Znany jest fakt, ze przy leczeniu cukrzycy za pomoca hormonu trzustki, insuliny, zmniejsza¬ jacej zawartosc cukru we krwi, usilowano w ostatnich latach w rózny sposób przedluzyc dzialanie hormonu w celu otrzymania w orga¬ nizmie warunków bardziej zblizonych do nor¬ malnych. Proponowano dodawanie do insuliny róznych srodków utrudniajacych wchlanianie, np. oliwy, bialka albo srodków zwezajacych naczynia krwionosne jak adrenaliny.W poszukiwaniu preparatów insuliny o dzia¬ laniu przedluzonym starano sie uzyskac zwiazki trudno rozpuszczalne w osoczu krwi i plynie tkankowym. Znane jest stosowanie insuliny w polaczeniu z niektórymi protaminami jak klu peina (insulina protaminowa), a prócz tego z do¬ datkiem malej ilosci cynku (insulina cynkowo- protaminowa). Insulina w polaczeniu z niektó¬ rymi rozpuszczalnymi w wodzie solami zasado¬ wymi chinoliny lub z akrydyna tworzy pochodne, które równiez zostaja stosunkowo wolno resor- bowane przez organizm.Zgodnie z licznymi publikacjami (Physiol. Re- views 14, 188, (1934); Nature 134, 290, (1934); Biochem. Jour. 28, 2125, (1934); BioL Chem. 114, 199, (1936); Biochem. Journ. 30, 1915, (1936) udalo sie otrzymac produkty reakcji insuliny i izocy¬ janianów, które zupelnie albo prawie zupelnie nie powoduja zmniejszania zawartosci cukru we krwi. Celem tych prac bylo zdobycie wiadomosci o rodzaju grup w czasteczce insuliny, które sa przyczyna fizjologicznego dzialania, przy czym przyjeto, ze izocyjaniany atakuja tylko niektóre grupy aminowe w czasteczce insuliny, nie wy¬ wolujac glebokich zmian w budowie czasteczki.Wynalazek opiera sie na spostrzezeniu, iz pre¬ paraty insuliny o dzialaniu przedluzonym mozna otrzymac za pomoca izocyjanianów, jezeli trak¬ tuje sie nimi hormon w sposób odmienny niz dotychczas, otrzymujac czesciowe zwiazanie da¬ jacych sie miareczkowac grup aminowych w cza¬ steczce hormonu. Stwierdzono, ze podobne wy¬ niki otrzymuje sie przez zastosowanie innych substancji niz izocyjaniany, o ile substancje tezdolne sa zwiazac grupy aminowe, zastepujac W mion atomy wodoru. Przedmiotem wynala$cu jest przeto sposób poddania hormonu dzialaniu izocyjanianów lub innych substancji, zdolnych reagowac z grupami aminowymi w sposób po¬ dobny do izocyjanianów, stosujac takie warunki reakcji, w wyniku której hormon zachowuje calkowicie lub prawie calkowicie swoje wlasci¬ wosci zmniejszania zawartosci cukru we krwi? lecz sposób tego dzialania zostaje tak zmieniony, dz dzialanie hormonu w organizmie chorego trwa w ciagu znacznie dluzszego okresu czasu.Nowy zwiazek insuliny rózni sie od znanych dotychczas, wymienionych wyzej pochodnych insuliny tym, ze dziala dluzej i jest latwo roz¬ puszczalny w osoczu krwi i plynie tkankowym.Pochodne insuliny wedlug wynalazku otrzy¬ muje sie w warunkach zmiennych zaleznych od uzytej substancji zdolnej zastapic wodór ami¬ nowy w czasteczce insuliny. Odpowiednie wa¬ runki reakcji mozna okreslic latwo za pomoca doswiadczen biologicznych.Reakcje mozna równiez sledzic na podstawie reakcji chemicznej. Reakcje miedzy insulina i substancja zdolna zastapic atom wodoru w grupie aminowej insuliny osiaga sie, dzialajac na hormon ta substancja w srodowisku, w któ¬ rym jest ona nierozpuszczalna albo tylko slabo rozpuszczalna, np. w wodzie albo w roztworze