PL439742A1 - Sposób otrzymywania wysoko oczyszczonego polimeru kwasu homogentyzynowego - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy uniwersalnego sposobu otrzymywania wysoko oczyszczonego polimeru kwasu homogentyzynowego (piomelaniny), obejmującego etap sprawnego oddzielenia komórek mikroorganizmów i części makrocząstek od kwasu homogentyzynowego, etap szybkiej polimeryzacji kwasu homogentyzynowego do piomelaniny oraz etap wydajnej izolacji czystego polimeru metodami fizykochemicznymi.

Description

Sposób otrzymywania wysoko oczyszczonego polimeru kwasu homogentyzynowego Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wysoko oczyszczonego polimeru kwasu homogentyzynowego (piomelaniny).

Kwas homogentyzynowy, nazywany inaczej kwasem 2,5- dihydroksyfenylooctowym lub alkaptonem, powstaje w wyniku metabolizmu L­ tyrozyny i jest pochodna hydrochinonu. Charakterystyczna cecha chinonów jest natomiast duza reaktywnosc i szybki cykl redoks.

Piomelanina jest to naturalny polimer kwasu homogentyzynowego wytwarzany przez bakterie, grzyby i rosliny. W naturze piomelanina sluzy organizmom do ochrony przed promieniowaniem UV oraz do wychwytywania wolnych rodników. Ponadto, posiada zdolnosc do redukcji zelaza i jego biokoncentracji, co moze byc przystosowaniem w przypadku jego niedoborów w srodowisku. Polimer kwasu homogentyzynowego jest stosunkowo reaktywnym zwiazkiem. Jego aktywnosc przypomina w pewnym zakresie oddzialywanie kwasów humusowych z substancjami obecnymi w glebie Z publikacji literaturowej autorów Huda M. Mahmood, Alaa K. Mohammed, May T. A Flayyih pt. ,,Purification and physiochemical characterization of pyomelanin pigment produced from local Pseudomonas aeruginosa isolates" znany jest sposób ekstrakcji i oczyszczania piomelaniny polegajacy na wyizolowaniu szczepu bakteryjnego zdolnego do wytwarzania duzych ilosci piomelaniny na pozywce do produkcji piomelaniny uzupelnionej L-tyrozyna.

Próbki zamrozono i rozmrozono w celu wyekstrahowania pigmentu piomelaniny, a nastepnie zakwaszono do pH 2 i odstawiono na jeden tydzien w temperaturze pokojowej. Nastepnie zawiesine gotowano przez 1 godzine, aby zapobiec tworzeniu sie melanoidyn, po czym odwirowano przy 8000 g przez 1 O minut.

PL 439742 A1 2/14Wytworzony pigment przemywano trzykrotnie 15 ml O, 1 M HCI, a nastepnie przemywano woda. Do osadu dodano 1 O ml etanolu i mieszanine inkubowano we wrzacej lazni wodnej przez 1 O min, po czym utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 1 dzien. Nastepnie osad przemywano dwukrotnie etanolem, po czym suszono na powietrzu.

Z publikacji literaturowej autora Sinan Bayram pt. ,,Production, purification, and characterization of Streptomyces sp. strain MPPS2 extracellular pyomelanin pigment" znany jest sposób bioprodukcji i oczyszczania piomelaniny. Szczep MPPS2 sp. zainokulowano pozywka. W tym celu przygotowano 150 ml sterylnej pozywki w 250 ml kolbach i inokulowane próbki inkubowano na wytrzasarce orbitalnej przez tydzien (200 obr/min, 35°C). Pod koniec 1-tygodniowego okresu inkubacji, brazowo zabarwiona pozywke przeniesiono do 50 ml probówek i wirowano przy 1 O OOO obr.Imin przez 1 O minut. Proces wirowania powtórzono trzy razy. Nastepnie dostosowano pH próbek bez biomasy bakteryjnej do wartosci 2 przy uzyciu 6 M HCI. Otrzymane próbki pozostawiono do polimeryzacji przez 24 h w ciemnym otoczeniu w temperaturze pokojowej. Pod koniec procesu polimeryzacji próbki ponownie wirowano przy 10 OOO obr.Imin przez 10 min. Po odwirowaniu ostroznie zdekantowano supernatant. Otrzymane „pelety" suszono w piecu w temperaturze 55°C przez 24 godziny. Oczyszczona i spolimeryzowana melanina zostala przeniesiona do probówek Eppendorf'a i przechowywana w temperaturze -20°C.

