PL249811B1 - Syntetyczny bioaktywny materiał hydroksyapatytowy (HAP) oraz sposób jego otrzymywania - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest syntetyczny bioaktywny materiał hydroksyapatytowy, w postaci cząstek nanometrycznych, który zawiera wapń Ca w ilości 39,84% wag. oraz fosfor P w ilości 18,53% wag. związane w nanokrystaliczny hydroksyapatyt HAP, a nanometryczne cząstki o kulistej morfologii mają wielkość w zakresie od 36,50 nm do 49,5 nm. Ponadto materiał hydroksyapatytowy zawiera domieszkę co najmniej jednego spośród jonów Mg²⁺, Zn²⁺, Sr²⁺ z zachowaniem stosunku molowego 1,67 dla dwóch i więcej jonów domieszki. Przedmiotem zgłoszenia jest też sposób otrzymywania ww. materiału metodą chemiczną na mokro, który polega na tym, że w alkalicznych warunkach reakcji syntezy, w trakcie mieszania roztworów wodnych substratów z roztworu reakcyjnego, zawierającego źródło wielu jonów, wytrąca się w postaci osadu związki zawierające fosfor i wapń, przy stosunku molowym atomów wapnia do atomów fosforu wynoszącym Ca/P=1,67. Reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od 25°C do 65°C w czasie od 2 do 12 godzin, przy pH roztworu o wartości od 9 do 11. W warunkach ciągłego mieszania z szybkością od 450 rpm do 1600 rpm do roztworu reakcyjnego z jonami Ca²⁺ dozuje się roztwór wodny zawierający jony fosforanowe PO₄^3- w czasie 30 - 50 min. Podczas syntezy utrzymuje się stan równowagi substratów, aż do wyczerpania i wytrącenia osadu z nanometrycznej wielkości cząstkami krystalicznymi hydroksyapatytu. Następnie osad oczyszcza się przez wielokrotne odwirowanie z prędkością od 3500 do 4000 rpm w czasie 2 do 5 min przemiennie z przemywaniem wodą dejonizowaną do uzyskania odczynu obojętnego i poddaje suszeniu w czasie od 24 do 72 godzin w temperaturze nie wyższej niż 90°C.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny bioaktywny materiał hydroksyapatytowy (HAP) przeznaczony do stosowania, zwłaszcza w materiałach implantacyjnych tkanki kostnej, jako bioceramiczny materiał wykazujący właściwości osteoindukcyjne oraz sposób jego otrzymywania.

Wśród nowoczesnych materiałów stosowanych w implantologii i medycynie regeneracyjnej szczególne miejsce zajmuje hydroksyapatyt, który może być otrzymywany w różnym kształcie i wielkości. Hydroksyapatyt cechuje się biozgodnością i zdolnością do bezpośredniego wiązania z tkanką kostną. Z tego względu tworzywa na bazie fosforanów wapnia (Ca-P), a zwłaszcza bioceramika hydroksyapatytowa zajmują szczególne miejsce wśród nowoczesnych materiałów implantacyjnych.

Hydroksyapatyt syntetyczny jest ortofosforanem wapnia o stosunku molowym Ca/P równym 1,667. Występuje w kilkunastu różnych formach kształtu, które można otrzymać w zależności od użytej metody syntezy. Krystaliczny hydroksyapatyt przedstawia wzór stechiometryczny Ca10(PO4)6(OH)2, a jego synteza musi zawierać reagenty będące źródłem wapnia i fosforanów. HAP można otrzymać ze źródeł naturalnych lub podczas odpowiednich syntez, z zastosowaniem metod mokrych, hydrotermalnych, suchej, topnikowej, zol-żel, ultradźwiękowej (sonochemicznej) lub mikrofalowej.

W ostatnich latach rozwój ceramiki hydroksyapatytowej koncentruje się na dążeniu do jak najwyższego podobieństwa materiału hydroksyapatytowego do apatytów biologicznych - składników mineralnych kości czy tkanek zmineralizowanych zęba. Istnieje bowiem bardzo duże zapotrzebowanie na materiały umożliwiające regenerację ubytków kostnych, zwłaszcza tych niemożliwych do samodzielnej regeneracji przez organizm człowieka, powstałych w wyniku wypadków, chorób nowotworowych, zabiegów dentystycznych albo operacji chirurgicznych.

Znane metody wytwarzania hydroksyapatytu umożliwiają otrzymanie proszków o odpowiedniej morfologii, strukturze krystalicznej, określonym stosunku molowym Ca/P, jak również pozwalają na wprowadzenie jonów do struktury hydroksyapatytu. Hydroksyapatyty o działaniu przeciwdrobnoustrojowym można wytwarzać stosując sole metali o takim działaniu, obecne podczas wytwarzania hydroksyapatytów lub poddając reakcji hydroksyapatyty z solami metali o działaniu przeciwdrobnoustrojowym.

