PL249105B1 - Układ mikroprzepływowy z zintegrowanym światłowodem jednomodowym - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest układ mikroprzepływowy z zintegrowanym światłowodem jednomodowym zawierający moduł hydrodynamicznego ogniskowania przestrzennego, moduł sortowania, charakteryzujący się tym, że moduł hydrodynamicznego ogniskowania przestrzennego, zawierający kanał główny (109), który to kanał ma koniec pierwszy i koniec drugi, koniec pierwszy kanału głównego (109) zawiera wloty do wprowadzania cieczy osłonowej (101, 103, 104, 105) i wlot do wprowadzania cieczy próbki (102), przy czym wloty (101, 102, 103, 104, 105) zorientowane są względem kanału głównego (109) pod kątem prostym, i wlot wprowadzania cieczy próbki (102) znajduje się pomiędzy wlotami wprowadzania cieczy arkuszowej (101, 103) i wloty do wprowadzania cieczy arkuszowej (104, 105) łączą się z pierwszym końcem kanału głównego (108) poprzez pierwsze kanały boczne (106, 107) i koniec drugi kanału głównego (109) łączy się z wylotami (113, 114) poprzez kanały wyjściowe (111, 112) i pomiędzy pierwszym i drugim końcem kanału głównego (109) znajduje się moduł sortujący (117) i z drugim końcem kanału głównego (109), pomiędzy kanałami wyjściowymi (111, 112) połączony jest kanał światłowodu (115) do wprowadzania światłowodu (116), definiując strefę detekcji (110).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest układ mikroprzepływowy z wbudowanym światłowodem jednomodowym, który służy do ciągłego dostarczania komórek w roztworze wodnym do miejsca pomiaru (obrazowanie), ich zatrzymywania w tym miejscu na czas pomiaru (obrazowanie lub akwizycja i obróbka sygnału), a następnie do ich sortowania na podstawie analizowanego sygnału do jednego z kanałów wyjściowych.

Obecne metody diagnostyki białaczki opierają się na genetycznym mapowaniu komórek, które jest skomplikowane, czasochłonne i podatne na błędy. Opracowano metody alternatywne, z których jedną z najbardziej obiecujących jest spektroskopia ramanowska, oferująca nieinwazyjną, unikalną identyfikację cząsteczek i pojedynczych komórkach.

Spektroskopia ramanowska dostarcza szczegółowych informacji o cząsteczkach na podstawie stanów wibracyjnych. Ponieważ wykrywalny sygnał Ramana jest zwykle bardzo słaby, a zatem właściwa detekcja i identyfikacja wymaga długiego czasu akwizycji, opracowano kilka ulepszeń oryginalnej metody (znanej jako spontaniczna spektroskopia Ramana).

Jedną z najbardziej obiecujących, znacznie zwiększającą wzmocnienie sygnału, a tym samym skracającą czas detekcji, jest stymulowana spektroskopia ramanowska (SRS). Podstawowy mechanizm przypomina spontaniczną spektroskopię Ramana: foton pompujący o częstotliwości kątowej ωp, który jest rozpraszany przez cząsteczkę, ma niewielkie prawdopodobieństwo wywołania pewnego przejścia wibracyjnego (lub obrotowego), w przeciwieństwie do prostego przejścia Rayleigha. Powoduje to, że cząsteczka emituje foton o zmienionej częstotliwości. Jednak SRS, w przeciwieństwie do spontanicznej spektroskopii ramanowskiej, jest zjawiskiem nieliniowym trzeciego rzędu z udziałem drugiego fotonu fotonu Stokesa o częstotliwości kątowej ωs - który stymuluje określone przejście. Kiedy różnica częstotliwości między obydwoma fotonami (ωp - ωs) przypomina określoną zmianę wibracyjną (lub rotacyjną) (ωv), występowanie tego przejścia jest rezonansowo wzmocnione. W SRS sygnał jest równoważny zmianom natężenia pompy i wiązek Stokesa.

Jednym z krytycznych wymagań dla prawidłowej akwizycji sygnałów Ramana jest to, aby próbka pozostawała w spoczynku w skupionej wiązce lasera pompującego (w punkcie detekcji). W przypadku identyfikacji pojedynczych komórek, które wymagają zawieszenia w płynnym ośrodku, oznacza to, że podczas pomiaru komórki muszą być unieruchomione, ale bez dotykania komórek, a nawet zbliżania się do nich z obiektem zewnętrznym (co mogłoby wpłynąć na sygnał). Metody nieinwazyjne obejmują pułapki optyczne, akustyczne lub dielektroforetyczne. Pułapki optyczne zaproponowane i opracowane przez Ashkina w latach 70. przeszły długą drogę i do dziś stały się powszechną metodą manipulowania małymi przedmiotami, od pojedynczych atomów i cząsteczek, po cząsteczki i organizmy żywe o wielkości kilkudziesięciu mikrometrów.

Podstawową zasadą pęsety optycznej jest przenoszenie pędu związane z uginaniem światła. Światło (foton) ma pęd, który jest proporcjonalny do jego energii i kierunku rozchodzenia się. Każda zmiana kierunku światła, spowodowana odbiciem lub załamaniem, spowoduje zmianę pędu światła. Jeśli przezroczysty obiekt dielektryczny (np. mikrocząstka lub komórka) ugina światło, zmieniając jego pęd, zachowanie pędu wymaga, aby obiekt przeszedł równą i przeciwną zmianę pędu. Powoduje to powstanie siły działającej na obiekt.

W typowej konfiguracji pęsety optycznej światło przychodzące pochodzi z lasera, który ma profil intensywności Gaussa (światło w środku wiązki jest jaśniejsze niż światło na krawędziach), a wiązka lasera jest skupiana przez wysokiej jakości obiektyw mikroskopu do miejsca w płaszczyźni e próbki. Ta plamka tworzy „pułapkę optyczną”, która jest w stanie zatrzymać małą cząsteczkę w jej środku.

Sumę sił można podzielić na dwie składowe: 1. siłę rozpraszania, skierowaną w kierunku padającego światła) oraz 2. siłę gradientu, wynikającą z gradientu profilu natężenia Gaussa i skierowaną w płaszczyźnie xy w kierunku środek wiązki. Siła gradientu jest siłą przywracającą, która wciąga stopkę do środka. Jeśli udział promieni załamanych w sile rozpraszania jest większy niż promieni odbitych, wówczas wzdłuż osi z powstaje również siła przywracająca, tworząc stabilną pułapkę.

