PL249260B1

PL249260B1 - Mieszanina 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonu i nanocząstek srebra oraz zastosowanie mieszaniny jako środka przeciwbakteryjnego do zwalczania Pseudomonas aeruginosa

Info

Publication number: PL249260B1
Application number: PL437292A
Authority: PL
Inventors: Marta Krychowiak-Maśnicka; Aleksandra Królicka; Ewa Paluszkiewicz; Aleksandra Bielicka-Giełdoń
Original assignee: Uniwersytet Gdański; Politechnika Gdańska
Priority date: 2021-03-13
Filing date: 2021-03-13
Publication date: 2026-03-16
Also published as: PL437292A1

Abstract

Mieszanina zawierająca srebro w postaci cząstek srebra i 1,4-naftochinon, charakteryzująca się tym, że zawiera działającą bakteriobójczo wobec Pseudomonas aeruginosa dawkę nanocząstek srebra oraz 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonu. Zgłoszenie obejmuje też zastosowanie przedmiotowej mieszaniny jako środka przeciwbakteryjnego wobec Pseudomonas aeruginosa, korzystnie do zastosowania na skórę lub rany.

Description

Wynalazek dotyczy sposobu aktywacji właściwości bakteriobójczych 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonu, zwanego droseronem, wobec naturalnie opornej pałeczki ropy błękitnej Pseudomonas aeruginosa za pomocą nanocząstek srebra, a tym samym za pomocą mieszaniny tych czynników. Wynalazek dotyczy również medycznego zastosowania mieszaniny do zwalczania P. aeruginosa oraz zastosowania tej mieszaniny jako środka o działaniu przeciwbakteryjnym, zwłaszcza do stosowania zewnętrznie, np. na skórę lub rany.

Zjawisko antybiotykoodporności mikroorganizmów, tj. zdolność do namnażania się w obecności antybiotyku, jest coraz powszechniejszym problemem, z którym musi mierzyć się medycyna. Wraz z rosnącą liczbą drobnoustrojów wykazujących oporność na coraz większy zakres antybiotyków, zmniejsza się pula możliwych terapii stosowanych w leczeniu zakażeń, a tym samym rośnie zagrożenie zdrowia i życia ludzkiego. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) i Amerykańskie Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorób (CDC) wskazują w swoich najnowszych raportach, że w związku z nastąpieniem ery postantybiotykowej niezbędne jest zastosowanie zrównoważonych strategii prewencji i leczenia chorób zakaźnych [1,2].

Pseudomonas aeruginosa jest gram-ujemną bakterią oraz oportunistycznym patogenem człowieka i zwierząt, charakteryzującym się znaczącą wirulencją. P. aeruginosa wykazuje naturalną oporność na wiele cząsteczek chemicznych, które są aktywne wobec innych patogenów [3]. W przypadku infekcji ran oparzeniowych P. aeruginosa jest jednym z najczęściej izolowanych gatunków bakterii i stanowi szczególny problemem w ich leczeniu ze względu na wielolekooporność ograniczającą możliwości terapeutyczne [4]. Poza antybiotykami, w terapiach ran oparzeniowych z dużym powodzeniem stosowane jest srebro jonowe, tj. azotan srebra i sulfadiazyna srebra [5]. Niemniej jednak, coraz częściej obserwowane jest zjawisko nabywania oporności na preparaty zawierające srebro przez patogeny infekujące rany [6]. Niezbędne jest więc opracowanie strategii umożliwiających opóźnienie lub zniesienie wykształcania bakteryjnej oporności oraz rozszerzenie możliwości terapeutycznych.

Znane jest działanie samych związków z grupy 1,4-naftochinonów wobec niektórych bakterii gram-dodatnich i grzybów [7]. Niemniej jednak, bakterie gram-ujemne wykazują umiarkowaną oporność na 1,4-naftochinony, w tym użyty 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon lub pozostają na nie całkowicie oporne jak w przypadku P. aeruginosa [3].

Niniejszy wynalazek opiera się na zjawisku przywrócenia wrażliwości opornych komórek mikroorganizmu na cząsteczki związku chemicznego dzięki zastosowaniu w mieszaninie drugiego czynnika pełniącego funkcję substancji uwrażliwiającej.

Opracowana według wynalazku mieszanina jest przykładem systemu dwuskładnikowego, w którym wykorzystuje się interakcję czynników do zwiększenia ich potencjału biologicznego w oparciu o zjawisko aktywacji i synergii.