wodnym. Stwierdzono, ze trudno jest zapobiec aby reakcja choc w czesci nie poszla tak daleko, aby nie nastapilo znaczne zmniejszenie aktyw¬ nosci koncowego produktu w stosunku do ma¬ terialu wyjsciowego. Otrzymuje sie co prawda produkty uzyteczne, lecz stanowi to strate war¬ tosciowej insuliny.W celu unikniecia tej niedogodnosci, zgodnie z wynalazkiem, reakcje insuliny i substancji podstawiajacej wodór aminowy przeprowadza sie w fazie jednorodnej.Rozpuszczalnikiem hormonu oraz substancji podstawiajacej wodór aminowy insuliny jest w wielu przypadkach mieszanina acetonu i wody.Regulujac temperature, wartosc pH, ilosc i ste¬ zenie izocyjanianu, sklad rozpuszczalnika oraz o ile to jest pozadane, czas reakcji, mozna otrzy¬ mac rózne pochodne insuliny.Jako substancje podstawiajace wodór aminowy insuliny mozna stosowac zamiast izocyjanianu, sap. chlorowcokwasy, bezwodniki kwasowe, ke¬ tony, chlorowcoalkyle, aldehydy i ketony, ksan- thydrol itd. Pochodne insuliny otrzymane za pomoca tych zwiazków nie róznia sie pod wzgle¬ dem aktywnosci i ogólnych wlasciwosci od pro¬ duktów otrzymanych za pornoca izocyjanianów Stwierdzono, iz przedluzenie aktywnosci pre¬ paratu nie wystepuje, o ile uzyty zwiazek nie reaguje z grupa aminowa insuliny dajaca sie miareczkowac. W miare jak grupy aminowe insuliny reaguja z izocyjanianem lub innym zwiazkiem aktywnosc preparatu na razie zostaje zachowana. Zanik aktywnosci rozpoczyna sie po¬ woli i staje sie bardziej wyrazny gdy przerea- guje 25 X lO—3 milimoli grup aminowych (w dal¬ szym ciagu opisu podawane jako 25 grup ami¬ nowych na milimol calokwitego azotu obecnego W hormonie, przy czym spadek aktywnosci wy¬ nosi 20 — 25%, a po zwiazaniu okolo 30 grup aminowych dajacych sie miareczkowac, spadek ten wynosi okolo 50%. Czasteczka insuliny za¬ wiera 78 grup aminowych dajacych sie mia¬ reczkowac, czyli 78 X 10—3 milimoli grup ami¬ nowych na milimoj calkowitego azotu. Pochodna, w której zwiazano 30 grup aminowych dajacych sie miareczkowac, posiada jeszcze aktywnosc o dzialaniu przedluzonym, nie jest jednak wska¬ zane stosowanie preparatu, w którym do tego stopnia zanikla aktywnosc i zgodnie z wynal¬ azkiem stosuje sie preparaty, w których nj# wiecej niz 30 grup aminowych zostalo zwiaza¬ nych. Najnizsza granica, przy której wystepuje zmiana wlasciwosci hormonu, jest przy zwia¬ zaniu 1 grupy aminowej. Zgodnie z wynalazkiem przebieg reakcji kontroluje sie sposobem che¬ micznym. Liczba grup aminowych insuliny da¬ jacych sie miareczkowac, która zostaje zwiazana, lezy w granicach 1 — 30.10—3 milimoli na milimol calkowitego azotu. Stwierdzono, iz w warunkach reakcji stosowanych do otrzymywania tych po¬ chodnych, niektóre grupy aminowe dajace sie pierwotnie miareczkowac zanikaja prawdopo¬ dobnie w wyniku miedzyczasteczkowego prze¬ grupowania, tak iz zmianie liczby grup amino¬ wych nie mozna przypisywac wylacznie -aktyw¬ nosci preparatu. Samo przegrupowanie IHS powoduje przedluzenia dzialania, zmniejszajacego, zawartosc cukru we krwi preparatu, tak ifc zgodnie z wynalazkiem, konieczne jest rozróz¬ niac zwiazane grupy aminowe dajace sie mia¬ reczkowac i grupy aminowe, które zanikaja wskutek przegrupowania, co osiaga sie prze* porównanie pochodnej insuliny otrzymanej zgo4* nie z wynalazkiem z preparatem