Dostępne na rynku pincety optyczne i pułapki optyczne polegają głównie na ogniskowaniu i prowadzeniu wiązki lasera pułapkującego przez obiektyw mikroskopu, który jest nieporęczny i kosztowny. Wraz z postępem w rozwoju i zastosowaniu światłowodów zaproponowano światłowodowe rozwiązania do pęsetowania/chwytania lub przemieszczania komórek i mikrocząstek za pomocą sił optycznych wykorzystujące albo (i) pojedyncze włókno światłowodowe, gdzie końcówka światłowodu jest modyfiko wana w celu uzyskania skupienia wiązki i stworzenia pułapki optycznej albo (ii) dwa wzajemnie przeciwstawne włókna światłowodowe, z niezmodyfikowanymi końcówkami, które dzięki temu emitują rozbieżną wiązkę laserową, która „odpycha” mikrocząsteczki lub komórki. Umieszczenie dwóch włókien z końcówkami skierowanymi do siebie i wyrównanymi osiami optycznymi tworzy pułapkę w kształcie podwójnego stożka. Dokładne wyrównane osi optyczne ma jednak kluczowe znaczenie, ponieważ rdzeń włókien emitujących światło jest bardzo mały (zwykle 5-10 μm), więc kilka mikrometrów niewspółosiowości może spowodować, że pułapka nie zostanie utworzona.

Dla porównania, przy użyciu dostępnej na rynku pęsety optycznej typowym pomiarze próbkę (cząstki, komórki lub molekuły w ciekłym ośrodku) umieszcza się na szkiełku mikroskopowym (opcjonalnie przykrytym szkiełkiem nakrywkowym) i łapie interesujące cząstki poprzez przesuwanie stolika mikroskopu względem wiązki laserowej która jest prostopadła do płaszczyzny szkiełka podstawowego (stolika mikroskopu).

Z dostępnymi pincetami optycznymi, które wykorzystują techniki mikroprzepływowe i kontrolę przepływu próbka może być doprowadzona do punktu detekcji (w kierunku x). Jednak w takich układach włókna światłowodowe układane są prostopadle do kierunku przepływu (kierunek y), a obserwacja/detekcja przez mikroskop odbywa się wzdłuż osi z. Zaproponowane przez nas rozwiązanie polega na dostarczaniu komórek (lub innych mikroskopijnych obiektów) do punktu detekcji jedną po drugiej, łapaniu ich i utrzymywaniu tam przez dowolny czas (na czas akwizycji sygnału), a następnie uwalnianiu i sortowaniu (np. na podstawie pozyskanego i przeanalizowanego sygnału SRS) jest nowatorski i unikalny poprzez (i) ułożenie pojedynczego światłowodu jednomodowego z niezmodyfikowaną końcówką (tylko ściętą prosto) równolegle do przepływu i końcówką skierowaną w kierunku przeciwnym do przepływu, a w konsekwencji (ii) na zasadzie pułapkowania i manipulowania komórkami lub innymi obiektami wielkości mikronów), mianowicie poprzez równoważenie ciśnienia promieniowania optycznego (a dokładniej siły rozpraszania optycznego rozbieżnej jednomodowej wiązki gaussowskiej) i ciśnienia hydrodynamicznego (tzn. siła oporu lepkiej cieczy, w której zawieszone są komórki lub mikrocząstki) w mikrokanalikach.

Z publikacji Intelligent image-activated cell sorting 2.0 (Akihiro Isozaki et al., Lab Chip, 2020) znany jest układ mikroprzepływowy, który służy do ciągłej analizy komórek biologicznych bez ich zatrzymywania w kanale mikroprzepływowym, a następnie do ich rozdzielania za pomocą lokalnej kontroli przepływu przez pompy hydrodynamiczne.

W publikacji Microfluidic device for continuous single cell analysis via Raman spectroscopy enhanced by integratedplasmonic nanodimers (Gerardo Perozziello, Patrizio Candeloro, Antonio De Grazia i inni, Optics Express, 2016) opisano układ mikroprzepływowy do ciągłej analizy komórek przy użyciu spektroskopii ramanowskiej techniką, w której komórki biologiczne są dostarczane do miejsca pomiaru kanałem mikroprzepływowym, a komórki są zatrzymywane na czas pomiaru poprzez zablokowanie kanału komórką w miejscu zwężenia kanału, a sam kanał ma jedno wejście dla komórki wejściowe i jedno wyjście.

W publikacji Flow-dependent optofluidic particle trapping and circulation, (Thomas Blakely, Reuven Gordon i David Sinton, Lab Chip, 2008) opisują płaskie układy mikroprzepływowe z wbudowanymi światłowodami do wychwytywania cząstek w kanale układu mikroprzepływowego, który jest skonstruowany w taki sposób, że światłowód znajduje się w płaszczyźnie kanału mikroprzepływowego, a przepływ cząstek jest skierowany w kierunku przeciwnym do sił rozpraszania światła dostarczanego do układu przez światłowód. Jednocześnie światłowody z soczewkami wykonanymi na końcach i ściętymi pod kątem prostym służą do uwięzienia i przytrzymania komórek. Zastosowanie tego drugiego rozwiązania jest technicznie prostsze, ale ze względu na mniejszy gradient siły optycznej cząstki muszą być dostarczane do pęsety optycznej jak najbliżej jej osi optycznej.

Żeby zmaksymalizować liczbę przechwyconych komórek, konieczne jest zogniskowanie ich w środku przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego. Z publikacji Universally applicable three-dimensional hydrodynamic focusing in a single-layer channel for single cell analysis (Yingying Zhao, Qin Li, Xiaoming Hu, Analytical Methods, 2018) znana jest metoda ogniskowania komórek w jednowarstwowym kanale mikroprzepływowym .

W chińskim opisie patentowym CN110918142B przedstawiono urządzenie, w którym poprzez odkształcenie powierzchni elementów mikrofluidycznych można sterować selektywnie kierunkiem przepływu.

