PL396074A1

PL396074A1 - Application of layers of parylene in the analysis

Info

Publication number: PL396074A1
Application number: PL396074A
Authority: PL
Inventors: Marek J. Potrzebowski; Anna Sroka-Bartnicka; Beata Miksa; Marek Sochacki
Original assignee: Ct Badan Molekular I Makro
Priority date: 2011-08-24
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2013-03-04
Also published as: PL222065B1

Description

396074 h396,074 h

Zastosowanie warstw parylenu w analizieApplication of parisylene layers in analysis

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie warstwy poli(p-ksylilenu) czyli Parylenu N jako materiału zabezpieczającego powierzchnię płytki pomiarowej i ułatwiającego desorpcję/jonizację analitu w analizach MALDI.The subject of the invention is the use of a layer of poly (p-xylylene) or Parylene N as a material protecting the surface of the measuring plate and facilitating the desorption / ionization of the analyte in MALDI analyzes.

Stan wiedzy: MALDI-TOF jest jedną z ważniejszych technik analitycznych, zaliczana do metod łagodnej jonizacji, zrewolucjonizowała dziedzinę spektrometrii mas w badaniu dużych mas cząsteczkowych. Jest standardowo wykorzystywana w badaniu protein, peptydów, polimerów syntetycznych. Istotą wykonywania widm MALDI TOF jest desorpcja/jonizacja laserowa, której poddawana jest mieszanina matrycy z próbką i czynnikiem kationizującym. W celu podniesienia jakości widm rejestrowanych techniką MALDI coraz więcej uwagi przywiązuje się do modyfikacji powierzchni płytek, na których umieszcza się analit. Istnieje wiele metod przygotowania próbki do analizy metodą MALDI opartych na modyfikacjach powierzchni płytki MALDI z zastosowaniem membran, cienkich filmów i monowarstw samoorganizujących np. MELDI - Material-Enhanced Laser Desorption/lonization1, SGALDI - Sol-Gel Assisted Laser Desorption/lonization2, PALDI - Polymer-Assisted Laser Desorption/lonization3, DIOS - Matrix-Free Desorption /lonization on Porous Silicon4. Zainteresowanie tego typu technikami stale rośnie. Takie podłoża (monowarstwy) używane są oprócz albo zamiast typowej matrycy. Podłoże ma ułatwić desorpcję i jonizację substancji analizowanych. 2State of the art: MALDI-TOF is one of the most important analytical techniques, included in the method of mild ionization, revolutionized the field of mass spectrometry in the study of high molecular masses. It is normally used in the study of proteins, peptides and synthetic polymers. The essence of making the MALDI TOF spectra is laser desorption / ionization, which is subjected to the mixture of the matrix with the sample and the cationizing agent. In order to improve the quality of the spectra recorded with the MALDI technique, more and more attention is paid to the modification of the surface of the plates on which the analyte is placed. There are many methods of sample preparation for MALDI analysis based on the modification of the MALDI plate surface with the use of membranes, thin films and self-assembling monolayers, e.g. MELDI - Material-Enhanced Laser Desorption / lonization1, SGALDI - Sol-Gel Assisted Laser Desorption / lonization2, PALDI - Polymer -Assisted Laser Desorption / lonization3, DIOS - Matrix-Free Desorption / lonization on Porous Silicon4. The interest in this type of techniques is constantly growing. Such substrates (monolayers) are used in addition to or instead of the conventional matrix. The substrate is to facilitate desorption and ionization of the analyzed substances. 2

