PL248228B1 - Cząsteczka siRNA wobec sekwencji transkryptu ludzkiej tenascyny- C (TNC), nanocząstka lipidowa LNP i kompozycja farmaceutyczna ją zawierające oraz ich zastosowanie w terapii i/lub zapobieganiu rozwojowi nowotworu glejaka - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są cząsteczki siRNA wobec sekwencji transkryptu ludzkiej tenascyny-C (TNC), nanocząstki lipidowe LNP obejmujące takie siRNA, kompozycje farmaceutyczne zawierające takie siRNA i ich mieszaniny oraz kompozycje farmaceutyczne o właściwościach przeciwnowotworowych zawierające takie cząsteczki siRNA w nanocząstkach lipidowych LNP do zastosowania w terapii i/lub zapobieganiu rozwoju nowotworu chrakteryzującego się zwiększoną ekspresją tenascyny-C (TNC) u człowieka, korzystnie wybranego z glejaka, raka piersi, raka jajnika, raka trzustki poprzez hamowanie ekspresji ludzkiej tenascyny-C (TNC).

Description

Opis wynalazku

DZIEDZINA TECHNIKI

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka siRNA wobec sekwencji transkryptu ludzkiej tenascyny-C (TNC), nanocząstka lipidowa LNP zawierająca takie siRNA, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie siRNA oraz ich zastosowanie w terapii i/lub zapobieganiu rozwojowi nowotworu glejaka, poprzez hamowanie ekspresji ludzkiej tenascyny-C (TNC).

STAN TECHNIKI

Tenascyna-C (TNC) jest glikoproteiną macierzy zewnątrzkomórkowej wpływającą na adhezję, inwazję, migrację i proliferację komórek guza, co wykorzystano np. w terapii guza mózgu (glejaka wielopostaciowego, GBM). W celu inhibicji TNC zastosowano podejście poprzez interferencję RNA (RNAi) [Zukiel et al. 2006; Rolle et al. 2010; Barciszewski et al. 2007].

TNC jest silnie eksprymowana w tkance nowotworowej większości złośliwych guzów obejmujących mózg [Leins et al. 2003] oraz jajniki [Wilson et al. 1996], jak również w części nowotworów piersi [Jahkola et al. 1998; Guttery et al. 2010] i trzustki [Liot et al. 2021], Wysoki poziom TNC pozytywnie koreluje ze stopniem złośliwości guza - nowotwory bardziej złośliwe zwykle prezentują wyższy poziom TNC, co stanowi niekorzystny marker prognostyczny. W tkance guza TNC występuje głównie w macierzy zewnątrzkomórkowej zrębu włóknistego silnie złośliwych nowotworów włącznie z rakiem okrężnicy i piersi, włókniakomięsakami, nowotworami płuc, czerniakami, rakiem płaskonabłonkowym, guzem pęcherza, gruczolakolakiem prostaty i wzdłuż obrzeża guza [Chiquet-Ehrismann et al. 2003].

W homogenatach GBM zaobserwowano wyraźnie wyższe poziomy TNC niż w prawidłowym mózgu [Pas et al. 2006]. Wysoki poziom ekspresji TNC w ludzkich glejakach i gwiaździakach, koreluje również z nasiloną angiogenezą [Behrem et al. 2005; Jallo et al. 1997]. Ponadto TNC stanowi marker komórek macierzystych nowotworu w GBM [Nie et al. 2015].

Publikacja EP2121927B1 przedstawia sposób inhibicji glejaka złośliwego przy wykorzystaniu dwuniciowego RNA (dsRNA), zwanego ATN-RNA, który zawiera fragment sekwencji mRNA tenascyny-C z nukleotydami od 405 do 567. Stosowana cząsteczka dsRNA jest naga, dostarczana w obecności jonów wapnia, a tym samym podatna na bardzo szybką degradację m.in. przez enzymy hydrolizujące RNA. Założenie tej terapii nie opisuje możliwości stosowania tej cząsteczki w innych typach nowotworów.

Inhibicja TNC za pomocą znakowanego radioaktywnie przeciwciała monoklonalnego podanego bezpośrednio do loży po usuniętym guzie w połączeniu z radioterapią i chemioterapią uzupełniającą w istotny sposób zwiększa przeżywalność pacjentów z pierwotnym GBM [Reardon et al. 2002; Reardon et al. 2003]. Podobnie, podanie dwuniciowego fragmentu RNA o długości 163 par zasad, ATN-RNA, bezpośrednio do loży po usuniętym guzie, skutecznie hamuje rozwój zarówno pierwotnych jak i nawracających ludzkich guzów mózgu poprzez inhibicję syntezy TNC oraz istotnie zwiększa przeżywalność oraz jakość życia pacjentów po resekcji glejaka [Zukiel et al. 2006; Rolle et al. 2010; Wyszko et al. 2008]. Co istotne, zastosowana terapia nie wykazuje działania prozapalnego w pierwotnych ludzkich komórkach GBM oraz liniach komórkowych glejaka in vitro [Rolle et al. 2010]. Analiza wieloczynnikowa wykazała, że ATN-RNA skutecznie zmniejsza wielkość nawracających guzów mózgu, co sugeruje, że zahamowanie ekspresji TNC jest szczególnie ważne w przypadku guzów nieoperacyjnych [Wyszko et al. 2008]. Obniżenie poziomu TNC wynikające z zastosowanie ATN-RNA in vitro spowodowało spadek migracji komórek nowotworowych [Grabowska et al. 2019]. W cytowanym badaniu cząsteczka ATN-RNA dodawana była do komórek nowotworowych w kompleksie z nanocząstkami magnetycznymi opłaszczonymi polietylenoiminą (PEI). Podobne podejście, oparte na dostarczeniu do komórek siRNA w kompleksie z PEI zastosowano przy wyciszeniu czynnika wzrostu PTN co zahamowało proliferację komórek nowotworowych glejaka in vitro oraz rozwój guzów w mysim modelu ksenograficznym, nie wywołując istotnej immunogenności [Grzelinski et al. 2006] .

W mysim modelu glejaka wielopostaciowego, powstałym w wyniku wewnątrzczaszkowej inokulacji komórek U87MG-Luc myszom, jednoczesne wyciszenie transkryptów genów kodujących receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) i TNC znacząco zahamowało proliferację komórek nowotworowych [Fu et al. 2021]. Dzięki sekwencji zawartej w plazmidowym DNA dostarczonym systemowo, cząsteczki siRNA skierowane przeciwko transkryptom genów EGFR i TNC ulegały ekspresji w wątrobie, skąd dalej były inkorporowane do tkanek docelowych za pomocą specyficznych znaczników naprowadzających. Pomimo zastosowania specyficznej sekwencji naprowadzającej, poziom siRNA w mózgu był ponad 100 krotnie niższy niż w wątrobie, co potencjalnie może wpływać negatywnie na efektywność oraz bezpieczeństwo terapii i przemawia na korzyść lokalnego podania cząsteczek siRNA bezpośrednio po resekcji guza do okolicy zmienionej chorobowo.

Wyciszenie transkryptu genu TNC za pomocą ATN-RNA w istotny sposób hamuje proliferację, migrację oraz różnicowanie ludzkich komórek oraz wielokomórkowych sferoidów nowotworowych piersi in vitro i nie wykazuje działania immunogennego [Wawrzyniak et al. 2020]. Ponadto, obniżenie poziomu transkryptu TNC za pomocą RNA tworzącego struktury typu spinki do włosów (shRNA) zmniejsza rozwój guzów piersi i zwiększa skuteczność immunoterapii stosowanej w leczeniu potrójnie ujemnego raka piersi (TNBC) w ksenograficznym modelu mysim [Li et al. 2020]. TNC wydzielana przez ludzkie komórki rakowe piersi jest pozytywnie skorelowana z występowaniem przerzutów do płuc [Oskarsson et al. 2011] oraz wątroby [Ma et al. 2012] i węzłów chłonnych [Yang et al. 2017]. Metaanaliza wykazała, że wysoki poziom TNC koreluje ze stopniem zaawansowania nowotworu i złym rokowaniem dla pacjentów w przypadku 14 typów nowotworu, w tym w raku piersi [Ming et al. 2019].

Podścielisko złośliwych guzów jajnika charakteryzuje wysoki poziom TNC w porównaniu z guzami łagodnymi [Wilson et al. 1996]. W dalszych badaniach wykazano, że TNC jest wydzielana głównie przez fibroblasty i odgrywa ważną rolę w inwazji komórek nowotworowych poprzez wpływ na ich adhezję oraz migrację in vitro [Wilson et al. 1999]. Ponadto, poziom TNC w surowicy pacjentów cierpiących z powodu nabłonkowego raka jajnika jest znacząco wyższy w porównaniu ze zdrowymi ludźmi [Tas et al. 2016].

Gruczolakorak trzustki najbardziej powszechny wśród różnych typów raka trzustki (PAAD), jest jedną z najbardziej agresywnych form nowotworów człowieka i najczęstszą przyczyną zgonu z powodu choroby nowotworowej na świecie. Z uwagi na niewielką skuteczność dotychczasowych metod terapeutycznych w leczeniu raka trzustki, która wiąże się z szybkimi przerzutami i zgonem pacjenta, pilnie potrzebne są nowe sposoby leczenia tej choroby nowotworowej. W prawidłowej trzustce poziom TNC jest stosunkowo niski, jednak jej poziom znacznie wzrasta w komórkach nowotworowych i jest pozytywnie skorelowany z progresją choroby nowotworowej trzustki [Esposito et al. 2006; Balasenthil et al. 2011; Cai et al. 2018]. Określenie poziomu TNC oraz inhibitora czynnika tkankowego w osoczu pacjentów umożliwia rozpoznanie wczesnego stadium PAAD, poprawia skuteczność diagnostyczną dotychczasowego biomarkera CA 19-9 oraz pozwala na rozróżnienie pacjentów z zapaleniem trzustki, PAAD i cukrzycą [Balasenthil et al. 2017].