Z publikacji literaturowej autorów Macarena Larroude, Djamila Onesime, Olivier Rue, Jean-Mare Nicaud, Tristan Rossignol pt. ,,A Yarrowia lipolytica strain engineered for pyomelanin production" znany jest sposób otrzymywania i oczyszczania piomelanin. Szczepy E. coli hodowano w 37°C na pozywce Luria­ Bertani (1 O g/I tryptonu, 5 g/I ekstraktu drozdzowego i 1 O g/I NaCI) zawierajacego 100 g/I ampicyliny lub 50 g/1. Szczepy Y. lipolytica hodowano w 28°C w minimalnej pozywce YNB zawierajacej 1 O g/I glukozy, 1, 7 g/I drozdzowej zasady azotowej, 5 g/I NH4CI i 50 mM buforu fosforanowego (pH 6,8) lub w bogatej pozywce YPD zawierajacej 1 O g/L glukozy, 1 O g/L peptonu i 1 O g/L ekstraktu drozdzowego. Dodano uracyl (100 mg/L) i leucyne (700 mg/L), aby spelnic wymagania szczepów auksotroficznych, a w celu selekcji szczepów dodano higromycyne B (250 mg/I) lub nourseotrycyne (400 mg/I). Szczepy Y. lipolytica PL 439742 A1 3/14hodowano wstepnie przez noc w 5 ml pozywki YPD (28°C, 80 rpm). Hodowle wstepne nastepnie odwirowano, przemyto dwukrotnie sterylna woda destylowana i zastosowano do zaszczepienia 15 ml pozywki YNB w 100 ml kolbach (OD500 0,05). Komórki hodowano w 28°C z mieszaniem (180 rpm) przez okres do 25 dni. Co 2-3 dni hodowle oceniano wizualnie w celu monitorowania wygladu brazowego pigmentu. Próbki odwirowano, a supernatanty zastosowano do analizy HPLC lub ekstrakcji piomelaniny. Ekstrakcja polegala na tym, ze hodowle odwirowano (10000 g przez 15 min) i melanine oczyszczono z supernatantu przez zakwaszenie (dodawano 1 M HCI az do osiagniecia pH ~2), co spowodowalo wytracanie piomelaniny. Po 24 h w temperaturze pokojowej powstale próbki odwirowano (10000 g przez 1 O min). Otrzymano brazowe ,,pelety", które przemyto i liofilizowano.

Celem wynalazku jest uzyskanie wysoko oczyszczonej, pozbawionej reszt organicznych piomelaniny. Celem wynalazku jest opracowanie szybkiego i wydajnego sposobu otrzymywania piomelaniny. Celem wynalazku jest równiez zapewnienie uniwersalnej metody, która pozwala na izolacje polimeru z róznych typów brzeczek pohodowlanych.

Cel ten zrealizowano w przedmiotowym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wysoko oczyszczonego polimeru kwasu homogentyzynowego, w którym: (a) wstepnie oczyszcza sie kwas homogentyzynowy oddzielajac kwas homogentyzynowy od komórek mikroorganizmów produkujacych kwas homogentyzynowy i czesci makroczastek w serii wirowan brzeczki pohodowlanej w obnizonej temperaturze, a nastepnie filtruje sie roztwór z zastosowaniem dwu membranowych filtrów, przy czym wstepne oczyszczanie prowadzi sie w prózni lub atmosferze gazu obojetnego; (b) polimeryzuje sie kwas homogentyzynowy do piomelaniny dodajac do roztworu otrzymanego w etapie a) H2O2, nastepnie roztwór alkalizuje sie do pH nie wyzszego niz 8,5, roztwór wytrzasa sie a PL 439742 A1 4/14nastepnie zakwasza do pH 2 i inkubuje sie w warunkach podwyzszonej temperatury i cisnienia, (c) izoluje sie polimer otrzymany w etapie b) stosujac sekwencje plukan i odwirowywania zestawem roztworów w warunkach obnizonej temperatury Korzystnie, w etapie a) wirowanie prowadzi sie przez 5 minut przy predkosci 5500 RCF w temp. 4 °C, nastepnie uzyskany supernatant przefiltrowuje sie przez dwumembranowy uklad filtrów, po czym przefiltrowany supernatant odwirowuje sie z maksymalna predkoscia wirówki, korzystnie okolo 20000 RCF, przez 10 minut.