Natomiast patent amerykański US11512691B2 dotyczy układu mikrofluidycznego, w którym składniki mieszaniny płynów w próbce są ukierunkowywane i izolowane poprzez dwuetapowe ogniskowanie, w którym płyny arkuszowe ściskają mieszaninę płynów w kanale wejściowym próbki w jednym kierunku, tak że mieszanina płynów staje się węższym strumieniem ograniczonym przez płyny arkuszowe, oraz poprzez ściskanie mieszaniny płynów w drugim kierunku, dalej w dół, tak że składniki są ściskane i ukierunkowywane w wybranym kierunku, aby przejść przez komorę do analizy w postaci pojedynczego zbioru w celu identyfikacji i rozdzielenia różnymi metodami. Inny patent amerykański US11446665 opisuje układ mikroprzepływowy posiadający mikrokanał do przetwarzania próbki. Mikrokanał może ogniskować próbkę za pomocą płynu ogniskującego i geometrii tworzącej strumień rdzeniowy. Geometria formowania strumienia rdzeniowego może obejmować boczny element skupiający płyn oraz jeden lub więcej pionowych elementów skupiających płyn. Układ mikrofluidyczny może zawierać wiele mikrokanałów działających równolegle na układzie mikrofluidycznym.

W amerykańskim zgłoszeniu patentowym US20060171846A1 ujawniono układ mikroprzepływowy zawierający zintegrowane falowody optyczne, które można wykorzystać do optycznego pułapkowania cząstek takich jak komórki przepływające przez układ. Falowody w tych układach mogą być tak rozmieszczone, aby tworzyły pułapki optyczne, które mogą być wykorzystywane do zasilania pomp i zaworów w układach mikrofluidycznych, do wychwytywania i analizowania cząstek w tych układach oraz do sortowania wychwyconych cząstek do różnych kanałów przepływu mikrofluidalnego. W innym amerykańskim zgłoszeniu patentowym US20090239250A1 opisano sposób analizy i uzyskiwania wiarygodnych danych dotyczących błony plazmatycznej pojedynczych komórek, przy użyciu mikroprzepływowego analizatora komórek. Mikrofluidyczny analizator komórek według wynalazku składa się z pułapki na pojedyncze komórki, manipulatora ustawionego na manipulowanie zewnętrzną powierzchnią komórki w pułapce, strefy detekcji w komunikacji z pułapką na pojedyncze komórki oraz detektora. W kolejnym amerykańskim zgłoszeniu patentowym US20140220557A1 przedstawiono urządzenie i sposób do rozdzielania cząstek. Urządzenie zawiera co najmniej jedno źródło światła kolimowanego, które może generować co najmniej jedną wiązkę światła kolimowanego. Urządzenie zawiera ponadto pierwszy kanał w pierwszej płaszczyźnie i dyszę zogniskowanego strumienia cząstek połączoną operacyjnie z pierwszym kanałem. Urządzenie zawiera również drugi kanał w drugiej płaszczyźnie, ortogonalnej do pierwszej płaszczyzny. Drugi kanał komunikuje się z pierwszym kanałem. Drugi kanał ma drugi przekrój poprzeczny. Drugi kanał jest zorientowany na odbiór skolimowanej wiązki źródła światła. Urządzenie zawiera ponadto trzeci kanał w trzeciej płaszczyźnie ortogonalnej do drugiej płaszczyzny. Trzeci kanał komunikuje się z drugim kanałem. Skolimowana wiązka źródła światła jest zorientowana tak, aby weszła w przekrój poprzeczny pierwszego kanału, następnie przeszła przez drugi kanał, a następnie weszła w przekrój poprzeczny trzeciego kanału.

W rozwiązaniach znanych ze stanu techniki najbardziej powszechnym podejściem jest wykorzystanie zestawu mikroskopowego, w którym dwa obiektywy są używane do dopasowania (alignment) wiązek laserowych i stworzenia pułapki optycznej. Natomiast w rozwiązaniach wykorzystujących światłowody, powszechnym podejściem jest jedno z następujących:

- użycie dwóch włókien z przeciwległymi końcówkami w celu utworzenia pułapki optycznej typu „ dual-cone ”;

- gdy używane jest tylko jedno włókno, końcówka włókna jest zwykle modyfikowana tak, aby ciągnęła komórkę, a nie ją popychała. Typowe modyfikacje włókna to: zwężanie włókna lub nanodrukowanie elementów optycznych na jego czubku (np. soczewka Fresnela).

Konieczne byłoby zatem zapewnienie układu mikroprzepływowego, w którym nie byłoby konieczne skupienie wiązki laserowej przez obiektywy mikroskopu, ponadto wykorzystywałby on także pojedyncze włókno światłowodowe pobawione modyfikacji typu zwężania, trawienia, nadrukowywania czy innych znanych ze stanu techniki.

Przedmiotem wynalazku jest układ mikroprzepływowy z zintegrowanym światłowodem jednomodowym zawierający moduł hydrodynamicznego ogniskowania przestrzennego, i moduł sortowania, moduł hydrodynamicznego ogniskowania przestrzennego, zawierający kanał główny, który to kanał ma koniec pierwszy i koniec drugi, koniec pierwszy kanału głównego zawiera wloty do wprowadzania cieczy osłonowej i wlot do wprowadzania cieczy próbki, przy czym wloty do wprowadzania cieczy osłonowej zorientowane są względem kanału głównego pod kątem prostym, i wlot wprowadzania cieczy próbki znajduje się pomiędzy pierwszymi wlotami wprowadzania cieczy osłonowej na pierwszym końcu kanału głównego, i drugie wloty do wprowadzania cieczy osłonowej łączą się z pierwszym końcem kanału głównego poprzez pierwsze kanały boczne, i koniec drugi kanału głównego łączy się z wylotami poprzez kanały wyjściowe, i zawierający moduł sortera optycznego, charakteryzujący się tym, że pomiędzy pierwszym i drugim końcem kanału głównego znajduje się moduł sortujący, i z drugim końcem kanału głównego pomiędzy kanałami wyjściowymi połączony jest kanał światłowodu do wprowadzania światłowodu, definiując strefę detekcji.

W korzystnej realizacji wynalazku kanały boczne i kanały wyjściowe łączą się z kanałem głównym pod kątem od 30° do 150°.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku kanały boczne łączą się z kanałem głównym pod kątem od 30° do 50°.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku kanały wyjściowe łączą się z kanałem głównym pod kątem od 130° do 150°.

W jeszcze następnej korzystnej realizacji wynalazku połączenie kanałów bocznych i kanałów wyjściowych z kanałem głównym ma kształt litery Y.

