PL248683B1 - Zastosowanie MMP2, jako regulatora różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku komórek β trzustki - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie MMP2, jako regulatora różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku komórek trzustki.

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie MMP2, jako regulatora różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku komórek β trzustki.

Wynalazek ujawnia zastosowanie metaloproteinazy macierzy 2 (MMP2), jako regulatora różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC, ang. human pluripotent stem cells) w kierunku komórek β trzustki. MMP2 wpływa na powstawanie komórek β w procesie różnicowania z ludzkich komórek macierzystych (SC-β, ang. stem cells derived β cells), reguluje ich proliferację i funkcjonalność. MMP2 jest pozytywnym regulatorem tych procesów. Zastosowanie rekombinowanego MMP2 (rh MMP2) w trakcie różnicowania jak również podczas dojrzewania komórek SC-β przyczynia się do znacznego ich wzrostu, podczas gdy podanie inhibitora MMP2 (MMP2i) hamuje ich ekspansję. Powstałe w obecności MMP2 komórki SC-β charakteryzują się zwiększonym in vitro i in vivo wydzielaniem insuliny (INS), stymulowanym glukozą, porównywalnym do ludzkich komórek β wysp trzustkowych.

Obecne protokoły różnicowania komórek β in vitro z hPSC opierają się na naśladowaniu kolejnych etapów rozwojowych trzustki poprzez modulację szlaków sygnałowych zaangażowanych w ten proces. Modulacja poszczególnych ścieżek sygnalizacyjnych odbywa się z użyciem związków drobnocząsteczkowych i czynników wzrostu. Aktualnie największą efektywność różnicowania osiąga się używając protokołów 3D, w których komórki tworzą organoidy zawieszone w medium różnicującym. Pierwszym etapem jest zróżnicowanie hPSC do endodermy (DE, ang. definitive endoderm) poprzez aktywację kanonicznego szlaku WNT iTGFβ. CHIR99021 poprzez inhibicję GSK3β aktywuje kanoniczny szlak WNT. Aktywacja szlaku TGFβ odbywa się zazwyczaj poprzez białko aktywinę A. Efektywność różnicowania na tym etapie wynosi około 90-95%, co zostało omówione w publikacjach (DAmour et al, 2005, Nat Biotechnol, 23(12), 1534-1541), (Borowiak & Melton, 2009, Curr Opin Cell Biol, 21(6), 727-732), (Takenaga, Fukumoto, & Hori, 2001, J Cell Sci, 120 (Pt 12), 2078-2090).

Po osiągnięciu stadium DE ma miejsce aktywacja ścieżki FGF poprzez dodanie czynnika wzrostu keratynocytów (KGF, ang. keratinocyte growth factor). Aktywacja ścieżki FGF prowadzi dalszą specyfikację do komórek endodermy przedjelitowej (PGT, ang. primitive gut tube), czyli prekursorów dla przełyku, żołądka, wątroby oraz trzustki (DAmour et al, 2006, Nat Biotechnol, 24(11), 1392-1401), (Kroon et al., 2008, Nat Biotechnol, 26(4), 443-452), (Russ et al, 2015, EMBO J, 34(13), 1759-1772). Następnym stadium osiąganym przez komórki podczas różnicowania są komórki progenitorowe (PP, ang. pancreatic progenitors). Dodanie do pożywki różnicującej kwasu retinowego (RA, ang. retinoic acid) indukuje ekspresję markerowego genu PDX1, czynnika transkrypcyjnego niezbędnego do formowania się trzustki (Johannesson et al., 2009, PLoS One, 4(3), e4794). Dodatkowo, kombinacja embrionalnego czynnika wzrostu (EGF, ang. embryonic growth factor) i nikotynamidy zwiększa efektywność różnicowania in vitro hPSC do komórek β poprzez aktywację ekspresji specyficznego czynnika transkrypcyjnego NKX6-1 już na etapie komórek PP. NKX6-1 jest niezbędny do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania komórek β (McGaugh & Nostro, 2017, J Vis Exp(121)). Markerem wyróżniającym komórki PP jest również SOX9. Na tym etapie różnicowania osiąga się efektywność około 70%. Kolejnym etapem różnicowania in vitro jest nabycie przez komórki cech progenitorów endokrynnych (EP, endocrine progenitors). Inhibicja szlaku Notch jest niezbędna do aktywacji NGN3 i rozpoczęcia powstawania komórek EP (Murtaugh, Stanger, Kwan, & Melton, 2003, Proc Natl Acad Sci USA, 100(25), 14920-14925), (Zhang et al., 2021, Cell Death Dis, 12(10), 867). Ponadto, zahamowanie szlaku TGFβ przez dodanie inhibitora receptora ALK5 (receptor TGFβ typu I) wspomaga różnicowanie endokrynnych komórek trzustki (Nostro et al., 2011, Development, 138(5), 861-871), (Rezania et al, 2012, Diabetes, 61(8), 2016-2029). Stadium komórek EP charakteryzuje się ekspresją genów takich jak, CHGA i NGN3, a efektywność różnicowania wynosi około 60%. Końcowym stadium jest dojrzewanie komórek EP i specjalizacja w kierunku funkcjonalnych komórek β. Jednakże wciąż niewystarczająco poznane są mechanizmy kierujące procesami dojrzewania EP i ich różnicowania w stronę komórek β. Podczas różnicowania in vitro nadal problem stanowi niska i zmienna efektywność uzyskiwania funkcjonalnych komórek β, jest to około 20-50% komórek. Po osiągnięciu stadium wczesnych niedojrzałych komórek β następuje ich dojrzewanie, czyli nabieranie cech charakterystycznych dla dojrzałych funkcjonalnych komórek β, takich jak ekspresja specyficznych genów (INS, NKX6-1, PDX1, CHGA, PCSK1) oraz zdolność sekrecji INS w odpowiedzi na zwiększony poziom glukozy.