Korzystnie, wirowanie w etapie a) prowadzi sie na filtrach 0,22 µm i 0,45 µm z polifluorku winylidenu.

Korzystnie, po zakonczeniu wirowania i filtracji w etapie a) supernatant dekantuje sie znad osadu.

Korzystnie, do uzyskanego w etapie a) roztworu zawierajacego kwas homogentyzynowy wprowadza sie 1 % (obj./obj.) perhydrolu (30% H2O2) lub 10% (obj./obj.) wody utlenionej (3% H2O2).

Korzystnie, roztwór alkalizuje sie NaOH.

Korzystnie, roztwór w etapie b) wytrzasa sie przez 30 min przy predkosci co najmniej 150 rpm w temperaturze 25°C.

Korzystnie, roztwór w etapie b) po zakwaszeniu, korzystnie HCI, inkubuje sie przez 30 min w temperaturze 121°C i pod cisnieniem 100-120 kPa.

Korzystnie, po zakonczeniu inkubacji roztwór w etapie b) schladza sie, korzystnie do temperatury 4 °C.

Korzystnie, zestaw roztworów, którym plucze sie polimer otrzymany w etapie b) stanowi woda podwójnie destylowana (18 MO·cm) o pH minimum 2, 96% etanol i woda destylowana o pH 8,5.

Korzystnie, w etapie c) odwirowania roztworu z precypitatem prowadzi sie przez min przy predkosci 20000 RCF w temperaturze 4 °C.

PL 439742 A1 /14Rozwiazanie wg wynalazku pozwala na eliminacje wiekszosci zbednej materii organicznej juz na etapie wstepnego oczyszczania. Znane rozwiazania nie uwzgledniaja tego, ze kwas homogentyzynowy po utlenieniu i polimeryzacji do piomelaniny moze osiagac mase nawet 50 tysiecy daltonów i tym samym stanowic istotna frakcje odwirowanego peletu. Przedmiotowy wynalazek ogranicza przedwczesna polimeryzacje kwasu homogentyzynowego do piomelaniny, zwiekszajac tym samym pózniejsza wydajnosc jej ekstrakcji. Cykl wirowan o specyficznie dobranych parametrach oraz filtracja przez dwumembranowe filtry pozwala na oddzielenie wiekszosci makroczastek od kwasu homogentyzynowego znajdujacego sie w roztworze.

Rozwiazanie wg wynalazku obejmuje równiez przyspieszenie polimeryzacji kwasu homogentyzynowego do piomelaniny. Znane rozwiazania bazuja na wykorzystaniu specyficznych enzymów i/lub zwiazków utleniajacych, które staja sie jednoczesnie zródlem zbednych zanieczyszczen w próbce.

Sposób wg wynalazku uwzglednia dodanie nadtlenku wodoru do roztworu zawierajacego kwas homogentyzynowy a nastepnie ogrzaniu zawartosci pod zwiekszonym cisnieniem. Niniejszy sposób nie generuje zbednych produktów i jest ekonomiczny.

Ostatnim elementem wynalazku jest wydajna izolacja polimeru z roztworu.

Piomelanina jest zwiazkiem bardzo polarnym i stabilnym w szerokim spektrum temperatur i pH. Przedmiotowy wynalazek obejmuje wstepne usuniecie zanieczyszczen poprzez sekwencje wirowan filtracji, a nastepnie przeprowadzenie hydrolizy kwasowej w okreslonych warunkach cisnienia i temperatury w celu usuniecia innych niepozadanych zwiazków. Uzyskany precypitat jest nastepnie odwirowywany, a pelet jest kilkukrotnie przeplukiwany odpowiednim zestawem roztworów.

