PL248424B1

PL248424B1 - Sposób eradykacji drobnoustrojów chorobotwórczych z powierzchni płaskich

Info

Publication number: PL248424B1
Application number: PL441356A
Authority: PL
Inventors: Agata Motyka-Pomagruk; Wojciech Śledź; Michał Prusiński; Jakub Orłowski; Weronika Babińska; Ewa Łojkowska; Anna Dzimitrowicz; Piotr Jamroz; Paweł Pohl; Jerzy Dora
Original assignee: Politechnika Wroclawska; Univ Gdanski
Priority date: 2022-06-02
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2025-12-08
Also published as: EP4285859A1; EP4285859B1; PL441356A1; EP4285859C0

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób eradykacji drobnoustrojów z powierzchni płaskich, w tym skóry, odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi oraz układ do realizacji sposobu, który charakteryzuje się tym, że stosuje się bezpośrednią ekspozycję powierzchni płaskich na zimną plazmę atmosferyczną (ang. Cold Atmospheric Pressure Plasma, CAPP), generowaną w formie wyładowań barierowych (ang. Dielectric Barrier Discharge, DBD) w formie strugi gazowej. Proces przeprowadza się stosując układ plazmowy z generatora prądu połączonego do: a) kwarcowej kapilary z elektrodami wolframowymi, b) wnęki z żywicy epoksydowej oraz c) wypełnienia wnęki wykonanego z krzemionki oraz izolatora. Do zwalczania chorobotwórczych drobnoustrojów stosuje się CAPP generowaną z użyciem helu jako gazu wyładowczego, który aplikowany jest do układu reakcyjno-wyładowczego z szybkością przepływu 2-10 L/min, a stosowana CAPP wytwarzana jest przy zastosowaniu prądu zmiennego o wartości wypełnienia 70% oraz częstotliwości modulującej 70%.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób unieczynniania drobnoustrojów odpowiedzialnych za infekcje u zwierząt i ludzi, zwłaszcza infekcje skórne, przykładowo mikroorganizmów z rodzajów Staphylococcus, Candida czy Dermatophilus, poprzez zastosowanie bezpośredniej ekspozycji powierzchni płaskiej na wybrany rodzaj plazmy, zwłaszcza powierzchni występujących w środowiskach szpitalnych na wybraną plazmę atmosferyczną.

W pracy autorstwa Sedghizadeh, P. P., Chen, M. T., Schaudinn, C., Gorur, A., & Jiang, C. pt.: „Inactivation kinetics study of an atmospheric-pressure cold-plasma jet against pathogenic microorganisms ” (IEEE Transactions on Plasma Science 2012, 40(11): 2879) opisano zastosowanie zimnej plazmy atmosferycznej CAPP (ang. Cold Atmospheric Pressure Plasma, CAPP) do zahamowania procesu namnażania się mikroorganizmów patogennych z gatunków Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli oraz Candida albicans. Plazmę inicjowano w stacjonarnym układzie plazmowym, w atmosferze helu, wykorzystując do inicjowania CAPP wyładowania pulsacyjne (1-2 kHz) w formie strugi gazowej. Opisano układ za pomocą którego realizowano eliminację komórek mikroorganizmów zbudowany z nanosekundowego generatora wysokiego napięcia (6 kV) o częstotliwości radiowej (1-2 kHz) oraz głowicy CAPP. Na tak generowaną CAPP eksponowano przez 180 s płytki agarowe z wysianą wcześniej murawą komórek analizowanych drobnoustrojów w liczbie 105, 106, 10⁷ komórek/cm². Po przeprowadzeniu traktowania mikroorganizmów z użyciem CAPP, wyznaczono w obrębie płytek agarowych z posianymi drobnoustrojami centralnie położoną strefę o średnicy 12 mm, nazwaną przez autorów ROI (ang. region of interest). Strefy ROI wykrojono z płytek agarowych oraz zawieszono w sterylnej wodzie w efekcie procesu sonikacji, przebiegającego w temperaturze pokojowej przez 5 min. Kolejno, zawiesiny bakteryjne przygotowane ze stref ROI zostały seryjnie rozcieńczone oraz posiane na podłoża agarowe celem przeprowadzenia inkubacji przez 16 h, zliczenia jednostek tworzących kolonie oraz późniejszej kalkulacji logarytmów redukcji w liczbie jtk drobnoustrojów patogennych. W oparciu o tak zaprojektowane analizy, zaraportowano efektowość zastosowania CAPP, inicjowanego przez 180 s, względem bakterii patogennych, przekraczającą 4 logarytmy redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie, natomiast w kwestii uwzględnionych w pracach drożdży C. albicans skuteczność opisanego rozwiązania przekraczała 3,5 log. Autorzy stwierdzili również, że krótsze czasy ekspozycji na tak inicjowaną CAPP ujawniają różnice w podatności analizowanych mikroorganizmów na stosowaną terapię. 5-30 s ekspozycja na stosowaną strugę gazową ujawniła wyższą podatność bakterii Gram(+), w stosunku do bakterii Gram(-), na krótsze czasy ekspozycji. Odwrotny efekt obserwowano przy dłuższych czasach działania CAPP, tj. np. 180 s. Jednakże przyjęta metodyka badawcza nie była konwencjonalna i w pełni zgodna ze standardami pracy mikrobiologicznej. Płytki agarowe z pożywkami służą namnażaniu mikroorganizmów i są niezbyt trafnie dobranym materiałem do poddania go ekspozycji na CAPP. Taki sposób zaplanowania eksperymentu nie oddaje realnej sytuacji, w której CAPP byłaby aplikowana względem drobnoustrojów patogennych. Zabrane informacje nie mówią też nic o eradykacji drobnoustrojów tworzących biofilm czy kolonizujących tkankę gospodarza. Ponadto, liczbę komórek mikroorganizmów, według konwencji przyjętej w literaturze przedmiotu, podaje się albo w formie bezpośredniej (liczba jtk) albo w formie liczby jednostek tworzących kolonie zawieszonych w odpowiedniej objętości roztworu (jtk/cm³). W przytoczonej pracy raportowano liczbę komórek mikroorganizmów na jednostkę powierzchni (komórki/cm²), jednakże brak jest w tym manuskrypcie opisu sposobu wyliczenia tego parametru. Stąd, nie ma pewności czy wycinano ROI z zaszczepionych testowanymi mikroorganizmami płytek agarowych, niepoddanych ani działaniu plazmy ani samego gazu wyładowczego, by oszacować tę wartość bądź alternatywnie skąd pochodzą przedstawione założenia o liczbie komórek uwzględnionej w danym eksperymencie. Kwestia sposobu zliczania komórek wydaje się być kluczowa, zwłaszcza, że w sekcji B opisano, że wartość ta służyła do oszacowania logarytmów redukcji w liczbie jtk mikroorganizmów patogennych, czyli de facto do oceny skuteczności całego procesu. Nie bez znaczenia jest fakt, że autorzy zaraportowali zależność efektywności eradykacji drobnoustrojów od liczby komórek drobnoustrojów patogennych zawieszonych w roztworze (sekcja III). Innym aspektem wymagającym głębszej uwagi jest kwestia wyznaczenia średnicy stref ROI. Nie sprecyzowano na jakiej podstawie przyjęto, że należy analizować strefę o średnicy 10-krotnie większej niż średnica samej końcówki strugi gazowej. Zważywszy na uzyskane średnice stref zahamowania wzrostu, przedstawione w manuskrypcie w Figurze 2, wyznaczenie stref ROI przez autorów wydaje się mieć dość losowy charakter.