kontrolnym otrzymanym w tych samych warunkach, lecz bez substancji, które podstawiaja atomy wodpru w grupie aminowej insuliny.Liczba uchwytnych droga miareczkowania grup aminowych, które przereagowaly z sub¬ stancja podstawiajaca atomy wpdoru, okresla sie za pomoca kilku róznych sposobów. W pew¬ nych przypadkach mozna okreslic ilosc substan¬ cji zwiazanej przez insuline bezposrednio i na tej podstawie obliczyc liczbe przereagpwanyety grup aminowych dajacych sie miareczkowac, przyjmujac, ze tylko te grupy sa atakowane. — 2 —Liczba przereagowanych grup aminowych da¬ jacych gia rnlareQLfcqwa6, mozna równiez okreslic przez miareczkowanie, leos w tym przypadku nalezy uwzglednij grupy aminowe, które zani¬ kaja wskutek prze^upow/ania w czasteczce.Liczba przejcagow«nych grup jwniriowyeh Skre¬ sla sie w tym przypadku jako róznice miedzy Uoieia grup dajacych sie miareczkowac przed i po rsafccji, prsy uwodnieniu poprawki na podstawie preparatu kontrolnego, albo cq na jedno wychodzi, pa podstawie róznicy miedzy grupami aminowymi dajacymi sie miareczko¬ wac w preparacie pochodnym, ofrzyrnanym agodnie « w^nalazMom ora* w preparacie kon¬ trolnym, otrzymanym przez traktowanie mate¬ rialu wyjsciowego w takich samych warunkach jak podciaa samej reakcji, ale bez plasowania substancji podstawiajacej atomy wodoru W gru¬ pie aminowej, WwierdiWG, i* Ueiha grup ami¬ nowych nie dajacych sie miarociikowac wnfeutek przypuwcaftlncgo przegrupowania miedzyczast- kowego -- niezaleznie od dzialania substan¬ cji podstawiajacej atomy wodoru — wynosi 30 — 40.10-3 miiimoli na milimol calkowitego azotu, tak i* calkowita liczba grup aminowych, które staja sie nieuchwytne przez miareczko¬ wanie zgodnie z wynalazkiem wynosi 60— 7P- Liczbe przereagowanych grup aminowych mozna tez okreslic innym sposobem, np. kolory¬ metrycznie.Ponizsze przyklady sluza do objasnienia wy¬ nalazku.Przyklad.!. 3,31 g insuliny rozpuszcza sie w 83,5 cm? wody zakwaszonej— HGt, po czym dodaje sie 47 cm* acetonu i roztwór na¬ stawia za pomoca — NaQH do wartosci pH = 7,3. Nastepnie dodaje sie kroplami 90 mg izocyjanianu fenylu w 1Q cm? acetonu w cia¬ gu 13 minut, utrzymujac przy tym wartosc pH = 7,35 — 7,25. Nastepnie oznacza sie zawar¬ tosc C02 w roztworze, co jest miara ilosci rozlo¬ zonego izocyjanianu przez rozpuszczalnik. Z ilo¬ sci izocyjanianu zuzytego podczas [reakcji z in¬ sulina oblicza sie liczbe przereagowanych grup aminowych dajacych sie miareczkowac, która wynosi 21. Pochodna insuliny wytraca sie przy pH = 5, nastepnie rozpuszcza sie ja w 50% acetonie przy pH = 7 — 8 i wytraca ponownie nadmiarem acetonu. Otrzymany produkt zbiera sie na filtrze, przemywa acetonem oraz eterem i suszy.W zupelnie taki sam sposób bez dodatku izo¬ cyjanianu otrzymuje sie produkt kontrolny.W tak otrzymanym produkcie stwierdzono przez miareczkowanie nieobecnosc 51 grup ami¬ nowych, podczas gdy w produkcie kontrolnym stwierdzano ubytek u gru& t^ odpowiada m grupom aminowym, która przeraagawi^F, 39 zgodne jest z liczba oczekiwana na podstawie ilosci uzytego izocyjanianu.Psieki 4ojw4a4cjifin4iim biologicznym wykwa nym na fcr&Uiach stwierdzono, ze produkt ptezy- many zawiera praktycznie biorac taka sama liczbe jednostek insuliny, jaka zawiera 3.21 g insuliny uzytej jafleo material wyjsciowy. Kli¬ niczne doswiadczenia z produktami wedlug wy¬ nalazku wykazaly, ze posiadaja one zdojnosó przedluzonego dzialania zmniejszajacego zawar¬ tosc cukru we krwi.Przyklad 11. 