PL248352B1 - Aptamer, aptasensor zawierający aptamer i zastosowanie aptameru do selektywnego wykrywania jonów manganu - Google Patents

Aptamer, aptasensor zawierający aptamer i zastosowanie aptameru do selektywnego wykrywania jonów manganu

Info

Publication number
PL248352B1
PL248352B1 PL446262A PL44626223A PL248352B1 PL 248352 B1 PL248352 B1 PL 248352B1 PL 446262 A PL446262 A PL 446262A PL 44626223 A PL44626223 A PL 44626223A PL 248352 B1 PL248352 B1 PL 248352B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
aptamer
manganese ions
aptasensor
solution
receptor layer
Prior art date
Application number
PL446262A
Other languages
English (en)
Other versions
PL446262A1 (pl
Inventor
Marta JARCZEWSKA
Marta Jarczewska
Elżbieta Malinowska
Marcin Olszewski
Original Assignee
Politechnika Warszawska
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Politechnika Warszawska filed Critical Politechnika Warszawska
Priority to PL446262A priority Critical patent/PL248352B1/pl
Priority to PCT/PL2024/050054 priority patent/WO2025071421A1/en
Publication of PL446262A1 publication Critical patent/PL446262A1/pl
Publication of PL248352B1 publication Critical patent/PL248352B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/18—Water
    • G01N33/1813—Specific cations in water, e.g. heavy metals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest aptamer zdolny do specyficznego wykrywania jonów manganu, który ma sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ.ID NO.1. Aptasensor mający powinowactwo do jonów manganu Mn2+, który zawiera złotą elektrodę roboczą (1) pokrytą warstwą receptorową (2) zawierającą aptamery (3) i cząsteczki wypełniacza (4) oraz znacznik anionowy (5) znajdujący się w roztworze. Sposób otrzymywania aptasensora obejmujący etap tworzenia warstwy receptorowej (2) przez inkubację złotych elektrod (1) w roztworze aptameru (3) przez 2h oraz etap b) inkubacji z roztworem wypełniacza (4) przez 1h w celu wyeliminowania niespecyficznych oddziaływań na powierzchni elektrody. Zastosowanie aptamerów jako warstwy receptorowej biosensora do selektywnego wykrywania jonów manganu in situ za pomocą technik elektrochemicznych.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest aptamer, aptasensor zawierający aptamer oraz zastosowanie aptameru do wykrywania jonów manganu.
Prawidłowe funkcjonowanie organizmów jest uzależnione od dostępności wody pitnej, której źródłem są wody gruntowe oraz powierzchniowe uwzględniające rzeki, jeziora oraz naturalne i sztuczne zbiorniki wodne. Z uwagi ma stały rozwój obszarów takich jak urbanizacja, budownictwo, rolnictwo oraz górnictwo, woda pitna podlega skażeniu. Wśród najbardziej niebezpiecznych zanieczyszczeń znajdują się metale ciężkie, w tym mangan. Mangan wykorzystywany jest w produkcji m.in. baterii, nawozów czy ceramiki. Choć mangan jest pierwiastkiem niezbędnym do prawidłowego wzrostu i rozwoju centralnego układu nerwowego w organizmie człowieka, to jego podwyższone stężenie może prowadzić do różnego rodzaju schorzeń, w tym do śmierci komórkowej w ogniskowym niedokrwieniu mózgu, epilepsji czy chorób neurodegeneracyjnych takich jak choroba Huntingtona czy Alzheimera. Wśród powszechnie stosowanych technik analitycznych do wykrywania poziomu manganu można wymienić spektrometrię fluorescencji rentgenowskiej z dyspersją energii (EDXRF), atomową spektrometrię absorpcyjną (AES) oraz atomową spektrometrię absorpcyjną sprzężoną z plazmą mikrofalową (ICP-AES). Z uwagi na konieczność zastosowania skomplikowanej aparatury, obecności doświadczonego operatora i czasochłonności analizy niezbędne jest opracowanie nowych rozwiązań do wykrywania jonów manganu.
Rozwiązaniem może być zastosowanie biosensorów zawierających warstwy bioreceptorowe o wysokiej selektywności względem jonów manganu. Specyficzność warstwy receptorowej warunkowana jest właściwościami cząsteczek biologicznych i w przypadku wykrywania jonów manganu istnieją doniesienia o możliwości zastosowania genetycznie modyfikowanego białka specyficznego względem lantanowców, czyli lanmoduliny. Istnieje również doniesienie literaturowe (M. Mizunuma i wsp., 2023) o zastosowaniu techniki SELEX i identyfikacji sekwencji aptamerowej o wysokiej zawartości zasad guaninowych, która może stanowić warstwę receptorową fluorescencyjnego biosensora (aptasensora) do detekcji jonów manganu.
Aptamery są to krótkie, jednoniciowe sekwencje oligonukleotydów RNA lub DNA, które w wyniku oddziaływania z analitami różnej klasy zmieniają swoją konformację przestrzenną. Aptamery znajdują swoje zastosowanie m.in. jako nośniki leków, a możliwość wprowadzania grup funkcyjnych pozwalających na ich dowiązanie do określonej powierzchni czy grup stanowiących znaczniki optyczne lub elektrochemiczne powoduje, że mogą być też użyte jako warstwy receptorowe biosensorów. Aptamery identyfikowane są poprzez zastosowanie procesu SELEX, który polega na wygenerowaniu puli sekwencji liczącej nawet do 1015 różnych sekwencji metodami chemii kombinatoryjnej, które następnie zostają poddane inkubacji z konkretnym analitem. Sekwencje nie związane z analitem są usuwane, a w kolejnym etapie dochodzi do odseparowania analitu od cząsteczki aptameru. Zbiór sekwencji podlega następnie powieleniu metodą PCR i jest poddawany kolejnej rundzie oddziaływania z analitem, doprowadzając ostatecznie do uzyskania zawężonej grupy sekwencji aptamerowych wykazujących największe powinowactwo do wybranego analitu. Ograniczona grupa sekwencji jest następnie poddawana sekwencjonowaniu oraz określana jest ich stabilność strukturalna. Należy jednak podkreślić, że duże znaczenie w stopniu oddziaływania z wybranym analitem ma długość sekwencji aptamerowej. Sekwencja MnG4C1 uzyskana w zespole M. Mizunuma (lipiec 2023) liczy 40 nukleotydów, co może sprzyjać występowaniu niespecyficznych oddziaływań ze składnikami próbek rzeczywistych, w tym z innymi jonami metali. Choć prowadzone były badania selektywności, to dotyczyły one analizy z użyciem techniki dichroizmu kołowego dla wysokich stężeń jonów przeszkadzających -100 μM oraz nie uwzględniały one m.in. analizy dla jonów ołowiu. Należy również wskazać, że na przestrzeni ponad 30 lat dzięki wykorzystaniu techniki SELEX możliwe było zidentyfikowanie sekwencji aptamerowych dla ograniczonej liczby jonów metali, w tym jonów ołowiu, potasu, miedzi czy kadmu.
