci i. 7 k1lei \\ opisie p1temow: m l 1 S '.!(ll '.1P 157) l 2 u,1a,vnwnn f07\\frzania opa,·h: n ·n•:tPdy i komro:.,ycj.: 1n1ns!om1owaniJ ~o:;!in z wykorz} st:micrn polinuk:eot;d,:i,,._ -~doln:,cl: d,) '>\-)CbZ.:mm ..:kspn.-sji g.;nÓ\\ \V pato 6 ~.iJ..:h. 1 aki1.: sp(i,:;ob:, v,:·k0u:) .;t;, v,ani;, ru;Jin lr..llL,g~Hi(.;Zn) ... h uo z,nni ... jsn1nia i1,f..:k..:ji i J\-..i~l-..::,,caniu vdpun,o•,..:; JJSI.Clt)i na 110.:,i::;nu;.,..; ::;4 i--0,Hro,\·1,;f~)jlll:. D,: ',l//~l,;uu na m0.1li~\\lSI,: pr.~cJl•SlJ.\'>ania si~ orgJ.n1lmov. modyiikowan:-ch g~rn:b·c1.rne do swdo,qska , prouuKt,.m pszczelich prze1.nacl'.<.1n:-ch dla ludzi. Punadt.o. na te:-eme Unii t'.urnpcj~ki~j. :tabmrnone i est stosowani1.~ lak ich transtónn:sntów. a taicie n;~~kt011 eh chemi1-,1err.peu1yków. 7nl1n'.' eh na pr1yldad , ,"'risu pntent ktnr:c'1 ~i-:L1dnikiem "--hydr,1kr;;) iienmeso,·-:;' :icetyh,s~licylow~,. c7y te? ich snh'. 7 or,,i\u ratcnto\,.\~go PL ==316()2 zn:1ny jest rÓ\.\lliez preparat de z,,ca!cianiu mikro:,pcr:'. d:o.·. J .:wl.:.s;-c/a 111:,scn,o. '.) u p:.L--:Zt'.JI. ,._ .. ,\ 11„r,.p.1.-:) j..:: fdliJr.),,adz0nyd1 lwmogc.1il.zni1,;. Uiniduv,y.:h pochoJnyi.:h prdtup,Jri1r) I,) Z uwagi 1ta fok 1, iz n,i<:,d ora;; innt: prudukl) p:;,.o.de w: ~01 l) st)"\\ anc sa jah• pokarm. suplementy diety, itp., preparaty przeznaczone dla pszczól powinny bazowac na dobrze poznanych, najlepiej naturalnych substancjach. bezpiecznych zarówno dla pszczól jak i dla ludzi, latwo de-gradowalnych i niepowodujacych zmian genetyc7..nych w organizmach tych owadów.

W litcramrze istnieja doniesienia o stosowaniu w pszczelarstwie produktów leczniczych zawierajacych ekstrakty wyizolowane z substancji naturalnego pochodzenia. Do takich naleza tymol i resweratrol, substancje wyekstrahowane z ziela tymianku (Thymus sp.), uz.ywane w walec z inna choroba pszczól. jaka jest PL 441003 A1 3/16waroza. Jednakze, jak \\')'nika z eksperymentu przeprowadzonego przez Maistrello i in., opu bi ikowanego w czasopismie Apido/ogie. nr 41, 2008. 141-150; tymol i reswerattoL bedace naturalnymi zwiazkami fenolowymi, w wyzszych stezeniach. wykazuja toksycznosc wobec organizmów pszczól. Z kolei Bravo i in. w artykule opublikowanym na lamach .Journal of lnvertebrate Pmhology. nr 149, 20 I 7r., wyka7,.ali w badaniach in vivo, aktywnosc ekstraktu uzyskanego z lisci Cryptocarya alba wobec mikrosporydiów Nosema spp .. którymi ?AJ.kazono pszczoly w pierwszych 8 dniach badania. Taki stosunkowo krótki czas badania nie daje pewnosci braku toksycznego dzialania ekstraktu wdluzszym czasiejego podawania pszczolom.

Znane ze stanu techniki, naturalne substancje do zwalczania chorób grzybowych, wystepujacych w pszczelarstwie, wymagaja uzycia stosunkowo duzych dawek, co niekiedy wywoluje skutki uboczne dla samych pszczóLczy tez wytwartanych przez nie produktów.

Dotychczas w leczeniu nosemozy u pszczól~ stosowano antybiotyki na bazie fumagiliny. Nie niszczyly one calkowicie zarodników Nosema spp., co prowadzilo do rozwijania sie opornosci grzyba na ten antybiotyk. Dodatkowo, czysta fumagilina trudno rozpuszcza sie w wodzie, bedacej podstawa syropów cukrO\,vych. przez co konieczne jest stosowanie róznych dodatków chemicznych zwiekszajacych· rozpuszc1.,alnosc antyhiotyku. Taka praktyka grozi mozliwoscia przenikania samej fumagiliny lub produktów jej metabolizmu do miodu. Ponadto fumagilina jest toksyczna dla pszczól i zwieksza ich smiertelnosc, a u ludzi moze wywolywac neutropenie i trombocytopenie. Z tych powodów, od kilku lat w Unii Europejskiej, obowiazuje calkowity zakaz jej stosowania.

Zatem. niezbedne sa dalsze badania w zakresie opracowania skutecznych bezpiecznych preparatów zapobiegajacych ta.kazeniu pszczól chorobami grzybowymi.

