PL40399B1 - - Google Patents

Description

¥ AT£v Opublikowano dnia 20 grudnia 1957 r..¦Ar CA2JL A%\ O |biblioteka| POLSKIEJ RZECZYPOSPOLITEJ LUDOWEJ OPIS PATENTOWY Nr 40399 KL 30 hf 2/04 Akademia Medyczna w Warszawie *) (Zaklad Mikrobiologii i Higieny) Warszawa, Polska Sposób otrzymywania skoncentrowanej hlaluronidazy % paciorkowca homolizujqcego grapy C Patent trwa od dnia 25' kwietnia 1957 r.Hialuronidaza jest enzymem powodujacym depolimeryzacje wielocukru sluzowego, znanego pod nazwa kwasu hialuronowego. Wytwarzana jest ona zarówno przez organizmy zwierzece jak i bakterie. W literaturze opisane sa liczne sposoby otrzymywania hialuronidazy wytwarza¬ nej przez bakterie. Do wytracania enzymu sto¬ suje sie np. 4%-wy flawianat sodowy (J. Exp.Med. Vol. 171, 1940, 137) lub siarczan amonowy i alkohol etylowy jest równiez adsorbowanie hlaluronidazy na dia¬ lizowanym wodorotlenku zelazowym (Blochem.J. 40, 1945, 583). Wymienione metody maja te wade, ze sa malo wydajne i skomplikowane.*) Wlasciciel patentu oswiadczyl, ze wspól¬ twórcami wynalazku sa Roman Pakula, mgr Henryk Osowiecki i mgr Irena Eysymontt Sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymac hialuronidaze z wysoka wydajnoscia oraz bez stosowania skomplikowanych operacji. Sposób ten dotyczy otrzymywania hialuronidazy ze szczepu paciorkowca hemolizujacego, nalezace¬ go do grupy C, który nie posiada wlasciwosci chorobotwórczych. Wymieniony szczep produk¬ cyjny hoduje sie na podlozu zawierajacym wy¬ ciag miesnia sercowego, czesciowo odbialczony wyciag watrobowy, glukoze i sole mineralne.Wedlug wynalazku w czasie fermentacji doda¬ je sie do pozywki porcjami roztwór glukozy oraz 10%-wy roztwór dwuweglanu sodowego, w celu utrzymania odczynu srodowiska na po¬ ziomie pH = 7,0, przy czym calkowita ilosc do¬ dawanej glukozy wynosi 4% w stosunku do ilosci pozywki. Dalsza istotna cecha wynalazku jest sposób oczyszczania hialuronidazy. Stwier¬ dzono, ze czysty produkt otrzymuje sie wów-czas, gdy frakcjonowane wysalanie hialuroni- dazy za pomoca siarczanu amonowego prowadzi sie przy pH = 6^ a liofilizacje w srodowisku fosforanowego zwiazku buforujacego przy pH=7,2.Przyklad: 3000 ml podloza produkcyjnego, skladajacego sie z 2000 ml wyciagu miesnia ser¬ cowego, 1000 ml wyciagu watrobowego, czescio¬ wo odbialczonego, 120 g peptonu bakteryjnego, 6 g chlorku sodowego i 1,2 g bezwodnego dwu- zasadbwego fosforanu potasowego, zadaje sie 10%-owym lugiem sodowym, az do osiagniecia pH — 7,0—7,2. Calosc sterylizuje sie w autokla¬ wie w ciagu 20—30 minut, przy nadcisnieniu 3/4 atm. Oddzielnie przygotowuje sie 240 mlx ste¬ rylnego, 50% -ego roztworu glukozy, oraz ste¬ rylnego 10%-ego roztworu dwuweglanu sodo¬ wego.Do wysterylizowanej pozywki dodaje sie 0,2% uprzednio przygotowanego roztworu glukozy oraz 10%-owy roztwór dwuweglanu sodowego, az do osiagniecia pH = 7,6. Nastepnie szczepi sie podloze trzema kroplami 18-godzinnej ho¬ dowli szczepu produkcyjnego i umieszcza w cieplarce w temperaturze 