Według wynalazku dobrano jeden rodzaj 1,4-naftochinonu w zastosowaniu w mieszaninie wykazując oczekiwane działanie wobec opornego szczepu bakterii.

Wynalazek dotyczy sposobu aktywacji właściwości bakteriobójczych 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonu, tj. droseronu, wobec naturalnie opornej pałeczki ropy błękitnej, tj. Pseudomonas aeruginosa, za pomocą srebra w danej formie - nanocząstek srebra.

Istotą wynalazku jest mieszanina zawierająca srebro w postaci cząstek srebra i 1,4-naftochinon charakteryzująca się tym, że zawiera nanocząstki srebra w stężeniu od 4 do 8 μg Ag/mL, które stabilizowane są kwasem 11-merkaptoundekanowym, oraz 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon w dawce od 32 do 64 μg/m.

Korzystniej zawiera sferyczne nanocząstki srebra o średniej wielkości 5 nm.

Wynalazek dotyczy również medycznego zastosowania mieszaniny do zwalczania P. aeruginosa oraz zastosowania tej mieszaniny jako środka o działaniu przeciwbakteryjnym do stosowania zewnętrznie, tj. na skórę lub rany.

Mieszanina według wynalazku zawiera nanocząstki srebra oraz 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon, zwany droseronem. Wykazany mechanizm oddziaływań nanocząstek srebra i droseronu stanowi specyficzne dla związków z grupy 1,4-naftochinonów zjawisko o wysokim potencjale do zwalczania jednego z najgroźniejszych patogenów bakteryjnych człowieka - P. aeruginosa.

W przykładzie realizacji wynalazku opisano, że mieszanina zawiera sferyczne nanocząstki srebra o średniej wielkości 5 nm stabilizowane kwasem 11-merkaptoundekanowym w stężeniu równym lub wyższym niż 4 μg Ag/mL oraz 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon w stężeniu równym lub wyższym niż 32 μg/mL. Zawiera minimalną dawkę obu składników działającą bakteriobójczo wobec P. aeruginosa występującego w stężeniu około 2,5 x 10⁵ jednostek tworzących kolonie (JTK)/mL, co oznacza, że dawka ta redukuje o 99,9% liczbę komórek bakteryjnych, tj. do co najmniej 2,5 x 10² JTK/mL.

Wynalazek opisano bliżej w przykładzie potwierdzającym efektywność mieszaniny i zastosowanie. W przykładzie opisano mieszaninę zawierającą droseron i sferyczne nanocząstki srebra o średniej wielkości 5 nm stabilizowane kwasem 11-merkaptoundekanowym. Wykazano, że sam ten naftochinon nie działa na referencyjny szczep bakterii P. aeruginosa, tj. jego MBC jest wyższe niż 512 μg/mL.

Fig. 1 pokazuje schemat syntezy 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonu (droseronu). (1) 2,3-epoksy-5-hydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon. (2) 3-chloro-5-hydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon. (3) 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon.

Fig. 2 pokazuje strukturę chemiczną droseronu, tj. 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonu.

Fig. 3 pokazuje zmiany minimalnych stężeń bakteriobójczych droseronu i preparatu nanocząstek srebra stabilizowanych kwasem 11-merkaptoundekanowym (AgC10COOH) zastosowanych jednocześnie wobec P. aeruginosa ATCC 27853.

Przykład 1

Znoszenie oporności Pseudomonas aeruginosa na 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon za pomocą nanocząstek srebra.

W badaniach wykorzystano gotowy preparaty sferycznych nanocząstek srebra (AgNPs) stabilizowanych kwasem 11-merkaptoundekanowym (AgCwCOOH) o średniej wielkości rdzenia metalicznego 5 nm (Prochimia Surfaces Sp. z o.o.). Stężenie srebra w preparatach ustalono za pomocą analizy pierwiastkowej z wykorzystaniem techniki optycznej spektrometrii emisyjnej w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-OES). Działanie spektrometru optycznego ICP-OES (Perkin Elmer ICP-OES Optima 2000 DV) było optymalizowane przed każdą serią pomiarów. Preparat nanocząstek srebra rozcieńczano wstępnie 10-krotnie za pomocą wody destylowanej. Następnie do 250 μL przygotowanej zawiesiny dodawano 1 mL kwasu azotowego cz.d.a. (65%), a następnie uzupełniano wodą demineralizowaną do objętości 5 mL. Następujące parametry spektrometru ICP-OES zostały wykorzystane podczas analiz: moc generatora 1300 W, częstotliwość generatora 40 MHz; demontowalny palnik kwarcowy; osiowy widok plazmy; gaz argon (Ar): przepływ gazu plazmowego 15,0 L/min, przepływ gazu wspomagającego 0,2 L/min; przepływ gazu w rozpylaczu 0,8 L/min; szklana cykloniczna komora rozpylająca; prędkość przepływu próbki: 1,5 L/min. Pomiarów stężenia jonów srebra (Ag+) dokonywano przy długości fali 328,068 nm w 3 powtórzeniach.