Celem \\>)'nalazku bylo pozyskanie naturalnego preparatu chroniacego pszczoly miodne pr1:ed grozna infekcja v.'Ywolywana przez zarodniki Nosema spp., a zarazem w pelni bezpiecznego zarówno dla pszczól jak i konsumentów produktów pszczelich. lslota wynalazku jest preparat bialkowy znajdujacy zastosowanie do zwalczania nosemozy, groznej choroby pszczoly miodnej, wyizolowany z materialu biologicznego w.kazonego mikrosporydiami Nosema spp, takimi jak. Nosema apis czy Nosema ceranae. korzystnie z ro:1..cieru mart"')'ch pszczól padlych z powodu takiego zakazenia.

PL 441003 A1 4/16Istota wynalazku jest równiez sposób otrzymywania takiego preparatu bialkowego.

Sposób wedlug wynalazku polegajacy na wyizolowaniu bialka z materialu biologicznego. skazonego mikrosporydiami Nosema. spp .• charakteryzuje sie tym. ze zawiesine zarodników, pozyskana korzystnie z martwych pszczól,·•·•· tzw; osypu, zakazonych tym grzybem, wyjalawia sie w autoklawie przez 15 minut w temperaturze od 121 do l 26°C, w obecnosci 0,2 M chlorku sodowego, a nastepnie, po schlodzeniu do temperatury w granicach 4-6°C, odwirowuje, korzystnie przy obrotach 11 OOO - 13000 rpm, w ciagu 15 minut, po czym do supernatantu dodaje 0,05% wodnego roztworu azydku sodowego, w celu zapobiezenia rozwojowi niepozadanych drobnoustrojów i dializuje w workach o srednicy porów 1-2 kDa, korzystnie przez 7 dni, ciagle mieszajac i zmieniajac w ciagu doby wode destylowana~ korzystnie 2-krotnic. Z ta~ otrLymanego dializatu ,,,.11raca sie bialko prq uzyciu siarczanu amonowego, korzystnie mieszajac i dodajac ten odczynnik stopniowo, az do jego wys)'Cenia na poziomie 65%, ponownie schladza do temperatury w granicach 4-6°C, kondycjonuje przez I dobe, odwirowuje, korzystnie przy obrotach 14000 - 16000 rpm. a zebrany osad zawiesza w jalowym, O, 1 M bufort:e fosforanowym o pH=7, ekstrahuje pr.lez dodanie równej objetosci n-'butanolu, intensywne mieszajac 1 potem odwiro\\'Uje, korzystnie przy zmniejszonych obrotach od 4000 do 5000 rpm, odparow1.1je, a sucha pozostalosc w postaci oczyszczonego pre!)aratu bialkowego, rozpuszcza sie w jalowej wodzie i zamraza w temperaturze -20°C do pózniejszego wykorzystania.

Wynalazek i skutecznosc jego dzialania ptzedstawiono w ponizszych przykladach wykonania.

Przyklad 1. Sposób przygotowania preparatu bialkowego wedlug wynalazku.

Przygotowano zawiesine z martwych pszczól zakazonych mieszanka zarodników Nosema apis i Nosema ceranae, przez roztarcie 50 osobników w l 00 ml wody destylowanej. Po dodaniu chlorku sodowego do stezenia koncowego 0,2M, zawiesine poddano jednokrotnemu autoklawowaniu prt:ez 15 min .• w temperaturze J 26°C, a nastepnie schlodzono w laini lodowej utrzymujacej temperature w granicach 4 - 6°C i.po odwirowaniu stalych pozostalosci z predlwscia 13000 rpm, w ciagu J 5 min. do uzyskanego supematantu dodano 0,05% wodny roztwór azydku ~odowego. Nastepnie roztwór dializowano w workach o srednicy porów 1-2 kDa, PL 441003 A1 /16ciagle mieszajac. W trakcie 7 dniowej dializy zmieniano wode destylowana 2-kromie w ciagu doby. Z tak uzyskanego dializatu wytracano bi.alko przy uz) 1 ciu siarczanu amonowego, dodajac ten odczynnik stopniowo porcjami, przy ciaglym mieszaniu, az do wysycenia na poziomic 65%. Mieszanine pozostawiono na I dobe w lazni utrzymujacej temp. w granicach 4 - 6°C. na mieszadle magnetycznym. Wytracone bialka odwirowywano z predkoscia obrotów od 14000 do 16000 rpm, w ciagu 20 min .. Osad zawierajacy bialka zebrano i zawieszono w jalowym, O, 1 M bufon~c PBS (Sigma) o pH=7, a nastepnie ekstrahowano dodajac równa objetosc n-butanolu, intensywne mieszajac przez ok. I h. Po odwirowaniu, przy obrotach 5000, górna faze zawierajaca glównie n-butanol wraz z rozpuszczonymi w nim skladnikami lipofilnymi odrlucono, natomiast faze dolna odparowano, pozbywajac sie pozostalosci rozpuszczalników. Sucha pozostalosc zawierajaca oczyszczony preparat bialkowy, rozpuszczono w jalowej wodzie destylowanej i zamrozono w temp. -20°C, do pózniejszego wykorzystania wedlug v.rynalazku.

Przyklad 2. Charakterystyka preparatu bialkowego wedlug wynalazku.

Przy uzyciu aparatu Nano-drop wykazano, ze preparat bialkowy wg wynalazku zawieral od 1 O do 150 mg bialka w 1 ml.