W innym manuskrypcie, opublikowanym przez Nasir, N. M., Lee, B. K., Yap, S. S., Thong, K. L., & Yap, S. L. pt.: „Coldplasma inactivation of chronic wound bacteria”. (Archives of Biochemistry and Biophysics 2016, 605: 76) opisano użycie CAPP, tym razem wygenerowanej w dwóch alternatywnych systemach, tj. w planarnym systemie plazmowym generowanym w formie strugi gazowej, w układzie plazmowym z wyładowaniami barierowymi (ang. Dielectric Barrier Discharge, DBD), jak również w przenośnym systemie plazmowym z wyładowaniami koronowymi, kierowanymi przez kapilarę (CGCD), względem bakterii odpowiedzialnych za ostre oraz chroniczne infekcje ran, a przynależących do gatunków S. aureus oraz P. aeruginosa. W analizach uwzględniono szczepy kliniczne S. aureus (trzy izolaty) oraz P. aeruginosa (cztery izolaty). Opisano układ CAPP generowany z użyciem DBD za pomocą którego realizowano unieczynnienie komórek bakteryjnych, zbudowany z elektrod ze stali o średnicy 6,0 cm i grubości 1,5 cm. Jako barierę elektryczną zastosowano szkło Pyrex o grubości 2,0 mm. 50 ąl z kultury nocnej bakterii umieszczano na szklanym szkiełku, które eksponowano następnie na działanie CAPP, generowanej w stacjonarnym systemie plazmowym w wyniku inicjowania DBD w przestrzeni pomiędzy elektrodami, wykonanymi ze stali nierdzewnej (średnica 6,0 cm, grubość 1,5 cm), przez okres do 60 min. Kolejno szkiełka z drobnoustrojami eksponowanymi na wyładowania były umieszczane w 50 ml buforowanego fosforanami chlorku sodu (PBS) oraz poddane wytrząsaniu. Następnie, wykonano seryjne rozcieńczenia i posiewy drobnoustrojów na podłoże TSA. Płytki inkubowano w 37°C przez 24 h aby zliczyć jtk/ml. Ekspozycja S. aureus na DBD przez okres 60 min skutkowała redukcją w liczbie jednostek tworzących kolonie tych patogennych mikroorganizmów na poziomie powyżej 2 logarytmów. Ten rodzaj wyładowania okazał się być znacznie skuteczniejszy względem czterech szczepów P. aeruginosa, gdyż już po 40 min ekspozycji obserwowano redukcję w liczbie jtk/ml na poziomie powyżej 9 logarytmów. Natomiast zastosowanie CGCD skutkowało redukcją w liczbie jtk/ml > 9 logarytmów już w 10 min bądź 30 min, odpowiednio w odniesieniu do gatunków P. aeruginosa i S. aureus. Jednak przytoczone wyniki wydają się być nieprzekonujące. Według dostępnych informacji, Figura 14 z manuskryptu zestawia porównanie efektywności DBD oraz CGCD względem szczepu P. aeurginosa nazwanego pa 20, prezentując w inny sposób dane już umieszczone w Figurach 10 oraz 12. W przypadku CGCD przedstawione rezultaty są zbieżne, jednakże dynamika spadku żywotności szczepu pa 20 w efekcie ekspozycji na wyładowania DBD zwizualizowana na Figurze 10, wydaje się nie pokrywać z danymi przedstawionymi wcześniej w Figurze 14. W sekcji 2.3. umieszczono informację, że CAPP aplikowano w czasie od 1 min do 30 min, jednakże przedstawione w pracy wykresy oraz sekcja „wyniki”, zawiera dane z przedziału czasu ekspozycji do 60 min. Stąd, oprócz relatywnie długich czasów ekspozycji, nie ma pewności co do skuteczności takiej metodyki.

W kolejnej pracy, tym razem opublikowanej przez Maisch, T., Shimizu, T., Li, Y. F., Heinlin, J., Karrer, S., Morfill, G., & Zimmermann, J. L. pt.: „Decolonisation of MRSA, S. aureus and E. coli by coldatmospheric plasma using a porcine skin model in vitro ” (PloS one 2012 277(4):e34610) zaraportowano po raz pierwszy bezpośrednie zastosowanie CAPP do wywołania dekolonizacji Gram(+) i Gram(-) bakterii chorobotwórczych względem ludzi i zwierząt z modelu skóry świńskiej. Testowano efektywność aplikacji dwóch komercyjnie dostępnych urządzeń generujących CAPP, tj. FlatPlaSter oraz miniFlatPlaSter, pod kątem ich zdolności do eradykacji trzech szczepów Staphylococcus aureus (dwa metycylinoporne: ATCC BAA-44 i ATCC 43300 oraz jeden szczep metycylinowrażliwy: ATCC 25923) oraz jednego szczepu Escherichia coli ATCC 25922. Opisano układ CAPP za pomocą którego realizowano eradykację bakterii zbudowany z elektrod płaskich wykonanych z mosiądzu i siatki stalowej, zamkniętych w pojemniku wykonanym z tworzywa sztucznego. Do generowania CAPP zastosowano napięcie 9 kV i częstotliwość 1 kHz. Aplikacja urządzenia FlatPlaSter przez 6 min prowadziła do uzyskania 3 logarytmów redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie (jtk) zarówno bakterii z gatunków S. aureus jak i E. coli. Wydłużenie czasu ekspozycji na CAPP do 8 min skutkowało zwiększeniem efektywności stosowanego urządzenia, prowadząc do obserwowanej redukcji w liczbie jtk przekraczającej 5 logarytmów. Stwierdzono podobną skuteczność urządzenia generującego CAPP zarówno w stosunku do szczepów metycylinoopornych jak i metycylinowrażliwych gronkowca złocistego. W porównaniu do FlatPlaSter, system miniFlatPlaSter okazał się być efektywniejszy w zwalczaniu uwzględnionych w analizach mikroorganizmów, gdyż już 5 min działania tak uzyskanego CAPP prowadziło do redukcji w liczbie jtk przekraczającej 3 log. Wspomniano również o stwierdzonym braku uszkodzeń tkanki skórnej traktowanej z użyciem CAPP. Warto jednakże podkreślić, że stosowano CAPP od razu po zainicjowaniu infekcji bakteryjnej (inokulum: 10^6-7 jtk/ml) na wybranym modelu świńskiej skóry. Stosując taką metodykę, drobnoustroje nie mają możliwości przeprowadzenia kolonizacji tkanki skórnej, co oznacza, że usunięcie komórek tych mikroorganizmów z traktowanej za pomocą CAPP powierzchni jest znacząco ułatwione. Obrany model eksperymentalny nie odzwierciedla w rzetelny sposób realnej potrzeby medycznej eradykacji drobnoustrojów, które zasiedliły daną tkankę i/lub stworzyły trudno-przepuszczalną dla leków warstwę biofilmu.