3*21 g insuliny rozpuszcza sie w 65 cm8 wody zakwaszonej —-HCI, po czym dodaje sie 67 cm8 acetonu i roztwór nastawia ostatecznie do wartosci pH = 9,5 za pomoca-3- mQP, Nastepnie dodaje sie Kropjamj. XM mg izocyjanianu fenylu w iQ cm3 ace^on^ w ciagu 13 minut. Równoczesnie dodaje sie stopniowo taka ilosc — NaOIi, aby wartosc pH utrzymac w granicach 9,5^8,4. Palej postepuje sie jalt w przykladzie I. liczba pr^creagowanycji grup aminowych obliczona z ilosci uzytego izocyjanianu wynosi 29. Stwierdzono w otrzymanym preparacie zamk 59 grup aminowych, podczas gdy w preparacie kontrolnym zanik 31 grup aminowych, cp odpo¬ wiada 28 grupom aminowym, które ulegly reakcji.Doswiadczenia biologiczne na królikach wy¬ kazaly, ze otrzymany preparat zawiera praktycz¬ nie biorac taka sama liczbe jednostek insuliny jaka zawiera 3,21 g insuliny uzytej jako ma¬ terial wyjsciowy. Kliniczne próby wykazaly, ze otrzymane pochodne wykazuja odpowiednia zdolnosc przedluzonego dzialania zmniejszaja¬ cego zawartosc cukru we krwi.Przyklad III. 3,21 g insuliny rozpuszcza sie w 65 cm3 wody zakwaszonej — HCl, po czym dodaje sie 67 cm3 acetonu i pH roztworu regu¬ luje do wartosci 8,0 ca pomoca — NaOH. W od¬ stepach 10- minutowych dodaje sie 31,5 mg chlorku benzoilu w 3 cm3 acetonu, przy czym równoczesnie doprowadza sie po kazdym doda¬ niu chlorku benzoilu wartosc pH do 8,0 za po¬ moca —- NaOH. Nastepnie dodaje sie roztworu reakcyjnego 450 cm3 wody, wytraca pochodna insuliny przy pH = 4,8, (rozpuszcza ja w 50 % acetonie przy pH = 7 — 8 i ponownie wytraca — 3 —nadmiarem acetonu. Osady zbiera sie, przemy¬ wa acetonem i eterem i wreszcie suszy.Stwierdzono metoda miareczkowa zanik 51 grup aminowych, podczas gdy w preparacie •kontrolnym liczba grup zaniklych wynosila 31.A zatem przereagowalo 20 grup aminowych.Doswiadczenia biologiczne na królikach wy¬ kazaly, ze preparat zawiera praktycznie taka sama liczbe jednostek insuliny jaka zawiera 3,21 g insuliny uzytej jako material wyjsciowy.Kliniczne doswiadczenia wykazaly, ze preparat posiada odpowiednia aktywnosc biologiczna.Przyklad IV. 3,21 g insuliny rozpuszcza sie w 65 cms wody zakwaszonej —-HCI, po czym dodaje sie 67 cm^ acetonu i roztwór nastawia sie do wartosci pH = 8,0 za pomoca —NaOH.W odstepach 10-minutowych dodaje sie trzy¬ krotnie 43,8 mg estru -benzylowego kwasu chlo- romrówkowego w 4 cm3 acetonu, utrzymujac wartosc pH = 8,0 za pomoca — NaOH. Nastepnie dodaje sie do roztworu reakcyjnego 450 cm3 wody, po czym postepuje sie jak w przykla¬ dzie III.Stwierdzono za pomoca miareczkowania nie¬ obecnosc 50 grup aminowych podczas gdy w kon¬ trolnym preparacie bylo tylko 31 grup, czyli 19 grup aminowych przereagowalo.Przyklad V. 2 g insuliny rozpuszcza sie w 85 cm3 wody zakwaszonej — HCl, przy czym pH reguluje sie do wartosci 7,0 za pomoca—-NaOH i nastepnie w ciagu 20 minut dodaje sie kropla¬ mi roztworu 63,4 mg bezwodnika kwasu octo¬ wego w 5 cm3 acetonu. Przez jednoczesny doda¬ tek—NaOH utrzymuje sie wartosc pH = 7,0.Tak otrzymana pochodna insuliny wytraca sie nadmiarem acetonu, zlbiera, przemywa acetonem i eterem i wreszcie suszy. PL