D’Amour et al. opisuje wytwarzanie wzbogaconych kultur endodermy właściwej (ang. definitive endoderm - DE) pochodzącej z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES) w obecności wysokiego stężenia aktywiny A i niskiego poziomu surowicy (D’Amour et al., 2005, Nat Biotechnol, 23(12),

1534-1541) co zostało zilustrowane w patencie USA nr 7704738. Przeszczepienie tych komórek pod torebkę nerkową myszy spowodowało różnicowanie w bardziej dojrzałe komórki o cechach tkanki endodermalnej co omawia patent USA nr 7704738.

Komórki endodermy pochodzące z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych można dalej różnicować w komórki prekursorowe trzustki (ang. pancreatic progenitors - PPs) z ekspresją czynnika transkrypcyjnego PDX1 po dodaniu FGF-10 i kwasu retinowego - zilustrowane w wynalazku USA nr 2005/0266554A1. Późniejsza transplantacja komórek PPs do poduszki tłuszczowej myszy z niedoborem odporności spowodowała utworzenie funkcjonalnych komórek endokrynnych trzustki po 3-4-miesięcznej fazie dojrzewania. Problem został zilustrowany w patencie USA nr 7993920 i w patencie USA nr 7534608).

Fisk i in. opisują system wytwarzania komórek wysp trzustkowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przedstawione w patencie USA nr 7033831. W tym przypadku ścieżkę różnicowania podzielono na trzy etapy. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste najpierw różnicowano do endodermy przy użyciu kombinacji maślanu sodu i aktywiny A omówione w patencie USA nr 7326572. Komórki następnie hodowano z antagonistami BMP, takimi jak Noggin, w połączeniu z EGF lub betaceluliną w celu wytworzenia komórek pozytywnych pod względem PDX1. Końcowe różnicowanie zostało wywołane przez nikotynamid.

Zastosowanie ligandów efryny i sfingozyno-1-fosforanu, jako regulatorów różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek endokrynnych zostało zilustrowane w patencie US 10066210B2.

Najnowsze prace prezentujące protokoły do różnicowania hPSC w kierunku komórek β trzustki: • Bars by T. et al., Differentiating functional human is let-like aggregates from pluripotent stem cells.

STAR Protoc. 2022 Dec 16;3(4): 101711. Epub 2022 Sep 21. PMID: 36136756; PMCID:

PMC9508476. https://doi: 10.1016/j.xpro.2022.101711.