Znane rozwiazania obejmuja zwykle bezposrednia precypitacje polimeru z podczyszczonego plynu pohodowlanego.

PL 439742 A1 6/14Zgodnie ze sposobem wg wynalazku na etapie a) ustala sie parametry wirowan. Wstepne oczyszczenie kwasu homogentyzynowego prowadzi sie z zastosowaniem dwumembranowych filtrów i prózni lub atmosfery gazu obojetnego.

Zastosowanie obnizonej temperatury przy wirowaniu 5500 RCF w czasie minut nie prowadzi do pekniecia komórek bakteryjnych i wydostania sie ich drobnoczasteczkowej zawartosci do roztworu, a niska temperatura kompensuje ograniczona szybkosc obrotów i jest czynnikiem wplywajacym na koagulacje zanieczyszczen. Powyzsza procedura ogranicza kontaminacje kwasu homogentyzynowego.

Wykorzystuje sie dwumembranowy zestaw filtrów w celu zmniejszenia ryzyka kontaminacji roztworu z kwasem homogentyzynowym poniewaz zmniejszone cisnienie przy filtracji równiez ogranicza pekanie komórek bakteryjnych zapobiega zanieczyszczeniu frakcji zawierajacej kwas homogentyzynowy.

Zastosowanie warunków prózniowych lub atmosfery gazu obojetnego ogranicza przedwczesna reakcje polimeryzacji i zwieksza wydajnosc pózniejszej ekstrakcji zwiazku.

W sposobie wg wynalazku na etapie b) przyspiesza sie polimeryzacje kwasu homogentyzynowego, która nie prowadzi do jego dodatkowej kontaminacji jonami metali lub bialkami (enzymami) oraz nie wplywa negatywnie na jego strukture. Podwyzszone cisnienie i temperatura sa natomiast kluczowym etapem przyspieszajacym polimeryzacje do piomelaniny.

Zastosowanie obojetnych dla kompozycji roztworu utleniaczy w postaci nadtlenku wodoru (H2O2) nie zanieczyszcza próbki i nie wplywa negatywnie na strukture piomelaniny. Powszechnie stosowane utleniacze, np. sole manganu (Mn 2 +) lub miedzi (Cu 2 +) moga zanieczyszczac próbke i wiazac sie z polimerem.

Wytrzasanie (30 min, min. 150 rpm, 25°C) roztworu zawierajacego 1 % (obj./obj.) perhydrolu (30% H2O2) lub 10% (obj./obj.) wody utlenionej (3% H2O2) i pH 8,5 stanowi nowa i nieoczywista a takze sprawdzona eksperymentalnie metode polimeryzacji kwasu homogentyzynowego.

PL 439742 A1 7/14Zakwaszenie roztworu do pH 2 oraz inkubacja 30 min w temperaturze 121°C w warunkach podwyzszonego cisnienia (100-120 kPa) jest krytycznym punktem przyspieszenia procesu polimeryzacji kwasu homogentyzynowego i hydrolizy ewentualnych zanieczyszczen organicznych. Pasywny proces polimeryzacji zajmuje tydzien (Sajjan, S., Kulkami, G., Yaligara, V., Lee, K., & Karegoudar, T. B. (201 O). Purification and physiochemical characterization of melanin pigment from Klebsiella sp. GSK. Journal of microbiology and biotechnology, 20(11 ), 1513-1520; Singh, D., Kumar, J., & Kumar, A. (2018).

W rozwiazaniu wg wynalazku zastosowano sekwencje plukan majacych na celu usuniecie pozostalych zanieczyszczen organicznych i nieorganicznych.

W rozwiazaniu zastosowano równiez obnizona temperature w calym procesie doczyszczania, co ogranicza to utrate polimeru na etapach wirowania i zapobiega ewentualnym reakcjom estryfikacji.

Dzieki sekwencji plukania i odwirowywania polimeru zakwaszonego do pH minimum 2 w temperaturze 4°C nie ma istotnej utraty metabolitu (piomelaniny) podczas etapów doczyszczania zwiazku.