Wytwarzanie hydroksyapatytów fosforanu wapnia według FR2776282A1 - odbywa się zasadniczo dwoma różnymi drogami, z których każda prowadzi do określonych zastosowań - z jednej strony preparat in situ, w którym utwardzanie hydroksyapatytu odbywa się w miejscu zastosowania w niskiej temperaturze (w szczególności in vivo w temperaturze ciała), do zastosowań chirurgicznych lub dentystycznych. Z drugiej strony preparat przemysłowy prowadzący do sproszkowanych lub słabo związanych apatytów lub do ceramiki apatytowej po obróbce cieplnej w wysokiej temperaturze lub obróbce kompresyjnej w obecności spoiwa. Kalcynowane apatyty przemysłowe są stechiometryczne i mają małą powierzchnię właściwą (poniżej 10 m²/g) oraz niską rozpuszczalność (iloczyn rozpuszczalności równy 10,119). Te właściwości sprawiają, że materiał jest trudny do bioresorbcji, co stanowi wadę w zastosowaniach chirurgicznych lub dentystycznych (gdzie ogólnie pożądana jest powolna wymiana wszczepionego materiału przez kość).

Jednak najpowszechniejsza metoda strącania obejmuje proces krystalizacji, i w zależności od składu, w temperaturze krystalizacji ponad 600°C, hydroksyapatyt (HAP) ulega rozkładowi termicznemu na drugie fazy, takie jak α-TCP i β-TCP.

W stanie techniki w celu stabilizowania faz oraz zminimalizowania aglomeracji zalecane są środki powierzchniowo czynne lub dyspergatory.

Sposób wytwarzania przeciwdrobnoustrojowego proszku hydroksyapatytu według patentu US5009898 obejmuje dodanie roztworu chlorku wapnia do roztworu zawierającego monowodorofosforan disodowy i co najmniej jedną sól srebra w celu wytworzenia osadu hydroksyapatytu zawierającego jony srebra, zebranie i przemycie osadu oraz następnie suszenie i kruszenie osadu z wytworzeniem proszku. Roztwór zawiera również co najmniej jeden jon metalu wybrany z grupy składającej się z jonów miedzi i cynku. Znany z opisu patentu US4917702 materiał do uzupełniania ubytków w kościach, zębach i ich korzeniach, a także do wytwarzania warstw na implantach metalicznych, stanowi proszkowy preparat apatytowy zawierający w sieci krystalicznej jony węglanowe i alkaliczne.

W rozwiązaniu znanym z opisu patentu JP3866864B2 kuliste amorficzne cząstki hydroksyapatytu wytwarza się przez dodanie kwasu fosforowego do wodnego roztworu wodorotlenku wapnia do wartości pH od 8 do 12 w temperaturze zawiesiny poniżej 50°C. Podczas syntezy do zawiesiny wodorotlenku wapnia dodaje się obojętny lub słabo zasadowy, rozpuszczalny w wodzie polimerowy dyspergator. Następnie otrzymaną zawiesinę amorficznego fosforanu wapnia poddaje się granulacji i suszy w celu uzyskania kulistych cząstek bezpostaciowego fosforanu wapnia o średniej wielkości cząstek od 0,5 do 200 pm. Po spiekaniu w temperaturze 800 do 1300°C wytwarza się, stosowane jako biomateriały, cząstki hydroksyapatytu.

Z opisu KR100787526A znany jest sposób otrzymywania sferycznych nanoproszków hydroksyapatytu HAP, α-fosforanu trójwapniowego (α-TCP) i β-fosforanu trójwapniowego (β-TCP). Na mieszaninę Ca(OH)2, H3PO4 oraz NaOH oddziałuje się mikrofalami o dawce 600-700 W w czasie 21-25 minut, przy pH roztworu w zakresie 6-7. Sposób wytwarzania pustej w środku mikrosfery z hydroksyapatytu, metodą strącania chemicznego, znany z opisu patentu CN100398433C, polega na mieszaniu rozpuszczonej w wodzie destylowanej zawiesiny tetrahydratu azotanu wapnia i wodorofosforanu amonu. Strącony osad suszy się i poddaje obróbce cieplnej.

Sposób otrzymywania syntetycznego bioceramicznego tworzywa implantacyjnego na bazie hydroksyapatytów węglanowych znany jest z opisu patentu PL214929B1. Podczas syntezy do zawiesiny wodnej Ca(OH)2, zawierającej dodatek roztworu soli pierwiastka modyfikującego, wprowadza się roztwór (NH4)2HPO4, zawierający źródło jonów węglanowych CO3^2- oraz Na⁺ wbudowujących się w strukturę hydroksyapatytu. Z zastosowaniem amoniaku utrzymuje się pH na poziomie powyżej 10, a stosunek molowy Ca/P wynosi 1,55-1,95. Powstałą zawiesinę amorficznego, niestechiometrycznego hydroksyapatytu węglanowego, w którego strukturę wbudowane są jony CO3^2-, HPO4^2- oraz jony pierwiastków modyfikujących, poddaje się procesowi dojrzewania, dekantacji i filtracji, a następnie suszy i rozdrabnia. Proszek o uziarnieniu poniżej 60 pm kalcynuje się w temperaturze 300-500°C. Z proszków formuje się implanty o żądanym kształcie, które poddaje się spiekaniu w temperaturze 600 do 950°C, w obecności CO2 z rozkładu surowców węglanowych.