.· Preparat bialko\.\')' otrzymany jak opisano w przykladzie I., podda.no rozdzialowi elektroforetycznemu wykonujac dwukierunkowa elektroforeze bialek 2D PAGE. W tym celu próbke preparatu zawieszono w buforze.do rehydratacji (8,8 mol/L mocznika, 2%. WN CHAPS; 70 mmol/L DTT; 0,2%, W/V, Bio-Lytes) i nalozono na 70 mrn paski JPG (Bio-Rad). Po rozdzieleniu bialek, w pierwszym wymiart:e, paski byly d\\'Ukrotnie równowazone, przez 15 min, w buforze o pH=8.8 i skladzie: 6 mol/L mocznika; 20%, VN, glicerol; 2%, WN, SDS; 375 mmol/L Tris­ HCI. Pierwszy etap wykonano w buforze równowazacym z 130 mmol/L DIT; drugi etap równowazenia zawieral 135 mmol/1 jodoacetarnidu (pierwszy kierunek elek1roforezy). Po wykonaniu elektroforezy trycynowej bialek (drugi kierunek elektroforezy), stwierdzono, ze bialka r.awane w preparacie wedlug wynalazku maja charakter obojetny i zasadowy oraz mase w granicach od 5 do 16 kD, co przedstawia widmo tej ana! izy, zamieszczone. na. rysunku jako fig. I.

Z kolei wykonane technika FT-IR A TR widmo w podczerwieni w zakresie 400 cm- 1 to 4000 cm- 1 , prLedstawione jako fig.2. potwierdza. ze w preparacie zdecydowanie przewazaja sygnaly pochodzace od bialek. Intensywny, szeroki sygnal w zakresie 3000- 3500 cm· 1 to absorbcja wywolana drganiami rozciagajacymi grup N-H (amid B) i O-H pochodzacymi glównie od 1..aadsorbowanej wody, zas sygnaly PL 441003 A1 6/162950 cm· 1 i 2830 cm• 1 to drgania rozciagajace charakterystyczne dla grup C-H. pochodzacych odpowiednio od Cl-b i CH 2• Pasma przynalezace do drgan zginajacych amidu I oraz amidu li, pochodzace od aminokwasów, zostaly zaobserwowane odpowiednio przy 1650 cm· 1 i 1540 cm· 1 , co odpowiada zarazem bialkom i zaadsorbowanej wodzie (grupy absorbujace w tym zakresie to: C=O, C~N, N-H. H-0-H). Pasmoabsorhcji pochodzace od jonu karboksylanowego (-C(=0)-0-) jest obserwowane przy ok. 1400 cm- 1 • natomiast szerokie pasmo absorbcji w zakresie 950 - l 200cm· 1 , z maksimum prl.y okolo l 100 cm· 1 , pochodzi od drgan rozciagajacych grup C-O-C w cukrach oraz od drgan zginajacych gtup C-O-H. obecnych zarówno w aminokwasach jak i w cukrach. Brak wyraznych sygnalów absorbcji w zakresie 820 -· 930 cm·1, charakterystycznych dla cukrów, v.'Skazuje, ze w preparacie moga znajdowac sie jedynie niewielkie ilosci sacharydów. Pozostale dwa pasma absorbcji przy ok. 614cm· 1 i 536cm·' odpowiaaaja pasmom amidu V i amidu VI.

Z kolei, przy uzyciu techniki chromatografii gazowej sprzezonej zs: spektrometria mas (GC-MS). analizowano obecnosc skladników cukrowych i lipidowych w preparacie wedlug standardowych procedur. Analiza widm masmvych i porównanie czasów retencji poszczególnych zwiazków z wzorcami, .pozwolila na identyfikacje tr.lech pentoz: rybozy, arabinozy i ksylozy; dwóch 6-deoksyheksoz: ramnozy i fukozy; trzech heksoz: mannozy, glukozy i galaktozy; dwóch hcksozarnin: glukozaminy i galaktozaminy oraz jednej heptozy. Kazdy z tych zwiazków wystepowal w ilosci mniejszej niz l µg/mg preparatu. Ponadto, stwierdzono sladowe· ilosci kwasu palmitynov.1ego i oleinowego. Zidentyfikowane skladniki preparatu wedlug wynalazku przedstawiono w tabeli I.

Prlyklad 4. Dzialanie preparatu bialkowego wedlug wynalazku na zwalc.r..anie nosemozy, Z uwagi na fakt, iz do zarazenia nosemoza dochodzi w trakcie pobierania przez pszczoly pokarmu, nektaru, pylku, wody czy tez zapasów miodu i pierzgi, preparat otrzymany wedlug wynalazku, podawano Z pokarmem. Pszczoly umieszczone po 40 osobników w 18 standardowych klatkach, poddawano obserwacji w ciagu I 5 dni. Rozmrozony do temperatury otoczenia preparat, podawano w poczatkowej fazie pszczolom zdrovirym, a nastepnie sztucznie zakazonym Nosema ópi.v i Nosema cercmae. Pszczoly dokanniano twor7.ac nastepujace grupy badawcze: PL 441003 A1 7/161. Kontrola - 3 klatki z zakazonymi pszczolami, dokarmianymi przez caly czas eksperymentu.tylko czystym. pokarmem; 2. Grupa I a - 3 klatki, w których zdrowe pszczoly dokanniano przez 6 dni pokarmem z dodatkiem 1 ml preparatu wedlug wynalazku, zawierajacym bialko w ilosci I 50 mg/ml. dodanym do 99 ml syropu cukrowo-wodnego otrzymanego prlez wymieszanie 50 g cukru i 50 ml przegotowanej wody.