Znany jest także materiał poli(p-ksylilen) czyli Parylen N, powszechnie stosowany, do pokrywania różnych powierzchni w celu ich zabezpieczenia przed działaniem czynników zewnętrznych. Główną zaletą technologii parylenów jest proces polimeryzacji z fazy gazowej VDP (ang. Vapour Deposition Polymerization)5, co w połączeniu z ich unikatowymi właściwościami fizykochemicznymi znacznie poszerza obszar ich zastosowań. Z tego też powodu technologia parylenów stała się konkurencyjna w stosunku do konwencjonalnych metod nakładania powłok polimerowych z fazy ciekłej, jak powlekanie natryskowe czy zanurzeniowe. Jej największą zaletą w porównaniu z wymienionymi metodami jest brak przejściowej fazy ciekłej, co sprawia, że siły napięcia powierzchniowego są praktycznie wyeliminowane, zaś nałożona warstwa posiada charakter konformalny. Oznacza to, że utworzona powłoka charakteryzuje się jednakową grubością w każdym miejscu niezależnie od krzywizny podłoża6. Dzięki polimeryzacji z fazy gazowej VDP paryleny doskonale nadają się jako materiał do powlekania różnych powierzchni. Z powodu dużej odporności i wytrzymałości mechanicznej, a także silnych własności hydrofobowych stosuje się je do powlekania urządzeń elektronicznych, a ze względu na wysoką biozgodność i niski współczynnik tarcia używa się ich np. do pokrywania implantów i narzędzi chirurgicznych.The poly (p-xylylene) material, or Parylene N, is also known, commonly used to cover various surfaces in order to protect them against external factors. The main advantage of the Parylene technology is the VDP (Vapor Deposition Polymerization) 5 gas phase polymerization process, which, combined with their unique physicochemical properties, significantly extends the area of their application. For this reason, the Parylene technology has become competitive with conventional liquid-phase polymer coating methods such as spray or dip coating. Its biggest advantage compared to the methods mentioned above is the lack of a liquid phase transition, which means that the surface tension forces are practically eliminated, and the applied layer has a conformal character. This means that the formed coating has the same thickness in all places, regardless of the curvature of the substrate6. Due to the VDP gas-phase polymerization, parylenes are well-suited as a coating material for various surfaces. Due to high resistance and mechanical strength, as well as strong hydrophobic properties, they are used for coating electronic devices, and due to high biocompatibility and low friction coefficient, they are used, for example, for coating implants and surgical instruments.

wzór 1pattern 1

Strukturę poli(p-ksylilenu) czyli Parylenu N (ΡΡΧ) przedstawiono wzorem 1. W oryginalnej literaturze i w literaturze patentowej brak jest informacji dotyczących zastosowania poli(p-ksylilenu) czyli Parylenu N jako materiału zabezpieczającego powierzchnię płytki pomiarowej ułatwiającego desorpcję/jonizację analitu w analizach MALDI. W literaturze znajdują się doniesienia o stosowaniu różnych monowarstw wspomagających desorpcję/jonizację, ale częstym problemem jest usuwanie ich po wykonaniu analizy z powierzchni płytki MALDI. Membrany, folie są często 3 przyklejane za pomocą taśmy dwustronnej. Nanoszone monowarstwy można usunąć metodami chemicznymi (poprzez rozpuszczenie).The structure of poly (p-xylylene) or Parylene N (ΡΡΧ) is shown in formula 1. There is no information on the use of poly (p-xylylene) or Parylene N as a material securing the surface of the measuring plate, facilitating desorption / ionization of the analyte in the analyzes MALDI. There are reports in the literature on the use of various monolayers to assist desorption / ionization, but a common problem is their removal from the surface of the MALDI wafer after analysis. Membranes, films are often adhered with double-sided tape. The applied monolayers can be removed by chemical methods (by dissolving).

Nieoczekiwanie, okazało się, że właściwości fizykochemiczne parylenu, pozwalają na wykorzystanie takiej powłoki jako warstwy zabezpieczającej powierzchnię płytki MALDI, przy czym usunięcie tej warstwy z jej powierzchni nie stanowi większego problemu.Surprisingly, it turned out that the physicochemical properties of the paraylene allow the use of such a coating as a layer protecting the surface of the MALDI wafer, while removing this layer from its surface is not a major problem.

Istota wynalazku:The essence of the invention:

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie parylenu, jako warstwy materiału zabezpieczającego powierzchnię płytki pomiarowej w analizach MALDI, ułatwiającego desorpcję/jonizację analitu.The subject of the invention is the use of paraylene as a layer of material protecting the surface of the measuring plate in MALDI analyzes, facilitating the desorption / ionization of the analyte.

Zastosowanie parylenu, według wynalazku, korzystnie do analizy polimerów syntetycznych, naturalnych, a także mieszanin związków o masie cząsteczkowej do 15 000.The use of Parylene, according to the invention, preferably for the analysis of synthetic, natural polymers, and mixtures of compounds with a molecular weight of up to 15,000.

Zastosowanie parylenu, według wynalazku, korzystnie do analizy związków przygotowywanych różnymi metodami w procesach z użyciem rozpuszczalnika Dried Droplet oraz bez użycia rozpuszczalnika Solvent Free.The use of Parylene, according to the invention, preferably for the analysis of compounds prepared by various methods in processes with the use of a Dried Droplet solvent and without the use of a Solvent Free solvent.

Zastosowanie parylenu, według wynalazku, w którym korzystnie proces czyszczenia modyfikowanej płytki MALDI prowadzi się poprzez zdejmowanie/usuwanie/zrywanie warstwy zabezpieczającej powierzchnię.The use of parylene, according to the invention, wherein the cleaning process of a modified MALDI wafer is preferably carried out by removing / removing / tearing off the surface-protective layer.