W opisie patentowym PL229015B1 ujawniono sposób otrzymywania nanocząstek hydroksyapatytowych w postaci nanopłytek, nanopręcików i nanosfer, w procesie precypitacji chemicznej na mokro, z użyciem środka dyspergującego. Reakcji poddaje się rozpuszczalną w wodzie sól wapnia (azotan, octan, chlorek, mleczan wapnia) i rozpuszczalny w wodzie fosforan (fosforan amonu, sodu, potasu), przy stosunku molowym atomów wapnia do atomów fosforu wynoszącym około Ca/P 1,67 i w obecności lecytyny jako środka dyspergującego. Reakcję prowadzi się w tem peraturze w zakresie od 20°C do 95°C, korzystnie 60°C, przy pH od 7 do 14, korzystnie 10.

Przedstawione powyżej doniesienia literaturowe i przegląd dokumentów patentowych prowadzi do wniosku, że pomimo wielu znanych rozwiązań dotyczących sposobów otrzymywania nanomateriałów apatytowych, to ze względu na ich szerokie interdyscyplinarnie zastosowanie, wciąż poszukuje się nowatorskich hydroksyapatytów o dobrze udokumentowanych właściwościach biologicznych, pozwalających zaliczyć je do materiałów dedykowanych dla zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu otrzymywania nanohydroksyapatytu HAP, o stechiometrycznym stosunku molowym, do zastosowań w medycynie regeneracyjnej. Celem wynalazku jest również dostarczenie nanokrystalicznego hydroksyapatytu, wykazującego oddziaływanie biologiczne.

Syntetyczny bioaktywny materiał hydroksyapatytowy, według wynalazku, w postaci cząstek nanometrycznych, w którym stosunek molowy atomów wapnia do atomów fosforu wynosi Ca/P = 1,67, zawierający wapń Ca wprowadzony w postaci kationu Ca²⁺ oraz fosfor P wprowadzony postaci anionu PO4³, charakteryzuje się tym, że zawiera wapń Ca w ilości 39,84% wag. raz fosfor P w ilości 18,53% wag. związane w nanokrystaliczny hydroksyapatyt HAP, a nanometryczne cząstki o kulistej morfologii mają wielkość w zakresie od 36,50 nm do 49,5 nm.

Sposób otrzymywania syntetycznego bioaktywnego materiału hydroksyapatytowego HAP metodą chemiczną na mokro, polega na tym, że w alkalicznych warunkach reakcji syntezy, z roztworu reakcyjnego, zawierającego źródło wielu jonów, z których co najmniej jeden jest rozpuszczalny w wodzie, w trakcie mieszania wytrąca się w postaci osadu związki zawierające fosfor i wapń, przy stosunku molowym atomów wapnia do atomów fosforu wynoszącym Ca/P = 1,67, a do wodnego roztworu reakcyjnego z jonami Ca²⁺ dozuje się w dawkach podzielonych roztwór wodny zawierający jony fosforanowe PO4^3-, charakteryzuje się tym, że reakcję prowadzi się w stałej temperaturze z zakresu 25°C do 65°C w czasie od 2 do 12 godzin, przy pH roztworu o stałej wartości z zakresu 9 do 11, i w warunkach ciągłego mieszania z szybkością 450 rpm do 1600 rpm, oraz dozuje roztwór wodny zawierający jony fosforanowe PO4^3-, korzystnie kwas ortofosforowy (H3PO4) do mieszaniny reakcyjnej zawierającej korzystnie wodorotlenek wapnia Ca(OH)2, w czasie 30-50 min, utrzymując stan równowagi substratów aż do wyczerpania i wytrącenia osadu z nanometrycznej wielkości cząstkami krystalicznymi hydroksyapatytu, po czym osad oczyszcza się przez wielokrotne odwirowanie z prędkością 3500-4000 rpm w czasie 2 do 5 min przemiennie z przemywaniem wodą dejonizowaną, o przewodności ~0,05 pS, do uzyskania odczynu obojętnego, i poddaje suszeniu w czasie od 24 do 72 godzin w temperaturze nie wyższej niż 90°C.

Prowadzi się kalcynację osadu z cząstkami krystalicznymi hydroksyapatytu w atmosferze powietrza, a ogrzewanie zachodzi z szybkością od 5°C/min do 10°C/min do temperatury z zakresu od 700°C do 1200°C, następnie przetrzymuje w maksimum temperatury z tego zakresu od 700°C do 1200° w czasie od 30 min do 2 h, po czym chłodzi z szybkością od 5°C/min do 10°C/min do temperatury pokojowej z wytworzeniem nanometrycznych kulistych cząstek hydroksyapatytu, które korzystnie rozdrabnia się do uzyskania powierzchni właściwej ziaren 0,33 m²/g.

W roztworze reakcyjnym jako źródło jonów wapnia Ca²⁺ zamiast wodorotlenku wapnia Ca(OH)2 stosuje się azotan wapnia lub węglan wapnia lub octan wapnia lub tlenek wapnia.