Poziom TNC wzrasta wraz z inwazyjnością komórek nowotworowych, a obniżenie ekspresji TNC za pomocą shRNA skutkuje znacznym zahamowaniem proliferacji i migracji komórek nowotworowych trzustki in vitro [Qian et al. 2019]. Podobnie, obniżenie poziomu transkryptu genu TNC z wykorzystaniem siRNA istotnie zmniejsza proliferację ludzkich komórek nowotworowych trzustki in vitro poprzez regulację procesu cyklu komórkowego oraz w mysim modelu ksenograficznym [Cai et al. 2018].

Znane są przykłady zastosowania nanocząstek lipidowych (LNP) jako nośnika do dostarczania kwasów nukleinowych, np. w formie plazmidu, do komórek glejaka, w kontekście badań naukowych [Yoshida et al. 2004]. Ponadto, ujawniono LNP o potencjalnym zastosowaniu w leczeniu glejaka, np. jako nośniki dla leków cytostatycznych [Ortega-Berlanga et al. 2021]. Natomiast w praktyce klinicznej stosuje się np. lek patisiran - kompleks siRNA z LNP [Hu et al. 2020] oraz szczepionki w postaci kompleksu mRNA z LNP przeciwko koronawirusowi (SARS-CoV-2) (np. Moderna, CureVac, BioNTech) [Dammes et al. 2020].

Układy LNP jako nośniki kwasów nukleinowych to złożone struktury (około 100 nm), zazwyczaj składające się z aminolipidów jako głównego składnika (ulegających jonizacji - MC3, KC2 lub kationowych - DOTAP), lipidów fosfatydylocholiny, cholesterolu i koniugatu glikolu polietylenowego z lipidem (PEG-lipid). Znane są różne typy LNP. Lipidy kationowe są jednymi z częściej opisywanych LNP jako nośników ułatwiających wnikanie kwasów nukleinowych do komórek. Jednocześnie, obojętne (jonizowalne) LNP wykazywały podobne działanie [Haider et al. 2006], natomiast charakteryzowały się mniejszą immunogennością [Chon et al. 1991] i lepszą penetracją w mikrośrodowisku guzopodobnym [Lieleg et al. 2009].

Rozwój jonizowalnych lipidów był jednym z głównych etapów w rozwoju technologii LNP. Lipidy tego typu są naładowane neutralnie w fizjologicznym pH i uzyskują ładunek dodatni w kwaśnym pH, co pozwala na zależne od pH środowiska zewnętrznego oddziaływanie elektrostatyczne z ujemnie naładowanym kwasem nukleinowym. LNP jonizowalne podczas transportu do komórki, ulegają jonizacji w środowisku o niskim pH, np. w endosomach i lizosomach, co prowadzi do rozerwania kompleksu i uwolnienia załadunku w komórce [Schlich et al. 2021]. Takie hybrydowe właściwości wpływają na wydłużenie okresu półtrwania kompleksów w krwi obwodowej i ułatwiają uwolnienie zawartości kompleksu w komórkach docelowych, co daje przewagę nad lipidami kationowymi i jest szczególnie istotne w przypadku dożylnego podania preparatu [Semple et al. 2001]. Przykładem jest ulegający jonizacji lipid Dlin-MC3-DMA, który ma pKa 6,44 i jest stosowany w zatwierdzonym preparacie patisiranu (Onpattro®, Alnylam Pharmaceuticals, Cambridge, MA, USA) [Akinc et al. 2019].

Tradycyjne metody wytwarzania LNP obejmują wytwarzanie filmu lipidowego, a następnie hydratację filmu wodnym buforem zawierającym kwas nukleinowy w celu biernego otoczkowania ładunku [Mac Lachlan et al. 2007]. Prowadzi to zwykle do powstawania dużych (>100 nm) i niejednorodnych cząstek o niskiej wydajności enkapsulacji, które wymagają dodania techniki zmniejszania rozmiaru, takiej jak ekstruzja lub sonikacja. Konieczna w tym sposobie otrzymywania sonikacja i ekstruzja, w negatywny sposób wpływają na stabilność kwasów nukleinowych [Furusawaa et al. 2014]. Poza tym metoda ta jest trudna do skalowania i uzyskania powtarzalności wytworzonych LNP - koniecznego warunku dla dopuszczenia określonej substancji jako lek w terapii.

UJAWNIENIE WYNALAZKU

Pomimo opisanych wcześniej rozwiązań i wiedzy odnośnie tenascyny-C, która ulega silnej ekspresji w tkankach nowotworowych większości złośliwych guzów włącznie z guzami mózgu, piersi, jajnika i trzustki, i której ekspresja wzrasta w tkankach nowotworowych wraz z ich rozwojem, skuteczne środki i sposoby dla terapii wymienionych nowotworów należą do niezaspokojonych potrzeb medycznych. Istnieje zatem zapotrzebowanie na utworzenie nowej technologii, w której wykorzystane zostaną bardziej selektywne narzędzia molekularne, dające lepsze rezultaty w oddziaływaniu na nowotwory, których rozwój jest skorelowany ze zwiększaniem poziomu TNC, szczególnie do leczenia glejaka, raka jajnika, piersi i trzustki, w oparciu o narzędzia molekularne, które będą jednocześnie dawały lepsze rezultaty terapeutyczne, będą łatwiejsze do dostarczenia, mniej immunogenne i mniej toksyczne dla pacjenta oraz łatwiejsze w przechowywaniu i podawaniu, co przełoży się na dostępność terapii i jej wyjście poza terapię eksperymentalną. Równie istotna jest forma - nośnik - w jakiej będą dostarczane takie ulepszone celowane narzędzia molekularne, tak aby były one skuteczne w terapii, łatwe i powtarzalne w formie wytworzenia oraz powodowały jak najmniej skutków ubocznych.

Zatem, nadal istnieje potrzeba stworzenia technologii, którą będzie można stosować jako podejście terapeutyczne w celu zahamowania procesów naciekania nowotworów mózgu, szczególnie glejaków, których nie można skutecznie usunąć chirurgicznie. Takim podejściem terapeutycznym jest zastosowanie do supresji ludzkich guzów mózgu inhibicji syntezy TNC poprzez zastosowanie wyselekcjonowanych siRNA-ATN i siRNA-TNC według wynalazku.

Z uwagi na niewielką skuteczność dotychczasowych metod terapeutycznych w leczeniu nowotworów trzustki, szczególnie PAAD, która wiąże się z szybkimi przerzutami i zgonem pacjenta, pilnie potrzebne są nowe środki do leczenia tej choroby, które zostały zaproponowane w niniejszym wynalazku.

Stan techniki nie ujawnia ani nie sugeruje sekwencji siRNA, które są aktywnymi cząstkami powstałymi w obrębie znanej cząsteczki terapeutycznej ATN-RNA i które mogą skutecznie wpływać na hamowanie rozwoju kilku typów nowotworów w tym glejaka, raka piersi, raka jajnika czy raka trzustki, nie wykazując przy tym wad i skutków ubocznych jakie ma znana cząsteczka ATN-RNA.

Zastosowanie techniki mieszania mikroprzepływowego według wynalazku do wytwarzania kompleksów lipidowych z różnym RNA, w tym kompleksów LNP1 z różnymi siRNA według wynalazku do terapii glejaka, raka piersi, raka jajnika, nowotworu trzustki wysoce eksprymujących tenascynę-C, rozwiązuje szereg problemów opisanych powyżej, np. pozwala na eliminację dodatkowych etapów syntezy, tj. sonikacji i ekstruzji, które w negatywny sposób wpływają na stabilność kwasów nukleinowych, przez co zwiększa się efektywność biologiczną w terapii podawanych kompleksów nanocząstek lipidowych z RNA. Ponadto stosowane kompleksy lipidowe wytworzone z zastosowaniem techniki mieszania mikroprzepływowego według wynalazku, dostarczają siRNA-ATN i siRNA-TNC o udowodnionym selektywnym działaniu na nowotwory docelowe (glejaka, nowotwór piersi, nowotwór jajnika, nowotwór trzustki).

Dodatkowo zastosowanie nawisów (szczególnie o długości 2 nt), zwiększa skuteczność wyciszenia docelowego transkryptu przez siRNA. Dzieje się tak, gdyż domena PAZ białka AGO2 oddziałuje z jednoniciowymi, nawisowymi fragmentami RNA. Ponadto, w hybrydzie siRNA posiadającej jeden nawis [np. dTdT], jako nić efektorowa wybrana zostaje nić z nawisem, co dodatkowo usprawnia docelowe wyciszanie TNC przez siRNA według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest zatem cząsteczka siRNA wobec sekwencji transkryptu ludzkiej tenascyny-C (TNC), ujawnionej w bazie NCBI jako NM_002160.4, Seq ID No: 25, charakteryzująca się tym, że cząsteczką siRNA jest cząsteczka MB-R-019 stanowiąca dupleks sekwencji efektorowej o Seq ID No: 3 z sekwencją pasażerską o Seq ID No: 4.

Korzystnie cząsteczka siRNA zawiera co najmniej jeden modyfikowany chemicznie nukleotyd i/lub co najmniej jedną modyfikację wybraną z modyfikacji 2'-O-Me, wiązań typu PTO, modyfikacji 2'-Fluoro RNA, modyfikacji 5'-E winylofosfonianem 2'-metoksyurydyny, modyfikacji cholesterolem, modyfikacji przez przyłączenie deoksynukleotydów [dTdT], korzystnie zawiera przyłączone deoksynukleotydy [dTdT] na 3’ końcu nici efektorowej.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest nanocząstka lipidowa LNP, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej jedną cząsteczkę siRNA według wynalazku.