· Nastepnie pszczoly zakazano zarodnikami Nosema spp. i do konca eksperymentu dokarmiano syropem cukrowo-\-vodnym z preparatem jak wyzej.

:L Grupa l b - 3 klatki, w których zdrowe pszczoly dokanniano przez 6 dni pokarmem z dodatk,iem 10ml preparatu wedlug wynalazku, zawierajacym bialko w ilosci I 00 mg/ml, dodanym do 90 ml syropu cukrowo-wodnego otrzymanego przez wymieszanie 45 g cukru i 45 ml przegotowanej wody.

Nastepnie pszczoly zakazano zarodnikami J\"osema spp. i do konca eksperymentu dokanniano syropem cukrowo"wodnym z preparatem jak wyzej. 4. Grupa 1c • 3 klatki. w których zdrowe pszczoly dokanniano przez 6 dni pokannem z dodatkiem 30 ml preparatu wedlug wynalazku. zawierajacym bialko w ilosci 50 mg/ml. dodanym do 70 ml syropu cukru inwertowanego.

Nastepnie pszczoly zakazano zarodnikami Nosema spp. i do konca eksperymentu dokarmiano syropu cukru inwertowanego z preparatem jak \.\')'zef . Grupa Id - 3 klatki, w których zdrowe pszczoly dokarmiano przez 6 dni pol<,annem z dodatkiem 50 ml preparatu wedlug wynalazku, zawiel"'.;1:jacym bialko w ilosci 20 mg/ml. dodanym do 50 mg ciasta dla pszczól. Nastepnie pszczoly zakw-..ano 1..arodnikami Nosema spp. i do konca eksperymentu dokarmiano ciastem dla pszczól z preparatemjak V.')'zej. 6. Grupa Je - 3 klatki, w których zdrowe pszczoly dokarmiano przez 6 dni pokarrnem z dodatkiem 70ml preparatu wedlug wynalazku. 7..awierajacym bialko w ilosci JO mg/ml, dodanym do 50 mg ciasta. Nastepnie pszczoly zakazano zarodnikami Nosema spp. i do konca eksperymentu dokanniano ciastem z preparatem jak wyzej.

W koncowej fazie, z kazdej grupy pszczól poddawanych eksperymentom. wykonywano standardowe rozciery do sporzadzenia preparatów mikroskopowych.

PL 441003 A1 8/16Ohecn,~ v,J preparatach 1arodniki !'l.rnPma ~r licrnno w komorze Ailrkera l rreparJtrm srorz:1d?0n:, ir. ? rn?-::icn; :, pwc7cll mb.ionych -~ gmpy kontm1n,:j.

V..\ r;iki nt7cnrowadzunvch ..:k ,;pcrvnH.:nh1\';, przed~t3\v;onc n:::. rvsurku i::iko fh:. 3 .. ,,r:lZ ., ,I. I . ~ L .J .. ... 'I.-. \\' ta:)eli 2, \\,.;kazuja zn.11.:LI,it: zmnicjsLu11:.1 ilo:~~ 1.arodnii..óv, \'uscnkl ~.pp. pozosialyt:h vv o,gJ.n:zrni.i<:h .1.aka.i:onyd1 psLcLul, ktCir:,m n& wstepie poJa'ndlhJ p1..:pan.H \A~Jlug w:,nJ!..tz;.,;u. najpierw jaku s,t..:Lepitml-.e. u prnem juz jako lek ps1.1::1:olom sr:tu-.:am.: 1.ali.alarr'.) m. Pl',kzas gdy v. ;.!rupie p:w.:zol kuntwlnyd1. zakazenic ru1.\\irn:lu ;;ie uu poziomu 12,0000 zarodników l\o.1enw :,;pp.,p!-lcwle. to \I, i,!rupie p,;zczol k1órvm podm.\ano preparat lic/ha 1:arodników 1malala do granic do I :10-iOO ,:arodniknw!J157C!0le. W~ rnk1 jedn<1?nacznie w<;h'a7.tl_Ja na Wt:diu~~ wyna laiku. Wyk:inno, ze rnrzyman: sro~oht:'m ,,.__,dluc. v. ynala?ku., ;nnowaqj '1) rrcparnt hiall.l"''"''.·, v, ~:pr•sl~b ;rrwc7acy zJb,::?pi.:cza pszczoly micd1:.e pr.~c i zaka:?:cnkrr: mikrnsro:-yJi::;.m1 .•·o 1. ma spp. 1.:0 dowicd,~ivllo ;:arówT,o w \I.Jrunkach L.1borat0f")jny..:h jak i w '>VJrunkad1 natur..1lnyd1. na roJzin..1.d1 ps?~cLdid1 Pr;,:) kbd 4 Rada ni(~ toks; cznosci preparatu hi::ilkowcgo wedlug,~ yna!arku na organizmy ps,'.c.~{I.