W innej korzystnej realizacji wynalazku średnica kanału włókna światłowodu odpowiada średnicy jednomodowego włókna światłowodu.

W korzystnej realizacji wynalazku włókno światłowodowe jest skierowane końcem w kierunku kanału głównego, a jego oś optyczna jest wyrównana ze środkiem kanału głównego.

W innej korzystnej realizacji wynalazku końcówka włókna światłowodu jednomodowego jest ścięta pod kątem prostym.

W jeszcze innej korzystnej realizacji wynalazku jest wykonany z optycznie przezroczystych i biokompatybilnych materiałów - polidimetylosiloksanu, szkła, poliwęglanu, polimetakrylanu metylu) lub ich kombinacji.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku bezpośrednio przed strefą detekcji jest umieszczony moduł sortujący.

W jeszcze następnej korzystnej realizacji wynalazku stosunek długości kanałów wyjściowych wynosi 1:3.

Rozwiązanie według wynalazku charakteryzuje się szczególnym ułożeniem światłowodu względem pola przepływu, a także względem kierunku akwizycji sygnału, w szczególności włókno światłowodowe w mikrokanale jest umieszczone równolegle do przepływu, z jego prosto ściętym końcem skierowanym w kierunku przeciwnym do przepływu i z jego rdzeniem (zwykle 5-10 μm) emitującym wiązkę laserową ustawioną w środku mikrokanału, gdzie naprężenie ścięcia działające na komórki jest minimalne, a prędkość przepływu jest najwyższa. Powoduje to, że nie jest wymagane skupienie wiązki laserowej przez obiektywy mikroskopu (najczęstsze podejście do tworzenia pęset i pułapek optycznych), co znacznie zwiększa mobilność systemu, jednocześnie zmniejszając jego złożoność, wagę i koszt.

Dodatkowo układ mikroprzepływowy według wynalazku wykorzystuje pojedyncze włókno światłowodowe do prowadzenia wiązki laserowej zamiast dwóch światłowodów z końcówkami skierowanymi do siebie. Inna istotną cechą jest to, że końcówka światłowodu nie musi być zwężana, trawiona, nadrukowywana ani w żaden inny sposób modyfikowana, poza standardowym rozcięciem i prostym cięciem.

Działanie (pułapkowanie) opiera się na równowadze między optycznymi siłami rozpraszania rozbieżnej wiązki laserowej i hydrodynamiczną siłą oporu strumienia cieczy niosącego cząstki, kropelki lub komórki. Umożliwia chwytanie/unieruchamianie i sortowanie mikroskopijnych obiektów o średnicy do kilkudziesięciu mikrometrów oraz manipulowanie przechwyconymi obiektami wzdłuż ścieżki optycznej w zakresie kilkuset mikrometrów (w zależności od właściwości optycznych cząstek, prędkości przepływu cieczy w mikrokanałach i zastosowanej mocy lasera). Pomimo swojej prostoty przedstawiony wynalazek, jak wspomniano powyżej, pozwala na precyzyjną kontrolę położenia pułapki (wraz z nią uwięzionych komórek lub mikrocząstek) poprzez zewnętrzną zmianę mocy wyjściowej lasera pułapkującego i również przez zmianę natężenia przepływu próbki w mikrokanałach bez konieczności przesuwania stolika mikroskopu lub modułu detekcyjnego (obiektyw + kamera).

Do porównania, we wszystkich innych prezentowanych w dostępnej literaturze w pęsetach optycznych opartych na obiektywach mikroskopowych położenie pułapki można zmienić jedynie poprzez mechaniczne przesunięcie obiektywu mikroskopu lub stolika przedmiotowego. Również, w znanych rozwiązaniach wykorzystujących pojedyncze włókno światłowodowe konieczna jest modyfikacja końcówki światłowodu i żadne z podejść wykorzystujących pojedyncze lub podwójne światłowody nie pozwala na opisane powyżej podwójne sterowanie położeniem pułapki optycznej (tj. poprzez zmianę mocy lasera lub zmianę natężenia przepływu w mikrokanałach).

Sam system mikroprzepływowy (sieć kanałów) jest ułożony poziomo, dzięki czemu jest kompatybilny z większością optycznych mikroskopów jasnego pola, mikroskopów z kontrastem fazowym lub fluorescencyjnych oraz ze stereoskopami.

Układ mikroprzepływowy wykonany z optycznie przezroczystych i biokompatybilnych materiałów - poli(dimetylosiloksanu) PDMS, szkła, poliwęglanu, PMMA lub ich kombinacji.

Celem wynalazku jest zapewnienie ciągłej sekwencji 3 operacji na każdej komórce lub cząstce w sposób nieinwazyjny (tj. bez fizycznego dotykania) i z dużą dokładnością, a mianowicie:

i) dostarczanie komórek (albo innych mikroobiektów) jeden po drugim w mikrokanale wzdłuż określonej ścieżki do strefy/punktu detekcji ii) unieruchomienie komórki/cząstki w tym punkcie z dużą dokładnością (nie pozwalając komórce/cząstce przemieścić się z tej pozycji na odległość większą niż 2 μm) i na dowolny czas, np. na czas potrzebny do zebrania sygnałów z uwięzionej komórki/cząstki z intensywnością wystarczającą do jego identyfikacji/klasyfikacji (w przypadku spontanicznej spektroskopii ramanowskiej może to trwać nawet kilkadziesiąt sekund) iii) po udanej akwizycji sygnału zwolnić unieruchomioną komórkę/cząstkę i posortować ją do jednego z kanałów wyjściowych.

Proponowane rozwiązanie zilustrowano na figurach:

Fig. 1a. schematyczny rysunek (reprezentacja trójwymiarowa) wynalazku, pokazujący poszczególne części wynalazku,

Fig. 1b. widok w rozłożeniu wynalazku, pokazujący poszczególne moduły (składający się z kilku części),

Fig. 2. mikrofotografia systemu (widok z góry) podczas pracy przedstawiająca unieruchomione komórkę HeLa-60 w pułapce optyczno-hydrodynamicznej (po prawej), w bliskim sąsiedztwie końcówki wbudowanego światłowodu,

Fig. 3. zbliżenie na unieruchomioną komórkę HeLa-60 w pułapce optohydrodynamicznej,

Fig. 4. profil energii optycznej na wyjściu światłowodu pułapkowego,

Fig. 5. Mikrofotografie pokazujące uniwersalność pułapki optyczno-hydrodynamicznej. Obraz optyczny pojedynczej (a) cząsteczki polistyrenu o wielkości 5 μm, (b) cząsteczki polistyrenu o wielkości 15 μm, (c) komórki drożdży o wielkości 5 μm, (d) komórki THP o wielkości 30 μm - wszystkie podczas uwięzienia w pułapce optohydrodynamicznej.