Największym wyzwaniem jest uzyskanie wysokiej selektywności warstw receptorowych tworzonych przez sekwencje aptamerowe już na etapie zastosowania techniki SELEX. Z kolei użyteczność aptamerowych warstw receptorowych może być potwierdzona poprzez sprzężenie ich z odpowiednią techniką detekcji charakteryzującą się wysoką czułością, niskimi granicami detekcji, a także niskim kosztem i prostotą wykonania pomiaru. Te cechy są zapewnione poprzez użycie technik elektrochemicznych takich jak woltamperometria czy spektroskopia impedancyjna.
Celem wynalazku jest rozwiązanie problemu jakim jest brak w stanie techniki optymalnej sekwencji aptamerowej, która oddziałuje specyficznie z jonami manganu i jednocześnie dla której wykazano selektywność wobec wybranych jonów przeszkadzających na poziomie poniżej maksymalnego dopuszczonego stężenia jonów manganu w próbkach wody zgodnie z wytycznymi WHO (1,82 μM) oraz wytycznymi polskimi (0,91 μM). Sekwencja aptamerowa według wynalazku, która może być zastosowana jako warstwa receptorowa wykazuje zwiększoną selektywność poprzez dostosowanie długości sekwencji oraz składu nukleotydów tworzących sekwencję.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest aptamer zdolny do specyficznego wykrywania jonów manganu, charakteryzujący się tym, że ma sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ. ID NO. 1 Ponadto aptamer charakteryzuje się tym, że jest zmodyfikowany grupą disiarczkową.
Korzystnie aptamer charakteryzuje się tym, że modyfikacja grupą disiarczkową jest na końcu 5'.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest aptasensor mający powinowactwo do jonów manganu Mn2+, charakteryzujący się tym, że zawiera złotą elektrodę roboczą 1 pokrytą warstwą receptorową 2 zawierającą aptamery 3 według wynalazku i cząsteczki wypełniacza 4 oraz znacznik anionowy 5 znajdujący się w roztworze. Korzystnie aptasensor jest sensorem elektrochemicznym.
Korzystnie warstwa receptorowa 2 aptasensora jest kowalencyjnie związana z powierzchnią elektrody. Korzystnie wypełniaczem 4 w aptasensorze jest 6-merkapto-1-heksanol.
Korzystnie znacznikiem anionowym 5 do generacji sygnału prądowego w aptasensorze jest sól sodowa kwasu antrachino-2-sulfonowego.
Korzystnie aptasensor charakteryzuje się tym, że powinowactwo warstwy receptorowej 2 do jonów manganu wynosi 64 nM.
Jeszcze bardziej korzystnie aptasensor charakteryzuje się tym, że zakres jego dynamicznej odpowiedzi liniowej wynosi od 50 nM do 1 μM.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania aptasensora obejmujący etap:
a) tworzenia warstwy receptorowej 2 przez inkubację złotych elektrod 1 w roztworze aptameru 3 przez 2 h.
b) inkubacji z roztworem wypełniacza 4 przez 1 h w celu wyeliminowania niespecyficznych oddziaływań na powierzchni elektrody.
Korzystnie sposób charakteryzuje się tym, że stężenie roztworu z etapu a) wynosi 4 μM. Korzystnie sposób charakteryzuje się tym, że wypełniaczem 4 jest 6-merkapto-1-heksanol. Korzystnie sposób charakteryzuje się tym, że stężenie wypełniacza 4 wynosi 2 mM.
Kolejnym przykładem wynalazku jest zastosowanie aptamerów jako warstwy receptorowej biosensora do selektywnego wykrywania jonów manganu in situ za pomocą technik elektrochemicznych. Korzystnie zastosowanie charakteryzuje się tym, że jony manganu wykrywa się w próbkach ciekłych. Bardziej korzystnie zastosowanie charakteryzuje się tym, że jony manganu wykrywa się w wodzie. Korzystnie zastosowanie charakteryzuje się tym, że jony manganu wykrywa się w pożywkach hodowlanych.
Objaśnienie figur rysunku
Przedmiot wynalazku został objaśniony w przykładach wykonania na rysunku, na którym:
Fig. 1 przedstawia schematyczną budowę warstwy receptorowej (2) złożonej z aptamerów DNA (3) i wypełniacza 6-merkapto-1-heksanolu (4).
Fig. 2 przedstawia schematyczne działanie warstwy receptorowej (2) złożonej z aptamerów DNA (3) i wypełniacza 6-merkapto-1-heksanolu (4) po inkubacji elektrod w roztworze zawierającym jony manganu oraz znacznik redoks (5).
Fig. 3 przedstawia odpowiedź dynamiczną dla układu elektrod miniaturowych firmy Metrohm Dropsens modyfikowanych sekwencją A1 (elektroda pracująca nr 1) oraz sekwencją odniesienia polyT (elektroda pracująca nr 2). Jako czynnik blokujący elektrody pracujące zastosowano 6-merkapto-1-heksanol.