Związek 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon (droseron) został zsyntezowany zgodnie z metodą przedstawioną poniżej, która została przedstawiona na Fig. 1. Struktury chemiczne produktów reakcji zostały potwierdzone metodą spektralną - protonowym rezonansem magnetycznym, a czystość związków sprawdzana była przy użyciu metody TLC. Układ chromatograficzny - 10:1 heksan:octan etylu. Widma ¹H NMR zostały wykonane na spektrometrze Varian VXR-S pracującym przy 500 MHz. Przesunięcia chemiczne podano w jednostkach δ w ppm w dół pola od wewnętrznego tetrametylosilanu. Użyte skróty w opisach widm 1H NMR są następujące: br.s-szeroki sygnał, s-singlet, d-dublet, dd-dublet dubletów, t-triplet, k-kwartet i m-multiplet.

g 5-hydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon rozpuszczono w 250 ml zimnego etanolu i dodano do roztworu nadboranu sodu (2,5 g) w 270 ml wody. Reakcję prowadzono przez 2 minuty, doprowadzając roztwór do pH 5 za pomocą 1M H2SO4. Następnie wytrząsano nasyconym roztworem NaCl i eterem naftowym (3-krotnie). Warstwę organiczną wysuszono za pomocą Na2SO4 i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty reakcji 2,3-epoks-5-hydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon (1) oczyszczono stosując chromatografię kolumnową. Eluent startowy heksan : octan etylu (50:1), następnie 20:1.

Produkt pośredni - 2,3-epoksy-5-hydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon (1): wydajność 50%.

¹H NMR (CDCI3, 500 MHz): 1,75 (3H, s); 3,84 (1H, s); 7,28-7,30 (1H, m); 7,60-7,62 (1H, m); 7,66 (1H, t, J=7,8Hz); 11,22 (1H, s).

Produkt uboczny - 3-chloro-5-hydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon, tj. 3-chloroplumbagina (2): wydajność 10% ¹H NMR (CDCI3, 500 MHz): 2,38 (3H, s); 7,30-7,32 (1H, m); 7,65-7,72 (2H, m); 11,80 (1H, s).

Następnie 0,1 g (0,49 mmol) 2,3-epoksyplumbaginy (1) rozpuszczono w 1 ml zimnego stężonego H2SO4. Roztwór pozostawiono na 5 minut. Po tym czasie ponownie dodano zimny, stężony kwas siarkowy (1,2 ml) i mieszano przez 10 minut. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 8 ml H2O. Tworząc się osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono. W celu otrzymania czystego produktu zastosowano chromatografię kolumnową. Fazę ruchomą stanowił chloroform. Otrzymano 0,35 mg (wydajność 30%) żądanego produktu, który zidentyfikowano za pomocą 1H NMR.

Produkt reakcji - 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon (3): wydajność 30% ¹H NMR (CDCle, 500 MHz): 2,12 (3H, s); 7,22 (1H, d, J=7,32Hz)); 7,29 (1H, s); 7,63-7,69 (2H, m); 11,13 (1H, s).

Działanie bakteriobójcze nanocząstek srebra AgCwCOOH i droseronu (Fig. 2) stosowanych osobno badano wobec referencyjnego szczepu P. aeruginosa ATCC 27853 za pomocą znanej metody mikrorozcieńczeń pożywki jak opisano w: Krychowiak M, Kawiak A, Narajczyk M, Borowik A, Królicka A: Silver Nanoparticles Combined With Naphthoquinones as an Effective Synergistic Strategy Against Staphylococcus aureus. Front Pharmacol 2018, 9:816. W pierwszej kolejności w pożywce Mueller-Hinton suplementowanej kationami (CA-MHB, Beckton Dickinson) przygotowywano roztwory badanych czynników za pomocą seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń.