Korzystnie nanocząstka lipidowa LNP jest kationowym lipidowym kompleksem.

Korzystnie kationowy lipidowy kompleks zawiera:

DSPC (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina): DOTAP (chlorek N-[1-(2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy) : cholesterol : DSPE-PEG2000 (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000), w stosunku wagowym 10:40:48:2 ± 10% każdego z lipidów.

Korzystnie Nanocząstka lipidowa LNP jest wytworzona metodą mieszania mikroprzepływowego.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozczynnik lub zaróbkę, charakteryzująca się tym, że zawiera cząsteczkę siRNA według wynalazku i/lub zawiera co najmniej jedną nanocząstkę lipidową LNP według wynalazku.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna charakteryzuje się tym, że nanocząstka lipidowa LNP stanowi kationowy lipidowy kompleks, zawierający:

DSPC (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina) : DOTAP (chlorek N-[1-(2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy) : cholesterol : DSPE-PEG2000 (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000), w stosunku wagowym 10:40:48:2 ± 10% każdego z lipidów.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna charakteryzuje się tym, że nanocząstka lipidowa LNP jest wytworzona metodą mieszania mikroprzepływowego.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna charakteryzuje się tym, że cząsteczka siRNA zawiera co najmniej jedną modyfikację wybraną z modyfikacji 2'-O-Me, wiązań typu PTO, modyfikacji 2'-Fluoro RNA, modyfikacji 5'-E winylofosfonianem 2'-metoksyurydyny, modyfikacji cholesterolem, modyfikacji przez przyłączenie deoksynukleotydów [dTdT], korzystnie zawiera przyłączone deoksynukleotydy [dTdT] na 3’ końcu nici efektorowej.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest cząsteczka siRNA według wynalazku albo nanocząstka lipidowa LNP według wynalazku, albo kompozycja farmaceutyczna według wynalazku do zastosowania w terapii i/lub zapobieganiu rozwojowi nowotworu glejaka poprzez hamowanie ekspresji ludzkiej tenascyny-C (TNC).

Nieoczekiwanie okazało się, że jedynie wyselekcjonowane siRNA w ramach wszystkich przetestowanych cząsteczek mogą zostać wykorzystane jako interferencyjne RNA dla zablokowania ekspresji TNC w komórkach nowotworowych, co wpłynie na zahamowanie rozwoju złośliwych nowotworów mózgu w tym glejaka, w którym obserwuje się wzrost poziomu TNC. Wskazanie, które konkretnie siRNA skutecznie wyciszają ekspresje TNC pozwoliło na wyselekcjonowanie w obrębie genu TNC miejsc o największym potencjale wyciszenia, szczególnie w ramach obszaru ATN w ramach TNC. Takie wyselekcjonowane siRNA, szczególnie w postaci lipidowych kompleksów kationowych LNP1 z MB-R-019, będzie podawane w celu zahamowania rozwoju ww. nowotworu, ich leczenia i wpłynie na poprawę jakości życia pacjentów oraz przedłużenia czasu ich życia.

Nieoczekiwanie okazało się, że kationowe lipidowe kompleksy LNP1 tj. cząsteczki powierzchniowo czynne o składzie: (DSPC [20 mg/ml]: DOTAP [20 mg/ml]:cholesterol:[20 mg/ml]:DSPE-PEG2000 [20 mg/ml] - w stosunku: 10:40:48:2) z wybranym siRNA według wynalazku (MB-R-019), pozwalają na uzyskanie stabilnej formulacji poprawiając dostarczanie wybranego siRNA, zwiększając stabilność cząsteczek siRNA w nich upakowanych, zwiększając czas półtrwania RNA oraz efektywność ich dostarczania i działania w docelowej komórce nowotworowej, co pozwoliło na uzyskanie selektywnej inhibicji ekspresji TNC w komórkach nowotworowych. Jednocześnie wykorzystany nośnik LNP1 okazał się nie tylko niezwykle skuteczny, ale i bardzo bezpieczny, co wykazano in vivo w testach toksyczności.

Ponadto kompleksy LNP1 z wybranym siRNA (MB-R-019) są syntetyzowane z wykorzystaniem metody mieszania mikroprzepływowego, co w porównaniu ze znanymi w stanie techniki metodami hydratacji filmu lipidowego czy rozcieńczania etanolem pozwala na uzyskanie jednorodnej, o niewielkich rozmiarach średnicy frakcji nanocząstek, przez co eliminuje się konieczność ich dalszej obróbki tj. sonikacji, ekstruzji, sortowania i specjalistycznego oczyszczania, a przez to nie dochodzi do uszkodzenia siRNA w trakcie tworzenia kompleksów lipidowych go zawierających, co wpływa na efektywność terapii kompleksami lipidowych wytworzonych zgodnie z wynalazkiem.

Korzystnie lipidowe kompleksy kationowe LNP1 z wybranym siRNA według wynalazku lub ich mieszaniny będą dostarczane bezpośrednio do loży pooperacyjnej po usuniętym guzie, co zapewni bezpieczne i lokalne działanie, znacząco ograniczając potencjalne występowanie efektów ubocznych. Domiejscowe podanie terapeutyku zwiększy skuteczność jego działania w obrębie tkanki nowotworowej i zmienionej chorobowo oraz przyczyni się do ograniczenia procesów naciekania, które często towarzyszą nowotworom, w szczególności guzom mózgu, których nie można całkowicie usunąć chirurgicznie.

Jednocześnie, modyfikacje chemiczne wyselekcjonowanych pod kątem skuteczności cząsteczek siRNA wybrane z modyfikacji 2'-O-Me, wiązań typu PTO, modyfikacji 2'-Fluoro RNA, modyfikacji 5'-E winylofosfonianem 2'-metoksyurydyny, modyfikacji cholesterolem, szczególnie modyfikacji przez dodanie deoksynukleotydów [dTdT] na 3’ końcu nici efektorowej jakie zawierają w stosunku do podstawowej sekwencji cząsteczki siRNA według wynalazku dodatkowo poprawiają ich stabilność, efektywność i specyficzność, a przez to wpływają na lepszą efektywność i wyciszanie ekspresji TNC z ich wykorzystaniem.

Wybrane cząsteczki siRNA o najkorzystniejszych właściwościach, tj. największej skuteczności wyciszania ekspresji genu TNC charakteryzują się jednocześnie najniższą indukcją ekspresji genów wczesnej odpowiedzi immunologicznej (RIG1 i OAS1) co czyni je bezpiecznymi jako terapeutyki.

O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe tutaj stosowane mają znaczenie powszechnie rozumiane przez znawcę w dziedzinie, do której należy ten wynalazek. Poniższe terminy i stosowane skróty, mają znaczenie przypisane im poniżej, chyba że określono inaczej. GBM - (ang. glioblastoma) nowotwór glejak; OV - (ang. ovarian cancer) rak jajnika; BRCA - (ang. breast cancer) rak piersi; PAAD - (ang. pancreatic adenocarcinoma) rak trzustki; ATN-RNA - dwuniciowa cząsteczka RNA (dsRNA) o długości 163nt - ujawniona w stanie techniki (hybryda Seq ID 1 i 2), odpowiadająca w pozycji 405-567 fragmentowi TNC (sekwencja transkryptu ludzkiego TNC ujawniona w bazie NCBI www.ncb i.nlm.nih.gov pod numerem NM_002160.4, oraz przedstawiona jako Seq ID No: 25); siRNA-ATN - cząsteczki siRNA w obrębie fragmentu ATN-RNA, różne siRNA-ATN, w tym stanowiące przedmiot zgłoszenia nazwane są wg wzoru: MB-R-trzy cyfrowy numer, odpowiadający ich pozycji względem cząsteczki ATN-RNA; siRNA-TNC - cząsteczka siRNA w ramach sekwencji TNC spoza fragmentu ATN-RNA, LNP - nanocząstki lipidowe (zarówno kationowe jak i jonizowalne), LNP1 - LNP kationowe (LNPI+określony RNA to nanocząstki lipidowe z wybranym RNA według wynalazku); LNP2 - LNP jonizowalne (obojętne); LNP1-ATN-RNA - kompleks lipidów kationowych i ATN-RNA otrzymany metodą mieszania mikroprzepływowego; LNP2-ATN-RNA- kompleks lipidów jonizowalnych i ATN-RNA otrzymany metodą mieszania mikroprzepływowego; LPN1-siRNA-TNC - kompleks lipidów kationowych i siRNA spoza sekwencji ATN otrzymany metodą mieszania mikroprzepływowego; LNP1-siRNA-ATN kompleks lipidów kationowych i siRNA w ramach sekwencji ATN, do którego należą LNP1-MB-R-trzy cyfrowy numer co oznacza kompleks lipidów kationowych oraz określone siRNA-ATN (tj. LNP1-MB-R-019, LNP1-MB-R-047, LNP1-MB-R-068, LNP1-MB-R-091, LNP1-MB-R-134).

KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU

Przykładowe realizacje wynalazku zaprezentowano na figurach rysunku, na których:

Fig. 1 : Przedstawia wykres pudełkowy przedstawiający porównanie poziomu ekspresji TNC w komórkach nowotworowych glejaka (GBM), raka jajnika (OV), raka piersi (BRCA), raka trzustki (PAAD) względem zdrowej tkanki. Analizę wykonano z wykorzystaniem danych pochodzących z bazy TCGA (The Cancer Genome Atlas) dla różnych nowotworów. W nowotworach GBM, OV, BRCA, PAAD (tkanka nowotworowa - lewa strona, tkanka zdrowa - prawa strona danego wykresu) wykazano podwyższoną ekspresję TNC w porównaniu ze zdrowymi pacjentami.