Fig. 4 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla układu elektrod miniaturowych firmy Metrohm Dropsens modyfikowanych sekwencją A1 (elektroda pracująca nr 1) oraz sekwencją odniesienia polyT (elektroda pracująca nr 2) oraz czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem po inkubacji z jonami manganu i mieszaniną jonów przeszkadzających.
Fig. 5 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 (4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μΜ), które poddano inkubacji z 100 nM jonami manganu (w 50 mM MES, pH 6,0) w obecności znaczników redoks: soli sodowej kwasu antrachino-2-sulfonowego (AQMS), chlorku heksaaminorutenu (RuHex), pary heksacyjanożelazianów (II) i (III) potasu (K3Fe (CN)6374- i błękitu metylenowego (MB). Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan anodowy).
Fig. 6 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1(4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μM), które poddano inkubacji z 100 nM jonami manganu (w 50 mM MES, pH 6,0) w obecności znaczników redoks: soli sodowej kwasu antrachino-2-sulfonowego (AQMS), chlorku heksaaminorutenu (RuHex), pary heksacyjanożelazianów (II) i (III) potasu (K3Fe(CN)63-/4- i błękitu metylenowego (MB). Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan katodowy).
Fig. 7 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 o określonych stężeniach i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μM), które poddano inkubacji z próbą zerową (100 μM AQMS) i 100 nM jonami manganu (w 50 mM MES, pH 6,0). Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan anodowy).
Fig. 8 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 o określonych stężeniach i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μM), które poddano inkubacji z próbą zerową (100 μM AQMS) i 100 nM jonami manganu (w 50 mM MES, pH 6,0). Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan katodowy).
Fig. 9 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 (4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem o określonych stężeniach, które poddano inkubacji z próbą zerową (100 μM AQMS) i 100 μM jonami manganu (w 50 mM MES, pH 6,0). Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan anodowy).
Fig. 10 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 (4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem o określonych stężeniach, które poddano inkubacji z próbą zerową (100 μM AQMS) i 100 nM jonami manganu (w 50 mM MES, pH 6,0). Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan katodowy).
Fig. 11 przedstawia krzywą kalibracji dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 (4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μM). Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan katodowy) w obecności znacznika redoks (100 μM AQMS).
Fig. 12 przedstawia porównanie selektywności dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 (4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μM). Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan katodowy) w obecności znacznika redoks (100 μM AQMS).
Fig. 13 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla elektrod dyskowych złotych i miniaturowych firmy BVT Technologies modyfikowanych sekwencją A1 (4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μM) w buforze MES (50 mM, pH 6,0) dla stężenia jonów manganu wynoszącego 250 nM. Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan katodowy) w obecności znacznika redoks (100 μM AQMS).
Fig. 14 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 (4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μM) w buforze MES i w próbce rzeczywistej (wody wodociągowej) dla stężenia jonów manganu wynoszącego 250 nM. Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan katodowy) w obecności znacznika redoks (100 μM AQMS).
Fig. 15 przedstawia porównanie odpowiedzi prądowej dla złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją A1 (4 μM) i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem (4 μΜ) w buforze MES i w próbce pożywki MEM bez i z dodatkiem 10 nM jonów manganu. Pomiary przeprowadzono z użyciem techniki SWV (skan katodowy) w obecności znacznika redoks (100 μΜ AQMS).
Przykłady wykonania
Przykład 1
Sposób identyfikacji optymalnej sekwencji aptamerowej złożonej z oligonukleotydów DNA, specyficznej względem jonów manganu (Mn2+).
W celu identyfikacji odpowiedniej sekwencji wykorzystano unikatową technikę VENNMultiplex™ SELEX z uwagi na niewielkie rozmiary wykrywanego analitu. Zastosowana procedura SELEX opiera się na użyciu procesu hybrydyzacji identyfikowanych sekwencji aptamerowych z sekwencjami komplementarnymi, które są unieruchomione na powierzchni nanocząstek magnetycznych. Procedura identyfikacji sekwencji obejmuje zastosowanie techniki VENNMultiplex™ SELEX w ramach 12 rund selekcyjnych, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) oraz badania bioinformatyczne.
Z uwagi na brak uzyskania dostatecznej puli wzbogaconych sekwencji (liczba fcount wynosiła poniżej 10) wprowadzono dodatkowe rundy selekcyjne, co pozwoliło na otrzymanie puli 3,6 m ln odczytów, gdzie 700000 stanowiło pulę 73000 unikalnych sekwencji. Dzięki wyeliminowaniu oddziaływań krzyżowych możliwe było uzyskanie tzw. liczby fcount o wartości 173 wskazującej na otrzymanie zbioru sekwencji wyróżniających się selektywnością na jony manganu. Następnie porównano wartości parametru delta G określającego stabilność strukturalną sekwencji, co umożliwiło zidentyfikowanie 8 sekwencji aptamerów DNA o długości 32 nukleotydów i ostateczne wytypowanie 1 sekwencji aptamerowej DNA (sekwencja A1) o długości 32 nukleotydów.
Sekwencja aptamerowa A1, po jej identyfikacji, została zsyntetyzowana.
Przykład 2
Zastosowanie aptameru jako warstwy receptorowej aptasensora do wykrywania jonów manganu Przeprowadzono badania elektrochemiczne z użyciem miniaturowego układu elektrod zawierającego dwie złote elektrody pracujące modyfikowane sekwencją A1 (elektroda nr 1) oraz sekwencją odniesienia polyT (elektroda nr 2), elektrodę referencyjną i elektrodę pomocniczą.
Do sekwencji A1 5' - TAG CGC CGA AGA ACG ACA ATTTTAGAT CGACA -3' mogą być dowiązane grupy funkcyjne np. w postaci grupy disiarczkowej, pozwalające m.in. na unieruchomienie sekwencji na powierzchni przetwornika oraz cząsteczki o właściwościach elektroaktywnych lub fluorescencyjnych stanowiące źródło odpowiedzi elektrochemicznej czy optycznej w przypadk u zastosowania sekwencji jako warstwy receptorowej aptasensora. Możliwa jest dodatkowa redukcja grup disiarczkowych i otrzymanie grup tiolowych, co sprzyja zwiększeniu gęstości upakowania warstw receptorowych na powierzchni złota. Nie jest to jednak niezbędne do utworzenia warstwy rozpoznającej, a dodatkowo zbyt gęste upakowanie warstwy receptorowej może ograniczyć jej elastyczność i zdolność do reorganizacji na skutek oddziaływania z wybranym analitem.