Zastosowanie parylenu, według wynalazku, w którym korzystnie rejestrowanie widm MALDI prowadzi się w trybie liniowym lub reflektronowym.Use of the paraylene according to the invention, wherein the recording of the MALDI spectra is preferably carried out in the linear or reflectron mode.

Nieoczekiwanie, wysoka odporność chemiczna - rozpuszczalność tylko w wysokich temperaturach i w specyficznych rozpuszczalnikach oraz odporność na promieniowanie laserem UV pozwoliła na wykorzystanie parylenu jako powłoki stanowiącej warstwę zabezpieczającą powierzchnię płytki MALDI podczas analizy analitu.Unexpectedly, high chemical resistance - solubility only at high temperatures and in specific solvents as well as resistance to UV laser radiation allowed the use of paraylene as a coating that protects the surface of the MALDI plate during analyte analysis.

Możliwość zdjęcia takiej warstwy bez zniszczenia powierzchni płytki znacznie skraca proces czyszczenia płytki i bez wątpienia ułatwia usuwanie z jej powierzchni trudno rozpuszczalnych związków lub śladowych ilości zanieczyszczeń. Ze względu na inercyjność biologiczną parylenu, może być on stosowany w analizie związków biologicznych. Dodatkowym atutem powłoki parylenowej jest możliwość sterylizacji jej powierzchni. Hydrofobowość powierzchni 4 parylenu ułatwia krystalizację próbek przygotowywanych metodą DD (Dried Droplet). Hydrofobowość materiału jest ważnym elementem wpływający na kokrystalizację analitu z matrycą poprzez minimalizację powierzchni kropli, a w związku z tym z większym stężeniem krystalizujących składników mieszaniny. Nałożona warstwa parylenu w procesie VDP posiada charakter konformalny, co jest bardzo ważne przy przygotowaniu płytek ze specjalnymi wgłębieniami do analiz metodą DD. Warstwa parylenu jest stabilna chemicznie (odporna na rozpuszczalniki) i charakteryzuję się jednakową grubością. W celu przeprowadzenia badań z zastosowaniem takiej warstwy przygotowano specjalną płytkę, przy współpracy z Zakładem Inżynierii Materiałowej Politechniki Łódzkiej. Jest to jedyny Instytut w Polsce zajmujący się nakładaniem takich warstw. Połowa płytki MALDI została pokryta warstwą Parylenu N, nanoszonego w temeraturze pokojowej. Druga połowa powierzchni pozostała bez zmian. W taki sposób zostały przygotowane dwie płytki. Pierwsza to pozłacana płytka z wgłębieniami przeznaczona do nakładania próbek metodą DD, druga to płytka płaska stalowa przeznaczona do nakładania próbek metodą SF. W literaturze częstym problemem jest usuwanie stosowanych warstw po wykonaniu analizy, z powierzchni płytki MALDI. Membrany, folie są często przyklejane za pomocą taśmy dwustronnej. Nanoszone monowarstwy usuwano metodami chemicznymi (poprzez rozpuszczenie). W przypadku zastosowania warstwy parylenu na płytce MALDI usunięcie tej warstwy z jej powierzchni nie stanowi większego problemu. Usunięcie odbywa się w sposób mechaniczny, poprzez zerwanie folii z powierzchni płytki, jak pokazano na fig. 1. Z miejsca z którego zdjęto warstwę parylenu, a poprzednio nałożone były próbki zarejestrowano widma. W widmach tych nie zarejestrowano żadnych sygnałów. Świadczy to o praktycznej możliwości zastosowania foli parylenowej jako materiału zabezpieczającego płytkę MALDI. W wyniku badań własnych stwierdzono, że warstwa poli(p-ksylilenu) czyli Parylenu N naniesiona na płytkę do analizy MALDI jest materiałem zabezpieczającym powierzchnię płytki pomiarowej i jednocześnie wspomagającym proces desorpcji/jonizacji analitu.The possibility of removing such a layer without damaging the surface of the tile significantly shortens the cleaning process of the tile and undoubtedly facilitates the removal of sparingly soluble compounds or traces of impurities from its surface. Due to the biological inertia of Parylene, it can be used in the analysis of biological compounds. An additional advantage of the Parylene coating is the ability to sterilize its surface. The hydrophobicity of the surface 4 of parylene facilitates the crystallization of samples prepared by the DD (Dried Droplet) method. The hydrophobicity of the material is an important element influencing the co-crystallization of the analyte with the matrix by minimizing the droplet area, and therefore a higher concentration of the crystallizing components of the mixture. The applied layer of Parylene in the VDP process is conformal, which is very important in the preparation of plates with special cavities for DD analysis. The Parylene layer is chemically stable (solvent resistant) and has the same thickness. In order to carry out research with the use of such a layer, a special plate was prepared in cooperation with the Department of Materials Science and Engineering of the Lodz University of Technology. It is the only Institute in Poland dealing with the application of such layers. Half of the MALDI plate was coated with a Parylene N layer applied at room temperature. The other half of the area remained unchanged. Two plates were prepared in this way. The first is a gold-plated plate with depressions intended for applying samples using the DD method, the second is a flat steel plate designed for applying samples using the SF method. A common problem in the literature is the removal of the applied layers from the surface of the MALDI wafer after analysis. Membranes, films are often glued with double-sided tape. The applied monolayers were removed by chemical methods (by dissolving). In the case of using a parisylene layer on a MALDI wafer, removing this layer from its surface is not a major problem. Removal takes place mechanically by peeling off the foil from the surface of the plate as shown in Fig. 1. The spectra were recorded from the site where the parafilene layer was removed and the previously applied samples. No signals were recorded in these spectra. This proves the practical possibility of using the Parylene foil as a material protecting the MALDI plate. As a result of own research, it was found that the layer of poly (p-xylylene) or Parylene N applied to the plate for MALDI analysis is a material protecting the surface of the measuring plate and at the same time supporting the process of desorption / ionization of the analyte.