Opis przygotowania mieszaniny

Na potrzeby eksperymentu mieszaniny przygotowywano w pożywce mikrobiologicznej, niemniej jednak mieszaninę można przygotować również w wodzie lub wodnych roztworach, np. soli fizjologicznej. Zatężone wodne zawiesiny nanocząstek srebra po oznaczeniu zawartości srebra (Ag) dodawano bezpośrednio do pożywki CA-MHB do końcowego stężenia wynoszącego 128 μg Ag/mL, a następnie wykonywano seryjne dwukrotne rozcieńczenia w pożywce do uzyskania mieszaniny o stężeniu 64, 32, 16, 8, 4, 2 lub 1 μg Ag/mL.

W przypadku droseronu (Fig. 2) przed dodaniem do pożywki przygotowywano jej skoncentrowane roztwory w dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierające 51,2 mg związku w 1 mL. W celu wykonania eksperymentu tak przygotowane roztwory dodawano do pożywki do końcowego stężenia 512 μg/mL, tj. w objętości 10 μL do 0,99 mL, a następnie wykonywano seryjne dwukrotne rozcieńczenia w pożywce do uzyskania roztworów stężeniu 256, 128, 64, 32, 16, 8 lub 4 μg/mL. Z przygotowanych mieszanin AgCwCOOH roztworów droseronu w pożywce pobierano po 100 μL i przenoszono do studzienek 96-dołkowej płytki mikrotestowej do badania aktywności bakteriobójczej poszczególnych czynników. W procedurze badania interakcji nanocząstek srebra i 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonu wykorzystano podejście Checkerboard Titration, które opisano również w: Krychowiak M, Kawiak A, Narajczyk M, Borowik A, Królicka A: Silver Nanoparticles Combined With Naphthoquinones as an Effective Synergistic Strategy Against Staphylococcus aureus. Front Pharmacol 2018, 9:816, polegające na jednoczesnym zastosowaniu dwóch badanych czynników na płytce mikrotestowej, gdzie każdy czynnik jest stosowany w następującym gradiencie stężeń w pożywce: 2 x MBC, 1 x MBC, 0,5 x MBC, 0,25 x MBC, 0,125 x MBC, 0,06 x MBC i 0,03 x MBC, gdzie MBC jest minimalnym stężeniem bakteriobójczym (MBC, ang. Minimal Bactericidal Concentration). Tym sposobem każdy dołek płytki mikrotestowej zawiera unikalną kombinację stężeń badanych czynników. W przypadku związków lub c zynników nie wykazujących aktywności bakteriobójczej, tak jak ma to miejsce w przypadku droseronu, stosuje się gradient stężeń rozpoczynający się od najwyższego możliwego do uzyskania stężenia związku, tj. najczęściej 512, 256, 128, 64, 32, 16 i 8 μg/mL. W przypadku nanocząstek srebra gradient stężeń zastosowanych w eksperymencie był następujący: 16, 8, 4, 2, 1,0,5 i 0,25 μg Ag/mL.

Mieszaniny przygotowywano w taki sposób, że zatężone wodne zawiesiny nanocząstek srebra po oznaczeniu zawartości srebra (Ag) dodawano bezpośrednio do pożywki CA-MHB do końcowego stężenia wynoszącego 32 μg Ag/mL, a następnie wykonywano seryjne dwukrotne rozcieńczenia w pożywce do uzyskania mieszanin o stężeniu 16, 8, 4, 2, 1 oraz 0,5 μg Ag/mL. Przed dodaniem do pożywki droseronu przygotowywano jej skoncentrowane roztwory w dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierające 51,2 mg związku w 1 mL. W celu wykonania eksperymentu tak przygotowane roztwory dodawano do pożywki do końcowego stężenia 1024 μg/mL, tj w objętości 20 μL do 0,98 mL, a następnie wykonywano seryjne dwukrotne rozcieńczenia w pożywce do uzyskania roztworów o stężeniu 512, 256, 128, 64, 32 oraz 16 μg/mL. Następnie mieszaniny przygotowano przez połączenie zawiesin nanocząstek i roztworów droseronu w stosunku objętościowym 1:1.