W celu weryfikacji możliwości zastosowania sekwencji aptamerowej jako warstwy receptorowej aptasensora do elektrochemicznego wykrywania jonów manganu zastosowano komercyjne miniaturowe czujniki Dropsens firmy Metrohm. W czujnikach znajdowały się 2 złote elektrody pracujące, z których jedna została zmodyfikowana sekwencją aptamerową (A1), a druga sekwencją odniesienia polyT, którą stanowiło 10 nukleotydów tyminowych, co miało na celu zminimalizowanie sygnału tła oraz efektu przesunięcia sygnału prądowego. Sekwencja aptamerowa i odniesienia zawierały grupę disiarczkową na końcu 5', co pozwoliło na ich kowalencyjne dowiązanie do powierzchni złota.
Początkowo złote elektrody były sonikowane w 100% etanolu przez 480s w dwóch powtórzeniach. Następnie elektrody były poddane skanowaniu elektrochemicznemu w roztworze 0,5M NaOH w zakresie potencjałów -0,35 -1,35 V dla szybkości skanowania 1 V/s i przy 50 skanach w 2 powtórzeniach. Kolejnym etapem było wykonanie pomiarów amperometrycznych w 0,5M H2SO4 przy potencjale o wartości 2V przez 5s i -0,35V przez 10 s. Następnie wykonano skanowanie elektrochemiczne techniką woltamperometrii cyklicznej w 0,5M H2SO4 dla szybkości skanowania 1V/s (10 skanów) i 0,1 V/s (4 skany) dla zakresu potencjałów -0,35-1,5V. Kolejnym etapem było elektrochemiczne skanowanie techniką woltamperometrii cyklicznej w roztworze 0,01M KCI/0,1M H2SO4 w zakresach potencjałów -0,2-0,75V (szybkość skanowania 0,1 V/s 5 skanów), 0,2-1 V (szybkość skanowania 0,1 V/s, 5 skanów), 0,2-1,25V (szybkość skanowania 0,1 V/s, 5 skanów), 0,2-1,5V (szybkość skanowania 0,1 V/s, 5 skanów). Ostatnim etapem przygotowania powierzchni złotych elektrod było skanowanie elektrochemiczne techniką woltamperometrii cyklicznej w roztworze 0,05M H2SO4 w zakresie potencjałów od -0,35 do
1,5V dla szybkości skanowania 0,1 V/s (6 skanów przy dwóch powtórzeniach). Grupę disiarczkową w sekwencji A1 poddano redukcji poprzez zmieszanie 1 μΙ 100 μ sekwencji z 1 μΙ 20 mM TCEP i 1 h inkubację w temperaturze pokojowej.
Tworzenie warstwy receptorowej zostało przeprowadzone przez całonocną inkubację elektrod złotych w 500 nM roztworze sekwencji aptamerowej/poly T, które wcześniej podgrzano przez 5 min w temperaturze 95°C i schłodzono do temperatury pokojowej przez 15 min., po której nastąpiło opłukane elektrod w buforze do zawijania sekwencji (folding buffer) w 3 - krotnym powtórzeniu, którą uzupełniono o 1 h inkubację z 2 mM roztworem wypełniacza 6-merkapto-1-heksanolu (MCH) w celu wyeliminowania niespecyficznych oddziaływań na powierzchni elektrody. Pomiary elektrochemiczne wykonano techniką woltamperometrii fali prostokątnej (SWV) w obecności znacznika „w roztworze” - 10 mM heksacyjanożelazianu potasu (III) (K3Fe(CN)s) i przeprowadzono pomiar w zakresie potencjałów od -0,2 do 0,7 V, dla częstotliwości 50 Hz. Pomiary wykonano najpierw w samym roztworze znacznika redoks, następnie w roztworze 100 nM jonów manganu. Określono zakres odpowiedzi liniowej oraz dolną granicę detekcji dla elektrod modyfikowanych sekwencją aptamerową A1. Zarejestrowana została odpowiedź dynamiczna w zakresie od 10 pM do 100 nM (Fig. 3), jednak zależność odpowiedzi prądowej od stężenia jonów manganu charakteryzowała się wysokimi odchyleniami standardowymi.
W kolejnym etapie wykonano również badania selektywności uwzględniające porównanie odpowiedzi elektrod inkubowanych z jonami manganu oraz mieszaniną jonów przeszkadzających takich jak: Pb2+, Cd2+, Cu2+, Hg2+, UO22+ (Fig. 4). Z uwagi na niską powtarzalność odpowiedzi elektrod, zastosowano jako przetworniki, klasyczne złote elektrody dyskowe.
W celu przygotowania warstw receptorowych na elektrodach dyskowych, powierzchnia złota została uprzednio oczyszczona z użyciem następującej procedury. Elektrody dyskowe początkowo polerowano z użyciem proszku tlenku glinu (AI2O3) o średnicy ziaren 0,3 i 0,05 μm przez około 2 min, a następnie poddano sonikacji w roztworze etanolu i wody (1:1 (v/v)). Kolejnym etapem była 1 min. inkubacja elektrod w roztworze piranii (nadtlenek wodoru: kwas siarkowy (H2O2:H2SO4), 1:3, (v/v)), a następnie elektrochemiczne skanowanie techniką woltamperometrii cyklicznej (CV) w zakresie potencjałów -0,3-1,7 V dla szybkości skanowania 0,3 V/s, 10 cykli. Potwierdzenie uzyskania czystej powierzchni złota określono na podstawie wykresów zarejestrowanych techniką woltamperometrii cyklicznej w roztworze 5 mM K3Fe(CN)s/K4Fe(CN)6 dla zakresu potencjałów od -0,2 do 0,6 V, przy szybkości skanowania 0,1 V/s, 2 cykli.