W roztworze reakcyjnym jako źródło jonów ortofosforanowych (PO4^3-) zamiast kwasu ortofosforowego (H3PO4) stosuje się jego sole takie jak ortofosforan amonu, ortofosforan potasu, ortofosforan sodu lub wodorosole kwasu ortofosforowego, takie jak diwodorofosforan amonu, wodorofosforan diamonu, diwodorofosforan potasu, wodorofosforan dipotasu, diwodorofosforan sodu, wodorofosforan disodu.

Stosuje się wodę amoniakalną w roztworze 25% w ilości wymaganej do ustalania wartości pH wodnego roztworu reakcyjnego w zakresie 9 do 11.

Nanometryczne cząstki hydroksyapatytu o kulistej morfologii mają po wysuszeniu wielkość w zakresie od 36,50 nm do 49,5 nm.

Zastosowanie syntetycznego bioaktywnego materiału hydroksyapatytowego do materiałów implantacyjnych tkanki kostnej, jako biozgodny materiał bioceramiczny wykazujący właściwości osteoindukcyjne.

Sposób według wynalazku umożliwia otrzymywanie w jednym etapie biozgodnego materiału bioceramicznego o szerokim zastosowaniu.

Wielkość kryształów ma znaczący wpływ na właściwości hydroksyapatytu, ponieważ mniejsze rozmiary kryształów są korzystne ze względu na zastosowanie jako bioaktywny materiał bioceramiczny. Nanometryczna wielkość kryształów, ma znaczenie dla możliwości lepszego ułożenia cząstek, gdyż mniejsze cząstki można przegrupować, a tym samym zagęszczać. Ponadto zmniejszenie rozmiarów kryształów i kulisty kształt może być korzystny dla polepszenia tworzenia materiału. Hydroksyapatyt przeznaczony jest do stosowania jako biozgodny materiał ceramiczny do materiałów implantacyjnych tkanki kostnej, cementów stomatologicznych, nośników leków i produktów kosmetycznych.

Sposób według wynalazku przedstawiono w przykładach, które zawierają ilustracje oraz wykresy przedstawione na rysunku, na którym Fig. 1 pokazuje obrazowanie SEM i analizę EDS produktu z przykładu 1, Fig. 2 pokazuje obrazowanie SEM i analizę EDS produktów poddanych kalcynacji z przykładu 2, Fig. 3 pokazuje widmo XRD produktu z przykładu 1, Fig. 4 pokazuje widmo XRD produktów poddanych kalcynacji z przykładu 2, Fig. 5 pokazuje widmo FTIR produktu z przykładu 1, Fig. 6 pokazuje widmo FTIR produktów poddanych kalcynacji z przykładu 2. Natomiast wykresy słupkowe pokazane na Fig. 7 a-h do Fig. 10 a-b, ilustrują aktywność biologiczną produktu z przykładów wykonania.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się syntetyczny biozgodny hydroksyapatyt (HAP) w postaci sypkiego proszku o nanometrycznej wielkości krystalicznych cząstek o morfologii kulistej, wykazujący udokumentowane właściwości osteoindukcyjne.

Otrzymywanie syntetycznego proszku hydroksyapatytu prowadzono metodą chemiczną na mokro w alkalicznych warunkach reakcji syntezy. W procesie syntezy, oprócz wstępnie ustalonego stężenia substratów wyjściowych, kontroluje się morfologię i wielkość cząstek hydroksyapatytu, zwł aszcza poprzez zmianę stężenia jonów wapnia Ca²⁺; a także poprzez pH, temperaturę prowadzenia reakcji, szybkość mieszania i kalcynację.

Reakcję prowadzi się w stałej temperaturze z zakresu od 25°C do 65°C, w czasie od 2 do 12 godzin, przy stałym pH roztworu o wartości od 9 do 11 i w warunkach ciągłego mieszania z szybkością 450 rpm do 1600 rpm.

W reakcji wytrącania osadu w trakcie mieszania roztworów wodnych substratów, stanowiących związki zawierające fosfor i wapń, utrzymuje się stechiometryczny stosunek molowy Ca/P = 1,67.

Do wodnego roztworu reakcyjnego z jonami Ca²⁺ dozowano w dawkach podzielonych roztwór wodny zawierający jony fosforanowe PO4^3-, odpowiednio do ilości wiązanych jonów, w czasie 30-50 min, utrzymując stan równowagi substratów aż do wyczerpania i wytrącenia osadu z nanometrycznej wielkości cząstkami krystalicznymi hydroksyapatytu.

Do ustalania pH wodnego roztworu reakcyjnego w zakresie wartości 9-11, stosuje się wodę amoniakalną w roztworze 25%.

Jako źródło jonów wapnia stosuje się wodorotlenek wapnia Ca(OH)2 lub azotan wapnia lub węglan wapnia lub octan wapnia lub tlenek wapnia. Natomiast jako źródło jonów fosforanowych stosuje się kwas ortofosforowy (H3PO4) lub jego sole takie jak ortofosforan amonu, ortofosforan potasu, ortofosforan sodu lub wodorosole kwasu ortofosforowego, takie jak diwodorofosforan amonu, wodorofosforan diamonu, diwodorofosforan potasu, wodorofosforan dipotasu, diwodorofosforan sodu, wodorofosforan disodu.