• Nair, G. G. et al. Author Correction: Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nat Cell Biol 21,792 (2019).

https://doi.org/10.1038/s41556-019-0316-3 • Velazco-Cruz, L., et al., Acquisition of Dynamic Function in Human Stem Cell-Derived β Cells. Stem Cell Reports, 12(2), 351-365 (2019).

https://doi.org/10.1016Zj.stemcr. 2018.12.012 • Rezania, A. et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 32, 1121-1133 (2014).

https://doi.org/10.1038/nbt.3033 • Pagliuca, F. W. et al. Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell 159, 428-439 (2014). https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.040

Prace prezentujące stan wiedzy dotyczący białka MMP2:

MMP2 należy do rodziny metaloproteinaz, enzymów proteolitycznych biorących udział w reorganizacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, ang. extra cellular matrix). MMP2 posiada domeny funkcjonalne takie jak endopeptydazy zależne od Ca²⁺ i Zn²⁺, które są aktywne w obojętnym pH. W swej domenie katalitycznej zawiera trzy elementy podobne do fibronektyny. MMP2 jest syntetyzowany, jako proenzym i przetwarzany do postaci aktywnej poprzez usunięcie propeptydu na końcu aminowym. Uważa się, że propeptyd utrzymuje enzym w postaci utajonej poprzez oddziaływanie reszty cysteiny w tym peptydzie z resztą cynku w miejscu aktywnym enzymu. Zakłócenie tej interakcji uruchamia mechanizm przełączania cysteiny i powoduje aktywację enzymu (Sternlicht & Werb, 2001, Annu Rev Cell Dev Biol, 17, 463-516.). MMP2 jest przede wszystkim żelatynazą, ale może działać jak kolagenaza, chociaż w słabszy sposób (Cui, Hu, & Khalil, 2017). Żelatynazy biorą udział w stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak wzrost i rozwój embrionalny, angiogeneza, choroby zapalne, infekcyjne czy progresja nowotworów (Cui et al., 2017, Prog Mol Biol Transl Sci, 147, 1-73.). Na przykład Li i in. podali, że aktywowane komórki gwiaździste trzustki (ang. stellate) promowały ekspresję MMP2 w raku trzustki, a ekspresja MMP2 była dodatnio skorelowana z przerzutami do węzłów chłonnych i inwazją otaczających tkanek i narządów, ale nie z przerzutami odległymi (Li et al., 2019, Am J Med Sci, 357(1), 16-22.). MMP2 zidentyfikowano, jako marker nowo powstałych niedojrzałych komórek β, ponieważ białko MMP2 jest obecne w komórkach β szczura w E20.5 (dzień embrionalny 20) iP2 (dzień 2 po urodzeniu), ale nie jest już wykrywalne po P7 (Aye, Toschi, Sharma, Sgroi, & Bonner-Weir, 2010, J Histochem Cytochem, 58(4), 369-376.). U myszy leczonych małą dawką STZ ekspresja MMP2 jest zwiększona w regenerujących się komórkach β (Beamish et al., 2017, J Endocrinol, 233(3), 229-241.). Badania nad rolą MMP2 w zachowaniu komórek w hodowli są nieliczne, ale wykazały wpływ na proliferację, przeżycie, apoptozę, różnicowanie i organizację komórek (Laronha & Caldeira, 2020, Cells, 9(5)). Przykładowo, hamowanie MMP2 przez inhibitor chemiczny lub przeciwciało neutralizujące zmniejsza odpowiedź mitogenną hodowanych komórek mięśni gładkich naczyń na płytkopochodny czynnik wzrostu, PDGF (Uzui, Lee, Shimizu, Tsutani, & Ueda, 2000, Atherosclerosis, 149(1), 51-59.).

Istotą wynalazku jest zastosowanie MMP2, jako regulatora różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku komórek β trzustki.