Preparat hia!kov:y ro,mrr,:zflny eh temr,eran1ry otoc:,,epw pc,d,w1arn1 ntm,,:·ff !)S>:cwlom umies?c?0n~m p0 40 O".obnibw \', l 8 ,;;tJndardowych klat!«;::+ ; pdd:mo 1. Kontrola ·· 3 kbtki ;:;~ zdrow)mi ps1.czolami dokarmian) mi puez rnl) 1.:/a: ~kspu') 11h:nH.1 t:- lku ..:.iy~t)m pobn111.m; 1 klatki z,! ,drow)rni ps,cwbmi dokanninn) mi rr,'c? caly Ga~ ck:-pcrymcntu r0Lam1cm z, d-id;:itki~·n-: 1 ml prcp,lf;.,tu \\dlt1f ,., : 11~Ji..1.:Lu. wodnego otrzymanego przez wymieszanie 50 g cukru i 50 ml przegotowanej wody. 3. Grupa 2b - 3 ~latki ze zdrowymi pszczolami dokannianymi przez caly czas eksperymentu pokannem z dodatkiem IO ml preparatu przygotowanego wg. wynalazku, zawierajacym bialko \V i I osci 100 mg/ml. dodanego do 90 ml cukmwo•wodnego otrzymanego przez wymieszanie 45 g cukru i 45 ml przegotowanej wody.

PL 441003 A1 9/16t (irupd 2c - J ldatk.i z..: 1:Jrowy111i p~Lcmlami Jui-.arrnian:,n,i pu:ct.. 1-'.aiy ~,a, t:k.:--pt:r)rncnlu pukam:t:lll L dmlatk11:rn Jd ml preparatu p1z.vgoh.mantgo w~ W) nalaz.ku. 73wierajac) m hialko v. i1osc1 :-O mg ml. dodaneµ,o do 71 ) m: po!-.armu dla n9czól in\Aertow,rne~o ,;yropu. tirupa 3d J klatki i'.;; 1..urowyn1i p~1..c.1.(1lami Jokannian:,rni prz.eL i..:a!y cab ck::-pt:r) mentu pol-.annern l. dod(l.Lluem 51) ml preparatu prz-,·guh)v.w1tgo v,g w:irnalazku. zawierajac) m hia!ko w ilo~c1 20 mg, mi. dodanefo do 5t; m~ nac;tH dla p;;.;zcz,'ll. o. Cirupd •+c - 3 klatt.i b. L cbper:-mentu pokarrnem l Jt•datkiem 7t) ml preoaralll przvgoh)wan) eh wg. w1nalazku. Za\\ iemiacy hialko v, ilosci IO mg/mL dodanego do 30 ml S) ropu cukrov.o-wodncgo otr7ymaneg.o nu.ez wymit~s?anie -;o g cukru i 20 mi rrzepotowanej w0d:-'- Pn 1,;: dniach p0róv,'nan0 \iczhe :iyw)<:"h p.::zcz0l \\ po:;-;7c7ególnych k 1 mk:.:cr 1 kontrn'q. [ ic:,h::i 7)''-V;·ch p'-?C1ól \V grup:it'!l l:iadawczych dokan:1i::mych pr.!pJ.I.1h.'n; •.v,::dtug ·v~ n.1lazku. byb pon',vvn) walna z liLzha zyv. ydi p:--.z.;Li.11 z grupy k1.,n,rd11.!j co prz.::d,;tJ.\\ irnw \'. t.tbd t J. \ifaj,11..: nJ "Lgi~Jz ie lldlur..,hia umicntl11o~c pj1 . .:,ól. nale/) St\\ ierd1it:., 1z P'"t.:parn, biJli-.ov.: wedlug VV) nulazh.u ll• ~ubstmc,1d niduks:rc:ma i \\ pt:ini bczpicl:ffa jakc dt'ddtek 1fo pszadich poJ\armów.

PL 441003 A1 /16Zastrzezenia patentowe I. Preparat bialkowy -.vyizolowany z materialu> biologicznego, zakazonego mikrosporydiamiNo;'i·ema spp, do zastosowania w zwalczania nosemozy pszczoly miodnej. 2. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wyizolowany jest z rozcieru mart\\'ych pszczól, padlych z powodu zakazenia Nosema spp., takimi jak np., Nosema apis i Nosema ceranae. 3. Sposób polegajacy na wyizolowaniu bialka z materialu biologjcznego skazonego mikrosporydiam i Nosema sp. znamienny tym, ze zawiesine zarodników Nosema spp. wyjalawia sie w autoklawie przez 1 S min w obecnosci 0,2 M chlorku sodowego, a nastepnie, po schlodzeniu do temperatury w granicach 4-6°C, odwirowuje~ po czym do supematantu, dodaje sie 0,05% wodnego roztworu azydku sodowego, dializuje w workach o srednicy porów 1-2 kDa 1 a nastepnie, z tak otrzymanego dializatu, \IJ)'lraca sie bialko przy uzyciu siarczanu amonowego, ciagle mieszajac, az do jego wysycenia, ponownie schladza do temperatury w granicach 4-6°C i kondycjonuje przez I dobl;, po czym odwirow'Uje. a zebrany osad zawiesza w jalowym~ O, I M buforze fosforanowym o pH=7 i ekstrahuje przez dodanie równej objetosci n-butanolu, intensywne mieszajac, potem odwirowuje i odparowuje, zas sucha pozostalosc, w posl<1ci oczyszczonego preparatu bialkowe:go, rozpuszcza sie w jalowej wodzie i zamraza w temperaturze -20°C do pózniejszego wykorzystania. 4. Sposób wedlug 7JtStrzezenia 3 znamienny tym, ze jako material biologiczny zakazony mikrosporydiami Nosema spp. stosuje siero:zcier z rnanwych pszczól tzw. osypu, zakazonych tym grzybem.