Osad oczyszcza się przez wielokrotne odwirowanie z prędkością 3500-4000 rpm w czasie 2 do 5 min, przemiennie z przemywaniem wodą dejonizowaną o przewodności ~0,05 pS, do uzyskania odczynu obojętnego i poddaje suszeniu w czasie od 24 do 72 godzin w temperaturze nie wyższej niż 90°C. Jest to istotny etap procesu, ponieważ ma na celu dostarczenie osadu, który w wyniku zastosowanych znaczących prędkości odwadniania, pozbawia osad wilgoci wraz z zanieczyszczeniami poprocesowymi. Natomiast stosowanie wody dejonizowanej ogranicza możliwość wprowadzenia do osadu obcych jonów.

Rezultatem tak prowadzonej obróbki osadu jest możliwość obniżenia temperatury oraz skrócenie czasu suszenia. Wysuszony osad mieli się oraz poddaje kalcynacji, przy czym uzyskany proszek z cząstek hydroksyapatytu można stosować bez tego etapu obróbki termicznej. W tak prowadzonym procesie syntezy bioaktywny materiał hydroksyapatytowy, zawiera wapń Ca w ilości 39,84% wag. oraz fosfor P w ilości 18,53% wag. związane w stechiometryczny nanokrystaliczny hydroksyapatyt HAP.

Nanometryczne krystaliczne cząstki hydroksyapatytu o kulistej morfologii mają po wysuszeniu wielkość w zakresie od 36,50 nm do 49,5 nm.

Kalcynację wysuszonego osadu prowadzi się w atmosferze powietrza, a ogrzewanie zachodzi z szybkością od 5°C/min do 10°C/min do temperatury od 700°C do 1200°C, następnie przetrzymuje się osad w maksimum temperatury z tego zakresu od 700°C do 1200° w czasie od 30 min do 2 h, po czym chłodzi z szybkością chłodzenia od 5°C/min do 10°C/min do temperatury pokojowej. Po kalcynacji i ujednorodnieniu przez zmielenie, nanometryczne cząstki hydroksyapatytu o kulistej morfologii rozdrabnia się do uzyskania powierzchni właściwej ziaren 0,33 m²/g.

Sposób według wynalazku umożliwia otrzymywanie w jednym etapie biozgodnego materiału bioceramicznego o szerokim zastosowaniu.

Wielkość wytworzonych kryształów ma znaczący wpływ na właściwości hydroksyapatytu, ponieważ mniejsze rozmiary kryształów są korzystne ze względu na przeznaczenie do stosowania jako bioaktywny materiał bioceramiczny. Nanometryczna wielkość kryształów, ma także wpływ na zagęszczanie cząstek, gdyż mniejsze cząstki można przegrupować, a tym samym zagęszczać. Ponadto zmniejszenie rozmiarów kryształów i kulisty kształt, może być korzystny dla polepszenia tworzenia materiału.

Otrzymane w procesie syntezy syntetyczne bioaktywne materiały hydroksyapatytowe ze względu na uzyskane aktywności, mogą być stosowane jako biozgodny materiał bioceramiczny do materiałów implantacyjnych tkanki kostnej.

W poniższych przykładach został dodatkowo wyjaśniony sposób otrzymywania syntetycznego bioaktywnego materiału hydroksyapatytowego, gdzie w przykładowych realizacjach przedstawiono otrzymywanie fosforanów wapnia w tym β-TCP, których obecność znacząco wpływa na właściwości osteoindukcyjne i osteokondukcyjne produktu.

Przykład 1

Przykład dotyczy syntezy czystego nanohydroksyapatytu nanoHAP.

W kolbie kulistej o pojemności 500 mL, zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną, przygotowano 0,5 mola (37,05 g) wodorotlenku wapnia Ca(OH)2. Dodano 400 mL wody dejonizowanej i umieszczono na mieszadle magnetycznym pracującym z prędkością 450 obr/min przez 20 min w temperaturze 50°C, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. W kolbie kulistej o pojemności 200 mL, zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną, odmierzono 0,3 mola (20,049 mL) kwasu ortofosforowego (H3PO4) i rozcieńczono go w 100 mL wody dejonizowanej. Tak przygotowany roztwór wkroplono przez 45 min do mieszaniny wodorotlenku wapnia umieszczonego na mieszadle magnetycznym pracującym z ciągłym mieszaniem z prędkością 600 obr/min. W trakcie dodawania kwasu ortofosforowego utrzymano pH = 11 poprzez dodanie wody amoniakalnej w roztworze 25%, jeśli było to konieczne. Wszystkie etapy reakcji przepro wadzono w temperaturze 50°C. Roztwór mieszano przez dalsze 2 godziny. Po syntezie roztwór odwirowano (3700 rpm przez 2 min) i w celu pozbycia się nadmiaru wody amoniakalnej produkt przemywano wodą dejonizowaną, aż do uzyskania obojętnego odczynu. Produkt reakcji przeniesiono do naczynia ceramicznego i suszono przez 24 godziny w temperaturze 90°C. Wysuszony produkt zmielono w celu uzyskania jednorodnego proszku i zważono.