Dzięki zastosowaniu rozwiązania według wynalazku uzyskano następujące efekty techniczno-użytkowe:

• Komórki β uzyskane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hPSC stanowią źródło komórek do przeszczepów u pacjentów z cukrzycą. Aktualne protokoły generacji tych komórek pozostawiają wciąż wiele do życzenia pod względem ilości funkcjonalnych komórek SC-β. Mimo, że pewne mitogeny mogą być wykorzystane do namnażania komórek β, dorosłe komórki β replikują się wyjątkowo rzadko. W wynalazku zastosowano komórki β pochodzące z hPSC i zidentyfikowano białko macierzy zewnątrzkomórkowej - MMP2, jako aktywator proliferacji wczesnych komórek SC-β. Zwiększona obecność białka MMP2 przyczyniła się do znacznego wzrostu proliferacji, podczas gdy inhibicja MMP2 hamowała ekspansję komórek SC-β. Ludzkie komórki SC-β ze zwiększoną proliferacją w następstwie traktowania ich rekombinowanym białkiem MMP2 charakteryzowały się zwiększonym wydzielaniem insuliny in vitro i in vivo, stymulowanym glukozą, porównywalnym do ludzkich komórek β wysp trzustkowych.

• Poprawa efektywności różnicowania komórek β trzustki: wynalazek wykorzystuje MMP2, jako regulatora różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku komórek β trzustki. Dzięki zastosowaniu rh MMP2 w trakcie procesu różnicowania komórek macierzystych, obserwujemy znaczący wzrost liczby komórek β, co przekłada się na zwiększoną efektywność uzyskiwania funkcjonalnych komórek β.

• Regulacja proliferacji i funkcjonalności komórek β: wynalazek pozwala na regulację proliferacji i funkcjonalności komórek β trzustki. MMP2 działa, jako pozytywny regulator tych procesów, co oznacza, że jego zastosowanie prowadzi do zwiększenia liczby komórek β oraz ich zdolności do wydzielania insuliny w odpowiedzi na stymulację glukozą, zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo.

• Otrzymywanie komórek β o właściwościach porównywalnych do komórek β wysp trzustkowych: Komórki β powstałe w obecności MMP2 charakteryzują się zwiększonym wydzielaniem insuliny zarówno in vitro, jak i in vivo, stymulowanym glukozą, co przypomina funkcję ludzkich komórek β wysp trzustkowych. Jest to istotne z punktu widzenia potencjalnych zastosowań terapeutycznych i badań nad leczeniem chorób związanych z dysfunkcją komórek β.

• Optymalizacja protokołów różnicowania komórek β: wynalazek przyczynia się do optymalizacji protokołów różnicowania komórek β trzustki in vitro z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Poprzez zastosowanie rh MMP2 w trakcie procesu różnicowania, uzyskujemy wyższą efektywność różnicowania oraz większą liczbę funkcjonalnych komórek β, co może przyspieszyć postęp w badaniach nad terapiami opartymi na komórkach β.

• Zwiększenie zrozumienia mechanizmów różnicowania komórek β: wynalazek pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów różnicowania komórek β trzustki poprzez identyfikację i weryfikację roli MMP2, jako kluczowego aktywatora tych procesów. Dzięki temu poszerzamy wiedzę na temat regulacji procesów różnicowania komórek β i otwieramy nowe możliwości terapeutyczne.

• Potencjalne zastosowania terapeutyczne: otrzymane komórki β mają potencjał terapeutyczny dla osób z cukrzycą.

Przykłady:

Sposób pozyskiwania komórek β trzustki przeprowadzono w następujący sposób: Komórki hPSCs hodowano w pożywce StemFlex (Thermo Fisher Scientific) na płytkach pokrytych witronektyną (rh VTN; Thermo Fisher Scientific) w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej, 5% CO2. Komórki pasażowano, co 3-4 dni za pomocą PBS-EDTA, kiedy ich konfluencja osiągała ~80%. Przed różnicowaniem komórki zdysocjowano za pomocą TrypLE (Thermo Fisher Scientific) w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Różnicowanie w kierunku komórek β trzustki przeprowadzano w formie organoidów 3D, płytka przez cały czas różnicowania była na wytrząsarce orbitalnej. Przed rozpoczęciem różnicowania organoidy przepłukano pożywką DMEM/F12. Pożywkę różnicującą do dnia 20 zmieniano codziennie, po dniu 20 co dwa dni według protokołu Nair i inni (Nair et al., 2019, Nat Cell Biol, 21(6), 792) z niewielkimi zmianami. Szczegółowy skład podstawowych pożywek przedstawiono w tabeli 1.