Następnie do studzienek zawierających po 100 μL zawiesin, roztworów lub mieszaniny w pożywce dodawano 10 μL inokulum bakteryjnego zawierającego ok. 2,5 x 10⁵ jednostek tworzących kolonie (JTK) w 1 mL. Inokulum otrzymywano przez rozcieńczenie 6-godzinnej hodowli bakteryjnej (CA-MHB, 37°C, 150 rpm) w świeżej pożywce CA-MHB do uzyskania zmętnienia równego 0,5 stopni w skali McFarlanda mierzonego za pomocą densytometru (DensiMeter II, EMO). Płytki mikrotestowe

PL 249260 Β1 inkubowano przez 24 godziny w 37°C, po czym zawartość dołków, w których obserwowano zahamowanie wzrostu bakterii, wysiewano na agar odżywczy TSA (ang. Tryptic Soy Agar; BTL Polska Sp. z o.o.). Tak przygotowane szalki z agarem inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C w celu zliczenia komórek bakteryjnych (JTK) pozostałych w dołkach po traktowaniu czynnikiem, a tym samym ustalenia minimalnego stężenia bakteriobójczego badanych czynników - MBC. Stężenie MBC definiowano jako najniższe stężenie czynnika redukujące w ciągu 24 godzin wyjściową liczbę JTK w dołku (ok. 2,5 x 10⁵ JTK/mL) o 99,9%, tj. o 3 logarytmy‘(ok. 2,5 x 10² JTK/mL).

Jak wskazano w Tabeli 1, droseron nie wykazuje aktywności bakteriobójczej wobec P. aeruginosa (MBC >512 pg/mL). Niemniej jednak, zastosowanie droseronu w połączeniu z nanocząstkami srebra AgCioCOOH (MBC = 8 pg Ag/mL) skutkowało uzyskaniem efektu bakteriobójczego przyjej stężeniu równym 32 pg/mL i stężeniu nanocząstek odpowiadającym 4 pg Ag/mL (Tabela 1, Fig. 3). Powyższe wyniki wskazują, że srebro efektywnie współdziała z droseronem, tj. 3,5-dhydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonem, znosząc oporność P. aeruginosa na ten związek. Pozwala to osiągnąć efekt bakteriobójczy mieszaniny przy znacząco zredukowanym stężeniu preparatu srebra (nawet do 50%) i stężeniu droseronu do 32 pg/mL. Pozwala to na szeroki zakres możliwości modulowania i aktywności biologicznej obu czynników oraz optymalizacji składu mieszaniny.

Tabela 1. Stężenia droseronu (3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinonu) i nanoczastek srebra w mieszaninach w pożywce CA-MHB warunkujące efekt bakteriobójczy wobec szczepu referencyjnego P. aeruginosa ATCC 27853.

Droseron (pg/mL)	AgCioCOOH (pg Ag/mL)
>512	0
512	1
256	2
128	2
64	4
32	4
16	8
8	8
0	8

AgCioCOOH - nanocząstki srebra stabilizowane kwasem 1 1-merkaptoundekanowym. Ag, jony srebra.

Bibliografia:

1. CDC, Antibiotic Resistance Threats in the United States, 2019. 2019, U.S. Department of Health and Human Services: Atlanta, GA.

2. WHO, 2019. ANTIBACTERIAL AGENTS IN CLINICAL DEVELOPMENT: an analysis of the antibacterial clinical development pipeline. 2019, WHO: Geneva, Switzerland.

3. Coban, A.Y. i in., Effects of efflux pump inhibitors phenyl-arginine-beta-naphthylamide and 1-(1-naphthylmethyl)-piperazine on the antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients. J Chemother, 2009. 21(5): p. 592-4.

4. Church, D. i in. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev, 2006. 19(2): p. 403-34.

5. Atiyeh, B.S. i in., Effect of silver on burn wound infection control and healing: review of the literature. Burns, 2007. 33(2): p. 139-48.

6. Percival, S.L., Bowler P.G. i Russell D. Bacterial resistance to silver in wound care. J Hosp Infect, 2005. 60(1): p. 1-7.

7. Widhalm J.R. i Rhodes D. Biosynthesis and molecular actions of specialized 1,4-naphthoquinone natural products produced by horticultural plants. Hortic Res, 2016, 3: 16046.

Claims

1. Mieszanina zawierająca srebro w postaci cząstek srebra i 1,4-naftochinon, znamienna tym, że zawiera nanocząstki srebra w stężeniu od 4 do 8 μg Ag/mL, które stabilizowane są kwasem 11-merkaptoundekanowym, oraz 3,5-dihydroksy-2-metylo-1,4-naftochinon w dawce od 32 do 64 μg/m.

2. Mieszanina według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sferyczne nanocząstki srebra o średniej wielkości 5 nm.

3. Mieszanina opisana w zastrz. 1 do zastosowania jako środek przeciwbakteryjny wobec Pseudomonas aeruginosa, korzystnie do zastosowania na skórę lub rany.