Modyfikacja elektrod została przeprowadzona poprzez 2 h inkubację w 4 μM roztworze aptameru, a następnie 1 h inkubację w roztworze 4 μM roztworu wypełniacza - 6-merkapto-1-heksanolu (w buforze 1M KH2PO4, pH 4,5) (Fig. 1). W pomiarach elektrochemicznych jako roztwór podstawowy zastosowano 50 mM MES o pH 6,0, który nie powinien ulegać kompleksowaniu z jonami manganu.
Badania elektrochemiczne mające na celu potwierdzenie możliwości zastosowania sekwencji aptamerowej jako warstwy receptorowej do detekcji jonów manganu rozpoczęto od dobrania rodzaju znacznika redoks, który stanowił źródło odpowiedzi prądowej w układzie sensorowym. W pomiarach wykorzystano następujące znaczniki: błękit metylenowy (50 μM), para heksacyjanożelazianów (ll)/(lll) potasu (5 mM), sól sodowa kwasu antrachino-2-sulfonowego (AQMS) (100 μM) oraz chlorek heksaaminorutenu (100 μM). Elektrody były początkowo inkubowane przez 5 min. w roztworze wybranego znacznika, po czym przeprowadzone zostały pomiary elektrochemiczne z użyciem technik woltamperometrii cyklicznej (CV) i woltamperometrii fali prostokątnej (SWV) - z uwzględnieniem skanu anodowego i katodowego. W kolejnym etapie przeprowadzono 5 min. inkubację elektrody pracującej w roztworze zawierającym określony znacznik redoks oraz wzbogacony jonami manganu o stężeniu 100 nM. Po tym etapie elektroda została ponownie umieszczona w roztworze zawierającym jedynie znacznik redoks, a następnie wykonano ponownie pomiary woltamperometryczne. Umożliwiło to porównanie odpowiedzi elektrod przed i po inkubacji z jonami manganu, a w efekcie zdefiniowanie wpływu jonów Mn2+ na odpowiedź czujnika modyfikowanego aptamerami. W porównaniu uwzględniono również odpowiedź dla próby zerowej, którą stanowił roztwór MES zawierający jedynie wybrany znacznik redoks. Z uwagi na różnice w wartościach elektrochemicznej powierzchni elektrod dla poszczególnych egzemplarzy za odpowiedź aptasensorów przyjęto różnicowy sygnał prądowy zarejestrowany za pomocą techniki woltamperometrii fali prostokątnej (SWV) z użyciem następującego wzoru:
,,, . . (/0 - O
0dpowiedź pptasenorra = —---- gdzie/0 oznacza sygnał prądowy zarejestrowany przed, natomiast I oznacza sygnał prądowy zarejestrowany po inkubacji elektrod z jonami manganu.
PL 248352 Β1
Odpowiedzi prądowe w obecności poszczególnych znaczników redoks zostały przedstawione na Fig. 5 i Fig. 6, które wskazują, że największe zmiany odpowiedzi prądowej były zarejestrowane podczas pomiarów z użyciem znaczników AQMS, pary heksacyjanożelazianów (II) i (III) potasu oraz błękitu metylenowego. W obecności chlorku heksaaminorutenu (RuFlex) nie było widocznych różnic pomiędzy elektrodami inkubowanymi w roztworze jonów manganu oraz próbie zerowej. Z kolei zmiany odpowiedzi przy użyciu znacznika błękitu metylenowego nie przekraczały 0,05. Należy podkreślić, że zastosowanie pary heksacyjanożelazianów (II) i (III) potasu jako znacznika redoks nie jest możliwe ze względu na fakt, że po dodaniu do roztworu znacznika soli manganu, dochodzi do wytrącenia kompleksu heksacyjanomanganowego i powstania mętnego zabarwienia roztworu (Adamson, A. W. i wsp., 1950). Dlatego w kolejnych pomiarach elektrochemicznych wykorzystano znacznik AQMS (Fig. 2).
Kolejne badania pozwoliły na dobranie warunków tworzenia warstw receptorowych uwzględniających stężenie aptameru (4 μΜ) (Fig. 7 i Fig. 8) oraz czynnika blokującego - MCH (4 μΜ) (Fig. 9 i Fig. 10). Następnie określony został zakres odpowiedzi liniowej aptasensora, który wynosił od 50 nM do 1 μΜ (Fig. 11). Na podstawie wykresu zależności odpowiedzi prądowej aptasensora od stężenia jonów manganu (Fig. 11) wyznaczono wartość stałej powinowactwa Kd aptamerowej warstwy receptorowej do jonów manganu. W tym celu wykorzystany został następujący wzór:
_ S max % [Mn ]
Κά + [Mn2+]
Gdzie S oznacza odpowiedź aptasensora (^° Smax maksymalną odpowiedź aptasensora, 'O
[Mn2+] stężenia jonów manganu.
Stała powinowactwa Kd wynosiła 64 nM, co wskazuje na silne wiązanie jonów manganu do warstwy receptorowej utworzonej z aptamerów i cząsteczek wypełniacza 6-merkapto-1-heksanolu.