Sekwencja plukania i odwirowywania polimeru zawieszonego w 96% etanolu w temperaturze 4 °C pozwala na doczyszczenie zwiazku z dodatkowych zanieczyszczen organicznych - piomelanina nie rozpuszcza sie w etanolu.

Obnizona temperatura zapobiega ew. reakcjom estryfikacji.

Glównym atutem przedmiotowego wynalazku jest optymalizacja trzech etapów pozyskiwania polimeru kwasu homogentyzynowego. Przewaga przedmiotowej metody wstepnego oczyszczania brzeczki pohodowlanej zawierajacej kwas homogentyzynowy nad powszechnie stosowanymi sposobami jest pozbycie sie maksymalnie duzej ilosci zanieczyszczen. Standardowa metoda jest bezposrednie odwirowanie bakterii (przy predkosci ok. 11200 RCF), zakwaszenie próbki i precypitacja zwiazku po uplywie tygodnia (Sajjan, S., Kulkami, G., Yaligara, V., Lee, K., & Karegoudar, T. B. (2010). Purification and physiochemical characterization of melanin pigment from Klebsiella sp. GSK.

Journal of Microbiology and Biotechnology, 20(11 ), 1513-1520; Singh, D., Kumar, J., & Kumar, A. (2018). Isolation of pyomelanin from bacteria and evidences showing its synthesis by 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase enzyme PL 439742 A1 8/14encoded by hppD gene. International Journal of Biological Macromolecules, 119, 864-873). Na tym etapie dochodzi do uszkodzenia komórek bakteryjnych, wydostania sie ich zawartosci do roztworu i dodatkowej kontaminacji próbki.

Dodatkowo zachodzi wiele reakcji chemicznych, które w róznym stopniu moga modyfikowac zwiazek. Technika opisana w wynalazku pozwala na unikniecie dodatkowej kontaminacji i znacznie zwieksza wydajnosc i szybkosc otrzymania polimeru kwasu homogentyzynowego.

Proces polimeryzacji przeprowadzany jest zwykle pasywnie lub przy pomocy jonów manganu (Mn 2 +) i miedzi (Cu 2 +) (Lorquin, F., Ziarelli, F., Amouric, A., Di Giorgio, C., Robin, M., Piccerelle, P., & Lorquin, J. (2021). Production and properties of non-cytotoxic pyomelanin by laccase and comparison to bacterial and synthetic pigments. Scientific reports, 11 (1 ), 1-16) i alkalizacji roztworu (Zeng, Z., Guo, X. P., Gai, X., Wang, P., Li, B., Yang, J. L., & Wang, X. (2017).

Pyomelanin from Pseudoalteromonas lipolytica reduces biofouling. Microbial Biotechnology, 10(6), 1718-1731 ). Dodatek jonów stanowi jednak dodatkowa frakcje zanieczyszczen, a co wiecej moga sie one wiazac do powierzchni polimeru (Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., & Milliken, C. E. (201 O). Properties and function of pyomelanin. Biopolymers, 449, 72) i tym samym utrudnic ich usuniecie w trakcie dalszych procesów oczyszczania.

Alkalizacja powyzej pH 10-11 prowadzic moze natomiast do niepozadanych i nieodwracalnych reakcji (Guin, P. S., Das, S., & Mandal, P. C. (2011 ).

Electrochemical reduction of quinones in different media: a review. International Journal of Electrochemistry, 2011 ).

Sposób wg wynalazku polegajacy na wprowadzeniu roztworu H2O2; alkalizacji roztworu do pH 8,5; oraz wytrzasaniu przez okreslony czas nie zanieczyszcza oraz nie modyfikuje struktury piomelaniny.

Przedstawiony w wynalazku etap ostatecznego doczyszczenia polimeru pozwala na uzyskanie zwiazku o minimum 95% stopniu czystosci bez wykorzystania technik chromatograficznych. Sekwencja doczyszczania zwiazku zakwaszona woda oraz etanolem w obnizonej temperaturze (4°C) jest eksperymentalnie potwierdzona i skuteczna metoda usuwania dodatkowych zanieczyszczen.