Fig. 2. Przedstawia względny poziom ekspresji TNC wyznaczony przez analizę typu RT-qPCR w badanych liniach komórkowych po transfekcji wskazanymi siRNA-ATN, siRNA-TNC lub ATN-RNA oraz samym nośnikiem Lipofektaminą 2000. (A) linia glejaka U-251 MG, (B) linia raka piersi MDA-MB-231, (C) linia raka jajnika OVCAR-3. Kontrola: C L2000 - sam nośnik; badane siRNA-ATN z nośnikiem:

MB-R-019, MB-R-047, MB-R-068, MB-R-091, MB-R-134 (wybrane siRNA z obrębu fragmentu

ATN-RNA); siRNA-TNC z nośnikiem [mniej=lepiej].

Fig. 3: Przedstawia analizę żywotności komórek po zastosowaniu kompleksów terapeutycznych z ATN-RNA, siRNA-TNC lub siRNA-ATN wobec różnych linii nowotworowych z wykorzystaniem do transfekcji Lipofektaminy 2000. Kontrola: C0 - komórki nietraktowane; L2000 - sam nośnik, badane siRNA-ATN z nośnikiem: MB-R-019, MB-R-047, MB-R-068, MB-R-091, MB-R-134; siRNA-TNC z nośnikiem (siRNA spoza ATN-RNA) [więcej=lepiej].

Fig. 4. Przedstawia wyniki oznaczeń poziomu ekspresji OAS1 i RIG1 wyznaczonych przez analizę typu RT-qPCR w badanych liniach komórkowych po transfekcji wskazanymi siRNA-ATN, siRNA-TNC lub ATN-RNA oraz samym nośnikiem Lipofektaminą 2000. Kontrola: C L2000 - sam nośnik; badane cząsteczki siRNA-ATN z nośnikiem: MB-R-019, mB-R-047, MB-R-068, MB-R-091, MB-R-134; siRNA-TNC z nośnikiem (siRNA spoza ATN-RNA) [mniej=lepiej].

Fig. 5: Przedstawia analizę żywotności komórek różnych linii po traktowaniu ATN-RNA w obecności różnych nośników. Kontrola: CO - komórki nietraktowane. L2000-ATN-RNA- nośnik Lipofektaminą 2000 z ATN-RNA, LNP1-ATN-RNA - lipidy kationowe z ATN-RNA. (A) glejak U-251 MG, (B) rak piersi MDA-MB-231, (C) rak jajnika OVCAR-3 (D) komórki nienowotworowe MRC-5 [więcej=lepiej.

Fig. 6. Przedstawia badanie poziomu ekspresji TNC w liniach glejakowych U-118 MG i U-251 MG po transfekcji ATN-RNA z wykorzystaniem dwóch typów nośnika LNP. LNP1-ATN-RNA - ATN-RNA w kompleksie z lipidami kationowymi, LNP2-ATN-RNA - ATN-RNA w kompleksie z lipidami jonizowalnymi, C LNP1 - kontrola - sam nośnik, C LNP2 - kontrola - sam nośnik [mniej=lepiej].

Fig. 7. Przedstawia badanie poziomu ekspresji TNC po zastosowaniu ATN-RNA oraz różnych siRNA w kompleksie z LNP1. (A) linia glejaka U-251 MG, (B) linia raka piersi MDA-MB-231, (C) linia raka jajnika OVCAR-3. Kontrole: C1 LNP1, C2 LNP1 - traktowane samym nośnikiem w ilości odpowiadającej ilości potrzebnej do dostarczenia odpowiadającego stężenia RNA (0,7 μg/ml i 1,4 μg/ml, odpowiednio). Podpisy pod słupkami wskazują na kompleks nośnika LNP1 + określony RNA (ATN-RNA; wybrane siRNA-ATN: MB-R-019, MB-R-091; siRNA-TNC), dla każdej linii badane w dwóch stężeniach (0,7 μg/ml i 1,4 μg/ml, odpowiednio) [mniej=lepiej].

Fig. 8. Przedstawia badanie poziomu ekspresji TNC w linii raka jajnika SKOV-3 po zastosowaniu mieszanin siRNA-TNC i siRNA-ATN: MB-R-019 i MB-R-091 w kompleksach z LNP1 w porównaniu do kompleksów LNP1-ATN-RNA oraz LNP1-siRNA-ATN stosowanych pojedynczo. Kontrole: C1 LNP1, C2 LNP1 - traktowane samym nośnik w ilości odpowiadającej ilości potrzebnej do dostarczenia odpowiadającego stężenia RNA (0,7 μg/ml i 1,4 μg/ml, odpowiednio). Podpisy pod słupkami wskazują na kompleks nośnika LNP1 + określony RNA/mieszanina RNA (ATN-RNA; wybrane siRNA-ATN: MB-R-019, MB-R-091; siRNA-TNC), badane w dwóch stężeniach (0,7 μg/ml i 1,4 μg/ml, odpowiednio) [mniej=lepiej].

Fig. 9. Przedstawia analizę żywotności komórek różnych linii nowotworowych po zastosowaniu ATN-RNA oraz różnych siRNA w kompleksie z LNP1. Kontrola: CO - komórki nietraktowane, C1 LNP1, C2 LNP1 - traktowane samym nośnikiem w ilości odpowiadającej ilości potrzebnej do dostarczenia odpowiadającego stężenia RNA (0,7 μg/ml i 1,4 μg/ml, odpowiednio). Podpisy pod słupkami wskazują na kompleks nośnika LNP1 + określony RNA (ATN-RNA; wybrane siRNA-ATN: MB-R-019, MB-R-091; siRNA-TNC), dla każdej linii badane w dwóch stężeniach (0,7 μg/ml i 1,4 μg/ml, odpowiednio) [więcej=lepiej].

Fig. 10. Przedstawia badanie poziomu ekspresji OAS1 i RIG1 po transfekcji rożnymi RNA w kompleksie z LNP1. (A) linia glejaka U-251 MG, (B) linia raka piersi MDA-MB-231, (C) linia raka jajnika OVCAR-3. Kontrola: LNP1 - sam nośnik. Podpisy pod słupkami wskazują na kompleks nośnika LNP1 + określony RNA (ATN-RNA; wybrane siRNA-ATN: MB-R-019, MB-R-091; siRNA-TNC) [mniej=lepiej].

Fig. 11. Przedstawia ocenę stabilności ATN-RNA oraz siRNA-TNC jako cząsteczek nagich (bez nośnika) i ich kompleksów lipidowych w LNP1 w surowicy ludzkiej w czasie 0-72 h.

Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są w całości niniejszym włączone, jako referencje. Poniższe przykłady ilustrują wynalazek, nie ograniczając go w żaden sposób.

SPOSOBY WYKONANIA WYNALAZKU

Poniższe przykłady umieszczono jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.

PL 248228 Β1

PRZYKŁADY

Materiały i metody

W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej, stosowano standardowe materiały i metody biochemiczne lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod. W poniższych przykładach stosowano powtarzające się następujące materiały, linie komórkowe, pożywki oraz metody, procedury i testy:

(I) Linie komórkowe, pożywki

W poniższej Tabeli 1 wskazano stosowane linie komórkowe wraz ze stosowanymi do ich hodowli pożywkami.

Tabela 1. Wykaz stosowanych linii komórkowych wraz z pożywkami stosowanymi do ich hodowli

Nazwa linii	Linia komórkowa /rodzaj nowotworu	Źródło	Stosowana pożywka hodowlana*
U-118MG	glejak	ATCC	DMEM
U-251 MG	glejak	Sigma-Aldrich	MEM
MDA-MB-231	potrójnie ujemny rak piersi, charakteryzujący się brakiem receptorów estrogenowego i progesteronowego oraz nadekspresją HER-2	ATCC	DMEM
OVCAR-3	rakjajnika	ATCC	RPMI1640
SK0V-3	rakjajnika	ATCC	McCoyś 5A
PANC-1	rak trzustki	ATCC	DMEM
MRC-5	linia nienowotworowa wyprowadzona z normalnej płodowej tkanki płucnej	ATCC	MEM

*DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Bio-West nr kat. L0101), MEM (Minimum Essential Medium) (Bio-West nr kat. L0430), RPMI 1640 (Bio-West nr kat. L0501), McCoy’s 5A (Bio-West nr kat. L0210) suplementowane 10% surowicą cielęcą (EURx nr kat. E5051-02), 1% stabilną glutaminą (BioWest nr kat. Χ0551), penicyliną (100 pg/ml), streptomycyną (100 mg/ml) (Bio-West nr kat. L0010) oraz dla OVCAR-3 insuliną ludzką (10 pg/ml), chyba, że wskazano inaczej.

(ID Wytwarzanie kompleksów lipidowych nanocząstek z różnymi RNA

Nanocząstki lipidowe otrzymywano metodą mieszania mikroprzepływowego w aparacie Nano Assembly Benchtop (Precision Nanosystem).

Do przygotowania lipidów kationowych LNP1 użyto roztwory robocze DSPC (20 mg/ml), DOTAP (20 mg/ml), cholesterol (20 mg/ml) i DSPE-PEG 2000 (20 mg/ml) w etanolu zmieszane w stosunku molowym 10:40:48:2 oraz roztwór ATN-RNA (100 pg) lub określonego siRNA (siRNA-ATN o wybranych sekwencjach oznaczonych wskazanymi numerami lub siRNA-TNC) (100 pg) w buforze cytrynianowym 100 mM pH 6,0.

Do przygotowania lipidów jonizowalnych (obojętnych) LNP2 użyto roztwory robocze DSPC (20 mg/ml), MC3 (20 mg/ml), cholesterol (20 mg/ml) i DSPE-PEG 2000 (20 mg/ml) w etanolu, zmieszane w stosunku molowym 10:40:48:2 oraz roztwór ATN-RNA (100 pg) lub określonego siRNA (siRNA-ATN o wybranych sekwencjach oznaczonych wskazanymi numerami lub siRNA-TNC) (100 pg) w buforze cytrynianowym 100 mM pH 6,0.