Podane niżej przykłady ilustrują zastosowanie warstwy parylenu jako materiału zabezpieczającego powierzchnię płytki pomiarowej i ułatwiającego 5 desorpcję/jonizację analitu w analizach MALDI nie ograniczając zakresu patentu przedstawionego w zastrzeżeniach patentowych.The following examples illustrate the use of a paraylene layer as a material protecting the surface of the measurement plate and facilitating analyte desorption / ionization in MALDI analyzes without limiting the scope of the patent as set forth in the claims.

Przykłady:Examples:

Przykład I.Example I.

Badania techniką MALDI politlenku etylenu (PEG 2000).Research with the MALDI technique of polyethylene oxide (PEG 2000).

Analizy MALDI wykonano dla politlenku etylenu (PEG 2000 o masie cząsteczkowej 2000) z zastosowaniem czterech matryc. Uśrednione wartości s/n z widm MALDI próbki PEG 2000 przygotowywanej metodą DD (a) i metodą SF (b) przedstawiono na Błąd! Nie można odnaleźć źródła odwołania.. Czerwone słupki oznaczają średnie wartości s/n z widm uzyskanych z próbek naniesionych na niemodyfikowaną powierzchnię płytki MALDI, natomiast zielone słupki odpowiadają średnim wartościom s/n z widm próbek naniesionych na płytkę pokrytą warstwą ΡΡΧ. Średnie wartości s/n uzyskano na podstawie 8 cykli pomiarowych (8 * 250 = 2000 widm). Porównanie uśrednionych wartości s/n z widm MALDI uzyskanych z próbek PEG 2000 z modyfikowanej i niemodyfikowanej powierzchni płytek przedstawiono na Błąd! Nie można odnaleźć źródła odwołania.. Z analizy powyższych danych wynika, że w przypadku metody DD, widma próbek naniesionych na płytkę MALDI z warstwą ΡΡΧ dla matryc DT i DHB wykazują wyższą wartość s/n niż widma z próbek naniesionych na niemodyfikowaną część płytki. Warstwa ΡΡΧ polepsza wartość s/n w widmach w zależności od rodzaju użytej matrycy. W przypadku próbek przygotowywanych wg metody SF, nie ma aż tak dużych różnic pomiędzy widmami uzyskanymi z różnych powierzchni płytki. Jednak aż w trzech przypadkach w widmach próbek przygotowywanych z zastosowaniem matryc IAA, HABA, DT z modyfikowanej parylenem powierzchni płytki uzyskano wyższe wartości s/n w widmach, co świadczy o wzmocnieniu procesu desorpcji i jonizacji.MALDI analyzes were performed on polyethylene oxide (PEG 2000, molecular weight 2000) using four matrices. The averaged s / n values from the MALDI spectra of the PEG 2000 sample prepared by the DD (a) method and the SF (b) method are shown in Error! Reference source not found. Red bars represent mean s / n values from spectra obtained from samples spotted on the unmodified MALDI plate surface, while green bars represent mean s / n values from spectra of samples spotted on a ΡΡΧ-coated plate. The mean s / n values were obtained on the basis of 8 measurement cycles (8 * 250 = 2000 spectra). A comparison of the averaged s / n values with the MALDI spectra obtained with PEG 2000 samples from the modified and unmodified plate surfaces is shown in Error! The reference source cannot be found. The analysis of the above data shows that in the case of the DD method, the spectra of the samples applied to the MALDI plate with the ΡΡΧ-layer for the DT and DHB matrices show a higher s / n value than the spectra of the samples applied to the unmodified part of the plate. The ΡΡΧ layer improves the s / n value in the spectra depending on the type of matrix used. In the case of samples prepared according to the SF method, there are no such large differences between the spectra obtained from different surfaces of the plate. However, in as many as three cases in the spectra of samples prepared with the use of the IAA, HABA and DT matrices from the paraylene-modified plate surface, higher s / n values were obtained in the spectra, which proves the enhancement of the desorption and ionization process.