Skład fazowy uzyskanego produktu wyznaczono metodą dyfrakcji promieni Roentgena (XRD), strukturę chemiczną potwierdzono metodą spektroskopii w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR), wielkość powierzchni właściwej wyznaczono metodą BET, wielkość ziaren, mikrostrukturę i analizę składu pierwiastkowego wyznaczono na podstawie obrazowania SEM z analizą EDS.

W reakcji uzyskano około 49,322 g produktu o jednorodnej strukturze i kulistej morfologii, o wielkości ziaren od 40,9 do 48,8 nm (Fig. 1). Uzyskany produkt to czysty fazowo hydroksyapatyt (Fig. 3). Na widmie FTIR widoczne są charakterystyczne pasma pochodzące od drgań rozciągających grup hydroksylowych (OH) (3568 cm^-1), pasma pochodzące od symetrycznych i asymetrycznych drgań rozciągających wiązań P-O w ugrupowaniach fosforanowych (PO4^3-) (1092 cm^-1, 1033 cm^-1, 962 cm^-1) i pasma pochodzące od drgań zginających wiązań O-P-O ugrupowań fosforanowych (PO4^3-) (603 cm^-1, 565 cm^-1, 477 cm^-1). Widoczne jest szerokie pasmo przy 3422 cm^-1 pochodzące od wody zaadsorbowanej i pasma pochodzące od drgań zginających H-O-H w wodzie (1634 cm^-1) (Fig. 5). Wielkość powierzchni właściwej ziaren zawiera się w granicach: 80,7m²/g.

Zbadano cytozgodność i proliferację komórek, aktywność przeciwbakteryjną, poziom reaktywnych form tlenu, sekrecję cytokiny prozapalnej w odpowiedzi na produkt nanoHAP oraz właściwości osteoindukcyjne tego produktu.

Aktywność biologiczną produktu nanoHAP przestawiono na Fig. 7 a-h w zakresie cytozgodności (a) względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 [w teście redukcji MTT] zgodnie z normami ISO10993-5-2009, proliferacji (b) komórek hFOB 1.9 w warunkach osteoindukcyjnych [przy użyciu zestawu CyQuant®], działania przeciwdrobnoustrojowego względem S.aureus MSSA (c) i S.aureus MRSA (d) [w teście AlamarBlue], zmian w poziomie reaktywnych form tlenu (e) w komórkach hFOB 1.19 [przy użyciu sondy fluorescencyjnej H2DCFDA], właściwości osteoindukcyjnych produktu względem komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych: ocena produkcji ALP (f) [w teście ALP] oraz badanie stężenia osteokalcyny (g) [w teście ELISA], analizie sekrecji cytokiny prozapalnej IL-6 (h) przez komórki hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych [w teście ELISA], Badania dowiodły m. innymi, że otrzymany nanoHAP wykazuje aktywność przeciwdrobnoustrojową względem patogenów wywołujących zakażenia tkanki kostnej u ludzi Staphylococcus aureus MSSA (Fig. 7c) oraz Staphylococcus aureus MRSA (Fig. 7d).

P rzy kła d 2

Przykład dotyczy syntezy czystego nanohydroksyapatytu poddanego procesowi kalcynacji nanoHAP 1200°C.

W kolbie kulistej o pojemności 500 mL, zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną, przygotowano 0,5 mola (37,05 g) wodorotlenku wapnia Ca(OH)2. Dodano 400 mL wody destylowanej i umieszczono na mieszadle magnetycznym pracującym z prędkością od 450-800 obr/min przez około 20 min w temperaturze 48°C, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. W kolbie kulistej o pojemności 200 mL, zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną, odmierzono 0,3 mola (20,049 mL) kwasu ortofosforowego (H3PO4) i rozcieńczono go w 100 mL wody destylowanej. Tak przygotowany roztwór wkroplono przez 45 min do mieszaniny wodorotlenku wapnia umieszczonego na mieszadle magnetycznym pracującym z ciągłym mieszaniem z prędkością 600-800 obr/min. W trakcie dodawania kwasu ortofosforowego utrzymano pH = 11 poprzez dodanie wody amoniakalnej w roztworze. 25%, jeśli było to konieczne. Wszystkie etapy reakcji przeprowadzono w temperaturze 48°C. Roztwór mieszano przez dalsze 3 godziny. Po syntezie roztwór odwirowano (3700 rpm przez 2 min) i w celu pozbycia się nadmiaru wody amoniakalnej produkt przemywano wodą dejonizowaną. Przemywanie produktu wykonano co najmniej 4 razy. Ilość powtórzeń zależy od ilości użytej wody amoniakalnej i od uzyskania obojętnego odczynu. Po przemyciu i odwirowaniu produkt reakcji przeniesiono do naczynia ceramicznego i poddano suszeniu przez 24 godziny w temperaturze 90°C. Po wysuszeniu otrzymany produkt mielono i poddano procesowi kalcynacji w temp. 1200°C przez 1 godzinę, zgodnie z warunkami kalcynacji: grzanie 10°C/min do 1200°C, utrzymywanie temp. 1200°C przez 1 h, chłodzenie 10°C/min do 20°C, chłodzenie powietrzem w temperaturze pokojowej. Po kalcynacji produkt ponownie mielono w celu uzyskania jednorodnego proszku.