Trudno gojące się rany stanowią źródło ostrego i/lub przewlekłego bólu, co w znaczący sposób przyczynia się do obniżenia jakości życia i gorszych rokowań dla zakażonych wielolekoopornymi szczepami bakteryjnymi zwierząt hodowlanych. Bakterie najczęściej izolowane z ran zwierząt, przynależą do gatunków infekujących również pacjentów w środowisku szpitalnym. Warto podkreślić szczególną zjadliwość i trudność w zwalczeniu patogenów pozyskiwanych ze środowisk szpitalnych jak również ograniczoną skuteczność stosowanych konwencjonalnych terapii antybiotykowych. Obecnie antybiotyki przypisywane są bardzo często celem zwalczenia chorób powodowanych przez wirusy, nie prowadzi się też rutynowo oznaczania profili lekooporności zwalczanych drobnoustrojów. Aplikowane są leki o szerokim spektrum działania, często w niewłaściwych dawkach, a pacjenci odstawiają przypisane medykamenty, gdy tylko poczują się lepiej. Dla powszechności występowania w środowisku naturalnym tych leków nie bez znaczenia jest fakt nadmiernego stosowania antybiotyków w hodowli zwierząt do zwiększenia przyrostu biomasy oraz w efekcie założeń prewencyjnych. Wysoka dostępność cząsteczek antybiotyków w środowisku tworzy znaczącą presję selekcyjną na eksponowane na ich subletalne dawki drobnoustroje, co prowadzi do rozprzestrzenia się między bakteriami, a następnie utrzymywania w ich populacjach determinant genetycznych wielolekooporności. Biorąc pod uwagę, że dotychczas stosowane opcje terapeutyczne są wysoce niewystarczające, celem wynalazku było opracowanie nowych, ekologicznych, jak również skutecznych, metod zwalczania patogenów odpowiedzialnych za infekcje u zwierząt i ludzi, zwłaszcza infekcje skórne.

Do tej pory stan techniki wskazuje, że podejmowano tylko cząstkowe próby zwalczania drobnoustrojów odpowiedzialnych z powierzchni płaskich z użyciem CAPP, co zostało opisane w powyżej przytoczonych przykładach literaturowych. Jednak nie ma pewności co do możliwości przełożenia przedstawionych rezultatów prac naukowych na wdrożenie tych rozwiązań z oczekiwanym efektem, w sposób niewymagający dalszych eksperymentów badawczych.

Wynalazek stanowi sposób zwalczania drobnoustrojów z powierzchni płaskich - powierzchnie meblowe, zwłaszcza w szpitalach, z zastosowaniem bezpośredniej ekspozycji na CAPP, inicjowaną w wyniku generowania wyładowań DBD w formie strugi gazowej.

Istota sposobu eradykacji drobnoustrojów chorobotwórczych z powierzchni płaskich polegający na tym, że z powierzchni płaskich, szczególnie powierzchni występujących w środowisku szpitalnym, poprzez bezpośrednią ekspozycję na CAPP, generowaną w wyniku inicjowania DBD ze strugi gazowej (atmosfera helu) charakteryzujący się tym, że generuje się plazmę atmosferyczną stosując prąd zmienny o wartości wypełnienia 70% oraz częstotliwości modulującej 70%, a zwalczanie drobnoustrojów prowadzi się stosując do wytworzenia CAPP hel jako gaz wyładowczy, aplikowany z szybkością przepływu 2-10 L/min, przy czym powierzchnia płaska z której unieczynnia się drobnoustroje traktowana jest wyładowaniem DBD, a taka ekspozycja trwa od 10 sekund do 10 minut, najkorzystniej 2 minuty, a odległość eksponowanej powierzchni płaskiej od stożka CAPP wynosi 2 mm - 10 cm, najkorzystniej 3 cm.

Korzystnie, gdy powierzchnia płaska z której unieczynnia się drobnoustroje traktowana jest jednokrotnie lub dwukrotnie wyładowaniem DBD.

Korzystnie, gdy wyładowaniem DBD unieczynnia się komórki drobnoustrojów patogennych bytujących na powierzchniach płaskich, w szczególności mikroorganizmy z gatunków S. aureus, S. epidermidis, C. albicans oraz D. congolensis.

Korzystnie, gdy wyładowaniem DBD traktuje się powierzchnie płaskie występujące w środowisku szpitalnym.

Podczas realizacji badań określono także istotne warunki generowania CAPP, przyczyniające się do zwiększenia skuteczności zaproponowanego sposobu eradykacji drobnoustrojów z powierzchni płaskich. Badania wykazały silną zależność realizacji sposobu od warunków generowania CAPP, tj. wartości wypełnienia prądu wynoszącej 70%, częstotliwości modulującej ten prąd wynoszącej 70%, szybkości przepływu gazu wyładowczego mieszczącego się w zakresie od 2 do 10 L/min, temperatury stożka plazmy <38°C, czasu ekspozycji na CAPP traktowanej powierzchni w zakresie od 10 sekund do 10 minut, najkorzystniej 2 minuty, liczby pojedynczych ekspozycji traktowanego materiału na CAPP w zakresie 1-2, odległości eksponowanej powierzchni płaskiej od stożka CAPP, tj. od 2 mm do 10 cm, najkorzystniej 3 cm. Dobór powyższych parametrów, przede wszystkim czasu ekspozycji, zależy od miana drobnoustrojów, a także rodzaju i wielkości sterylizowanej powierzchni.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w formie trzech przykładów, obrazujących sposób zwalczania drobnoustrojów z powierzchni płaskich poprzez bezpośrednią ekspozycję na CAPP, generowaną w wyniku inicjowania DBD w formie strugi plazmowej, oraz na 4 figurach:

- na Figurze 1. przedstawiono schemat układu reakcyjno-wyładowczego do wytwarzania CAPP, generowanej w wyniku inicjowania DBD ze strugi gazowej w atmosferze helu stosowany, według wynalazku, do eliminowania komórek mikroorganizmów patogennych względem ludzi i zwierząt. Ten układ reakcyjno-wyładowczy, według wynalazku, zbudowany jest z generatora prądu częstotliwości radiowej modulowanej za pomocą pulsów połączonego do: a) kwarcowej kapilary zawierającej elektrody wolframowe umieszczone na zewnątrz rurki kwarcowej b) wnęki (głowicy) z żywicy epoksydowej c) wypełnienia wnęki wykonanego z krzemionki oraz izolatora, przy czym stosuje się hel jako gazu wyładowczy do wytworzenia CAPP, wtłaczany do układu reakcyjno-wyładowczego przy szybkości przepływu 2-10 L/min.