Matryca DT niezależnie od sposobu przygotowania próbki w połączeniu z warstwą parylenu pozwala uzyskać wyższe wartości s/n w rejestrowanych widmach MALDI. 6The DT matrix, regardless of the sample preparation method, in combination with the Parylene layer, allows to obtain higher s / n values in the recorded MALDI spectra. 6

Przykład II.Example II.

Badania techniką MALDI polilaktydu (Polimer B).MALDI research of polylactide (Polymer B).

Analizy MALDI wykonano dla polilaktydu z zastosowaniem czterech matryc. Uśrednione wyniki analizy s/n na podstawie 8 cykli pomiarowych dla próbki polilaktydu liniowego (polimer B - o masie cząsteczkowej 3000 z grupami końcowymi butylową i hydroksylową) (8 * 250 = 2000 widm) zestawiono na rysunku. Próbki polimeru B przygotowywano metodą DD (a) i metodą SF (b). Czerwone słupki oznaczają uśrednione wartości s/n z widm próbek naniesionych na niemodyfikowaną powierzchnię płytki MALDI, natomiast zielone słupki przedstawiają uśrednione wartości s/n z widm próbek naniesionych na płytkę pokrytą warstwą ΡΡΧ.MALDI analyzes were performed on polylactide using four matrices. The averaged results of the s / n analysis based on 8 measurement cycles for a sample of linear polylactide (polymer B - molecular weight 3000 with butyl and hydroxyl end groups) (8 * 250 = 2000 spectra) are presented in the figure. Polymer B samples were prepared by DD (a) and SF (b). The red bars represent the average s / n values from the spectra of the samples spotted on the unmodified surface of the MALDI plate, while the green bars represent the average s / n values from the spectra of the samples spotted on the ΡΡΧ-coated plate.

Porównanie uśrednionych wartości s/n z widm MALDI uzyskanych z próbek polimeru B z modyfikowanej i niemodyfikowanej powierzchni płytek.Comparison of averaged s / n values with MALDI spectra obtained from polymer B samples from the modified and unmodified surface of the plates.

Warstwa ΡΡΧ naniesiona na płytkę MALDI spowodowała wzrost wartości s/n w widmach próbek otrzymanych z matryc DT, DHB dla próbek przygotowanych zarówno metodą DD jak i SF. Dla próbek przygotowanych w matrycy HABA otrzymane widma są porównywalne niezależnie od rodzaju powierzchni płytki, z której były uzyskane. Takim samym poziomem jakości charakteryzują się widma wykonane w matrycy IAA, bez względu na zastosowaną metodę przygotowania próbki oraz powierzchnię płytki z której wykonywane były analizy.The ΡΡΧ layer applied to the MALDI wafer caused an increase in the s / n value in the spectra of the samples obtained from the DT and DHB matrices for the samples prepared with both the DD and SF methods. For samples prepared in the HABA matrix, the obtained spectra are comparable regardless of the type of plate surface from which they were obtained. The spectra made in the IAA matrix are characterized by the same level of quality, regardless of the method of sample preparation used and the surface of the plate from which the analyzes were performed.

Zastosowanie warstwy ΡΡΧ na płytce MALDI daje w widmach wyższą wartość s/n tylko w przypadku próbek wykonanych w matrycy DT oraz DHB.The application of the ΡΡΧ layer on the MALDI wafer gives in the spectra a higher s / n value only for samples made in the DT and DHB matrix.

Przykład III.Example III.

Badania techniką MALDI Insuliny bydlęcej oraz Cytochromu.Research using the MALDI technique of Bovine Insulin and Cytochrome.

Wpływ warstwy parylenu na jakość widm MALDI w zależności od trybu rejestrowania widm.Influence of the parylene layer on the quality of the MALDI spectra depending on the spectral recording mode.