Roztwór składników lipidowych w etanolu oraz roztwór ATN-RNA lub siRNA w buforze cytrynianowym poddano mieszaniu w stosunku objętościowym 1:3, stosując szybkość przepływu 12 ml/min. Otrzymaną dyspersję lipidowych nanocząstek poddano dializie (1 h, 4°C, 130 rpm) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (0,137 mol/l chlorek sodu, 0,0027 mol/l chlorek potasu,

0,01 mol/l bufor fosforanowy) pH 7,2-7,6, stosując błonę dializacyjną z regenerowanej celulozy MWCO 10 kDa. W celu zapewnienia jałowości produktu uzyskane zawiesiny kompleksów lipidowych nanocząstek poddano procesowi filtracji przez sączek wyjaławiający o średnicy porów nie większej niż 200 nm. Następnie otrzymaną dyspersję przeniesiono do fiolek i przechowywano w temp. 4-8°C.

Celem scharakteryzowania otrzymanych lipidów dokonywano pomiarów ich właściwości fizykochemicznych. Średnią wielkość, potencjał zeta oraz wskaźnik polidyspersyjności lipidów określono metodą DLS (Malvern Zetasizer Nano ZS). Wyniki uzyskano w trybie rozpraszania wstecznego w temperaturze 25°C. Każda analiza składała się z trzech pomiarów, z których obliczono średnią wielkość. Wydajność inkorporacji i stopień wiązania oceniano nakładając na żel agarozowy 1,2% zarówno kompleksy lipidów związanych z RNA jak i niezwiązane z niczym RNA. Następnie dokonywano analizy densytometrycznej sygnałów (Image J, Fiji) i przyrównywano do siebie uzyskane wartości.

Skróty stosowanych substancji oznaczają: DSPC - 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (CAS: 816-94-4); DOTAP - chlorek N-[1-(2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (CAS: 132172-61-3); DSPE-PEG2000 - 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (CAS: 474922-26-4),MC-3 (DLin-MC3-DMA) - ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-ylo-4-(dimetylamino) butanian) (CAS: 1224606-06-7).

(III) Oznaczanie stabilności cząsteczek RNA samych i w kompleksie z LNP1

Do 500 ng ATN-RNA lub określonego siRNA, a przy badaniach porównawczych również równomolowej ilości kompleksu LNP1-ATN-RNA i LNP1-siRNA-ATN lub LNP1-siRNA-TNC - wytworzonego jak wskazano w (II) dodawano po 5 μ! surowicy ludzkiej (Sigma, nr kat. H4522) i inkubowano całość w 37°C odpowiednio przez 0, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h. Prowadzoną przez zawarte w surowicy nukleazy degradację RNA przerywano poprzez dodanie 0,5 μ! (20U) inhibitora RNAz (Protector RNase Inhibitor, Roche). Próby mieszano z buforem obciążającym i rozdzielono na 1,2% żelu agarozowym. Stopień degradacji RNA stanowiący miarę stabilności kompleksów oceniano na postawie densytometrycznej analizy intensywności sygnału (Image J, Fiji) dla poszczególnych prób, chyba że wskazano inaczej.

(IV) Hodowla linii komórkowych i ich transfekcja

Komórki określonej linii komórkowej wysiewano na płytkach 12-dołkowych, zachowując gęstość 50-100 tys. komórek/dołek lub na płytkach 96-dołkowych wysiewając po około 10 tys. komórek/dołek. Komórki hodowano w dedykowanej dla nich pożywce odpowiednio suplementowanej zgodnie z (I) powyżej. Hodowle prowadzono w inkubatorach zapewniających optymalne warunki wzrostu dla komórek zwierzęcych, tj.: stężenie CO2 5%, temperaturę 37°C, wilgotność 95%.

Komórki transfekowano przy ich około 70% konfluencji. Dokonywano wymiany pożywki na jej niesuplementowany odpowiednik wzbogacony o mieszaninę transfekcyjną. W składzie mieszaniny transfekcyjnej znajdował się odczynnik Lipofectamine™ 2000 (L2000) (Invitrogen) sam bądź wymieszany zgodnie z zaleceniami producenta z badanym RNA (ATN-RNA bądź siRNA) lub określony kompleks lipidowy wytworzony jak w (II) z lub bez badanego RNA. W przypadku prób kontrolnych, do których dodawano sam czynnik transfekcyjny lub pusty LNP, stosowano ich ilości potrzebne do wykonania transfekcji odpowiadających im prób z RNA. Po upływie 48 h komórki zbierano i przeprowadzano na nich dalsze analizy (np. izolację RNA i RT-qPCR- patrz (VI)), chyba, że wskazano inaczej.

(V) Ocena cytotoksyczności

Oceny aktywności metabolicznej komórek (cytotoksyczności) dokonywano testem kolorymetrycznym z bromkiem 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazoliowym (MTT), chyba, że wskazano inaczej. Test oparty jest na zdolności dehydrogenazy mitochondrialnej do przekształcania pomarańczowej, rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej do nierozpuszczalnego ciemnoniebieskiego formazanu. Eksperyment przeprowadzano na płytkach 96-dołkowych. Na płytce pozostawiano 4 dołki puste, które w późniejszych etapach stanowiły tło odczytu. Komórki wysiewano po około 10.000 na dołek i hodowano 2 godz. na suplementowanej pożywce w optymalnych warunkach wzrostowych dla danej linii komórkowej jak podano w (II). Następnie wymieniano pożywki hodowlane na ich niesuplementowany odpowiednik i dodawano badane pod kątem cytotoksyczności, nośniki, nanocząstki lipidowe i ich kompleksy z RNA w objętości końcowej 100 μl. Testy cytotoksyczności wykonywano dla dwóch stężeń RNA: 0,7 oraz 1,4 μg/ml, co odpowiadało ilości 0,07 i 0,14 μg RNA na pojedynczy dołek. Ilość nośnika (L2000) oraz nanocząstek lipidowych (LNP1) bez RNA użytych do testu dobrano by odpowiadały ich stężeniu w kompleksach z RNA. Prowadzono inkubację 48 h w inkubatorze z 5% CO2.

Przygotowywano roztwór MTT w niesuplementowanej pożywce hodowlanej o stężeniu końcowym 0,5 mg/ml. Komórki przepłukiwano roztworem PBS. Na dołki nakładano po 100 μ! roztworu MTT i inkubowano płytkę 90 min w 5% CO2, 37°C. Następnie ściągano roztwór MTT i zalewano dołki 100 μl DMSO celem rozpuszczenia soli formazanu. Całość wytrząsano 10 min. Z płytki ściągano wieczko i sczytywano absorbancję przy długości fal 590 nm (formazan) oraz 670 nm (MTT).

(VI) Izolowanie RNA i analiza RT-qPCR oraz ocena wyciszenia TNC

Całość RNA z linii komórkowych izolowano za pomocą odczynnika RNA Extracol (EURx). Odwróconą transkrypcję przeprowadzono przy wykorzystaniu: 250 ng RNA, losowego startera i zestawu do odwrotnej transkrypcji Tran Scriba (A&A Biotechnology) zgodnie z zaleceniami producenta. Powstały cDNA amplifikowano zestawem do qPCR RT HS-PCR Mix SYBR A (A&A Biotechnology) starterami komplementarnymi, odpowiednio dla:

- tenascyny-C (TN1 : CCACGTACTTACCTGCACC (Seq ID No: 15), TN2: CTGATCTCTCCCTCATCTTC (Seq ID No: 16));

- syntetazy 2'-5'-oligoadenylanowej 1 (OAS1F: CAGGAGCTCCAGGGCATAC (Seq ID No.:17);

OAS1R: CATCCGCCTAGTCAAGCACT (Seq ID No: 18);

- genu indukowanego kwasem retinowym I (RiGiF: TTgGtATCTCCTAATCGCAAAAG (Seq ID No: 19); RIG1R: GGCAAGTCCCCCTGTAAAC (Seq ID No: 20));

- aktyny beta (ACB1: AGAGCTACGAGCTGCCTGAC (Seq ID No: 21);

ACB2: AGCACTGTGTTGGCGTACAG (Seq ID No: 22));

- fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (HPRT1 : TGACCTTGATTTATTTTGCATAC (Seq ID No: 23), HPRT2: CGAGCAAGACGTTCAGTCCT(Seq ID No: 24)).

Reakcję PCR prowadzono z denaturacją wstępną w 95°C przez 3 min, następnie denaturację właściwą w 95°C przez 15 s, hybrydyzację w 62°C przez 30 s i wydłużanie amplikonu w 72°C przez 20 s., po czym nastąpiło 39 cykli w sekwencji: denaturacja-hybrydyzacja-wydłużanie, chyba, że wskazano inaczej.

(VII) Ocena wyciszenia TNC

Wyciszenie TNC oznaczano jako % obniżenia ekspresji TNC względem kontroli w odniesieniu do poziomu ekspresji równolegle oznaczanych genów referencyjnych ACTB i HPRT; gdzie 100% oznacza pełne wyciszenie [więcej=lepiej]. Istotność statystyczną określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; * dla p < 0,033; ** dla p < 0,002; *** dla p < 0,001.

(VIII) Ocena toksyczności LNP1 in vivo

W celu oceny toksyczności nośnika, w którym znajduje się proponowane siRNA wyciszające ludzką TNC, wykorzystano myszy szczepu BALBc. Szczep ten stanowi tło genetyczne myszy BALBc/nude, które zostaną wykorzystane w doświadczeniu docelowym z zaszczepieniem ludzkich komórek glejaka wielopostaciowego i traktowaniu ich proponowaną cząsteczką terapeutyczną. Myszy BALBc/nude (CByJ.Cg-Foxn1nu/J) nie posiadają grasicy i nie są w stanie wytwarzać limfocytów T, a w konsekwencji mają upośledzony układ odpornościowy i doskonale nadają się do przeszczepów ksenogenicznych (np. wprowadzenie ludzkich komórek glejaka do ciała myszy).