Uzyskany produkt scharakteryzowano analogicznie jak w przykładzie 1.

W reakcji uzyskano produkt o morfologii kulistej i wielkości ziaren w zakresie od 692,4 nm do 958.0 nm (Fig 2), który fazowo składał się z około 94% hydroksyapatytu i około 6% β fosforanu wapnia (Fig. 4). Na widmie FTIR widoczne są charakterystyczne pasma pochodzące od drgań rozciągających grup hydroksylowych (OH^-) (silne pasmo przy 3571 cm^-1, słabe pasmo przy 632 cm^-1), pasma pochodzące od symetrycznych i asymetrycznych drgań rozciągających wiązań P-O w ugrupowaniach fosforanowych (PO4^3-) (1091 cm^-1, 1048 cm^-1, 961 cm^-1) i pasma pochodzące od drgań zginających wiązań O-P-O ugrupowań fosforanowych (PO4^3-) (601 cm^-1, 570 cm^-1, 438 cm^-1). Widoczne jest też szerokie pasmo przy 3434 cm^-1 pochodzące od wody zaadsorbowanej (Fig. 6 FTIR). Wielkość powierzchni właściwej ziaren zawiera się w granicach 0,33 m²/g.

Zbadano cytotozgodność i proliferację komórek, aktywność przeciwbakteryjną, poziom reaktywnych form tlenu, sekrecję cytokiny prozapalnej w odpowiedzi na produkt nanoFlAP 1200°C oraz właściwości osteoindukcyjne tego produktu.

Aktywność biologiczną produktu nanoFlAP 1200°C przestawiono na Fig. 8 a do h w zakresie cytozgodności (a) względem fibroblastów L929 i osteoblastów hFOB 1.19 [w teście redukcji MTT] zgodnie z normami ISO10993-5-2009, proliferacji (b) komórek hFOB 1.9 w warunkach osteoindukcyjnych [przy użyciu zestawu CyQuant®], działania przeciwdrobnoustrojowego względem S.aureus MSSA (c) i S.aureus MRSA (d) [w teście AlamarBlue], zmian w poziomie reaktywnych form tlenu (e) w komórkach hFOB 1.19 [przy użyciu sondy fluorescencyjnej H2DCFDA], właściwości osteoindukcyjnych produktu względem komórek hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych: ocena produkcji ALP (f) [w teście ALP] oraz badanie stężenia osteokalcyny (g) [w teście ELISA], analizie sekrecji cytokiny prozapalnej IL-6 (h) przez komórki hFOB 1.19 w warunkach osteoindukcyjnych [w teście ELISA], Badania dowiodły m. innymi, że otrzymany nanoHAP1200°C wykazuje aktywność przeciwdrobnoustrojową względem patogenów wywołujących zakażenia tkanki kostnej u ludzi Staphylococcus aureus MSSA (Fig. 8c) oraz Staphylococcus aureus MRSA (Fig. 8d).

LITERATURA

1. J. Marciniak, Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, Gliwice, (2002);

2. B. Świeczko-Żurek, Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, Gdańsk, (2009);

3. M. Nałęcz, Biocybernetyka i inżynieria biomedyczna, Polska Akademia Nauk, Warszawa, (2003);

4. M. Szubert, Modyfikacja warstwy wierzchniej biomateriałów ceramicznych oraz ocena właściwości otrzymanych modyfikatów. Rozprawa Doktorska, Poznań (2014);

5. P. Arokiasamy, M.M.A.B. Abdullah, S. Z. A. Rahim, S. Luhar, , A.V. Sandu, N. H. Jamil, M. Nabiałek, Synthesis methods of hydroxyapatite from natural sources: A review, Ceramics International 48 (2022) 14959-14979;

6. A. Szcześ, L. Hołysz, E. Chibowski, Synthesis of hydroxyapatite for biomedical applications, Advances in Colloid and Interface Science 249 (2017) 321-330;

7. N.l. Agbeboh, I.O. Oladele, O.O. Daramola, A.A. Adediran, O.O. Olasukanmi, M.O. Tanimola, Environ-mentally sustainable processes for the synthesis of hydroxyapatite, Heliyon, 6(4)(2020) e03765 1-10].

8. M. Śupova, Substituted hydroxyapatites for biomedical applications: A review, Ceramics International 41 (2015) 9203-9231;

9. A. Sobczak-Kupiec, Z. Wzorek, B. Jodańska, D. Malina, Magnez jako modyfikator właściwości fizykochemicznych hydroksyapatytu, Czasopismo Techniczne. Chemia, 108 2-Ch (2011) 269-277;

10. D. Shepher, Zinc-substituted hydroxyapatite for the inhibition of osteoporosis. Hydroxyapatite (Hap) for Biomedical Applications, Woodhead Publishing Series for Biomaterials, Ed. Michael Mucalo (2015) 107-126;

11. Y. Ch. Liu, Y.Te Lee, T.Ch. Huang, G.S. Lin, Y.W. Chen, B.S. Lee, K.L. Tung, In Vitro Bioactivity and Antibacterial Activity of Strontium-, Magnesium-, and Zinc-Multidoped Hydroxyapatite Porous Coatings Applied via Atmospheric Plasma Spraying, ACS Applied Bio Materials 4 3 (2021) 2523-2533;