- na Figurze 2. przedstawiono eradykację, w efekcie ekspozycji na CAPP generowaną w układzie plazmowym z DBD w formie strugi gazowej, mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje ran z gatunków S. aureus, S. epidermidis, C. albicans oraz D. congolensis, aplikowanych na powierzchnię płaską w zawiesinie o gęstości optycznej 0,5 McF. Wyniki przedstawiono w formie wykresu ramka-wąsy, obrazującego medianę oraz poszczególne kwartyle rozkładu danych, tyczącego się obserwowanego procentu redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie drobnoustrojów S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, w efekcie zastosowywania CAPP, według wynalazku, w odniesieniu do nietraktowanych tym wyładowaniem prób kontrolnych. Eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, każde z nich obejmowało dwa powtórzenia techniczne.

- na Figurze 3 przedstawiono eradykację, w efekcie ekspozycji na CAPP generowaną w układzie plazmowym z DBD w formie strugi gazowej, mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje ran z gatunków S. aureus, S. epidermidis, C. albicans oraz D. congolensis, aplikowanych na powierzchnię płaską w zawiesinie o gęstości optycznej 0,05 McF. Wyniki przedstawiono w formie wykresu ramka-wąsy, obrazującego medianę oraz poszczególne kwartyle rozkładu danych, tyczącego się obserwowanego procentu redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie drobnoustrojów S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, wynikające z zastosowywania CAPP, według wynalazku, w odniesieniu do nietraktowanych tym wyładowaniem prób kontrolnych. Eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, każde z nich obejmowało dwa powtórzenia techniczne.

- na Figurze 4. przedstawiono eradykację, w efekcie ekspozycji na CAPP generowaną w układzie plazmowym z DBD w formie strugi gazowej, mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje ran z gatunków S. aureus, S. epidermidis, C. albicans oraz D. congolensis, aplikowanych na powierzchnię świńskiej skóry w zawiesinie o gęstości optycznej 0,5 McF. Wyniki przedstawiono w formie wykresu ramka-wąsy, obrazującego medianę oraz poszczególne kwartyle rozkładu danych, tyczącego się obserwowanego procentu redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie drobnoustrojów S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, wynikające z zastosowywania CAPP, według wynalazku, w odniesieniu do nietraktowanych tym wyładowaniem prób kontrolnych. Eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, każde z nich obejmowało dwa powtórzenia techniczne.

Przykład 1

Sposób eradykacji drobnoustrojów odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi osiągnięty poprzez zastosowanie CAPP, a wykazany poprzez unieczynnienie zawiesiny komórek mikroorganizmów patogennych o gęstości optycznej 0,5 McF na powierzchni płaskiej

Właściwości przeciwdrobnoustrojowe CAPP, wytworzonej w układzie plazmowym z DBD, generowanej w formie strugi gazowej, udowadnia się poprzez ujawnienie zdolności tak wytworzonej CAPP do eradykacji z powierzchni płaskiej komórek następujących mikroorganizmów patogennych odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi: S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, które aplikowano na podłoże polistyrenowe w zawiesinie o gęstości optycznej 0,5 McF.

Badane szczepy drobnoustrojów, tj. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, są dostępne w banku patogenów Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego (MWB UG i GUMed), w postaci zamrożonych hodowli w jałowym 40% (v/v) roztworze glicerolu, a przetrzymywane są w temperaturze -80°C. Aby przeprowadzić eksperymenty z użyciem pojedynczej kolonii danego mikroorganizmu, wymienione powyżej szczepy patogenów wysiewa się z zastosowaniem techniki posiewu redukcyjnego na pożywkę stałą. W przypadku S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637 stosuje się do posiewów płytki z agarem mózgowosercowym (ang. Brain Heart Infusion-Agar; BHI-A), natomiast drożdżaki C. albicans ATCC 90028 inokulowane są na płytki zawierające zestalony agarem ekstrakt drożdżowy, pepton i glukozę (ang. Yeast extract Peptone Glucose Agar; YPG-A). Inkubację zaszczepionych drobnoustrojami płytek stałych prowadzi się przez 24 h dla S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 i C. albicans ATCC 90028 w temperaturze 37°C oraz 72 h dla D. congolensis ATCC 14637 również w temperaturze 37°C, ale w atmosferze o 5% zawartości CO2. Następnie pobiera się pojedynczą kolonię mikroorganizmu z użyciem jałowej ezy i inokuluje nią pożywkę płynną. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637 hodowane są w bulionie mózgowo-sercowym (ang. Brain Heart Infusion; BHI), natomiast drożdżaki C. albicans ATCC 90028 namnaża się w pożywce płynnej z ekstraktem drożdżowym, peptonem i glukozą (ang. Yeast extract Peptone Glucose; YPG). Zaszczepione pożywki płynne inkubuje się w 37°C przez 12 h przy wytrząsaniu 140 rpm. Hodowle nocne otrzymane w ten sposób wiruje się przy 6500 rpm przez 4 min, usuwa supernatant, a osad komórek drobnoustrojów zawiesza się w 1 ml jałowego roztworu Ringera. Następnie zawiesinę mikroorganizmów w roztworze Ringera poddaje się kolejnemu wirowaniu przy 6500 rpm przez 4 min, a uzyskany supernatant usuwa. Powstały osad komórek mikroorganizmów ponownie zawiesza się w 1 ml roztworu Ringera. Po wykonaniu następnego, przeprowadzonego w opisany powyżej sposób, płukania osadu mikroorganizmów roztworem Ringera, komórki z uzyskanego osadu zawiesza się w 1 ml roztworu Ringera. Taką zawiesinę mikroorganizmów wprowadza się do 10 ml roztworu Ringera, znajdującego się w szklanej probówce o pojemności 15 ml, w takiej objętości by bazując na pomiarach densytometrycznych z użyciem densytometru DEN-1B (BioSan, Łotwa), doprowadzić gęstość optyczną zawiesiny komórek mikroorganizmów do 0,5 McF. Powyżej opisane czynności prowadzi się dla każdego testowanego szczepu patogennego tj. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637.