Kolejnym etapem było określenie selektywności aptamerowych warstw receptorowych poprzez porównanie odpowiedzi prądowych po inkubacji elektrod w 250 nM roztworze jonów manganu oraz jonów przeszkadzających o tym samym stężeniu (Fig. 12). Największą odpowiedź uzyskano dla jonów Mn2+, która jest dwukrotnie wyższa od odpowiedzi dla jonów uranylowych (UO22+), niklu (Ni2+) czy antymonu. W przypadku jonów kadmu (Cd2+), rtęci (Hg2+) i chromu (CrCU2-) obserwowana jest zmiana odpowiedzi aptasensora wskazująca na wzrost sygnału prądowego po inkubacji elektrod z wyżej wymienionymi kationami. W przypadku jonów rtęci inny charakter odpowiedzi może być uzasadniony obecnością 6 zasad tyminowych, co prawdopodobnie skutkuje tworzeniem mostków dityminowych i zmiany konformacji aptamerów, a w efekcie zwiększenie stopnia przyciągania cząsteczek AQMS do powierzchni elektrody. Z kolei w przypadku oddziaływania aptamerów zjonami kadmu zmiana konformacji może być uzasadniona obecnością zasad tyminowych i guaninowych zawierających atomy tlenu i azotu, które mogą silnie oddziaływać zjonami Cd2+. Dopuszczalny limit stężenia jonów manganu to zgodnie z wytycznymi WHO (1,82 μΜ) oraz wytycznymi polskimi (0,91 μΜ). Dlatego zdecydowano się na porównanie odpowiedzi aptasensora dla jonów manganu i jonów przeszkadzających dla 250 nM, co jest stężeniem poniżej aptasensora.
W kolejnym etapie sprawdzono możliwość zastosowania komercyjnych miniaturowych czujników firmy BVT Technologies jako przetworników do tworzenia aptamerowych warstw receptorowych. Warstwa aptamerowa została utworzona w ten sam sposób jak w przypadku zastosowania elektrod dyskowych i zastosowano tę samą procedurę pomiarową. Odpowiedź uzyskana dla przetworników miniaturowych inkubowanych w 250 nM roztworze jonów manganu jest nieznacznie większa od odpowiedzi dla elektrod dyskowych, jednak wyróżnia się istotnym odchyleniem standardowym (Fig. 13). Prawdopodobną przyczyną jest zróżnicowanie gęstości upakowania aptamerów na powierzchni sitodrukowanych przetworników, która wpływa na końcową odpowiedź sensorów.
Przykład 3
Zastosowanie aptasensora do wykrywania jonów manganu w próbkach wody i innych próbkach ciekłych.
Ostatnim etapem badań było zweryfikowanie użyteczności aptasensora poprzez porównanie odpowiedzi dla próbki laboratoryjnej jonów manganu przygotowanej w buforze MES oraz próbki wody wodociągowej wzbogaconej jonami manganu. Próbkę laboratoryjną stanowił roztwór 50 mM MES (kwas 2 - (N-morfolino)etanosulfonowy) o pH 6,0 z dodatkiem 100 μΜ znacznika redoks AQMS oraz zawiera jącym jony manganu o stężeniu 250 nM. Z kolei do przygotowania próbki wody wodociągowej wykorzystano 1 mL wody kranowej, w której rozpuszczono określoną odważkę azotanu manganu, co umożliwiło sporządzenie 10 mM roztworu jonów manganu. Próbka została następnie rozcieńczona do stężenia 250 nM jonów Mn2+ poprzez zastosowanie roztworu 50 mM MES (kwas 2 - (N-morfolino)etanosulfonowy) o pH 6,0 z dodatkiem 100 μΜ znacznika redoks AQMS. Procedura oczyszczenia złotych elektrod jak i ich modyfikacji sekwencją aptamerową i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem była identyczna jak w opisanej powyżej procedurze. Pomiar elektrochemiczny polegał na inkubacji modyfikowanych elektrod przez 5 min. w roztworze 100 μΜ AQMS, po czym przeprowadzone zostały pomiary elektrochemiczne z użyciem technik woltamperometrii cyklicznej (CV) i woltamperometrii fali prostokątnej (SWV) - z uwzględnieniem skanu anodowego i katodowego. W kolejnym etapie przeprowadzono 5 min. inkubację elektrody pracującej w roztworze próbki laboratoryjnej lub próbki wody wodociągowej wzbogaconej jonami manganu. Po tym etapie elektroda została ponownie umieszczona w roztworze zawierającym jedynie znacznik redoks, a następnie wykonano ponownie pomiary woltamperometryczne. Odpowiedzi dla elektrod inkubowanych w buforze MES i próbce wody wodociągowej są niemal identyczne i odpowiedź aptasensora jest na poziomie 0,16. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić minimalny wpływ składników matrycy w postaci wody wodociągowej na odpowiedź aptasensora. Jednocześnie zmiana odpowiedzi prądowej zarejestrowana w przypadku analizy próbki wody wodociągowej była spowodowana wzbogaceniem próbki wody o jony manganu w stężeniu 250 nM. Potwierdza to zatem możliwość zastosowania złotych elektrod dyskowych modyfikowanych sekwencją aptamerową do analizy próbek rzeczywistych w postaci wody wodociągowej (Fig. 14).