. Sposób wedlug :1..astrzezenia 3 znamienny tym~ ze zawiesine zarodników pozyskanych z materialu biologicznego, skazonego mikrosporydiarni No,wma spp., wyjalawia sie w granicach temperatur autoklawu od 121 do l 26°C.

PL 441003 A1 11/166. Sposób wedlug zastrzezenia 3 znamienny tym. ze odwirowanie preparatu przed dializa odbywa sie prly obrotach od 11 OOO do 13000 rpm. w ciagu 15 minut. 7. Sposób wedlug zastrzezenia 3 znamieimy tym. ze supernatant dializuje sie przez 7 dni, ciagle mieszajac i zmieniajac 2-krotnic w ciagu doby wode destylowana, 8. Sposób wedlug zastnezenia 3 znamienny tym, ze wytracanie bialka z dializatu nastepuje w trakcie mieszania, przy stopniov1-')'ITI dodawaniu siarczanu amonowego, az do jego \\')'Sycenia na poziomie 65%. 9. Sposób wedlug zastrzezenia 3 znamic:nny tym, ze wytracone bialko. po schlodzeniu i kondycjonowaniu; wiruje sie przy obrotach od 14000 do 16000 rpm„ a preparat po ekstrakcji, przy obrotach zmniejszonych do 5000 rpm.

PL 441003 A1 12/16o. o: r \. ,,, . ; • •--.. ,,r _____ { •. : 10 ;:'.'-QO Fig. I. ---~-----.. .,,, ___ _ '100 ~ Fig. 2. i ' \ _, '\ PL 441003 A1 13/16Tabela I. % udzialu . ilosc czas retencji zidentyfikowany skladnik \\' skladnika w preparacie µglmg Imin.] wg wv11alazku 13.991 ramnow 2,3 0.07 I i 14.069 ryboza 1,8 0,06 I I 14.176 fukoza .. 2,1 0,07 14.277 arabinoza. 4,5 0,14 14.553 ksyloza 8 0,26 18.818 mannoza 12,2 0,39 18.986 glukoza 8,5 0,28 19.126 galaktoza 13, 1 0.42 21.745 glukozamina 14, I 0;46 22.163 galaktozamina 18,6 0,60 22.886 heptoza 4,5 0,14 .067 kwas palmitynowy (16:0) slady slady ·.· 18.445 kwas oleinowy ( 18:1) 10,3 0,25 r--·--·-· I 1400000 li. e o 1200000 E i 1000000 ll 800000 ·e .. . ~ 1a 500000 ... m ~· C li i 400000 .m C: 200000 1 -= o -_-1--~. -• _l i zakazone grupa la grupa lb grupa le grupa ld grupa le L. ____ _,_, __ - -··- Fig.3 PL 441003 A1 14/16Tabela 2.

Liczba pszczól Grupa badawcza pszczól Na poczatku Zywych zakazonych Nosema spp. ckspel)'mentu po zakonczeniu podawania okreslona w przykl. 3. pokarmu z preparatem bialkowym zakazone - karmione 120 38 czystym pokarmem grupa la 120 43 gnJpa lb 120 67 grupa le 120 82 grupa Id 120 98 grupa le 120 41 Tabela 3.

.. Liczba pszczól Grupa badawcza pszczól Na poczatku Zywych po zakoncz. zdrowych okreslona w eksperymentu podawania pokarmu z przykl. 4. preparatem bialkowym Kontrola ( czysty 120 96 pokann) grupa 2a 120 98 grupa 2b 120 96 I grupa 2c 120 107 grupa 2d 120 112 grupa 2e 120 97 PL 441003 A1 /16al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 OS SS I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp,gov,pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.441003 Klasyfikacja zgloszenia: AOlN 63 1 , A61K 35/64, A0lP 3/00, A61P 3110, A23K 50/90 Podklasy w których prom:idzono poszukiw,mia: A0IN A61K A0lP A61P A23K Bazy komputerowe w których prowadzono posznki"ania: EPODOC WPI ESPACENET STN bazy UPRP Kategoria Dokumenty - z podana idcnty fikacja Odniesienie do dokumentu zastrz.

A WO2010128465 Al (BEEOLOGICS LLC, PALOi NITZAN, GLICK 1-9 EITAN IUSI) 2010-11-11 skrót. przyklady. zastrzezenia A US2020113920 Al (BARNARD COLLEGE [US]) 2020-04-16 skrót, 1-9 przyklady. zastrzezenia A WO2016135655 Al (TROVO Stefano [TT]) 2016-09-01 skrót przyklady, 1-9 zastrzcz,;nia A Burnham AJ. Seientific Ad,ances in Controlling Nosema eeranae 1-9 (Mierosporidia) Infcctions in Honey Bees (Apis mellifcra), Front Vet Sei. 2019 Mar 15;6:79, D Dalszy ciag wykazu dokumentó" na nastepnej stronie A- dol-, .. umcnt ol-,._1..-::-slajac~ ogólny ~lan tcclmilJ, L..tór~- nic jest uwaL.any za posiadajac) szcLcgólnc z1t.Lczc1Lic, r - dokument ~t;-rnm:riacy wczcsnicjs7C z;:lo~7.c11ic lub p;itcnt. ;ik opubhko,y;iny ''" h1h po dacie 7.gloszcni::i.