PL 439742 A1 9/14Ze wzgledu na szerokie spektrum wlasciwosci piomelaniny, zastosowanie procesu wg wynalazku pozwoli na jej wtórne wykorzystanie w wielu galeziach przemyslu, m.in. w kosmetologii, czy w hydrometalurgii.

Przyklad Etap a). Wstepne oczyszczanie próbki: Brzeczke pohodowlana nalezy odwirowac przez 5 min/5500 RCF w temperaturze 4 °C (lub nizszej). Odpowiednia temperatura i predkosc obrotów umozliwiaja oddzielenie wiekszosci komórek mikroorganizmów od roztworu z kwasem homogentyzynowym. Dodatkowo, obnizona temperatura równiez jest czynnikiem koagulujacym, np. w przypadku zwiazków o charakterze lipowym.

Uzyskany supernatant nalezy nastepnie przefiltrowac przez dwumembranowy uklad filtrów (0,22 µm i 0,45 µm; z polifluorku winylidenu), dzieki czemu mozliwe jest zastosowanie korzystnej wartosci cisnienia do filtracji, co dalej zmniejsza ryzyko kontaminacji. Przefiltrowany supernatant nalezy nastepnie odwirowac z maksymalna predkoscia wirówki (zalecane okolo 20000 RCF) przez 1 O minut.

Wirowanie nalezy przeprowadzac w prózni lub w atmosferze gazu obojetnego w celu ograniczenia przedwczesnej polimeryzacji kwasu homogentyzynowego.

Uzyskany supernatant nalezy zdekantowac znad powierzchni osadu.

Etap b). Przyspieszenie procesu polimeryzacji: Do uzyskanego w etapie a) roztworu zawierajacego kwas homogentyzynowy nalezy wprowadzic 1 % (obj./obj.) perhydrolu (30% H2O2) lub % (obj./obj.) wody utlenionej (3% H2O2) - nadtlenek wodoru nie zmienia kompozycji roztworu. Po wprowadzeniu czynnika utleniajacego, preparat nalezy zalkalizowac roztworem NaOH do pH maksymalnie 8,5. Dzieki temu hydrochinony zostana przeksztalcone do rozpuszczalnych chinonów, co zwieksza ich rozpuszczalnosc i ulatwia polimeryzacje. Roztwór nalezy nastepnie wytrzasac przez 30 min (min. 150 rpm) w temperaturze 25°C. Po uplywie czasu preparat nalezy zakwasic roztworem HCI do pH minimum 2, a nastepnie inkubowac 30 min w temperaturze 121 °C w warunkach podwyzszonego cisnienia (100-120 kPa). Po uplywie czasu roztwór nalezy schlodzic do temperatury 4°C.

Wytracony precypitat swiadczy o obecnosci polimerów (min 1 O kDa) kwasu homogentyzynowego.

PL 439742 A1 /14Etap c). Izolacja polimeru: Roztwór z uzyskanym precypitatem (etap b) nalezy odwirowac przez 5 min/20000 RCF w temperaturze 4 °C. Uzyskany supernatant nalezy zdekantowac, a osad zawiesic w wodzie podwójnie destylowanej (18 MO·cm) o pH minimum 2 (zakwaszona roztworem HCI). Próbke nalezy odwirowac przez 5 min/20000 RCF w temperaturze 4 °C, zlac supernatant i ponowic wspomniany proces zawieszania i wirowania jeszcze dwukrotnie w celu doczyszczenia preparatu. Osad nalezy nastepnie zawiesic w etanolu 96% i zwirowac 5 min/20000 RCF w temperaturze 4°C. Supernatant nalezy zlac znad osadu, a proces zawieszania w etanolu i wirowania powtórzyc jeszcze dwukrotnie. Na koniec precypitat nalezy zawiesic w wodzie destylowanej (18 MO·cm) o pH 8,5 i wykonac dialize (z odcieciem masy czasteczkowej do 1 O kDa) w celu odsolenia i ostatecznego doczyszczenia próbki.