Z uwagi na możliwą obecność jonów manganu w innych próbkach ciekłych np. w pożywkach przeznaczonych do hodowli komórkowych przeprowadzono również analizę dla wybranych pożywek, które poddano 10x krotnemu rozcieńczeniu za pomocą roztworu 50 mM MES (kwas 2 - (N-morfolino)etanosulfonowy) o pH 6,0 z dodatkiem 100 μM znacznika redoks AQMS. Jedną próbkę stanowił rozcieńczony roztwór pożywki, natomiast druga próbka rozcieńczonego roztworu pożywki dodatkowo została wzbogacona jonami manganu o stężeniu 10 nM. W przypadku próbki wzbogaconej jonami manganu została ona przygotowana poprzez rozpuszczenie określonej odważki azotanu manganu w 10 krotnie rozcieńczonej pożywce do hodowli komórkowej, co pozwoliło na uzyskanie wyjściowego stężenia wynoszącego 10 mM. Tak przygotowany roztwór został następnie rozcieńczony do końcowego stężenia wynoszącego 10 nM jonów manganu. Procedura oczyszczenia złotych elektrod jak i ich modyfikacji sekwencją aptamerową i czynnikiem blokującym 6-merkapto-1-heksanolem była identyczna jak w opisanej powyżej procedurze. Pomiar elektrochemiczny polegał na inkubacji modyfikowanych elektrod przez 5 min. w roztworze 100 μM AQMS, po czym przeprowadzone zostały pomiary elektrochemiczne z użyciem technik woltamperometrii cyklicznej (CV) i woltamperometrii fali prostokątnej (SWV) - z uwzględnieniem skanu anodowego i katodowego. W kolejnym etapie przeprowadzono 5 min. inkubację elektrody pracującej w roztworze rozcieńczonej pożywki lub rozcieńczonej pożywki wzbogaconej jonami manganu. Po tym etapie elektroda została ponownie umieszczona w roztworze zawierającym jedynie znacznik redoks, a następnie wykonano ponownie pomiary woltamperometryczne. Porównanie odpowiedzi prądowej dla elektrod inkubowanych w buforze MES, buforze MES z dodatkiem 10 nM jonów manganu, rozcieńczonej pożywce MEM firmy VWR oraz rozcieńczonej pożywce MEM firmy VWR z dodatkiem 10 nM jonów manganu wskazało, że odpowiedź elektrod modyfikowanych sekwencją aptamerową dla próbki pożywki do hodowli komórkowej wzbogaconej jonami manganu jest nieznacznie większa (0,07) niż w przypadku próbki laboratoryjnej buforu MES wzbogaconej jonami manganu (0,04) po uwzględnieniu odpowiedzi dla buforu MES i rozcieńczonej pożywki MEM bez dodatku jonów manganu. Nieznacznie większa odpowiedź w przypadku próbki pożywki do hodowli komórkowej wzbogaconej jonami manganu może wynikać ze złożoności analizowanej próbki pożywki do hodowli, której składniki mogły mieć wpływ na końcową odpowiedź aptasensora. Dodatkowo, na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować o obecności jonów manganu w pożywce MEM firmy VWR (Fig. 15).
Wykaz oznaczeń:
- złota elektroda
- warstwa receptorowa
- aptamer
- wypełniacz
- znacznik anionowy
PL 248352 Β1
Wykaz skrótów:
AQMS - sól sodowa kwasu antrachino-2-sulfonowego
AES - atomowa spektrometria absorpcyjna
CV - woltamperometria cykliczna
DNA - kwas deoksyrybonukleinowy
EDXRF - spektrometria fluorescencja rentgenowska z dyspersją energii
ICP-AES- atomowa spektrometria absorpcyjna sprzężona z plazma mikrofalowa
MB - błękit metylenowy
MCH - 6-merkapto-1-heksanol
MEM - pożywka z niezbędnym minimum (minimum essential medium)
MES - kwas 2 - (N-morfolino)etanosulfonowy
NGS - sekwencjonowanie nowej generacji
PGR - reakcja łańcuchowa polimerazy
RuHex - heksaaminoruten
SELEX - systematyczna ewolucja ligandów poprzez wykładnicze wzbogacenie
SWV - woltamperometria fali prostokątnej
Spis literatury:
1. M. Mizunuma, M. Suzuki, T. Kobayashi, Y. Hara, A. Kaneko, K. Furukawa, Y. Chuman, Development of Mn2+ - Specific Biosensor Using G-Quadruplex-Based DNA, Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 11556.
2. A. W. Adamson, J. P. Welker, M. Volpe, Exchange Studies with Complex lons.1. The Exchange of Radiocyanide with Certain Heavy Metal Complex Cyanides, J Am Chem Soc, 1950,72, 4030-4036
Wykaz sekwencji:
< 11O Politechnika Warszawska < 120> Aptamer, aptasensor zawierający aptamer i zastosowanie aptameru do selektywnego wykrywania jonów manganu <130 60340 <160 1 < 170> BiSSAP 1.3.6 <210 1 < 211> 32 < 212> DNA < 213> sekwencja sztuczna <220 < 223> aptamer do wykrywania jonów manganu <40 0 1 tagcgccgaa gaacgacaat tttagatcga ca

Claims (18)

1. Aptamer zdolny do specyficznego wykrywania jonów manganu, znamienny tym, że ma sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ. ID NO. 1.
2. Aptamer według zastrz. 1 znamienny tym, że jest zmodyfikowany grupą disiarczkową.
3. Aptamer według zastrz. 1 znamienny tym, że modyfikacja grupą disiarczkową jest na końcu 5'.
4. Aptasensor mający powinowactwo do jonów manganu Mn2+, znamienny tym, że zawiera złotą elektrodę roboczą (1) pokrytą warstwą receptorową (2) zawierającą aptamery (3) jak opisano w zastrz. 1 i cząsteczki wypełniacza (4) oraz znacznik anionowy (5) znajdujący się w roztworze.
5. Aptasensor według zastrz. 4 znamienny tym, że jest sensorem elektrochemicznym.
6. Aptasensor według zastrz. 4 znamienny tym, że warstwa receptorowa (2) jest kowalencyjnie związana z powierzchnią elektrody.
7. Aptasensor według zastrz. 4, znamienny tym, że wypełniaczem (4) jest 6-merkapto-1-heksanol.
8. Aptasensor według zastrz. 4 znamienny tym, że znacznikiem anionowym (5) do generacji sygnału prądowego jest sól sodowa kwasu antrachino-2-sulfonowego.
9. Aptasensor według któregokolwiek z zastrz. od 4 do 8 znamienny tym, że powinowactwo warstwy receptorowej (2) do jonów manganu wynosi 64 nM.
10. Aptasensor według któregokolwiek z zastrz. od 4 do 9, znamienny tym, że zakres jego dynamicznej odpowiedzi liniowej wynosi od 50 nM do 1 μM.
11. Sposób otrzymywania aptasensora określonego w zastrz. 5 obejmujący etap:
a) tworzenia warstwy receptorowej (2) przez inkubację złotych elektrod (1) w roztworze aptameru (3) przez 2 h.
b) inkubacji z roztworem wypełniacza (4) przez 1 h w celu wyeliminowania niespecyficznych oddziaływań na powierzchni elektrody.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stężenie roztworu z etapu a) wynosi 4 μM.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że wypełniaczem (4) jest 6-merkapto-1-heksanol.