Analizy MALDI na specjalnie przygotowanych płytkach wykonano dla dwóch modelowych protein: Insuliny bydlęcej i Cytochromu. Insulina i Cytochrom są wykorzystywane w analizie MALDI jako wzorce do kalibracji aparatu aby dokonać 7 dokładnych przypisań mas cząsteczkowych w badaniach związków bioorganicznych.MALDI analyzes on specially prepared plates were performed for two model proteins: Bovine Insulin and Cytochrome. Insulin and Cytochrome are used in MALDI analysis as instrument calibration standards to make 7 accurate molecular weight assignments in bioorganic compound studies.

Próbki do pomiaru przygotowywane były metodą DD (Dried Droplet). Następnie nakroplono je bezpośrednio na płytkę z nałożoną warstwą ΡΡΧ oraz na drugą niemodyfikowaną część płytki. Widma rejestrowano w trybie liniowym oraz w trybie reflektronu.The samples for measurement were prepared by the DD (Dried Droplet) method. Then they were spotted directly on the plate with the ΡΡΧ layer applied and on the other unmodified part of the plate. The spectra were recorded in the linear mode and in the reflectron mode.

Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 4, gdzie widma MALDI próbek przygotowanych metodą DD uwidoczniono na wykresie: a) Insulina rejestracja w trybie reflektronu, b) Cytochrom rejestracja w trybie liniowym. Uśrednione wartości s/n zestawiono w Tabeli 1.The obtained results are shown in Fig. 4, where the MALDI spectra of the samples prepared by the DD method are visualized in the graph: a) Insulin recording in reflectron mode, b) Cytochrome recording in linear mode. The averaged values of s / n are summarized in Table 1.

Tabela 1. Uśrednione wartości s/n Insulina bydlęca Cytochrom Rodzaj płytki Tryb liniowy Tryb reflektron Tryb liniowy Tryb reflektron Standardowa płytka 3597 1599 602 370 Płytka z warstwą parylenu 3776 1069 634 370Table 1. Mean values of s / n Bovine insulin Cytochrome Plate type Linear mode Reflectron mode Linear mode Reflectron mode Standard plate 3597 1599 602 370 Parylene layer plate 3776 1069 634 370

Widma zarejestrowane z modyfikowanej powierzchni płytki nie różnią się zasadniczo od widm zarejestrowanych z niemodyfikowanej powierzchni. Oznacza to, że warstwa parylenu nie przeszkadza w desorpcji/jonizacji analitu. Przypisanie mas cząsteczkowych jest tak samo dokładne z warstwy parylenu jak w przypadku widm rejestrowanych z niemodyfikowanej powierzchni płytki. Rejestracja widma w trybie liniowym z próbek naniesionych na warstwę parylenu wpływa na uzyskanie wyższych wartości s/n. 8The spectra recorded from the modified surface of the plate do not differ significantly from the spectra recorded from the unmodified surface. This means that the Parylene layer does not interfere with the desorption / ionization of the analyte. The assignment of the molecular weights is as accurate from the Parylene layer as for the spectra recorded from the unmodified plate surface. The registration of the spectrum in the linear mode from the samples applied to the paraylene layer results in obtaining higher s / n values. 8

Przykład IV.Example IV.

Badania techniką MALDI równomolowej mieszaniny Insuliny bydlęcej i Cytochromu. Wpływ hydrofobowości warstwy parylenu na uzyskane widma MALDI.MALDI studies of an equimolar mixture of bovine insulin and Cytochrome. Influence of hydrophobicity of the Parylene layer on the obtained MALDI spectra.

Analizy MALDI na specjalnie przygotowanych płytkach wykonano dla mieszaniny równomolowej dwóch modelowych protein: Insuliny i Cytochromu. Taka mieszanina związków służy do kalibracji wewnętrznej podczas wykonywania pomiarów metodą MALDI. Do próbki analitu dodaje się mieszaninę wzorców kalibracyjnych przeważnie o różnych masach aby dokonać dokładnego przypisania masy cząsteczkowej analitu.MALDI analyzes on specially prepared plates were performed for an equimolar mixture of two model proteins: Insulin and Cytochrome. This mixture of compounds is used for internal calibration when performing MALDI measurements. A mixture of calibration standards, usually of different weights, is added to the analyte sample to accurately assign the molecular weight of the analyte.

Próbki do pomiaru przygotowywane były dwoma metodami: metodą DD (Dried Droplet) i SF (Solvent Free - metoda bez użycia rozpuszczalników). Następnie tak przygotowane próbki były naniesione bezpośrednio na płytkę z nałożoną warstwą parylenu oraz na drugą niemodyfikowaną część płytki.The samples for measurement were prepared using two methods: DD (Dried Droplet) and SF (Solvent Free) method. Then the samples prepared in this way were applied directly to the plate with a layer of Parylene and to the other unmodified part of the plate.

Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 5, gdzie uwidoczniono widma MALDI mieszaniny Insuliny i Cytochromu przygotowywane różnymi metodami: a) DD, b) SF. Z uzyskanych danych wynika, że warstwa parylenu ułatwia proces desorpcji/jonizacji analizowanych próbek przygotowywanych metodą DD z zastosowaniem matrycy DHB. Hydrofobowość warstwy parylenu ma wpływ na sposób krystalizacji składników analitu z matrycą. W przypadku metody SF niezależnie od rodzaju powierzchni z której rejestrowane były widma uzyskane wyniki były porównywalne. Warstwa parylenu nie wpływa negatywnie na jakość zarejestrowanych widm przygotowywanych wg metody SF.The obtained results are shown in Fig. 5, which shows the MALDI spectra of the mixture of Insulin and Cytochrome prepared by different methods: a) DD, b) SF. The obtained data show that the paraylene layer facilitates the desorption / ionization process of the analyzed samples prepared by the DD method with the use of DHB matrix. The hydrophobicity of the Parylene layer affects the method of crystallization of the analyte components with the matrix. In the case of the SF method, regardless of the type of surface from which the spectra were recorded, the obtained results were comparable. The Parylene layer does not adversely affect the quality of the recorded spectra prepared according to the SF method.

Pomiary mas cząsteczkowych techniką MALDIMALDI molecular weight measurements

Widma mas zarejestrowano na spektrometrze Voyager Elitę firmy PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA, wyposażonym w laser azotowy (337 nm). Otrzymane widma przetworzono stosując program Data Explorer ver. 4.0 (Applied 9Mass spectra were recorded on a Voyager Elite spectrometer from PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA, equipped with a nitrogen laser (337 nm). The obtained spectra were processed using Data Explorer ver. 4.0 (Applied 9

Biosystems Inc., Foster City, CA). W trakcie wykonywania widm użyto kalibracji zewnętrznej. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2.Biosystems Inc., Foster City, CA). External calibration was used during the spectra production. The results are shown in Table 2.

Tabela 2. parametry aparatu podczas pomiarów MALDI Polimery Proteiny Modę of operation: Linear Linear/Reflektron Extraction modę: Delayed Delayed Polarity: Positive Positive Acąuisition control: Automatic Manuał Accelerating voltage: 20 kV 20 kV Grid voltage: 92.1 % 70% Guide wire : 0.02 % 0.03 % Extraction delay time: 100 ns 50 ns Acąuisition mass rangę 700-15000 2000-15000 Low mass gate: 500 1000Table 2. Instrument parameters during MALDI measurements Polimery Proteins Mode of operation: Linear Linear / Reflektron Extraction mode: Delayed Delayed Polarity: Positive Positive Acquisition control: Automatic Manual Accelerating voltage: 20 kV 20 kV Grid voltage: 92.1% 70% Guide wire: 0.02 % 0.03% Extraction delay time: 100 ns 50 ns Acquisition mass rank 700-15000 2000-15000 Low mass gate: 500 1000

Matryce: 1,8-dihydroksyantracen-9(10H)-on (DT), kwas trans 3-indoloakrylowy (IAA), kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB), i kwas 2-(4-hydroksyfenyloazo)-benzoesowy (HABA) oraz sole: Nal zostały zakupione w firmie SIGMA-ALDRICH.Matrices: 1,8-dihydroxyanthracene-9 (10H) -one (DT), trans 3-indoleacrylic acid (IAA), 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), and 2- (4-hydroxyphenylazo) benzoic acid (HABA ) and salts: Nal were purchased from SIGMA-ALDRICH.

Przygotowanie próbek do analizy MALDI Metoda DD polimeryPreparation of samples for analysis MALDI Method DD polymers

Sporządzono roztwory matrycy, soli (Nal) i polimeru o stężeniach 10 mg/mL każdy. Jako rozpuszczalnika użyto tetrahydrofranu (THF, POCH, Gliwice Polska, 99%). Roztwory zmieszano w stosunku objętościowym 10Ι]μΙ_:1 μΐ_:1ΐ]μΐ_. Następnie 1Ι)μΙ_ tak przygotowanej mieszaniny naniesiono na płytkę do analizy MALDI i pozostawiono do wyschnięcia. 10Solutions of matrix, salt (Nal) and polymer at 10 mg / mL each were prepared. Tetrahydrofran (THF, POCH, Gliwice Poland, 99%) was used as a solvent. The solutions were mixed in the volume ratio of 10Ι] μΙ_: 1 μΐ_: 1ΐ] μΐ_. Then, 1Ι) μΙ of the mixture prepared in this way was applied to the MALDI analysis plate and allowed to dry. 10