Myszom BALBc zostały podane cząsteczki LNP1 bezpośrednio do prawej komory mózgu podczas operacji mikrochirurgicznej w ramce stereotaktycznej w znieczuleniu ogólnym. LNP1 zostały podane w stężeniach 200 μg, 150 μg, 100 μg, 50 μg oraz 10 μg w jednej objętości 10 μl w postaci wstrzyknięcia bolusa. Ma to na celu najbardziej efektywne podanie całej dawki terapeutyku, tak aby maksymalizować biodystrybucję. Następnie prowadzono obserwację myszy trwającą 28 dni, pod kątem występowania zaburzeń neurologicznych, apatii oraz utraty masy ciała.

Przykład 1. Analiza in-silico poziomu ekspresji TNC w różnych nowotworach

Na serwerze GEPIA [Tang et al. 2017] wykonano analizę poziomów ekspresji białka TNC z wykorzystaniem danych pochodzących z sekwencji nowotworów z bazy TCGA (The Cancer Genome Atlas) z porównaniem z jej ekspresją w odpowiadająca zdrowym tkankom. W czterech typach nowotworów tj. GBM, OV, BRCA, PAAD zaobserwowano podwyższoną ekspresję TNC w porównaniu ze zdrowymi pacjentami (Fig. 1). Wykazano w analizie in-silico, że złośliwe glejaki, w tym glejak wielopostaciowy (GBM) oraz niektóre nowotwory piersi (BRCA), jajnika (OV) i trzustki (PAAD) wykazują podniesiony poziom tenascyny-C, którą można wykorzystać jako cel terapeutyczny w terapii tych nowotworów.

Przykład 2. Wytworzenie 21 nt siRNA-ATN w obrębie ATN-RNA oraz analiza ich wpływu na obniżenie ekspresji genu TNC

Poszukiwano siRNA-ATN dających niższą toksyczności i immunogenność z jednoczesną większą skutecznością obniżającą ekspresję genu TNC w liniach komórkowych glejaka, jajnika, raka piersi i trzustki. W tym celu przetestowano 153 rodzaje cząsteczek siRNA-ATN o długości 21 nt, które powstały

PL 248228 Β1 z połączenia zsyntetyzowanych niezależnie od siebie dwóch jednoniciowych RNA do siebie komplementarnych. Każde siRNA-ATN powstało z połączenia jednoniciowej cząsteczki RNA o sekwencji efektorowej (wiodącej) 5’->3’ i jednoniciowej cząsteczki RNA o sekwencji pasażerskiej 5’->3’, powstałej na matrycy zawierającej fragment odpowiadający ATN-RNA z genu TNC. Każdy kolejny siRNA-ATN rozpoczynał się o jeden nukleotyd dalej w odniesieniu do sekwencji ATN-RNA (Tabela 2), kolejne siRNA-ATN zostały ponumerowane jako od MB-R-001 do MB-R-153. Dla uzyskania określonej funkcjonalności syntetyzowanych cząsteczek siRNA modyfikowano je chemicznie wprowadzając określone modyfikacje wskazane w Tabeli 3. Następnie potwierdzono ich działanie na wytwarzane siRNA, co przedstawiono na kolejnych przykładach.

Tabela 2. Sekwencja ATN-RNA- (składa się ze złożenia sekwencji efektorowej i sekwencji pasażerskiej) - odnosi się do *miejsca wiązania do sekwencji TNC 405-576 z Seq ID No: 25

SEKWENCJA EFEKTOROWA (WIODĄCA) 5’->3’: (Seq ID No: 1) caagcgacagaguggggugaacgccacccugccagaagagaaccagccagugguguuuaaccacguuuacaacaucaagcugccagugggaucccag jguucgguggaucuggagucagccaguggggagaaagaccuggcaccgccuucagagcccagcgaa

SEKWENCJA PASAŻERSKA 5’->3’: (Seq ID No: 2) uucgcugggcucugaaggcggugccaggucuuucuccccacuggcugacuccagauccaccgaacacugggaucccacuggcagcuugauguugua aacgugguuaaacaccacuggcugguucucuucuggcaggguggcguucaccccacucugucgcuug *miejsce wiązania do TNC wyznaczono na podstawie algorytmu blastn w oparciu o sekwencję ludzkiego transkryptu.

Tabela 3. Zastosowane modyfikacje chemiczne cząsteczek siRNA i ich funkcja

MODYFIKACJA	DZIAŁAŃΙΕ/FUNKCJA WPROWADZONEJ MODYFIKACJI
2'-O-Me	Dodawano 3 zasady 2’O-Me na końcu 5’ oraz 3’ w celu zwiększenia odporności na działanie nukleaz oraz zwiększenie stabilności samej cząsteczki
Wiązania typu PTO	Wprowadzano atom siarki w miejsce tlenu w szkielecie fosfodiestrowym w celu zwiększenia odporności na działanie egzonukleaz
2'-Fluoro RNA	Podstawiano fluor w pozycji 2’ rybozy w celu zwiększenia stabilności, odporności na chemiczną hydrolizę oraz działanie nukleaz
5'-E winylofosfonian 2'metoksyurydyny	Dodawano dla naśladowania naturalnie występującego 5’-fosforanu, który jest szybko metabolizowany przez enzymy metaboliczne w warunkach in vivo.
Cholesterol	Dodanie grup lipofilowych do oligonukleotydu zwiększa wychwyt komórkowy/przenikanie przez błonę.
[dTdT]	Dodawano deoksynukletydy [dTdT] na 3’ końcu nici efektorowej poprawiając specyficzność wiązania nici efektorowej do sekwencji docelowej oraz poprawiając stabilność cząsteczki w komórce

Ze względu na dalej przewidziane testy tj. masowy screening dla określenia funkcjonalności siRNA z poszczególnych obszarów ATN na różnych liniach komórkowych, do dalszych badań wykorzystano siRNA, dla których w czasie syntezy nici efektorowej na jej 3’ końcu przyłączano deoksynukleotydy [dTdT]. Zastosowana modyfikacja [dTdT] minimalizuje efekt tzw. “off targetu”, tzn. niespecyficznego wyciszenia transkryptów, poprzez promowanie tworzenia kompleksu RISC (ang. RNA-induced silencing complex) z nicią efektorową. Ponadto, zarówno nici efektorowe jak i pasażerskie siRNA stanowiące przedmiot wynalazku są komplementarne jedynie do transkryptu TNC. W celu transfekcji i oznaczenia poziomu wyciszenia transkryptu genu TNC in vitro stosowano linie glejaka U-118 MG i U-251 MG, raka piersi MDA-MB-231, raka jajnika OVCAR-3 i SKOV-3. Hodowlę i transfekcję prowadzono jak opisano powyżej w (IV) w obecności Lipofektaminy 2000 z ATN-RNA, badanym określonym siRNA-ATN (po

PL 248228 Β1 kolei konstruktami od MB-R-001 do MB-R-153) oraz siRNA-TNC czyli siRNA spoza sekwencji ATN. siRNA-TNC zaprojektowany został jako komplementarny do sekwencji mRNA tenascyny-C w pozycji 4625-4646, względem transkryptu NM 002160.4 (Tabela 2). Po 48 godz. z komórek wyizolowano RNA i przeprowadzono analizę RT-qPCRjak opisano w (VI) powyżej.

Porównano skuteczność działania ATN-RNA oraz badanych siRNA-ATN (kolejno od MB-R-001 do MB-R-153) i siRNA-TNC transfekowanych do nowotworowych linii komórkowych w oparciu o badanie poziomu ekspresji TNC. Poziom ekspresji w komórkach transfekowanych RNA w stężeniu 0,35 pg/ml (t.j. 0,175 pg RNA/dołek) odnoszono do komórek traktowanych samym nośnikiem. Istotność statystyczną określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; * dla p < 0,033; ** dla p < 0,002; *** dla p < 0,001. Z przebadanych cząsteczek siRNA-ATN pięć z nich to jest MB-R-019, MB-R-047, MB-R-068, MB-R-091, MB-R-134 wykazywało najwyższe wyciszenie, jednak ich efekt był różny w zależności od używanej linii nowotworowej. Otrzymane wyniki dla wybranych siRNA-ATN przedstawiono na Fig. 2 oraz w Tabeli 5.