12. M. Yamaguchi , Role of nutritional zinc in the prevention of osteoporosis, Molecular and Cellular Biochemistry volume 338 (2010) 241-254;

13. D. Lytkina, A. G. D. Fedorishin, N. Korotchenko, R. Akhmedzhanov, V. Kozik, Synthesis and Properties of Zinc-Modified Hydroxyapatite, Journal of Functional Biomaterials 11(1) 10 (2020) 1-12.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Syntetyczny bioaktywny materiał hydroksyapatytowy HAP, w postaci cząstek nanometrycznych, w którym stosunek molowy atomów wapnia do atomów fosforu wynosi Ca/P = 1,67, zawierający wapń Ca wprowadzony w postaci kationu Ca²⁺ oraz fosfor wprowadzony postaci anionu PO4³, znamienny tym, że zawiera wapń Ca w ilości 39,84% wag. oraz fosfor P w ilości 18,53% wag. związane w nanokrystaliczny hydroksyapatyt HAP, a nanometryczne cząstki o kulistej morfologii mają wielkość w zakresie od 36,50 nm do 49,5 nm.
2. 2. Sposób otrzymywania syntetycznego bioaktywnego materiału hydroksyapatytowego HAP metodą chemiczną na mokro, polega na tym, że w alkalicznych warunkach reakcji syntezy, z roztworu reakcyjnego, zawierającego źródło wielu jonów, z których co najmniej jeden jest rozpuszczalny w wodzie, w trakcie mieszania wytrąca się w postaci osadu związki zawierające fosfor i wapń, przy stosunku molowym atomów wapnia do atomów fosforu wynoszącym Ca/P = 1,67, a do wodnego roztworu reakcyjnego z jonami Ca²⁺ dozuje się w dawkach podzielonych roztwór wodny zawierający jony fosforanowe PO4^3-, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w stałej temperaturze z zakresu 25°C do 65°C w czasie od 2 do 12 godzin, przy pH roztworu o stałej wartości z zakresu 9 do 11, i w warunkach ciągłego mieszania z szybkością 450 rpm do 1600 rpm, oraz dozuje roztwór wodny zawierający jony fosforanowe PO4^3-, korzystnie kwas ortofosforowy (H3PO4) do mieszaniny reakcyjnej zawierającej korzystnie wodorotlenek wapnia Ca(OH)2, w czasie 30-50 min, utrzymując stan równowagi substratów aż do wyczerpania i wytrącenia osadu z nanometrycznej wielkości cząstkami krystalicznymi hydroksyapatytu, po czym osad oczyszcza się przez wielokrotne odwirowanie z prędkością 3500-4000 rpm w czasie 2 do 5 min przemiennie z przemywaniem wodą dejonizowaną, o przewodności ~0,05 pS, do uzyskania odczynu obojętnego, i poddaje suszeniu w czasie od 24 do 72 godzin w temperaturze nie wyższej niż 90°C.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że prowadzi się kalcynację osadu z cząstkami krystalicznymi hydroksyapatytu w atmosferze powietrza, a ogrzewanie zachodzi z szybkością od 5°C/min do 10°C/min do temperatury z zakresu od 700°C do 1200°C, następnie przetrzymuje w maksimum temperatury z tego zakresu od 700°C do 1200° w czasie od 30 min do 2 h, po czym chłodzi z szybkością od 5°C/min do 10°C/min do temperatury pokojowej z wytworzeniem nanometrycznych kulistych cząstek hydroksyapatytu, które korzystnie rozdrabnia się do uzyskania powierzchni właściwej ziaren 0,33 m²/g.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w roztworze reakcyjnym jako źródło jonów wapnia Ca²⁺ zamiast wodorotlenku wapnia Ca(OH)2 stosuje się azotan wapnia lub węglan wapnia lub octan wapnia lub tlenek wapnia.
5. 5. Sposób według zastrz. 2 albo 4 znamienny tym, że w roztworze reakcyjnym jako źródło jonów ortofosforanowych (PO4^3-) zamiast kwasu ortofosforowego (H3PO4) stosuje się jego sole takie jak ortofosforan amonu, ortofosforan potasu, ortofosforan sodu lub wodorosole kwasu ortofosforowego, takie jak diwodorofosforan amonu, wodorofosforan diamonu, diwodorofosforan potasu, wodorofosforan dipotasu, diwodorofosforan sodu, wodorofosforan disodu.
6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się wodę amoniakalną w roztworze 25% w ilości wymaganej do ustalania wartości pH wodnego roztworu reakcyjnego w zakresie 9 do 11.
7. 7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że, nanometryczne cząstki hydroksyapatytu o kulistej morfologii mają po wysuszeniu wielkość w zakresie od 36,50 nm do 49,5 nm.
8. 8. Zastosowanie syntetycznego bioaktywnego materiału hydroksyapatytowego, otrzymanego sposobem według zastrz. 2 do 7 do materiałów implantacyjnych tkanki kostnej, jako biozgodny materiał bioceramiczny wykazujący właściwości osteoindukcyjne.