37°C. Od chwili kiedy bakterie zaczynaja intensywnie i szybko roz¬ mnazac sie (po okolo 10 godzinach), dodaje sie porcjami do srodowiska pozostala czesc roztwo¬ ru glukozy (3,8%) oraz 10%-owy roztwór dwu¬ weglanu sodowego w takiej ilosci, azeby pH srodowiska wynosilo 7,0.Dla kontroli prawidlowego przebiegu fermen¬ tacji i narastania miana hialuronidazy, pobiera sie z hodowli próbki w odstepach okolo 1-go- dzinnych i oznacza zawartosc enzymu metoda turbometryczna.Po okolo 18 godzinach hodowli, gdy srodowis¬ ko nie ulega dalszemu zakwaszeniu i gdy na¬ stepuje zahamowanie wzrostu bakterii, przeja¬ wiajace sie stalym poziomem miana hialuroni¬ dazy (okolo 100—120 jednostek turbidymetrycz- nych — TRU — na 1 ml podloza), odwirowuje sie bakterie na wirówce typu Alfa-Laval, a kla¬ rowny plyn fermentacyjny doprowadza do pH = 6,0, zadaje krystalicznym siarczanem amonowym do lizyskania 60%-ego nasycenia i odstawia na noc do chlodni. Powstaly strat hialuronidazy odsacza sie przez 2—3 warstwy bibuly na lejku Buchnera i rozpuszcza nastepnie w okolo 300 ml wody destylowanej. Otrzymany koncentrat hialuronidazy doprowadza sie do pH = 6,0 i zadaje krystalicznym siarczanem amonowym (30%-owe wysycenie) w celu wy¬ tracenia nieczynnych bialek balastowych. Po od¬ dzieleniu osadu na lejku Buchnera, koncentrat zadaje sie po raz drugi krystalicznym siarcza¬ nem amonowym (6^%-owe wysycenie) i pozo¬ stawia w chlodni (5°C) przez 10—12 godzin az do wytracenia sie hialuronidazy. Wytracony enzym odsacza sie przez 2—3 warstwy bibuly na lejku Buchnera i zadaje 100 ml wody desty¬ lowanej. Tak otrzymany koncentrat poddaje sie dializie w worku celofanowym (w temperatu¬ rze 5°C) wobec wody destylowanej. Po zaniku jonów NH4", koncentrat zakwasza sie 10%-owym kwasem solnym do pH = 5,5 a wytracone bial¬ ka balastowe odwirowuje. Nastepnie koncen¬ trat zadaje sie fosforanowym zwiazkiem bufo¬ rujacym z zelatyna do pH = 7,2. Otrzymany produkt po przesaczeniu przez filtr Berkefelda, rozlewa sie do fiolek, i poddaje liofilizacji. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania skoncentrowanej hia¬ luronidazy z paciorkowca hemolizujacego grupy C na drodze fermentacyjnej, znamien¬ ny tym, ze do pozywki doprowadza sie por¬ cjami roztwór glukozy, w ogólnej ilosci 4% glukozy w stosunku do ilosci pozywki, utrzy¬ mujac pH podloza na poziomie = 7,0 przez dodawanie 10%-ego roztworu dwuweglanu sodowego, po czym po ukonczonej fermen¬ tacji hialuronidaze poddaje sie frakcjonowa¬ nemu wysoleniu i liofilizacji.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze frakcjonowane wysalanie przeprowadza sie za pomoca krystalicznego siarczanu amono¬ wego przy pH = 6,0.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze liofilizacje przeprowadza sie w obecnosci bu¬ forujacego zwiazku fosforanowego przy pH = 7,2. Akademia M e dyczna ;.,w Warszawie (Zaklad Mikrobiologii ' i Higieny) CWD - jednoraz. — zam. 3835/S/Lz — 2096 — Lak — 10.9.57 — 100 — Pap. druk. ki. III m/90 g PL