L - dokument. który mo7e podcl;iw8C '" v,-~tpliwosc n1strzegm1e pienvs7enstwo(-w8). h1b puytOC7DffV w celu ust8lenia dat~- p11bhbc_ii inne_Qo c~·towm1ego dokmne11t11 lub z innego szczególnego powodu.

O - dokument odnoSZl\C' s1e do uJawrnema ustnego przez zastosowarne, w, staw1eme lub uJawmerne \\ 1rn1y sposób.

P dokument upublitov\ an: pucd data zgloszcma, ale póznicJ mz zastILcgana data p1cn\ szcllst\va.

T - dok11111ent pó/.nicjs/,}. opublikuwan)' po dacie ·1:~los,,:cnia lub w cbcic piern S/.Ciislwa i nicb~clac: ,., konniLcic /.C /.glos'l.eniem. ale C) tm, an: ,.v celu ·1:w·1:w11ienia z3s;id h1h teorii lc7.~cych u podstnw ,vynnl;izl:u.

X - dokument o S7Czególn:vm znaczeniu: zastl7.e_gm1~' \Yyn8.fa7ek nie mo7.e byc mY87.an:v 7<1 now~- lub nie mo7e b~-c uwa7.an~- 78. posiada_j8.cy po7iom w~·nalazc7.y. _je7eli ten dokument branv jest poci uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczemu; zastaegan:v v,-ynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom 1yynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jcdn: m lub l\..iltoma tego typu dokumentami, a tal\..ic polacLcmc bedz1c oczy wistc dla Lltawc:. & - clol.11111c11t nalc/.:ji .. ) clo lej ~;i mej rucV,in)' palenlo,.vcj.

Sprawozdanie wykonal/-a: Magdalena Stepaniuk Ekspert Data: 23,01 ,2023 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 22.04.2022r.

Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL 441003 A1 16/16

Claims (9)