PL 248683 Β1

Tabela 1

Odczynnik	Dzień 1-3 (pożywka SI)	Dzień 4-6 (pożywka S2)	Dzień 7-12 (pożywka S3)	Dzień 13-19 (pożywka S5)	Dzień 20-26 (pożywka ESFM)
Pożywka MCDB131	1*	1*	1*	lx	1*
Suplement Olutamax (100*)	1 X		U		1·χ
Penicylina/Streptomycyna (10,000 U/mL, 100*)	X lOOU/ml	1*, lOOU/ml	lx, lOTU/ml	1«. I00U/mI	!>:, łOOU/ml
Glukoza	2,44 mM	2.44 mM	2,44 mM	20 mM	2,6 mM
Wadorowęglaii sodu	29 mM	13 mM	13 mM	18,5 mM	-
Roztwór aminokwasów (NEAA. 100*)	-		-	-
BSA	2%	2%	2%	2%	2,1%
ns-x	2 pl·'100 ml	2 pUlOU ml	500 pl/100 ml	500 phi 00 ml	-
Siarczan cynku	-	-	-	260 nM	1,04 μΜ
Siarczan heparyny	-	-	-	-	10 mg/1
Pierwiastki śladowe A (1000*)	-	-	-	-	1«
Pierwiastki śladowe B ([000«)	-		-	-	1X

Związki niskocząsteczkowe i białka kierunkujące różnicowanie dodawano każdego dnia do odpowiedniej objętości podstawowej pożywki różnicującej. Szczegółowy skład pożywki różnicującej używanej podczas różnicowania podano poniżej. W nawiasie zapisano stężenie końcowe związku niskocząsteczkowego lub białka.

• Dzień 1: podstawowa pożywka S1, CHIR99021 (3 pM), aktywina A (100 ng/ml), witamina C (250 pM).

• Dzień 2-3: podstawowa pożywka S1, aktywina A (100 ng/ml), witamina C (250 pM).

• Dzień 4-6: podstawowa pożywka S2, KGF (50 ng/ml), witamina C (250 pM), IWP2 (1,25 pM).

• Dzień 7: podstawowa pożywka S3, KGF (50 ng/ml), kwas retinowy (2 pM), PdBu (500 nM), SANT-1 (250 nM), LDN193189 (200 nM), witamina C (250 pM), Y-27632 (10 pM).

• Dzień 8-12: podstawowa pożywka S3, aktywina A (5 ng/mL), KGF (50 ng/ml), kwas retinowy (100 nM), SANT-1 (250 nM), witamina C (250 pM), Y-27632 (10 pM), IWP2 (1,25 pM), EGF (100 ng/mL), nikotynamida (10 mM). 216 • Dzień 13-19: podstawowa pożywka S5, kwas retinowy (100 nM), SANT-1 (250 nM), LY-411575 (1 pM), hormon T3 (1 pM), inhibitor Alk5 (10 pM), betcelulina (20 ng/mL), witamina C (250 pM).

• Dzień 20-26: podstawowa pożywka ESFM.

Protokół został przedstawiony na Fig. 1, która ilustruje etapy różnicowania in vitro z ludzkich PSC w kierunku komórek β trzustki. Na schemacie zaznaczono poszczególne stadia (hPSC - SC-β), dzień różnicowania, w którym osiąga się dane stadium oraz związki niskocząsteczkowe (np. CHIR, IWP2, T3), białka (np. Aktywina A - AA, KGF, EGF, Betacelulina) wpływające na osiągnięcie przez różnicowane komórki określonego stadium.

Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe trzy przykłady.

Przykład 1: Zastosowanie MMP2, jako aktywatora namnażania komórek β trzustki powstałych w procesie różnicowania z komórek hPSC.