Układ mikroprzepływowy według wynalazku składa się z trzech głównych modułów (Fig. 1b):

i) moduł hydrodynamicznego ogniskowania przestrzennego (118) - odpowiedzialny za ogniskowanie komórek lub mikrocząstek zawieszonych w cieczy nośnej w wąskim strumieniu i dostarczanie ich do strefy detekcji ii) moduł pułapki optohydrodynamicznej, składający się z kanału do wprowadzania światłowodu (116), samego światłowodu jednomodowego (116) oraz dolnej części kanału głównego (109) - odpowiedzialny za wychwytywanie (uwięzienie) dostarczonych komórek lub mikrocząstek i utrzymywanie ich w miejscu na czas detekcji/skanowania iii) moduł sortujący (119) - odpowiedzialny za oddzielenie interesujących komórek/mikrocząstek od reszty komórek/mikrocząstek po skanowaniu i na podstawie analizowanego sygnału.

Przestrzenne ogniskowanie hydrodynamiczne (118)

Zasada przestrzennego ogniskowania hydrodynamicznego opiera się na względnych natężeniach przepływu objętościowego próbki cieczy i cieczy osłonowych. Dodatkowo bardzo małe wymiary kanałów i niskie prędkości przepływu powodują bardzo niską liczbę Reynoldsa (Re <<1) co oznacza, że przepływ jest laminarny. Innymi słowami ciecze nie mieszają się przez konwekcję, ale nieskończenie cienkie (grubości rzędu atomów) warstwy cieczy przesuwają się jedna po drugiej (lub obok siebie) jak kartki papieru.

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku ciecz próbki (zawiesina komórek lub cząstek) jest wprowadzana do mikrokanałów przez wlot (102), a ciecze osłonowe/ogniskujące są wprowadzane przez wloty (101), (103), (104) i (105), natomiast wynalazek charakteryzuje się tym że kąt między kanałami wlotowymi (106, 107) a głównym kanałem (109) wynosi od 30° do 60°. Ciecze osłonowe wprowadzane przez otwory wlotowe (101) i (103) skupiają strumień próbki cieczy poprzez ściskanie jej w pionie. Przedstawiona kolejność wprowadzania cieczy (ciecz dolna osłona - zawiesina cząstek/komórek ciecz górna osłona) skutkuje powstaniem 3-warstwowego współprzepływającego strumienia cieczy z zawiesiną przepływającą pośrodku. Względna grubość poszczególnych cieczy w mikrokanaliku jest wprost proporcjonalna do objętościowego natężenia przepływu, z jakim są one wprowadzane do mikrokanalików. Strumienie osłonowe wprowadzane przez otwory wlotowe (104) i (105) łączą się z wygenerowanym trójwarstwowym strumieniem cieczy w złączu (108) i skupiają go poprzez poziome ściskanie. Strumień cieczy próbki po takim ogniskowaniu może mieć szerokość i grubość kilku mikrometrów, dzięki czemu komórki w cieczy próbki płyną po wąskiej trajektorii w środku głównego kanału (109) i mogą być dostarczane do punktu detekcji (110) za pomocą wysoką precyzją.

Ciecze osłonowe mogą być wprowadzane do mikrokanalików przez poszczególne porty wlotowe (101), (103), (104) i (105) niezależnie od siebie za pomocą wysoko precyzyjnych niskociśnieniowych pomp strzykawkowych (preferowana metoda) lub dedykowanych regulatorów ciśnienia. Średnica zogniskowanego strumienia cieczy próbki (zawiesina komórek lub mikrocząsteczek) oraz położenie tego strumienia w kanale głównym (więc prędkość i trajektoria poszczególnych komórek lub mikrocząsteczek) mogą być precyzyjnie kontrolowane przez względne prędkości przepływu pomiędzy cieczą próbki a cieczami osłonnymi.

Przykład: jeśli chcemy uzyskać pozycjonowanie komórek o średnicy około 12 μm w płaszczyźnie przekroju poprzecznego z dokładnością ±1 μm wystarczy, aby średnica przekroju strumienia cieczy próbki wynosiła około 6 μm. W tym celu stosunek natężenia przepływu objętościowego zawiesiny komórek (z otworu wlotowego 102) do cieczy osłonowych, podawanych z otworów wlotowych (101, 103, 104 i 105), powinien wynosić 1:12.

Główny kanał (109)

Wysokość głównego kanału (109) jest typowo określona przez średnicę światłowodu (106), który wprowadzamy naprzeciw zogniskowanego strumienia. Na przykład, przy użyciu standardowego ś wiatłowodu jednomodowego o przeciętej średnicy 125 μm, wysokość kanałów mikroprzepływowych również wynosi 125 μm. Pozwala to na precyzyjne ustawienie i wyrównanie rdzenia światłowodu (a tym samym emitowanej wiązki laserowej) z geometrycznym środkiem głównego kanału (a więc z wąskim skupionym strumieniem komórek lub mikrocząstek) bez konieczności stosowania mikrometrycznych śrub pozycjonujących lub innych skomplikowanych przyrządów do dalszego wyrównania. Szerokość głównego kanału (109) jest preferencyjnie taka sama jak wysokość, aby umożliwić ogniskowanie izometryczne. Długość głównego kanału (109) jest typowo pomiędzy 250 μm a 1500 μm (chociaż może mieć nawet 5 cm), i rozgałęzia się symetrycznie, w kształcie litery Y, na dwa kanały wyjściowe (111) i (112).

Strefa detekcji (110)

Strefa detekcji (110) znajduje się w bliskim sąsiedztwie, tj. w odległości od 5 μm do 250 μm, od punktu rozgałęzienia na drugim końcu kanału głównego (109).