Do płaskodennych, 24-dołkowych płytek wykonanych z polistyrenu, nanosi się 500 pl zawiesiny komórek mikroorganizmu patogennego (S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 lub D. congolensis ATCC 14637) o gęstości optycznej 0,5 McF. Tak przygotowane płytki 24-dołkowe inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby umożliwić adhezję komórek wprowadzonego mikroorganizmu do dna studzienki. Następnie, pozostałości pożywki znad absorbowanych do polistyrenu komórek usuwa się z użyciem pipety automatycznej. Komórki mikroorganizmu obecne na powierzchni dna studzienki poddaje się 1 -minutowej ekspozycji na CAPP, generowaną w wyniku inicjowania wyładowań DBD w układzie reakcyjno-wyładowczym (Figura 1) w formie strugi gazowej z zastosowaniem następujących parametrów: szybkość przepływu gazu wyładowczego, tj. helu: 5,2 L min^-1, wartość wypełnia prądu: 70%, wartość częstotliwości modulująca ten prąd: 70%, temperatura stożka plazmy = 37°C. Po zakończeniu działania CAPP wprowadza się do każdego dołka po 200 pl jałowego roztworu Ringera i prowadzi wytrząsanie przy 1000 rpm przez 10 min, celem oderwania od dna studzienek komórek drobnoustrojów, które przeżyły traktowanie stosowaną plazmą. Kolejnym krokiem jest wykonanie seryjnych rozcieńczeń do 10^-3 tak uzyskanej zawiesiny komórkowej, aby na następnym etapie prac metodą posiewu na murawę inokulować na pożywki stałe (BHI-A: S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637; YPG-A: C. albicans ATCC 90028) po 100 pl z przygotowanych seryjnych rozcieńczeń. Po inkubacji w 37°C trwającej 24 h dla S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz 72 h w atmosferze o 5% zawartości CO2 dla D. congolensis ATCC 14637, wykonuje się zliczenie jednostek tworzących kolonie wyrosłych na zaszczepionych wcześniej płytkach agarowych. Liczba jednostek tworzących kolonie dla prób badawczych traktowanych CAPP przyrównywana jest do liczby jednostek tworzących kolonie w próbach kontrolnych, niepoddanych działaniu DBD. Eksperyment wykonuje się dla szczepów S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, aplikowanych na płytki 24-dołkowe w zawiesinie o gęstości optycznej 0,5 McF, w trzech powtórzeniach biologicznych, w tym każde z nich obejmuje dwa powtórzenia techniczne.

Efektywność opisywanego sposobu eradykacji drobnoustrojów odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi poprzez bezpośrednie działanie zimnej plazmy atmosferycznej ocenia się poprzez wyznaczenie procentu oraz logarytmu redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, będących skutkiem działania CAPP generowanej w systemie plazmowym z DBD w formie strugi gazowej, w odniesieniu do nietraktowanych tym wyładowaniem prób kontrolnych.

Skuteczność raportowanego sposobu eradykacji drobnoustrojów odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi poprzez bezpośrednią ekspozycję na działanie CAPP mikroorganizmów aplikowanych w zawiesinie o gęstości optycznej 0,5 McF na powierzchnię płaską zobrazowano na Fig. 2:

- Przeciwdrobnoustrojowe właściwości CAPP, generowanej w układzie plazmowym w wyniku inicjowania DBD w formie strugi gazowej, w stosunku do mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi aplikowanych na powierzchnię płaską w zawiesinie o gęstości optycznej 0,5 McF (Fig. 2). Układ do generacji CAPP poprzez DBD zbudowany jest z głowicy zimnej plazmy atmosferycznej przez którą przepływa gaz oraz z generatora pulsującego wysokiej częstotliwości jak przedstawiono na Fig. 1. Układ reakcyjno-wyładowczy, zbudowany jest z generatora prądu częstotliwości radiowej modulowanej za pomocą pulsów połączonego do: a) kwarcowej kapilary zawierającej elektrody wolframowe umieszczone na zewnątrz rurki kwarcowej b) wnęki (głowicy) z żywicy epoksydowej c) wypełnienia wnęki wykonanego z krzemionki oraz izolatora. W efekcie przeprowadzonych badań wykazano, że 1 min działanie DBD spowodowało redukcję w liczbie żywych komórek mikroorganizmów patogennych w zakresie średnich dla testowanych gatunków 99,97475-100%. Odnosząc się do logarytmu redukcji, zastosowane wyładowanie, według wynalazku, prowadziło do redukcji w liczbie żywych komórek drobnoustrojów przekraczającej średnią wartość 3,598 log. Na Figurze 2 zobrazowano (wykres ramka-wąsy, przedstawiający medianę oraz poszczególne kwartyle rozkładu danych. Okręgi odpowiadają wartościom odstającym) procent redukcji w liczbie jtk S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, które to drobnoustroje aplikowano wcześniej na powierzchnię płaską w formie zawiesiny o gęstości optycznej 0,5 McF, przy czym wspomniany procent redukcji w liczbie żywych komórek mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje skórne wynikał z ekspozycji wspomnianej powierzchni płaskiej na generowaną CAPP w odniesieniu do nietraktowanej plazmą grupy kontrolnej. Dane różnią się w statystycznie istotny sposób (test KruskalaWallisa, p < 0,05), gdy są oznaczone inną literą.

Przykład 2

Sposób eradykacji drobnoustrojów odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi osiągnięty poprzez zastosowanie CAPP, a wykazany poprzez unieczynnienie zawiesiny komórek mikroorganizmów patogennych o gęstości optycznej 0,05 McF na powierzchni płaskiej

Właściwości przeciwdrobnoustrojowe CAPP, wytworzonej w układzie plazmowym z DBD, generowanej w formie strugi gazowej, udowadnia się poprzez ujawnienie zdolności tak wytworzonej CAPP do eradykacji z powierzchni płaskiej komórek następujących mikroorganizmów patogennych, odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi: S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, które aplikowano na podłoże polistyrenowe w zawiesinie o gęstości optycznej 0,05 McF.

Badane szczepy drobnoustrojów, tj. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, są dostępne w banku patogenów MWB UG i GUMed w postaci zamrożonych hodowli w jałowym 40% (v/v) roztworze glicerolu, a przetrzymywane są w temperaturze -80°C. Aby przeprowadzić eksperymenty z użyciem pojedynczej kolonii danego mikroorganizmu, wymienione powyżej szczepy patogenów wysiewa się z zastosowaniem techniki posiewu redukcyjnego na pożywkę stałą. W przypadku S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637 stosuje się do posiewów płytki z agarem mózgowo-sercowym (BHI-A), natomiast drożdżaki C. albicans ATCC 90028 inokulowane są na płytki zawierające zestalony agarem ekstrakt drożdżowy, pepton i glukozę (YPG-A). Inkubację zaszczepionych drobnoustrojami płytek stałych prowadzi się przez 24 h dla S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 i C. albicans ATCC 90028 w temperaturze 37°C oraz 72 h dla D. congolensis ATCC 14637 również w temperaturze 37°C, ale w atmosferze o 5% zawartości CO2. Następnie pobiera się pojedynczą kolonię mikroorganizmu z użyciem jałowej ezy i inokuluje nią pożywkę płynną. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637 hodowane są w bulionie mózgowo-sercowym (BHI), natomiast drożdżaki C. albicans ATCC 90028 namnaża się w pożywce płynnej z ekstraktem drożdżowym, peptonem i glukozą (YPG). Zaszczepione pożywki płynne inkubuje się w 37°C przez 12 h przy wytrząsaniu