1. Zastrzezenia patentowe I. Preparat bialkowy -.vyizolowany z materialu> biologicznego, zakazonego mikrosporydiamiNo;'i·ema spp, do zastosowania w zwalczania nosemozy pszczoly miodnej.
2. 2. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wyizolowany jest z rozcieru mart\\'ych pszczól, padlych z powodu zakazenia Nosema spp., takimi jak np., Nosema apis i Nosema ceranae.
3. 3. Sposób polegajacy na wyizolowaniu bialka z materialu biologjcznego skazonego mikrosporydiam i Nosema sp. znamienny tym, ze zawiesine zarodników Nosema spp. wyjalawia sie w autoklawie przez 1 S min w obecnosci 0,2 M chlorku sodowego, a nastepnie, po schlodzeniu do temperatury w granicach 4-6°C, odwirowuje~ po czym do supematantu, dodaje sie 0,05% wodnego roztworu azydku sodowego, dializuje w workach o srednicy porów 1-2 kDa 1 a nastepnie, z tak otrzymanego dializatu, \IJ)'lraca sie bialko przy uzyciu siarczanu amonowego, ciagle mieszajac, az do jego wysycenia, ponownie schladza do temperatury w granicach 4-6°C i kondycjonuje przez I dobl;, po czym odwirow'Uje. a zebrany osad zawiesza w jalowym~ O, I M buforze fosforanowym o pH=7 i ekstrahuje przez dodanie równej objetosci n-butanolu, intensywne mieszajac, potem odwirowuje i odparowuje, zas sucha pozostalosc, w posl<1ci oczyszczonego preparatu bialkowe:go, rozpuszcza sie w jalowej wodzie i zamraza w temperaturze -20°C do pózniejszego wykorzystania.
4. 4. Sposób wedlug 7JtStrzezenia 3 znamienny tym, ze jako material biologiczny zakazony mikrosporydiami Nosema spp. stosuje siero:zcier z rnanwych pszczól tzw. osypu, zakazonych tym grzybem.
5. 5. Sposób wedlug :1..astrzezenia 3 znamienny tym~ ze zawiesine zarodników pozyskanych z materialu biologicznego, skazonego mikrosporydiarni No,wma spp., wyjalawia sie w granicach temperatur autoklawu od 121 do l 26°C.1/166.
6. Sposób wedlug zastrzezenia 3 znamienny tym. ze odwirowanie preparatu przed dializa odbywa sie prly obrotach od 11 OOO do 13000 rpm. w ciagu 15 minut.
7. 7. Sposób wedlug zastrzezenia 3 znamieimy tym. ze supernatant dializuje sie przez 7 dni, ciagle mieszajac i zmieniajac 2-krotnic w ciagu doby wode destylowana,
8. 8. Sposób wedlug zastnezenia 3 znamienny tym, ze wytracanie bialka z dializatu nastepuje w trakcie mieszania, przy stopniov1-')'ITI dodawaniu siarczanu amonowego, az do jego \\')'Sycenia na poziomie 65%.
9. 9. Sposób wedlug zastrzezenia 3 znamic:nny tym, ze wytracone bialko. po schlodzeniu i kondycjonowaniu; wiruje sie przy obrotach od 14000 do 16000 rpm„ a preparat po ekstrakcji, przy obrotach zmniejszonych do 5000 rpm.2/16o. o: r \. ,,, . ; • •--.. ,,r _____ { •. : 10 ;:'.'-QO Fig. I. ---~-----.. .,,, ___ _ '100 ~ Fig. 2. i ' \ _, '\3/16Tabela I. % udzialu . ilosc czas retencji zidentyfikowany skladnik \\' skladnika w preparacie µglmg Imin.] wg wv11alazku 13.991 ramnow 2,3 0.07 I i 14.069 ryboza 1,8 0,06 I I 14.176 fukoza .. 2,1 0,07 14.277 arabinoza. 4,5 0,14 14.553 ksyloza 8 0,26 18.818 mannoza 12,2 0,39 18.986 glukoza 8,5 0,28 19.126 galaktoza 13, 1 0.42 21.745 glukozamina 14, I 0;46 22.163 galaktozamina 18,6 0,60 22.886 heptoza 4,5 0,14 15.067 kwas palmitynowy (16:0) slady slady ·.· 18.445 kwas oleinowy ( 18:1) 10,3 0,25 r--·--·-· I 1400000 li. e o 1200000 E i 1000000 ll 800000 ·e .. . ~ 1a 500000 ... m ~· C li i 400000 .m C: 200000 1 -= o -_-1--~. -• _l i zakazone grupa la grupa lb grupa le grupa ld grupa le L. ____ _,_, __ - -··- Fig.34/16Tabela 2. Liczba pszczól Grupa badawcza pszczól Na poczatku Zywych zakazonych Nosema spp. ckspel)'mentu po zakonczeniu podawania okreslona w przykl. 3. pokarmu z preparatem bialkowym zakazone - karmione 120 38 czystym pokarmem grupa la 120 43 gnJpa lb 120 67 grupa le 120 82 grupa Id 120 98 grupa le 120 41 Tabela 3. .. Liczba pszczól Grupa badawcza pszczól Na poczatku Zywych po zakoncz. zdrowych okreslona w eksperymentu podawania pokarmu z przykl. 4. preparatem bialkowym Kontrola ( czysty 120 96 pokann) grupa 2a 120 98 grupa 2b 120 96 I grupa 2c 120 107 grupa 2d 120 112 grupa 2e 120 975/16al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 OS SS I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp,gov,pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.441003 Klasyfikacja zgloszenia: AOlN 63 1 30, A61K 35/64, A0lP 3/00, A61P 3110, A23K 50/90 Podklasy w których prom:idzono poszukiw,mia: A0IN A61K A0lP A61P A23K Bazy komputerowe w których prowadzono posznki"ania: EPODOC WPI ESPACENET STN bazy UPRP Kategoria Dokumenty - z podana idcnty fikacja Odniesienie do dokumentu zastrz. A WO2010128465 Al (BEEOLOGICS LLC, PALOi NITZAN, GLICK 1-9 EITAN IUSI) 2010-11-11 skrót. przyklady. zastrzezenia A US2020113920 Al (BARNARD COLLEGE [US]) 2020-04-16 skrót, 1-9 przyklady. zastrzezenia A WO2016135655 Al (TROVO Stefano [TT]) 2016-09-01 skrót przyklady, 1-9 zastrzcz,;nia A Burnham AJ. Seientific Ad,ances in Controlling Nosema eeranae 1-9 (Mierosporidia) Infcctions in Honey Bees (Apis mellifcra), Front Vet Sei. 2019 Mar 15;6:79, D Dalszy ciag wykazu dokumentó" na nastepnej stronie A- dol-, .. umcnt ol-,._1..-::-slajac~ ogólny ~lan tcclmilJ, L..tór~- nic jest uwaL.any za posiadajac) szcLcgólnc z1t.Lczc1Lic, r - dokument ~t;-rnm:riacy wczcsnicjs7C z;:lo~7.c11ic lub p;itcnt. ;ik opubhko,y;iny ''" h1h po dacie 7.gloszcni::i. L - dokument. który mo7e podcl;iw8C '" v,-~tpliwosc n1strzegm1e pienvs7enstwo(-w8). h1b puytOC7DffV w celu ust8lenia dat~- p11bhbc_ii inne_Qo c~·towm1ego dokmne11t11 lub z innego szczególnego powodu. O - dokument odnoSZl\C' s1e do uJawrnema ustnego przez zastosowarne, w, staw1eme lub uJawmerne \\ 1rn1y sposób. P dokument upublitov\ an: pucd data zgloszcma, ale póznicJ mz zastILcgana data p1cn\ szcllst\va. T - dok11111ent pó/.nicjs/,}. opublikuwan)' po dacie ·1:~los,,:cnia lub w cbcic piern S/.Ciislwa i nicb~clac: ,., konniLcic /.C /.glos'l.eniem. ale C) tm, an: ,.v celu ·1:w·1:w11ienia z3s;id h1h teorii lc7.~cych u podstnw ,vynnl;izl:u. X - dokument o S7Czególn:vm znaczeniu: zastl7.e_gm1~' \Yyn8.fa7ek nie mo7.e byc mY87.an:v 7<1 now~- lub nie mo7e b~-c uwa7.an~- 78. posiada_j8.cy po7iom w~·nalazc7.y. _je7eli ten dokument branv jest poci uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczemu; zastaegan:v v,-ynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom 1yynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jcdn: m lub l\..iltoma tego typu dokumentami, a tal\..ic polacLcmc bedz1c oczy wistc dla Lltawc:. & - clol.11111c11t nalc/.:ji .. ) clo lej ~;i mej rucV,in)' palenlo,.vcj. Sprawozdanie wykonal/-a: Magdalena Stepaniuk Ekspert Data: 23,01 ,2023 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 22.04.2022r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego6/16