Po dostarczeniu komórek lub cząstek do strefy detekcji (110) należy je unieruchomić w taki sposób w kanale mikroprzepływowym aby środek komórki/cząstki nie oddalał się od wybranego (pułapk ującego) punktu dalej niż ±2 μm. Umożliwia to przeprowadzenie czułego i długotrwałego pomiaru/analizy.

Światłowód i pułapka hydrooptyczna

Pomiędzy dwoma kanałami wyjściowymi (111) i (112), jako kontynuacja kanału głównego (109) znajduje się trzeci kanał (115), w który wprowadzono włókno światłowodowe jednomodowe (116), którego końcówka znajduje się kilka mikrometrów (5-250 μm) w dół od strefy detekcji (110) (oraz od punktu rozgałęzienia) skierowanego w kierunku przeciwnym do przepływu. Światłowód wraz z dolną częścią kanału głównego (109), ze strefą detekcji i ze złączem Y tworzą moduł pułapkowania.

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku jednomodowe włókno światłowodowe (116) o średnicy 125 μm jest osadzone w urządzeniu z końcówką ściętą pod kątem prostym i skierowaną przeciwnie do przepływu, a ścieżka optyczna emitowanej wiązki laserowej jest wyrównana ze środkiem głównym kanałem, a więc ze strumieniem zogniskowanych komórek lub cząstek.

Aby ułatwić wprowadzenie światłowodu (116) do zamkniętego mikrokanalika (115), od strony wejściowej zaczyna się kanał osadzania (115) o szerokości ok. 2 razy szersza niż szerokość światłowodu, następnie stopniowo zwęża się, osiągając ostateczną szerokość (równą średnicy światłowodu) w odległości cca. 500 μm od złącza Y (nie pokazano). Po wprowadzeniu światłowodu (116) do kanału (115) i ustawieniu jego końcówki w odpowiedniej pozycji, kanał (115) zostaje uszczelniony światłoutwardzalnym klejem UV o odpowiednio dobranej lepkości.

Podczas pracy, przez wbudowany światłowód, przed głównym kanałem emitowana jest wiązka laserowa o długości fali λ=973 nm, maksymalnej mocy optycznej 550 mW mając profil gaussowski (promieniowanie jest ograniczone do podstawowego (TEM00) modu gaussowskiego). Profil rozprzestrzeniania się energii optycznej w wypełnionym wodą kanale mikroprzepływowym pokazano na rysunku 4.

Komórki lub cząsteczki są popychane przez hydrodynamiczny opór lepkiej cieczy w kierunku końcówki światłowodu emitujący wiązkę laserową o charakterystyce gaussowskiej. Emitowana wiązka Gaussa wywiera ciśnienie promieniowania na komórki lub cząstki, które płyną w kierunku końcówki światłowodu, a przy rozpraszającej sile optycznej, która ma dominujący udział, wiązka odpycha komórki od końcówki w kierunku przeciwnym do przepływu. Gdy wiązka lasera się rozchodzi, traci swoją energię wraz z odległością od końcówki światłowodu i w pewnej odległości optyczna siła rozpraszania działająca na komórki zrównuje się z siłą oporu lepkiego, w którym to momencie komórka zatrzymuje się i pozostaje nieruchoma (tj. zostaje uwięziona). Położenie tej pułapki optyczno-hydrodynamicznej można zmieniać wzdłuż ścieżki optycznej lasera, zmieniając objętościowe natężenia przepływu (lub przyłożone ciśnienie zewnętrzne) cieczy lub zmieniając moc wyjściową lasera.

Na początku działania pułapki optycznej ustawia się prędkość przepływu cieczy próbki i cieczy osłonowych oraz eksperymentalnie dostosowuje moc lasera tak, aby pułapka powstała w punkcie najbardziej dogodnym do obrazowania i akwizycji sygnału.

W przedstawionym minimalizowaniu uszkodzeń ogniw całkowite objętościowe natężenie przepływu (suma natężeń przepływu z portów wlotowych 101, 102, 103, 104 i 105) nie powinno przekraczać 130 μL/h. Wyższe prędkości przepływu skutkują oporem większym niż to, co może być skutecznie skompensowane przez wiązkę laserową bez uszkadzania komórek.

Moduł sortowania (120)

Kanał główny (109) rozgałęzia się symetrycznie, w kształcie litery Y, na dwa kanały wyjściowe (111) i (112), które kończą się otworami wyjściowymi (113) i (114), do których przymocowane są małe pojemniki z tworzywa sztucznego lub szkła za pomocą elastycznych rurek teflonowych (niepokazanych na rysunku), w celu zbierania odpowiednio posortowanych komórek i odpadów. Przed złączem głównego kanału (109) z dwoma kanałami wylotowymi (111) i (112) po obu stronach głównego kanału osadzony jest dowolny rodzaj mechanizmu odchylającego lub przyciągania/odpychania (117), który wraz z dwoma kanałami wyjściowymi (111) i (112), portami wylotowymi (113) i (114) oraz pojemnikami zbiorczymi (nie pokazane) tworzą moduł sortujący systemu mikroprzepływowego. Kąt między kanałami mikroprzepływowymi (111, 112) i głównego kanału (109) wynosi od 130° do 150°. Sorter może być dowolnego typu, np. dielektroforetyczny, push-pull, optyczny, akustyczny (aby wymienić tylko najbardziej znane typy ze stanu techniki), i według czego odpowiedni mechanizm (117) jest integrowany z układem mikrofluidycznym, wychylający komórek/cząsteczek z środka kanału głównego i kierowania ich do wybranego kanału wylotowego. Musi on albo popychać, albo przyciągać już uwięzioną komórkę z siłą wystarczającą do przesunięcia jej ze środka kanału (109) w kierunku jednego (wybranego) z kanałów wyjściowych.

W rozwiązaniu według wynalazku zostały wykorzystane głównie dwa typy sorterów. Pierwszy z nich to sorter optyczny, w którym drugi światłowód jest zintegrowany prostopadle z jego rdzeniem wyrównanym z pozycją pułapkowania. Domyślnie kanały wyjściowe mają niewielką różnicę w oporze hydrodynamicznym, a komórki (bez oddziaływania na nie siłą zewnętrzną) przepływają do kanału sortującego bliżej drugiego (sortującego) włókna. Są to odpady (nieistotne komórki). Jeśli jednak komórka po wychwyceniu i wykryciu jest analizowana jako pozytywna, wówczas krótki impuls wiązki laserowej jest wypromieniowywany z włókna sortującego, co popycha komórkę do drugiego kanału sortującego.