PL 439742 A1 11/14Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania wysoko oczyszczonego polimeru kwasu homogentyzynowego, znamienny tym, ze (d) wstepnie oczyszcza sie kwas homogentyzynowy oddzielajac kwas homogentyzynowy od komórek mikroorganizmów produkujacych kwas homogentyzynowy i czesci makroczastek w serii wirowan brzeczki pohodowlanej w obnizonej temperaturze, a nastepnie filtruje sie roztwór z zastosowaniem dwu membranowych filtrów, przy czym wstepne oczyszczanie prowadzi sie w prózni lub atmosferze gazu obojetnego; (e) polimeryzuje sie kwas homogentyzynowy do piomelaniny, dodajac do roztworu otrzymanego w etapie a) H202, nastepnie roztwór alkalizuje sie do pH nie wyzszego niz 8,5, roztwór wytrzasa sie a nastepnie zakwasza do pH 2 i inkubuje sie w warunkach podwyzszonej temperatury i cisnienia, (f) izoluje sie polimer otrzymany w etapie b) stosujac sekwencje plukan i odwirowywania zestawem roztworów w warunkach obnizonej temperatury 2. Sposób wedlug zastrz 1, znamienny tym, ze w etapie a) wirowanie prowadzi sie przez 5 minut przy predkosci 5500 RCF w temp. 4°C, nastepnie uzyskany supernatant przefiltrowuje sie przez dwumembranowy uklad filtrów, po czym przefiltrowany supernatant PL 439742 A1 12/14odwirowuje sie z maksymalna predkoscia wirówki, korzystnie okolo 20000 RCF, przez 10 minut. 3. Sposób wedlug zastrz 2, znamienny tym, ze wirowanie w etapie a) prowadzi sie na filtrach 0,22 µm i 0,45 µm z polifluorku winylidenu. 4. Sposób wedlug zastrz 1, znamienny tym, ze po zakonczeniu wirowania i filtracji w etapie a) supernatant dekantuje sie znad osadu.

. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do uzyskanego w etapie a) roztworu zawierajacego kwas homogentyzynowy wprowadza sie 1 % (obj./obj.) perhydrolu (30% H2O2) lub 10% (obj./obj.) wody utlenionej (3% H2O2). 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze roztwór alkalizuje sie NaOH. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze roztwór w etapie b) wytrzasa sie przez 30 min przy predkosci co najmniej 150 rpm w temperaturze 25°C. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze roztwór w etapie b) po zakwaszeniu, korzystnie HCI, inkubuje sie przez 30 min w temperaturze 121°C i pod cisnieniem 100-120 kPa. 9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze po zakonczeniu inkubacji roztwór w etapie b) schladza sie, korzystnie do temperatury 4°C. 1 O. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zestaw roztworów, którym plucze sie polimer otrzymany w etapie b) stanowi woda podwójnie destylowana (18 MO·cm) o pH minimum 2, 96% etanol i woda destylowana o pH 8,5. 11. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w etapie c) odwirowania roztworu z precypitatem prowadzi sie przez 5 min przy predkosci 20000 RCF w temperaturze 4 °C.

PL 439742 A1 13/14URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.439742 Klasyfikacja zgloszenia: C12P7 /42 (2006.01), C0BF2/04 (2006.01), B01D21/26 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C12P, C0BF, B01D Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: EPO DOC, WP!, X-Full (NPL ), BAZY DANYCH UPRP Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie do dokumentu zastrz.

A KR20210080783 A (UNIV AJOU IND ACADEMIC COOP FOUND) 2021- 1-11 07-01 A WO9850573 Al (UNIV NEBRASKA) 1998-11-12 1-11 A Lorquin, F., Ziarelli, F., Amouric, A et al. Production and properties of 1-11 non-cytotoxic pyomelanin by laccase and comparison to bacterial and synthetic pigments. Sci Rep 11, 8538 (2021). https:/ /doi.org/10.1038/s41598-021-87328-2 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A- dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T- dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej.

Sprawozdanie wykonal/-a: Agnieszka Ucinska Ekspert Koordynator Data: 23.08.2022 Uwagi do zgloszenia Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 05.12.2021 r.