Metoda DD proteinyProtein DD method

Sporządzono roztwory 50 mg (3.2 χ 10'7 M) matrycy DHB w 1 mL THF, zmieszano go z 1 mg (1.74 χ 10'7 M insuliny bydlęcej oraz 8.09 χ 10'8 M Cytochromu), następnie 1 μΙ_ mieszaniny naniesiono na płytkę do analizy MALDI.Solutions of 50 mg (3.2 × 10'7 M) DHB matrix in 1 mL THF were prepared, mixed with 1 mg (1.74 × 10.7 M bovine insulin and 8.09 × 10'8 M Cytochrome), then 1 μΙ of the mixture was applied to the plate for MALDI analysis.

Metoda SF polimerySF polymers method

Matrycę, sól i polimer zmieszano w proporcjach wagowych 10:1:1, a następnie ucierano ręcznie w moździerzu 2 minuty. Porcję zmielonego proszku naniesiono na płytkę do analizy MALDI, a następnie rozsmarowano go za pomocą szpatułki na powierzchni płytki tworząc cienką warstwę.The matrix, salt and polymer were mixed in a weight ratio of 10: 1: 1, and then hand rubbed in a mortar for 2 minutes. An aliquot of the ground powder was applied to the MALDI analysis plate and then spread over the plate surface with a spatula to form a thin layer.

Metoda SF proteinyProtein SF method

Matrycę DHB i proteiny zmieszano w proporcjach wagowych 50:1 a następnie postępowano jak w przypadku polimerów.DHB matrix and proteins were mixed in a 50: 1 weight ratio and then proceeded as for the polymers.

Literatura 1. Feuerstein, I., Rainer, M., Bernardo, K., Stecher, G., Huck, C. W., Kofler, K., Pelzer, A., Horninger, W., Klocker, H., Bartsch, G., Bonn, G. K. J. Proteome. Res. 2005, 6, 2320. 2. Dattelbaum A. M., lyer S., Expert Rev. Proteomics 2006, 3, 153. 3. Woldegiorgis A., von Kieseritzky F., Dahlstedt E., Hellberg J., Brinck T., Roeraade J., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18, 841. 4. Wei J., Buriak J. M., Siuzdak G,. Naturę 1999, 399, 243. 5. Gorham W.F. (to Union Carbide Corp.) U.S. Patent 3,342,754 (1967). 6. Mordelt G., Heim P., Metalloberflaeche, 1998, 52, 368. 4320/CH5/2011References 1. Feuerstein, I., Rainer, M., Bernardo, K., Stecher, G., Huck, CW, Kofler, K., Pelzer, A., Horninger, W., Klocker, H., Bartsch, G ., Bonn, GKJ Proteome. Res. 2005, 6, 2320. 2. Dattelbaum A. M., Lyer S., Expert Rev. Proteomics 2006, 3, 153. 3. Woldegiorgis A., von Kieseritzky F., Dahlstedt E., Hellberg J., Brinck T., Roeraade J., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18, 841. 4. Wei J., Buriak J. M., Siuzdak G ,. Nature 1999, 399, 243. 5. Gorham W.F. (this is Union Carbide Corp.) U.S. Patent 3,342,754 (1967). 6. Mordelt G., Heim P., Metalloberflaeche, 1998, 52, 368.4320 / CH5 / 2011

Claims

., > ^ «c * - ^ łi -i V ^ > (i --- a ¢. ^» ΐ; • ftdic-tiJ.sc · '. Sr · »: < ł > ji» ,, lm < * ijw ^ .w < -. ii ν-χΗ »ω ^ 5 --- rtw- '^ -« 396074 Patent claims 1. Use of a paraylene layer as a material protecting the surface of the measuring plate and facilitating the desorption / ionization of the analyte in MALDI analyzes of synthetic and natural polymers, as well as mixtures of compounds, especially with molecular weight up to 15,000 kDa.

2. Use according to claim 1 The method of claim 1, characterized in that the paraylene layers as a material protecting the surface of the measuring plate are used in MALDI analyzes carried out with the Dried Droplet solvent and without the use of the Solvent Free solvent.

3. Use according to claim 1 5. The method of claim 1, wherein the parisylene layers are removed from the modified MALDI wafer after application by peeling off / tearing off the surface protective layer.

4. Use according to claim 1 The method of claim 1, characterized in that the Parylene layers as a material protecting the surface of the measuring plate are used in the analysis of MALDI spectra in the linear and reflectron mode. 4320 / CH5 / 2011 NOUN