Drugim typem sortera jest sorter o konfiguracji według preferowanego przykładu wykonania wynalazku, co pozwala na sortowanie komórek w połączeniu z analizą w czasie rzeczywistym. W tym celu po obu stronach końcówki światłowodu (116) znajdują się dwa oddzielne kanały wlotowe (111 i 112), w których przepływ jest regulowany poprzez zmianę ciśnienia hydrostatycznego (zmianę pionowego położenia pojemników zbiorczych).

„Uruchamiacz/spust” sortera (117) selektywnie wtłacza komórki do jednego z kanałów (111, 112) za pomocą dielektroforezy, elektroforezy, elektroosmozy, energii rozpraszania optycznego, lokalnej zmiany przepływu, stojących fal akustycznych, magnetyzmu lub sił hydrostatycznych.

Rozwiązanie według wynalazku zawiera i) urządzenie mikroprzepływowe z wieloma wlotami i wylotami, ii) z wbudowanym światłowodem jednomodowym oraz iii) moduł sortujący. Urządzenie mikroprzepływowe ma wiele portów wlotowych (w przedstawionej wersji preferowane są 5), które łączą się w dół w jeden wspólny kanał (określany jako kanał główny lub kanał detekcyjny), który następnie ponownie rozgałęzia się do kilku kanałów wylotowych (w przedstawionej wersji preferowane są 2). Zawiesina (komórki lub mikrocząsteczek w fazie wodnej) jest wprowadzana ze sterylnego zbiornika lub strzykawki przez elastyczne rurki polimerowe (PE, PFTE, silikon lub podobne) przez ok reślony otwór wlotowy, i przez pozostałe 4 otwory wlotowe wprowadzana są płyny osłonowe (roztwór soli fizjologicznej, woda lub pożywka do hodowli komórek). Punkt detekcji, w którym komórki i cząstki są uwięzione/unieruchomione, znajduje się w/lub w pobliżu punktu rozgałęzienia, tj. w miejscu, w którym pojedynczy kanał główny rozgałęzia się na kilka kanałów wyjściowych (kanały sortujące). Kanały wyjściowe kończą się otworami wylotowymi, z których każdy jest podłączony za pomocą elastycznych rurek (najlepiej wykonanych z teflonu) do małego pojemnika lub fiolki. Kontynuacja głównego kanału poza punkt rozgałęzienia nie jest traktowana jako kanał wyjściowy, zamiast tego służy do osadzenia światłowodu jednomodowego, który służy do generowania pułapki optyczno-hydrodynamicznej do unieruchamiania komórek i cząstek. Przepływ w urządzeniu mikroprzepływowym może być uruchamiany i sterowany na przykład za pomocą niskociśnieniowych pomp strzykawkowych o wysokiej precyzji lub za pomocą regulatora ciśnienia.

Przykład 1

Aby zweryfikować znaczenie i wydajność modułu hydrodynamicznego ogniskowania przestrzennego oraz możliwości pułapkowania przeprowadzono 3-etapowy eksperyment sprawdzający koncepcję.

Najpierw do urządzenia mikroprzepływowego wprowadzono wodny roztwór cząstek polistyrenu o średnicy 15 μm, w stężeniu 0,02% w/v przez wlot próbki (102), bez użycia cieczy osłonowych przez wloty 101, 103, 104, 105. Cząsteczki polistyrenu przepływały losowo przez cały przekrój poprzeczny kanału, co skutkowało słabą skutecznością wychwytywania wynoszącą 5%. Słaba skuteczność wychwytywania w tym przypadku wynika z tego, że cząsteczki przepływają losowo i tylko kilka cząstek, które są wyrównane z osią optyczną światłowodu, zostaje uwięzionych.

W następnym kroku trajektorie cząstek zostały przestrzennie ograniczone w kierunku Y, tj. wzdłuż szerokości kanału, poprzez powolne zwiększanie natężenia przepływu cieczy z osłony bocznej przez wloty 104 i 105. Natężenia przepływu osłony do próbki dostosowano do stosunku 5:1, dla którego trajektorie cząstek pokrywały się z osią optyczną światłowodu w kierunku Y. Zaobserwowaliśmy teraz skuteczność wychwytywania na poziomie 35%, co wynika z faktów, że wszystkie cząsteczki były wyrównane z rdzeniem włókna w kierunku Y, ale tylko ułamek z nich znajdował się we właściwej pozycji wzdłuż kierunku Z, tj. wzdłuż wysokości kanału.

Aby jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność wychwytywania, zarówno przepływ cieczy w górnej, jak i dolnej osłonie przez wloty 101 i 103 był stale zwiększany, tak że cząstki były również zamykane w kierunku Z i całkowicie wyrównane z osią optyczną światłowodu, co skutkowało ciągłym wychwytywaniem cząstek z efektywnością nad 70%. W każdym przypadku cząstki były wychwytywane przez pęsetę optohydrodynamiczną i trzymane przez >2 sekundy przed uwolnieniem. Aby osiągnąć 100% skuteczność wychwytywania, wszystkie cząstki przepływające w kanale muszą być wyrównane z osią optyczną z dużą precyzją. Wymaga to bardzo dużych prędkości przepływu w osłonie, co skutkuje dużymi siłami oporu, których nie można zrównoważyć siłami rozpraszania optycznego w układzie według wynalazku systemie.

Przykład 2

Wynalazek umożliwia dostarczanie do punktu detekcji, schwytywanie, uwalnianie i sortowanie szerokiego asortymentu, rozmiarów i morfologii różnych materiałów. Dopóki na cząstki mogą być wywierane wystarczające siły rozpraszające, większe niż siła oporu hydrodynamicznego, możliwe jest pułapkowanie obiektów mikroskopycznych za pomocą wynalazku. Zademonstrowaliśmy wszechstronność wynalazku poprzez hydrodynamiczne ogniskowanie, wychwytywanie i sortowanie i) cząstek polistyrenu o średnicy 5 μm oraz 15 μm, ii) pojedynczych komórek ssaków, takich jak komórki białaczki (T HP-1) o wielkości w zakresie 10-30 μm, jak również iii) mikroorganizmy, takie jak komórki drożdży Saccharomyces Cerevisiae o wielkości 3-5 μm. Wyniki są podsumowane na Fig. 5.