W celu identyfikacji i weryfikacji roli MMP2, jako aktywatora proliferacji komórek β trzustki powstałych w procesie różnicowania z hPSC zastosowano rekombinowany ludzki MMP2 (rh MMP2) (R&D Systems) oraz inhibitor MMP2 (MMP2i) (Cayman Chemicals) w zakresie stężeń od 0,5 pM do 5 pM. rh MMP2 w zakresie stężeń 5-140 ng/mL był bezpośrednio dodawany do pożywki różnicującej zaczynając od etapu EPs. Wszystkie hPSCs hodowano i różnicowano do komórek SC-β tak jak przedstawiono w opisie powyżej i na Fig. 1. Następnie komórki poddano różnej analizie pod kątem ich zdolności proliferacyjnych. Komórki SC-β potraktowano 15 ng/ml rh MMP2, powodując dwukrotny wzrost ekspresji markera proliferacji Ki67 w komórkach z ekspresją INS, jak wykazała analiza cytometrii przepływowej przedstawiona na Fig. 2. Fig. 2 przedstawia kwantyfikację proliferujących komórek SC-β (INS+/Ki67+) za pomocą cytometrii przepływowej po traktowaniu rh MMP2. Zastosowano test t-Studenta. Dane przedstawiono, jako średnie ± SD. N = 3 replikacje biologiczne. Natomiast MMP2i wpływał na zależne od dawki zmniejszenie liczby komórek EndoC-βΜ, linii komórkowej wyprowadzonej z ludzkich płodowych komórek β - Fig. 3. Fig. 3. Przedstawia wykres przedstawiający konfluencję komórek EndoC-βΜ traktowanych różnymi stężeniami MMP2i przez pięć dni znormalizowanych do godziny zero. N = 3 replikacje biologiczne.

Zwiększona proliferacja komórek SC-β w obecności rh MMP2 utrzymywała się jeszcze przez kolejnych 6 pasaży - przedstawione na Fig. 4 i Fig. 5. Fig. 4 ilustruje schematyczne przedstawienie projektu eksperymentu mającego na celu ocenę długoterminowej ekspansji komórek SC-β w obecności MMP2. hPSC różnicowano do komórek β, a następnie hodowano i pasażowano albo w pożywce podstawowej, albo w pożywce uzupełnionej rh MMP2. W P6 wykryto niezwykły 142% wzrost liczby komórek z ekspresją C-PEP w obecności MMP2 - ilustruje Fig. 5. Wzrost proliferacji był specyficzny dla komórek produkujących C-PEP a nie dla komórek z ekspresją glukagonu GCG. Fig.5a przedstawia kwantyfikację procentu komórek C-PEP+ a Fig. 5b przedstawia kwantyfikację procentu komórek GCG+ SC-β podczas 5 pasaży w obecności rh MMP2. qRT-PCR wskazał zwiększoną ekspresję markerów komórek β: INS, CHGA, NKX6-1 i SUR1 w komórkach SC-β hodowanych z MMP2, co ilustruje Fig. 6. Fig.6 przedstawia analizę qRT-PCR poziomów ekspresji genów specyficznych dla komórek β, dla niepasażowanych i pasażowanych komórek SC-β w obecności MMP2. Wartości p oszacowano za pomocą testu t-Studenta. Dane przedstawiono, jako średnie ± SD. N = 3 repliki biologiczne.

Wnioski:

Długotrwałe traktowanie komórek SC-β rh MMP2 prowadziło do ich zwiększonej, utrzymującej się ekspansji i dojrzewania.

Przykład 2: Identyfikacja i weryfikacja roli MMP2, jako aktywatora wydzielania insuliny, zależnej od glukozy, przez komórki β trzustki powstałe w procesie różnicowania z hPSC.

W celu identyfikacji i weryfikacji roli MMP2, jako aktywatora wydzielania insuliny, zależnej od glukozy, przez komórki β trzustki powstałe w procesie różnicowania z hPSC zastosowano rekombinowany ludzki MMP2. rh MMP2 w zakresie stężeń 5-140 ng/mL był bezpośrednio dodawany do pożywki różnicującej zaczynając od etapu EPs. Wszystkie hPSCs hodowano i różnicowano do komórek SC-β tak jak w opisanym powyżej przykładzie i jak przedstawiono na Fig. 1. Następnie komórki poddano analizie wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (ang. glucose stimulated insulin secretion, GSIS) w celu oceny funkcji SC-β w obecności MMP2. Komórki inkubowano przez 1 godzinę w buforze Krebsa:128 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,7 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,1% BSA, następnie inkubowano w buforze Krebsa z niską zawartością glukozy 2,8 mM D-(+)-glukozy i wysoką zawartością glukozy 16,7 mM D-(+)-glukozy przez 30 minut w każdym etapie. Po każdym etapie inkubacji zbierano supernatanty. Komórki następnie zdysocjowano za pomocą TrypLE w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek i policzono (Countess, Inivitrogen). Insulinę ludzką zmierzono z supernatantów przy użyciu testu ELISA (Mercodia), zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki SC-β hodowane w pożywce podstawowej krótkoterminowo (P0) lub hodowane przez 6 pasaży (P6) jak i komórki traktowane rh MMP2 przez 6 pasaży (P6 MMP2) wykazywały minimalne wydzielanie INS w odpowiedzi na 2,8 mM glukozy. Natomiast, po stymulacji wysoką glukozą (16,7 mM) komórki SC-β - P6 MMP2 wydzielały znacząco więcej INS niż komórki hodowane krótko- lub długoterminowo w pożywce podstawowej, a po P6 komórki SC-β traktowane MMP2 zawierały więcej INS niż komórki nietraktowane. Na Fig. 7 przedstawiono wydzielanie insuliny w komórkach SC-β, zarówno niepasażowanych, jak i pasażowanych w obecności MMP2, traktowanych niską glukozą (2,8 mM) lub wysoką glukozą (16,7 mM) znormalizowaną do całkowitej liczby komórek. Do określenia wartości p przedstawionych na wykresie zastosowano analizę ANOVA dla wielokrotnych porównań. Dane przedstawiono, jako średnie ± SD. N = 3 repliki biologiczne.