14. Sposób według zastrz. 11 znamienny tym, że stężenie wypełniacza (4) wynosi 4 μM.
15. Zastosowanie aptamerów określonych w zastrz. 1 jako warstwy receptorowej biosensora do selektywnego wykrywania jonów manganu in situ za pomocą technik elektrochemicznych.
16. Zastosowanie według zastrz. 15 znamienne tym, że jony manganu wykrywa się w próbkach ciekłych.
17. Zastosowanie według zastrz. 15 znamienne tym, że jony manganu wykrywa się w wodzie.
18. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że jony manganu wykrywa się w pożywkach hodowlanych.
PL446262A 2023-09-29 2023-09-29 Aptamer, aptasensor zawierający aptamer i zastosowanie aptameru do selektywnego wykrywania jonów manganu PL248352B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL446262A PL248352B1 (pl) 2023-09-29 2023-09-29 Aptamer, aptasensor zawierający aptamer i zastosowanie aptameru do selektywnego wykrywania jonów manganu
PCT/PL2024/050054 WO2025071421A1 (en) 2023-09-29 2024-07-29 Aptamer, aptasensor comprising aptamer, and use of the aptamer for selective detection of manganese ions

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL446262A PL248352B1 (pl) 2023-09-29 2023-09-29 Aptamer, aptasensor zawierający aptamer i zastosowanie aptameru do selektywnego wykrywania jonów manganu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL446262A1 PL446262A1 (pl) 2025-03-31
PL248352B1 true PL248352B1 (pl) 2025-12-01

Family

ID=92711097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL446262A PL248352B1 (pl) 2023-09-29 2023-09-29 Aptamer, aptasensor zawierający aptamer i zastosowanie aptameru do selektywnego wykrywania jonów manganu

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL248352B1 (pl)
WO (1) WO2025071421A1 (pl)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10520462B1 (en) * 2018-11-24 2019-12-31 Alfaisal University Electrochemical screening for the selection of DNA aptamers

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111562298A (zh) * 2020-05-20 2020-08-21 海南师范大学 一种以亚甲基蓝为指示剂高灵敏检测铅离子的电化学适配体传感器的构建与应用
TWI767419B (zh) * 2020-11-24 2022-06-11 國立成功大學 經修飾金屬奈米粒子、其製造方法以及檢測錳離子濃度的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10520462B1 (en) * 2018-11-24 2019-12-31 Alfaisal University Electrochemical screening for the selection of DNA aptamers

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALA A ET AL.: "Electrochim. Acta, 2015; 180: 763-769", ELECTROCHEMICAL DETERMINATION OF LEAD ION WITH DNA OLIGONUCLEOTIDE-BASED BIOSENSOR USING ANIONIC REDOX MARKER. *
LEE YJ ET AL.: "Sens Actuators B Chem, 2014; 201: 535-544", A MULTIFUNCTIONAL SENSOR: CHROMOGENIC SENSING FOR MN2+ AND FLUORESCENT SENSING FOR ZN2+ AND AL3+. *
ZHOU Y AT AL.: "Talanta, 2012; 97: 331-335", COLORIMETRIC DETECTION OF MN2+ USING SILVER NANOPARTICLES COFUNCTIONALIZED WITH 4-MERCAPTOBENZOIC ACID AND MELAMINE AS A PROBE. *

Also Published As

Publication number Publication date
PL446262A1 (pl) 2025-03-31
WO2025071421A1 (en) 2025-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ji et al. Binding-induced DNA walker for signal amplification in highly selective electrochemical detection of protein
Zhang et al. Monitoring amyloid-β proteins aggregation based on label-free aptasensor
Warwick et al. Sensing and analysis of soluble phosphates in environmental samples: a review
Zhu et al. Label-free detection of kanamycin based on the aptamer-functionalized conducting polymer/gold nanocomposite
Lin et al. Electrochemical DNA biosensor for the detection of short DNA species of Chronic Myelogenous Leukemia by using methylene blue
Shi et al. Target-triggered catalytic hairpin assembly and TdT-catalyzed DNA polymerization for amplified electronic detection of thrombin in human serums
Jolly et al. Self-assembled gold nanoparticles for impedimetric and amperometric detection of a prostate cancer biomarker
Rabai et al. Development of a label-free electrochemical aptasensor based on diazonium electrodeposition: Application to cadmium detection in water
Yan et al. Aptamer-based electrochemical biosensor for label-free voltammetric detection of thrombin and adenosine
Jarczewska et al. Application of DNA aptamers as sensing layers for electrochemical detection of potassium ions
Huang et al. Amperometric biosensor for microRNA based on the use of tetrahedral DNA nanostructure probes and guanine nanowire amplification
Miao et al. An aptasensor for detection of potassium ions based on RecJ f exonuclease mediated signal amplification
US20190250120A1 (en) System for electrochemical detection of molecules of interest
JP2015503095A (ja) アナライトの検出
Bala et al. Electrochemical determination of lead ion with DNA oligonucleotide-based biosensor using anionic redox marker
Gao et al. Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications
Zhou et al. A label–free GR–5DNAzyme sensor for lead ions detection based on nanoporous gold and anionic intercalator
Bai et al. Bi-enzyme functionlized hollow PtCo nanochains as labels for an electrochemical aptasensor
Bala et al. Peptide nucleic acid as a selective recognition element for electrochemical determination of Hg2+
Eissa et al. Selection, characterization, and electrochemical biosensing application of DNA aptamers for sepiapterin
Melinte et al. Poly-L-Lysine@ gold nanostructured hybrid platform for Lysozyme aptamer sandwich-based detection
Li et al. A sensitive electrochemical aptasensor based on water soluble CdSe quantum dots (QDs) for thrombin determination
Luo et al. Molecular machine powered catalytic hairpin assembly for signal-on electrochemical detection of Alzheimer’s amyloid-β oligomer
Hu et al. Three-way junction DNA based electrochemical biosensor for microRNAs detection with distinguishable locked nucleic acid recognition and redox cycling signal amplification
Fu et al. Sensitive electrochemical immunoassay of a biomarker based on biotin-avidin conjugated DNAzyme concatamer with signal tagging