Tabela 4. Wybrane siRNA-ATN skierowane przeciw TNC w obszarze ATN oraz siRNA-TNC spoza obszaru ATN i ich sekwencje

NAZWA SEKW. siRNA	MIEJSCE WIĄZANIA DO TNC* Seq ID No:25	MIEJSCE W OBRĘBIE SEKW. ATN	SEKWENCJA EFEKTOROWA (WIODĄCA) δ'->3' 2 dodaną modyfikacja na 3’ - w tym przypadku [dT][dTj. Sekwencją podana lako Sen ID No nie ma modyfikacji	Seq ID No (BEZ MODYFIKACJI)	SEKWENCJA PASAŻERSKA 5'->3'	SeqlD No
MB-R-019	423-443	19 39	UCUUCUGGCAGGGUGGCGUUC[dT][dT]	3	GAACGCCACCCUGCCAGAAGA	4
MB-R-047	451-471	47-67	AACGUGGUUAAACACCACUGG[dT][dT]	5	CCAGUGGUGUUUAACCACGUU	6
MB-R-068	472-492	68-88	CACUGGCAGCUUGAUGUUGUA[dT][dT]	7	UACAACAUCAAGCUGCCAGUG	8
MB-R-091	495-515	91-111	AGAUCCACCGAACACUGGGAU[dT][dT]	9	AUCCCAGUGUUCGGUGGAUCU	10
MB-R-134	538-558	134-154	CUCUGAAGGCGGUGCCAGGUCIdT]IdT]	11	GACCUGGCACCGCCUUCAGAG	12
SiRNATNC	4625-4645	—	JUAAGUUUCCAAUUUCAGGUU [ dT ] [ dT ]	13	AACCUGAAAUUGGAAACUUAA	14

‘względem sekwencji ludzkiego TNC (Seq ID No: 25)

Tabela 5. Wyciszenie TNC jako % obniżenia ekspresji TNC względem kontroli [więcej=lepiej]

	Podawana cząsteczka RNA
Linia komórkowa	L2000-ATN- RNA	L-2000siRNATNC	L2000MB-R 019	L2000MB-R 047	L2000MB-R 068	L2000- MB· R 091	L2000-MB-R 134
U-251 MG (glejak)	36%	38%	75%	27%	5%	48%	efekt niespecyficzny
MDA-MB-231 (rak piersi)	57%	48%	90%	96%	27%	85%	68%
OVCAR-3 (rak jajnika)	efekt niespecyficzny	75%	99%	30%	44%	85%	48%

PL 248228 Β1

Wykazano, że wymienione w Tabeli 4 i 5 siRNA wybrane z testowanych różnych siRNA-ATN, po wprowadzeniu do komórek nowotworowych, skutecznie powodują obniżenie poziomu transkryptu genu TNC w określonych liniach nowotworowych. Skuteczność różnych cząsteczek siRNA pochodzących z ATN-RNA, jak również skierowanych poza sekwencję ATN-RNA nie jest równoważna. Cząsteczki MB-R-019, MB-R-091 oraz siRNA-TNC wykazują najwyższą efektywność działania i najsilniej obniżają poziom transkryptu genu TNC spośród przetestowanych cząsteczek we wszystkich badanych typach nowotworów (w tym trzustki - wyniki nie pokazane). Wymienione cząsteczki siRNA, w zależności od typu nowotworu, wykazują wyższe (w zakresie 38-99%) wyciszenie niż cząsteczka ATN-RNA (Tabela 5). Natomiast siRNA-ATN: MB-R-068 i MB-R-134 wykazywały wyższą zdolność wyciszania niż cząsteczka ATN-RNA w liniach raka piersi i raka jajnika w zakresie 68-96%.

Stosowane w badaniach siRNA (Tabela 4) zawierały modyfikacje w stosunku do podstawowej sekwencji uzyskanej na podstawie ATN-RNA czy TNC spoza obszaru ATN polegające na dodaniu nukleotydów [dTdT] na 3’ końcu nici efektorowej. Taka modyfikacja poprawia stabilność, efektywność i specyficzność cząsteczki siRNA. Jak wskazano powyżej w Tabeli 3 możliwe jest wytworzenie siRNA z innymi modyfikacjami, aby dalej zwiększyć stabilność cząsteczki oraz poprawić jej efektywność w wyciszaniu sekwencji docelowej. Jednak jak wykazano efekt obniżenia ekspresji był zależny od sekwencji siRNA a zatem miejsc docelowych o największym potencjale wyciszenia TNC znajdujących się w ramach sekwencji ATN, nie natomiast od rodzaju zastosowanej modyfikacji określonej cząsteczki siRNA.

Przykład 3· Analiza żywotności komórek - ocena cytotoksyczności RNA przy transfekcji z Lipofektaminą

Procedurę rozpoczynano od pasażowania komórek z linii glejaka, raka piersi oraz linii jajnika na 12 dołkowe płytki hodowlane. Hodowle i transfekcję prowadzono jak opisano powyżej w (IV), dla każdego rodzaju RNA w dwóch stężeniach RNA, odpowiednio 0,7 pg/ml i 1,4 pg/ml (odpowiednio 0,35 pg RNA/dołek i 0,7 pg RNA/dołek), w co najmniej trzech powtórzeniach. Cytotoksyczność dla określonej linii komórkowej oceniono testem aktywności metabolicznej opartym o MTT jak opisano wyżej w (V). Wartości uzyskane dla komórek traktowanych Lipofektaminą, kompleksami Lipofektaminy i ATN-RNA oraz określonym siRNA odniesiono do komórek nietransfekowanych, które stanowiły kontrolę - K. Ilość użytej Lipofektaminy była stała i wynosiła 1,75 pl/dołek. Istotność statystyczną uzyskanych wyników określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; * dla p < 0,033; ** dla p < 0,002; *** dla p < 0,001. Uzyskane wyniki przedstawiono na Fig. 3 i w Tabeli 6.

Tabela 6. Ocena cytotoksyczności - żywotność wskazana jako % kontroli; gdzie 100% - odpowiada żywotności komórek nietraktowanych [więcej=lepiej]

	Transfekowany kompleks RNA
Linia komórkowa - podawane stężenie	L2000 ATN RNA	L2000siRNAmc	L20O0- MB-R019	L2000- MB-R047	L2000- MB-R068	L2000- MB-R091	L2000- MB-R134
U-251 MG [0,7 pg/ml]	49%	95%	78%	80%	85%	76%	68%
U-251 MG [1,4 pg/ml]	2%	88%	89%	84%	78%	70%	89%
MDA-MB-231 [0,7 pg/ml]	36%	87%	86%	87%	87%	91%	87%
MDA-MB-231 [1,4 pg/ml]	20%	90%	101%	98%	91%	86%	84%
OVCAR-3 [0,7 pg/ml]	6%	37%	61%	77%	25%	84%	68%
OVCAR-3 [1,4 pg/ml]	6%	25%	48%	63%	17%	74%	27%

Nieoczekiwanie kompleks L2000-ATN-RNA wykazuje wysoką cytotoksyczność wobec wszystkich badanych linii komórkowych, zwiększającą się wraz ze wzrostem podawanej ilości ATN-RNA. Przy stężeniu 1,4 pg/ml dla linii komórkowych U-251 MG oraz OVCAR-3 wykazano całkowite obumarcie badanych hodowli in vitro. Wpływ testowanych siRNA na przeżywalność komórek linii glejaka ani raka piersi nie przekroczył w żadnym przypadku 50%. W linii komórkowej jajnika w obecności nośnika L2000 najniższą toksyczność wykazały cząsteczki MB-R-019, MB-R-047 i MB-R-091. siRNA, bez względu na rodzaj, wykazuje dużo niższą cytotoksyczność w porównaniu do ATN-RNA wprowadzanego do komórek w tym samym stężeniu wagowym.

PL 248228 Β1

Przykład 4· Oznaczenie aktywacji genów związanych z odpowiedzią zapalną - ocena immunogenności na poziomie komórkowym z Lipofektaminą jako nośnikiem

Dla oceny immunogenności poszczególnych konstruktów RNA tj. ATN-RNA i wybranych siRNA komórki glejaka, raka piersi i raka jajnika badano ich wpływ na aktywację genów odpowiedzi zapalnej tj. syntetazy 2'-5'-oligoadenylanowej (OAS1) i genu indukowanego kwasem retinowym I (RIG1). Procedurę rozpoczynano od pasażowania komórek z linii komórkowej na 12-dołkowe płytki hodowlane. Hodowle i transfekcję prowadzono jak opisano powyżej w (IV). Transfekcję każdej linii komórkowej prowadzono z różnymi RNA: ATN-RNA w stężeniu 0,35 pg/ml oraz siRNA w stężeniu 0,35 pg/ml (0,175 pg RNA/dołek) stosując jako nośnik Lipofectamine™2000. Następnie komórki zebrano, wyizolowano RNA i przeprowadzono analizę RT-qPCRjak opisano w (VI).

Porównano wpływ ATN-RNA, siRNA-ATN, oraz siRNA-TNC z nośnikiem komercyjnym (L2000) na indukcję odpowiedzi immunologicznej porównując poziom ekspresji OAS1 i RIG1 w komórkach transfekowanych RNA i odnoszono do komórek traktowanych samym nośnikiem. Istotność statystyczną określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; * dla p < 0,033; ** dla p < 0,002; *** dla p < 0,001. Uzyskane wyniki przedstawiono na Fig. 4 i w Tabeli 7.

Tabela 7. Ocena immunogenności poszczególnych RNA wyrażona jako % kontroli wobec komórek traktowanych samym nośnikiem (przyjęte za 100%) w odniesieniu do ekspresji genów referencyjnych ACTB i HPRT [mniej=lepiej]

	fransfekowany kompleks RNA
Badana ekspresja genu [%] - linia	L2000-	L2000-	L2000-	L2000-	L2000-	L2000-	L2000-
komórkowa	ATN-	siRNA-	MB-R-	MB-R-	MB-R-	MB-R-	MB-R-
	RNA	TNC	019	047	068	091	134
OAS1 U-251 MG	390%	97%	119%	1100%	20100%	150%	1830%
RIG1 U-251 MG	300%	120%	108%	92%	340%	74%	101%
0AS1 MDA-MB-231	720%	511%	294%	890%	3300%	510%	1100%
RIG1 MDA-MB-231	76%	895%	283%	1235%	2000%	1380%	2770%
0AS1 OVCAR-3	150%	310%	125%	3544%	340%	1100%	300%
RIG1 OVCAR-3	240%	105%	68%	210%	220%	160%	110%

Immunogenność poszczególnych siRNA nie jest równoważna. Różni się ona w zależności od zastosowanej linii komórkowej. Cząsteczka MB-R-019 wykazuje najniższą średnią immunogenność we wszystkich testowanych nowotworowych liniach komórkowych wywołując o ponad 50% mniejszy wzrost poziomu ekspresji badanych genów w porównaniu do ATN-RNA.