Jednak cząsteczki o mniejszych rozmiarach, takie jak kulki polistyrenowe mniejsze niż 1 μm i bakteryjne komórki E. Coli (1-2 μm), nie mogły być stabilnie pułapkowane ze względu na stosunkowo małe rozpraszanie optyczne i działające na nie siły gradientu w porównaniu z siłą oporu hydrodynamicznego, nawet przy minimalnej prędkości przepływu. Nasze demonstracje wyraźnie pokazują szerokie zastosowanie OHT, w tym do badań pojedynczych komórek w formacie w pełni „laboratorium na chipie” (LabOn-A-Chip).

Przykład 3

Układ mikroprzepływowy można stosować nawet bez modułu sortującego, wykorzystując tylko moduły skupiająco-dostarczające i pułapkujący wynalazek może być wykorzystany np. w spektroskopii ramanowskiej do uzyskiwania/generowania bibliotek sygnałów i widm wraz z obrazami optycznymi różnych typów komórek, co może być nieocenione we wczesnym wykrywaniu raka lub innego rodzaju chorób.

Wloty próbki oraz wloty cieczy osłonowych połączono z strzykawkami szklanymi (Hamilton, USA, objętość 0,5 ml) za pomocą elastycznych rurek teflonowych (ID/OD=0,5/1,0 mm) i przepływ był sterowany za pomocą precyzyjnych niskociśnieniowych pomp strzykawkowych (Nemesys, Cetoni, Niemcy). Użyliśmy ludzkich komórek białaczkowych, zmieszanych ze zdrowymi białymi krwinkami w stosunku 1:4 i zawieszonych w roztworze buforowym PBS w stężeniu 5 x 105 komórek/ml.

Komórki prowadzone do układu mikroprzepływowego były skupione w cieczy nośnej w wąskim strumieniu za pomocą przestrzennego ogniskowania hydrodynamicznego używając czystego roztworu PBS (bez komórek) jako cieczy osłonowych, dostarczanych z wlotów 101, 103, 104, 105 przy st osunkach natężenia przepływu 1:5 i 1:12 dla poziomowo i pionowo cieczy osłonowych odpowiednio. Chip mikroprzepływowy umieszczono na stoliku stymulowanego spektroskopu ramanowskiego (SRS), budowanym przez modyfikację odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (Nikon EclipseTi2). Komórki były kierowane do punktu detekcji, przechwytywane za pomocą pułapek optyczno-hydrodynamicznych i przetrzymywane przez okres 3-8 s, podczas gdy sygnał SRS o długości fali 2940 cm^-1 był zbierany, po czym komórki były uwalniane i sortowane przez moduł sortera optycznego oparty na światłowodzie zintegrowany z chipem mikroprzepływowym. Sorter optyczny był po prostu kolejnym światłowodem tego samego typu co laser pułapkowy, ale umieszczony prostopadle do głównego kanału (a tym samym do światłowodu pułapkowego) z końcówką skierowaną w stronę punktu detekcji.

Po wstępnym uwolnieniu komórki z pułapek optyczno-hydrodynamicznych, poprzez wyłączenie lasera pułapkującego, zastosowano krótki impuls z lasera sortującego o mocy 500 mW, który odbił komórki od środka kanału i skierował je do kanału wyjściowego, który był dalej z sortującego lasera.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Układ mikroprzepływowy z zintegrowanym światłowodem jednomodowym zawierający moduł hydrodynamicznego ogniskowania przestrzennego, zawierający kanał główny, który to kanał ma koniec pierwszy i koniec drugi, koniec pierwszy kanału głównego zawiera wloty do wprowadzania cieczy osłonowej i wlot do wprowadzania cieczy próbki, przy czym wloty do wprowadzania cieczy osłonowej zorientowane są względem kanału głównego pod kątem prostym, i wlot wprowadzania cieczy próbki znajduje się pomiędzy pierwszymi wlotami wprowadzania cieczy osłonowej na pierwszym końcu kanału głównego, i drugie wloty do wprowadzania cieczy osłonowej łączą się z pierwszym końcem kanału głównego poprzez pierwsze kanały boczne, i koniec drugi kanału głównego łączy się z wylotami poprzez kanały wyjściowe, i zawierający moduł sortera optycznego, znamienny tym, że pomiędzy pierwszym i drugim końcem kanału głównego (109) znajduje się moduł sortujący (117), i z drugim końcem kanału głównego (109) pomiędzy kanałami wyjściowymi (111, 112) połączony jest kanał światłowodu (115) do wprowadzania światłowodu (116), definiując strefę detekcji (110).
2. 2. Układ według zastrz. 1, znamienny tym, że kanały boczne (106, 107) i kanały wyjściowe (111, 112) łączą się z kanałem głównym (109) pod kątem od 30° do 150°.
3. 3. Układ według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że kanały boczne łączą się z kanałem głównym (109) pod kątem od 30° do 50°.
4. 4. Układ według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że kanały wyjściowe (111, 112) łączą się z kanałem głównym (109) pod kątem od 130° do 150°.
5. 5. Układ według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienny tym, że połączenie kanałów bocznych (106, 107) i kanałów wyjściowych (111, 112) z kanałem głównym (109) ma kształt litery Y.

   PL 249105 BI
6. 6. Układ według zastrz. 1, znamienny tym, że średnica kanału włókna światłowodu (115) odpowiada średnicy jednomodowego włókna światłowodu (116).
7. 7. Układ według zastrz. 1 albo 6, znamienny tym, że włókno światłowodowe (116) jest skierowane końcem w kierunku kanału głównego (109), a jego oś optyczna jest wyrównana ze środkiem kanału głównego (109).
8. 8. Układ według zastrz. 1, 6 albo 7, znamienny tym, że końcówka włókna światłowodu jednomodowego (116) jest ścięta pod kątem prostym.
9. 9. Układ według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, znamienny tym, że jest wykonany z optycznie przezroczystych i biokompatybilnych materiałów - polidimetylosiloksanu, szkła, poliwęglanu, polimetakrylanu metylu) lub ich kombinacji.
10. 10. Układ według zastrz. 1, znamienny tym, że bezpośrednio za strefą detekcji (110) jest umieszczony moduł sortera (120).
11. 11. Układ według dowolnego z zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, że stosunek długości kanałów wyjściowych wynosi 1:3.