PL 439742 A1 14/14

Claims (11)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób otrzymywania wysoko oczyszczonego polimeru kwasu homogentyzynowego, znamienny tym, ze (d) wstepnie oczyszcza sie kwas homogentyzynowy oddzielajac kwas homogentyzynowy od komórek mikroorganizmów produkujacych kwas homogentyzynowy i czesci makroczastek w serii wirowan brzeczki pohodowlanej w obnizonej temperaturze, a nastepnie filtruje sie roztwór z zastosowaniem dwu membranowych filtrów, przy czym wstepne oczyszczanie prowadzi sie w prózni lub atmosferze gazu obojetnego; (e) polimeryzuje sie kwas homogentyzynowy do piomelaniny, dodajac do roztworu otrzymanego w etapie a) H202, nastepnie roztwór alkalizuje sie do pH nie wyzszego niz 8,5, roztwór wytrzasa sie a nastepnie zakwasza do pH 2 i inkubuje sie w warunkach podwyzszonej temperatury i cisnienia, (f) izoluje sie polimer otrzymany w etapie b) stosujac sekwencje plukan i odwirowywania zestawem roztworów w warunkach obnizonej temperatury

2. Sposób wedlug zastrz 1, znamienny tym, ze w etapie a) wirowanie prowadzi sie przez 5 minut przy predkosci 5500 RCF w temp. 4°C, nastepnie uzyskany supernatant przefiltrowuje sie przez dwumembranowy uklad filtrów, po czym przefiltrowany supernatant2/14odwirowuje sie z maksymalna predkoscia wirówki, korzystnie okolo 20000 RCF, przez 10 minut.

3. Sposób wedlug zastrz 2, znamienny tym, ze wirowanie w etapie a) prowadzi sie na filtrach 0,22 µm i 0,45 µm z polifluorku winylidenu.

4. Sposób wedlug zastrz 1, znamienny tym, ze po zakonczeniu wirowania i filtracji w etapie a) supernatant dekantuje sie znad osadu.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do uzyskanego w etapie a) roztworu zawierajacego kwas homogentyzynowy wprowadza sie 1 % (obj./obj.) perhydrolu (30% H2O2) lub 10% (obj./obj.) wody utlenionej (3% H2O2).

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze roztwór alkalizuje sie NaOH.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze roztwór w etapie b) wytrzasa sie przez 30 min przy predkosci co najmniej 150 rpm w temperaturze 25°C.

8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze roztwór w etapie b) po zakwaszeniu, korzystnie HCI, inkubuje sie przez 30 min w temperaturze 121°C i pod cisnieniem 100-120 kPa.

9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze po zakonczeniu inkubacji roztwór w etapie b) schladza sie, korzystnie do temperatury 4°C.

1 O. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zestaw roztworów, którym plucze sie polimer otrzymany w etapie b) stanowi woda podwójnie destylowana (18 MO·cm) o pH minimum 2, 96% etanol i woda destylowana o pH 8,5.

11. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w etapie c) odwirowania roztworu z precypitatem prowadzi sie przez 5 min przy predkosci 20000 RCF w temperaturze 4 °C.3/14URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.439742 Klasyfikacja zgloszenia: C12P7 /42 (2006.01), C0BF2/04 (2006.01), B01D21/26 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C12P, C0BF, B01D Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: EPO DOC, WP!, X-Full (NPL ), BAZY DANYCH UPRP Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie do dokumentu zastrz. A KR20210080783 A (UNIV AJOU IND ACADEMIC COOP FOUND) 2021- 1-11 07-01 A WO9850573 Al (UNIV NEBRASKA) 1998-11-12 1-11 A Lorquin, F., Ziarelli, F., Amouric, A et al. Production and properties of 1-11 non-cytotoxic pyomelanin by laccase and comparison to bacterial and synthetic pigments. Sci Rep 11, 8538 (2021). https:/ /doi.org/10.1038/s41598-021-87328-2 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A- dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T- dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonal/-a: Agnieszka Ucinska Ekspert Koordynator Data: 23.08.2022 Uwagi do zgloszenia Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 05.12.2021 r.4/14