140 rpm. Hodowle nocne otrzymane w ten sposób wiruje się przy 6500 rpm przez 4 min, usuwa supernatant, a osad komórek drobnoustrojów zawiesza się w 1 ml jałowego roztworu Ringera. Następnie zawiesinę mikroorganizmów w roztworze Ringera poddaje się kolejnemu wirowaniu przy 6500 rpm przez 4 min, a uzyskany supernatant usuwa. Powstały osad komórek mikroorganizmów ponownie zawiesza w 1 ml roztworu Ringera. Po wykonaniu kolejnego, przeprowadzonego w opisany powyżej sposób, płukania osadu mikroorganizmów roztworem Ringera, komórki z uzyskanego osadu zawiesza się w 1 ml roztworu Ringera. Taką zawiesinę mikroorganizmów wprowadza się do 10 ml roztworu Ringera znajdującego się w szklanej probówce o pojemności 15 ml, w takiej objętości by bazując na pomiarach densytometrycznych z użyciem densytometru DEN-1B (BioSan, Łotwa), doprowadzić gęstość optyczną zawiesiny komórek mikroorganizmów do 0,5 McF. Stosowaną w tym eksperymencie zawiesinę drobnoustrojów o gęstości optycznej 0,05 McF uzyskuje się poprzez rozcieńczenie w stosunku objętościowych 1:9 przygotowanej wcześniej zawiesiny komórek o gęstości 0,5 McF z jałowym roztworem Ringera. Powyżej opisane czynności prowadzi się dla każdego testowanego szczepu patogennego, tj. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637.

Do płaskodennych, 24-dołkowych płytek wykonanych z tworzywa sztucznego, w tym przypadku polistyrenu, nanosi się 500 μl zawiesiny komórek mikroorganizmu patogennego (S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 lub D. congolensis ATCC 14637) o gęstości optycznej 0,05 McF. Tak przygotowane płytki 24-dołkowe inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby umożliwić adhezję komórek wprowadzonego mikroorganizmu do dna studzienki. Następnie, pozostałości pożywki znad absorbowanych do polistyrenu komórek usuwa się z użyciem pipety automatycznej. Komórki mikroorganizmu obecne na powierzchni dna studzienki poddaje się 1-minutowej ekspozycji na CAPP, generowaną w wyniku inicjowania wyładowań DBD w formie strugi gazowej. Układ do generacji CAPP poprzez DBD zbudowany jest z głowicy zimnej plazmy atmosferycznej przez którą przepływa gaz oraz z generatora pulsującego wysokiej częstotliwości (Fig. 1) z zastosowaniem następujących parametrów: szybkość przepływu gazu wyładowczego, tj. helu: 5,2 L min^-1, wartość wypełnia prądu: 70%, wartość częstotliwości modulująca ten prąd: 70%, temperatura stożka plazmy <38°C. Po zakończeniu działania CAPP wprowadza się do każdego dołka po 200 μl jałowego roztworu Ringera i prowadzi wytrząsanie przy 1000 rpm przez 10 min, celem oderwania od dna studzienek komórek drobnoustrojów, które przeżyły traktowanie stosowaną plazmą. Kolejnym krokiem jest wykonanie seryjnych rozcieńczeń do 10^-3 tak uzyskanej zawiesiny komórkowej, aby na następnym etapie prac metodą posiewu na murawę inokulować na pożywki stałe (BHI-A: S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637; YPG-A: C. albicans ATCC 90028) po 100 μί z przygotowanych seryjnych rozcieńczeń. Po inkubacji w 37°C trwającej 24 h dla S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz 72 h w atmosferze o 5% zawartości CO2 dla D. congolensis ATCC 14637, wykonuje się zliczenia jednostek tworzących kolonie wyrosłych na zaszczepionych wcześniej płytkach agarowych. Liczba jednostek tworzących kolonie dla prób badawczych traktowanych CAPP przyrównywana jest do liczby jednostek tworzących kolonie w próbach kontrolnych, niepoddanych działaniu DBD. Eksperyment wykonuje się dla szczepów S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, aplikowanych na płytki 24-dołkowe w zawiesinie o gęstości optycznej 0,05 McF, w trzech powtórzeniach biologicznych, w tym każde z nich obejmuje dwa powtórzenia techniczne.

Skuteczność raportowanego sposobu eradykacji drobnoustrojów odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi poprzez bezpośrednią ekspozycję na działanie CAPP mikroorganizmów aplikowanych w zawiesinie o gęstości optycznej 0,05 McF na powierzchnię płaską zobrazowano na Fig. 3:

- Przeciwdrobnoustrojowe właściwości CAPP, generowanej w układzie plazmowym w wyniku inicjowania DBD w formie strugi gazowej, w stosunku do mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi aplikowanych na powierzchnię płaską w zawiesinie o gęstości optycznej 0,05 McF (Fig. 3). W efekcie przeprowadzonych badań wykazano, że 1 min działanie wyładowaniem DBD generowanym w układzie reakcyjno-wyładowczym (Fig. 1) spowodowało redukcję w liczbie żywych komórek mikroorganizmów patogennych w zakresie średnich 99,9968-100% procent. Odnosząc się do średniej z logarytmu redukcji, zastosowane wyładowanie, według wynalazku, prowadziło do redukcji w liczbie żywych komórek drobnoustrojów przewyższającej 4,494 log. Na figurze zobrazowano (wykres ramka-wąsy, przedstawiający medianę oraz poszczególne kwartyle rozkładu danych. Okręgi odpowiadają wartościom odstającym) procent redukcji w liczbie kolonii S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, które to drobnoustroje aplikowano wcześniej na powierzchnię płaską w formie zawiesiny o gęstości optycznej 0,05 McF, przy czym wspomniany procent redukcji w liczbie żywych komórek mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje skórne wynikał z ekspozycji wspomnianej powierzchni płaskiej na generowaną CAPP w odniesieniu do nietraktowanej plazmą grupy kontrolnej. Dane różnią się w statystycznie istotny sposób (test Kruskala-Wallisa, p < 0,05), gdy są oznaczone inną literą.

Przykład 3

Sposób eradykacji drobnoustrojów odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi osiągnięty poprzez zastosowanie CAPP, a wykazany poprzez unieczynnienie komórek mikroorganizmów patogennych na powierzchni świńskiej skóry

Właściwości przeciwdrobnoustrojowe CAPP, wytworzonej w układzie plazmowym z DBD, generowanej w formie strugi gazowej, udowadnia się poprzez ujawnienie zdolności tak wytworzonej CAPP do eradykacji komórek następujących mikroorganizmów patogennych odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi: S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, z powierzchni świńskiej skóry.