Wnioski:

Traktowanie rekombinowanym białkiem MMP2 komórek różnicujących w kierunku komórek β spowodowało wyraźną krótko- i długoterminową ekspansję komórek SC-β in vitro, znacząco zwiększając wydzielanie przez nie insuliny stymulowanej glukozą.

PL 248683 Β1

Przykład 3: Pozytywny wpływ MMP2 na funkcjonalność SC-β in vivo.

Aby ocenić funkcjonalność in vivo, przeszczepiono 1,5x10⁶ komórek SC-β nieekspandowanych, albo ekspandowanych w obecności MMP2, pod torebki nerkowe myszy SCID-Beige (o obniżonej odporności). Po 3 tygodniach sprawdzono ludzki C-PEP w surowicy krwi myszy na czczo i po stymulacji glukozą. Fig. 8 ilustruje pomiary przy użyciu testu ELISA ludzkiego C-PEP w surowicy myszy, którym przeszczepiono porównywalną liczbę komórek SC-β traktowanych krótko- i długoterminowo rh MMP2. Jako kontroli użyto pierwotnych ludzkich wysepek trzustkowych (~700 IEQ) do przeszczepu. Pomiary wykonano przed i 60 minut po wstrzyknięciu glukozy myszom 3 tygodnie po przeszczepieniu. W celu określenia wartości p zastosowano test ANOVA. Dane przedstawiono, jako średnie ± SD. N = 14 replik biologicznych. Nie wykryto ludzkiego C-PEP u myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną pod torebkę nerki. Poziom C-PEP w surowicy był prawie dwukrotnie wyższe u myszy z implantami komórek β traktowanych MMP 2 w porównaniu z grupą kontrolną i był podobny do poziomu C-PEP u myszy z przeszczepionymi ludzkimi pierwotnymi wyspami trzustkowymi (~700 IEQ). Następnie przeprowadzono dootrzewnowy test tolerancji glukozy IPGTT na myszach z komórkami SC-β nietraktowanymi i traktowanymi rh MMP2. Fig. 9a ilustruje poziom glukozy we krwi u myszy SCID 3 tygodnie po przeszczepieniu komórkami SC-β traktowanych rh MMP2 (MMP2) lub nie traktowanych (cntr). Myszy głodzono przez 16 godzin, a następnie mierzono poziom glukozy we krwi przed (0 minut) oraz 15, 30, 60 i 90 minut po wstrzyknięciu glukozy. Dane przedstawiono, jako średnie ± SD. N = 4 repliki biologiczne. Wartość p określono za pomocą testu t-Studenta. Sprawdzono również, czy komórki SC-β ekspandowane w obecności rh MMP2 mogą utrzymać euglikemię po indukowanej streptozotocyną (STZ) utracie endogennych mysich komórek β - ilustruje fig. 9 b.

Wnioski:

Seryjne pasażowanie komórek SC-β w obecności MMP2 wzmacnia ich funkcjonalność in vivo, podobnie jak ma to miejsce in vitro.

Claims (1)

1. Zastosowanie MMP2, jako regulatora in vitro różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku komórek β trzustki.