Świeżą świńską skórę, pozyskaną z lokalnych zakładów masarskich, poddaje się procesowi przetwarzania i sterylizacji w następujący sposób. Na początek usuwa się fragmenty tkanki łącznej oraz mięśniowej spod przygotowywanej do eksperymentu skóry świńskiej. Tak oczyszczony materiał jest krojony na części o powierzchni ok. 1 cm², które są zanurzane na 10 min w 70% roztworze etanolu, celem przeprowadzenia wstępnej sterylizacji tego materiału odzwierzęcego. Po zakończonej chemicznej sterylizacji, fragmenty świńskiej skóry wykładane są na powierzchnię jałowych płytek Petriego o średnicy 96 mm i poddaje się je 20-minutowej, fizycznej sterylizacji z zastosowaniem promieniowana UV. Tak wysterylizowane skóry wykłada się na powierzchni jałowych płytek Petriego, zabezpiecza folią typu parafilm, a kolejno umieszcza się w temperaturze -20°C, celem przeprowadzenia kolejnych analiz.

Zawiesiny komórek mikroorganizmów patogennych o gęstości 0,5 McF, potrzebne do przeprowadzenia sztucznej infekcji wyjałowionej wcześniej świńskiej skóry, przygotowuje się z użyciem drobnoustrojów S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, pozyskanych z banku patogenów MWB UG i GUMed, gdzie przechowywane są w -80°C w postaci hodowli zamrożonych w jałowym 40% (v/v) roztworze glicerolu. Aby przeprowadzić dalsze eksperymenty z użyciem pojedynczej kolonii danego mikroorganizmu, wymienione powyżej szczepy patogenów wysiewa się z zastosowaniem techniki posiewu redukcyjnego na pożywkę stałą. W przypadku S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637 stosuje się do posiewów płytki BHI-A, natomiast drożdżaki C. albicans ATCC 90028 inokulowane są na płytki z YPG-A. Inkubację zaszczepionych drobnoustrojami pożywek stałych prowadzi się przez 24 h w temperaturze 37°C dla S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 i C. albicans ATCC 90028 oraz 72 h dla D. congolensis ATCC 14637 również w temperaturze 37°C, ale w atmosferze o 5% zawartości CO2. Następnie pobiera się pojedynczą kolonię mikroorganizmu z użyciem jałowej ezy i inokuluje nią pożywkę płynną. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637 hodowane są w bulionie BHI, natomiast drożdżaki C. albicans ATCC 90028 w pożywce płynnej YPG. Zaszczepione pożywki płynne są umieszczane w 37°C na 12 h przy stosowaniu wytrząsania 140 rpm. Otrzymane w taki sposób hodowle nocne poddaje się wirowaniu przy 6500 rpm przez 4 min, usuwa supernatant, a osad komórek drobnoustrojów zawiesza się w 1 ml jałowego roztworu Ringera. Następnie, zawiesina mikroorganizmów w roztworze Ringera jest kolejny raz wirowana przy 6500 rpm przez 4 min, a uzyskany supernatant usuwa się. Powstały osad komórek mikroorganizmów ponownie zawiesza się w 1 ml roztworu Ringera. Po wykonaniu ostatniego, przeprowadzonego w opisany powyżej sposób, płukania osadu mikroorganizmów roztworem Ringera, komórki z pozyskanego osadu zawiesza się w 1 ml roztworu Ringera. Taką zawiesinę mikroorganizmów wprowadza się do 10 ml roztworu Ringera znajdującego się w szklanej probówce o pojemności 15 ml, w takiej objętości by bazując na pomiarach densytometrycznych z użyciem densytometru DEN-1B (BioSan, Łotwa), doprowadzić gęstość optyczną zawiesiny komórek mikroorganizmów do 0,5 McF. Powyżej opisane czynności prowadzi się dla każdego testowanego szczepu patogennego tj. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637.

Sztuczną infekcję, wyjałowionej jak opisano powyżej świńskiej skóry, z zastosowaniem przygotowanych wcześniej zawiesin drobnoustrojów o gęstości optycznej 0,5 McF prowadzi się następująco. 1 ml zawiesiny komórek mikroorganizmu odpowiedzialnego za infekcje skórne u zwierząt i ludzi, czyli S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 lub D. congolensis ATCC 14637, o gęstości optycznej 0,5 McF wprowadza się do sterylnej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Zawiesinę drobnoustrojów poddaje się następnie wirowaniu przy 6500 rpm przez 7 min. Supernatant zlewa się poprzez odwrócenie probówki, a pozostałe na dnie komórki drobnoustrojów zawiesza poprzez rozpipetowanie w śladowej ilości roztworu Ringera (ok. 20 ąl), który pozostał w probówce. Kolejno płytka Petriego, zawierająca sterylne fragmenty świńskiej skóry, jest przenoszona z zamrażarki (-20°C) do komory bezpieczeństwa biologicznego celem rozmrożenia materiału tkankowego. Proces rozmrażania prowadzi się przez 20 min a fragmenty świńskiej skóry są dodatkowo w tym czasie eksponowane na promieniowanie UV. Kolejnym punktem prac jest przeniesienie wysterylizowanych powierzchniowo i rozmrożonych fragmentów świńskiej skóry na powierzchnię pożywki HEPES zestalonej 1,5% agarem, wylanej wcześniej na płytki Petriego o średnicy 96 mm. Następnie na powierzchni świńskiej skóry rozprowadza się równomierne zawiesinę drobnoustrojów z użyciem pipety automatycznej. Sztucznie inokulowana świńska skóra umieszczana jest na 24 h w cieplarce, ustawionej na temperaturę 37°C, celem umożliwienia kolonizacji tego materiału przez wprowadzone drobnoustroje. Po tym czasie, skolonizowana świńska skóra jest eksponowana na bezpośrednie działanie CAPP przez czas 2 min. Układ do generacji CAPP poprzez DBD zbudowany jest z głowicy zimnej plazmy atmosferycznej przez którą przepływa gaz oraz z generatora pulsującego wysokiej częstotliwości (Fig. 1). Po interwale trwającym 2 min, materiał odzwierzęcy eksponowany jest po raz drugi na CAPP przez kolejne 2 min. Stosowana plazma, generowana w dwóch cyklach, była inicjowana w wyniku generowania DBD w formie strugi gazowej z zastosowaniem następujących parametrów: szybkość przepływu gazu wyładowczego, tj. helu: 4.0 L min^-1, wartość wypełnienia prądu: 70%, wartość częstotliwości modulująca ten prąd: 70%, temperatura stożka plazmy = 37°C.

Aby zliczyć komórki drobnoustrojów, które przeżyły traktowanie wyładowaniem DBD, generowanym w formie strugi gazowej, stosuje się następującą procedurę. Sterylną wymazówką zwilżoną w roztworze Ringera pobiera się wymaz z traktowanej wyładowaniem DBD, zaszczepionej wcześniej sztucznie komórkami mikroorganizmu odpowiedzialnego za infekcje skórne u zwierząt i ludzi (S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 lub D. congolensis ATCC 14637) sterylnej świńskiej skóry. Wymaz pobierany jest z części środkowej 1 cm² fragmentu świńskiej skóry poprzez 5krotne pociągnięcie w lewo oraz w prawo po powierzchni tego materiału wspomnianą powyżej wymazówką. Wymazówkę tę z pobranymi komórkami umieszcza się w 300 ąl roztworu Ringera w probówce typu Eppendorf o pojemności 2 ml. Następnie trzonek wymazówki odcina się w jałowy sposób, aby umożliwić zamknięcie wieczka probówki typu Eppendorf. Probówkę typu Eppendorf poddaje się intensywnemu procesowi wytrząsania przez 1 min z zastosowaniem urządzenia typu vortex, a kolejno wirowaniu przy 6500 rpm przez 8 min. Następnie supernatant jest zlewany, a komórki drobnoustrojów pozostałe na dnie probówki zawiesza się w 100 ąl roztworu Ringera. Z tak otrzymanej zawiesiny komórkowej przygotowuje się seryjne rozcieńczenia do 10^-8 w roztworze Ringera (stosunek objętościowy 1:9), prowadząc proces rozcieńczania prób w płytkach 96-dołkowych. Następnie z użyciem pipety 8-kanałowej pobiera się po 20 ąl z przygotowanych wcześniej seryjnych rozcieńczeń i wykonuje z tych rozcieńczeń posiewy paskowe, poprzez powolne uwalnianie z pipety automatycznej wielokanałowej zawiesiny drobnoustrojów na powierzchnię pożywki stałej w całej jej długości. S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 oraz D. congolensis ATCC 14637 posiewa się na płytki BHI-A, natomiast drożdżaki C. albicans ATCC 90028 inokulowane są na płytki z YPG-A. Po inkubacji zaszczepionych płytek w 37°C, trwającej 24 h dla S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990 i C. albicans ATCC 90028 oraz 72 h dla D. congolensis ATCC 14637 również w temperaturze 37°C, ale w atmosferze o 5% zawartości CO2, wykonuje się zliczenia jednostek tworzących kolonie, wyrosłych na zaszczepionych wcześniej płytkach agarowych. Liczba jednostek tworzących kolonie dla prób badawczych traktowanych CAPP przyrównywana jest do liczby jednostek tworzących kolonie w próbach kontrolnych, niepoddanych działaniu DBD. Eksperyment wykonuje się dla szczepów S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, w trzech powtórzeniach biologicznych, w tym każde z nich obejmowało dwa powtórzenia techniczne.

Efektywność opisywanego sposobu eradykacji drobnoustrojów, odpowiedzialnych za infekcje skórne u zwierząt i ludzi, poprzez bezpośrednie działanie CAPP ocenia się poprzez wyznaczenie pro centu oraz logarytmu redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, będących skutkiem działania wyładowań DBD w formie strugi gazowej, w odniesieniu do nietraktowanych wyładowaniem prób kontrolnych.

Skuteczność raportowanego sposobu eradykacji drobnoustrojów, odpowiedzialnych za infekcje ran u zwierząt i ludzi poprzez bezpośrednią ekspozycję na działanie CAPP mikroorganizmów, sztucznie inokulowanych na powierzchnię świńskiej skóry zobrazowano na Fig. 4:

- Przeciwdrobnoustrojowe właściwości CAPP, generowanej w układzie plazmowym w wyniku inicjowania DBD w formie strugi gazowej, w stosunku do mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje ran u zwierząt i ludzi sztucznie inokulowanych na powierzchnię świńskiej skóry (Fig. 4). W efekcie przeprowadzonych badań wykazano, że dwie ekspozycje po 2 min na działanie wyładowania DBD generowanego w układzie reakcyjno-wyładowczym (Fig. 1) spowodowały redukcję w średniej liczbie żywych komórek mikroorganizmów patogennych w zakresie 98,8698-100%. Odnosząc się do średniego logarytmu redukcji, zastosowane wyładowanie DBD, według wynalazku, prowadziło do redukcji w liczbie żywych komórek drobnoustrojów powyżej 1,94683 log. Na figurze zobrazowano (wykres ramka-wąsy, przedstawiający medianę oraz poszczególne kwartyle rozkładu danych. Okręgi odpowiadają wartościom odstającym) procent redukcji w liczbie kolonii S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 14990, C. albicans ATCC 90028 oraz D. congolensis ATCC 14637, które to drobnoustroje skolonizowały wcześniej powierzchnię świńskiej skóry, przy czym wspomniany procent redukcji w liczbie żywych komórek mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje ran wynikał z ekspozycji wspomnianej powierzchni świńskiej skóry na CAPP w odniesieniu do nietraktowanej plazmą grupy kontrolnej. Dane różnią się w statystycznie istotny sposób (test Kruskala-Wallisa, p < 0,05), gdy są oznaczone inną literą.

Claims

1. Sposób eradykacji drobnoustrojów chorobotwórczych z powierzchni płaskich polegający na tym, że powierzchnie płaskie poddaje się bezpośredniej ekspozycji na zimną plazmę atmosferyczną (CAPP), generowaną w postaci wyładowań barierowych (DBD w formie strugi gazowej, znamienny tym, że generuje się plazmę atmosferyczną stosując prąd zmienny o wartości wypełnienia 70% oraz częstotliwości modulującej 70%, a zwalczanie drobnoustrojów prowadzi się stosując do wytworzenia CAPP hel jako gaz wyładowczy, aplikowany z szybkością przepływu 2-10 L/min, przy czym powierzchnia płaska z której unieczynnia się drobnoustroje traktowana jest wyładowaniem DBD, a taka ekspozycja trwa od 10 sekund do 10 minut, najkorzystniej 2 minuty, a odległość eksponowanej powierzchni płaskiej od stożka CAPP wynosi 2 mm - 10 cm, najkorzystniej 3 cm.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że powierzchnia płaska z której unieczynnia się drobnoustroje traktowana jest jednokrotnie lub dwukrotnie wyładowaniem DBD.

3. Sposób według zastrz. 1-2, znamienny tym, że wyładowaniem DBD unieczynnia się komórki drobnoustrojów patogennych bytujących na powierzchniach płaskich, w szczególności mikroorganizmy z gatunków S. aureus, S. epidermidis, C. albicans oraz D. congolensis.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wyładowaniem DBD traktuje się powierzchnie płaskie występujące w środowisku szpitalnym.