Przykład 5· Analiza żywotności komórek - ocena cytotoksyczności ATN-RNA przy transfekcji różnymi nośnikami lipidowymi

Procedurę rozpoczynano od pasażowania komórek z linii glejakowych, raka piersi, linii jajnika oraz linii komórek nienowotworowych na 12-dołkowe płytki hodowlane. Hodowle i transfekcję prowadzono jak opisano powyżej w (IV). Kompleksy lipidowych nanocząstek LNP1-ATN-RNA (LNP1 z ATN-RNA) wytworzono jak opisano powyżej w (II). ATN-RNA w danym nośniku lipidowym podawano w stężeniu 12,5 nM (1,4 pg/ml, 0,7 pg RNA/dołek). Cytotoksycznośćdla określonej linii komórkowej oceniono testem aktywności metabolicznej opartym o MTT jak opisano wyżej w (V). Porównano toksyczności ATN-RNA w obecności różnych nośników lipidowych. Wartości uzyskane dla komórek traktowanych ATN-RNA odniesiono do kontrolnych komórek nietraktowanych. Istotność statystyczną określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; *** dla p < 0,001. Uzyskane wyniki przedstawiono na Fig. 5 i w Tabeli 8.

Tabela 8. Ocena cytotoksyczności - żywotność wskazana jako % względem kontroli, gdzie 100% - odpowiada żywotności komórek nietraktowanych [więcej Hep i ej]

Linia komórkowa	Transtekowany kompleks: L2000-ATN-RNA	Transtekowany kompleks: LNP1-ATN-RNA
0VCAR-3	23%	32%
U-251 MG	14%	40%
MDA-MB-231	2%	59%
MRC-5	5%	16%

PL 248228 Β1

Wyniki dla wszystkich czterech linii komórkowych wskazują na średnio 3-krotnie wyższą przeżywalność komórek traktowanych kompleksami lipidowymi będących przedmiotem patentu, w porównaniu do komercyjnego czynnika transfekcyjnego. Świadczy to o relatywnie mniejszej toksyczności patentowanej metody transfekcji.

Przykład 6· Analiza poziomu ekspresji TNC po traktowaniu cząsteczkami RNA w różnych nośnikach

Poszukiwano skutecznych nośników dla uzyskania stabilizacji cząsteczek RNA i bezpiecznego oraz wydajnego ich dostarczania do komórek docelowych dla uzyskania jak najlepszych rezultatów terapeutycznych. W tym celu wytworzono różne kompleksy lipidowych nanocząstek z ATN-RNA oraz z różnymi siRNA i bez nich do stosowania jako kontrola. Zgodnie z metodą przedstawioną w (II) wytworzono kationowe LNP1 kompleksy lipidowych nanocząstek oraz jonizowalne (obojętne) kompleksy lipidowych nanocząstek LNP2.

A) Porównanie wyciszania TNC dla ATN-RNA podawanego w kompleksach lipidowych kationowych LNP1 i obojętnych LNP2

Komórki z glejakowych linii komórkowych U-118 MG i U-251 MG pasażowano na 12-dołkowe płytki hodowlane. Hodowle i transfekcję prowadzono jak opisano powyżej w (V). Transfekcję każdej linii komórkowej prowadzono z LNP1-ATN-RNA i LNP2-ATN-RNA w stężeniu 1,4 pg/ml (0,7 pg RNA/dołek) dla linii U-118 MG oraz 2,8 pg/ml (1,4 pg RNA/dołek) dla linii U-251 MG. Następnie komórki zebrano, wyizolowano RNA i przeprowadzono analizę RT-qPCRdla oznaczenia poziomu ekspresji TNC jak opisano w (VI). Uzyskane wyniki odnoszono do komórek traktowanych samym nośnikiem. Istotność statystyczną określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; ** dla p < 0,01; *** dla p < 0,001. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 6 i w Tabeli 9.

Tabela 9. Ocena wyciszenia ekspresji TNC w odniesieniu do kontroli wyrażona w % [więcej=lepiej

Linia glejakowa	LNP1-ATN-RNA	LNP2-ATN-RNA
U-118 MG	11%	efekt niespecyficzny
U-251 MG	63%	efekt niespecyficzny

Nieoczekiwanie okazało się, że zastosowanie nośnika kationowego LNP1 prowadzi do efektywniejszego wyciszenia genu TNC w porównaniu z nośnikiem obojętnym LNP2 skutkując nawet do 3 razy większym wycieszeniem jego ekspresji. Nieoczekiwanie okazało się, że stosując nośnik obojętny (jonizowalny) uzyskuje się jedynie rezultaty niespecyficzne. Ponadto okazało się, że dla wyciszania tenascyny-C rodzaj zastosowanego nośnika nie jest bez znaczenia, a stosując niewłaściwy nośnik, można uzyskać efekt odwrotny od zamierzonego. Pomimo, iż stan techniki wskazywał na wyższość LNP jonizowalnych (LNP2), uzyskane wyniki ujawniły efekt odwrotny tojest przewagę LNP kationowych (LNP1), co było nieoczywiste i niemożliwe do przewidzenia. Dla dalszych badań dla różnych siRNA stosowano zatem kompleksy lipidowe z nośnikiem kationowym (LNP1).

B) Porównanie wyciszania TNC dla podawanych różnych siRNA i ATN-RNA w kationowych kompleksach lipidowych LNP1

Komórki z linii komórkowych glejaka, raka piersi i raka jajnika pasażowano na płytki hodowlane. Hodowle i transfekcję prowadzono jak opisano powyżej w (IV) z wykorzystaniem kompleksów LNP1 jako nośników różnych RNA. Transfekcję każdej linii komórkowej prowadzono z LNP1-ATN-RNA, LNP1 z różnymi wybranymi siRNA-ATN oraz siRNA-TNC, podając każde RNA w dwóch stężeniach 50 nM (0,7 pg/ml, 0,35 pg RNA/dołek) oraz 100 nM (1,4 pg/ml, 0,7 pg RNA/dołek). Następnie komórki zebrano, wyizolowano RNA i przeprowadzono analizę RT-qPCR dla oznaczenia poziomu ekspresji TNC jak opisano w (VI). Uzyskane wyniki odnoszono do komórek traktowanych samym nośnikiem i niespecyficznego siRNA (MISSION® siRNA Universal Negative Control #2, nr kat. SIC002). Istotność statystyczną określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; * dla p < 0,033; ** dla p < 0,002; *** dla p < 0,001. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 7 i w Tabeli 10.

PL 248228 Β1

Tabela 10. Ocena wyciszenia ekspresji TNC dla badanych RNA w kompleksach lipidowych LNP1 w odniesieniu do kontroli, wyrażona w %, gdzie 100% stanowi pełne wyciszenie [więcej=lepiej]

	Transfekowany kompleks RNA w LNP1 i stosowane stężenie
0,7 pg/mL	1,4 pg/mL
Linia komórkowa	LNP1-ATN- RNA	LNP1- siRNA- INC	LNP1- MB-R· 01 g	LNP1- MB-R- 091	LNP1- ATN- RNA	siRNA-TNC	LNP1- MB-R- 019	LNP1- MB-R- 091
U-251 MG	60%	59%	57%	69%	74%	66%	78%	81%
MDA-MB-231	*	4%	56%	56%		26%	81%	81%
0VCAR-3	*	53%	81%	57%	*	56%	65%	56%

* efekt niespecyficzny

Kompleks LNP1-MB-R-019 wykazuje najwyższą skuteczność wyciszania TNC w badanych liniach nowotworowych, i obniża ekspresję w zakresie aż o 56-81%, odpowiednio.

C) Porównanie wyciszania TNC dla podawanych mieszanin różnych siRNA w różnych proporcjach

Postępując podobnie jak w pkt B) powyżej badano wpływ na wyciszanie ekspresji TNC w komórkach raka jajnika OVCAR-3 podając kompleksy LNP1 z mieszaninami różnych RNA w dwóch stężeniach 50 nM (0,7 pg/ml, 0,35 pg RNA/dołek) oraz 100 nM (1,4 pg/ml, 0,7 pg RNA/dołek). Otrzymane wyniki przedstawiono w Tabeli 11.

Tabela 11. Ocena wyciszenia ekspresji TNC w komórkach raka jajnika przy transfekcji kompleksów LNP1 z mieszaninami różnych siRNA w porównaniu do ATN-RNA, siRNA-ATN oraz siRNA-TNC stosowanych pojedynczo, w odniesieniu do kontroli wyrażona w %; gdzie 100% stanowi pełne wyciszenie [więcej=lepiej].

Wyciszenie TNC [% kontroli]	LNP1-ATN- RNA	LNP1- siRNA-TNC	LNP1- MB-R 019	LNP1- MB-R 091	LNP1- MB- R 019+MB -R-091	LNP1-MB- R- 019+siR NA-TNC	LNP1-MB-R091+siRNA-TNC
0,7 pg/ml	w	*	*	*	50%	70%	10%
1,4 pg/ml	*	*	50%	30%	*	40%	55%

* efekt niespecyficzny

Mieszaniny siRNA wykazują lepszą skuteczność niż pojedyncze cząsteczki w równych stosunkach wagowych. W stężeniu 0,7 pg/ml (0,35 pg RNA/dołek) mieszanina kompleksów LNP1-MB-R-019+siRNA-TNC wykazuje najwyższą skuteczność wyciszania TNC i obniża ekspresję w zakresie do 70%. W stężeniu 1,4 pg/ml (0,7 pg RNA/dołek) najskuteczniejsza okazuje się mieszanina LNP1-MB-R-091/siRNA-TNC wykazując obniżenie poziomu TNC o 55%. W działaniu mieszanin siRNA widoczny jest efekt synergistyczny stosowanych cząsteczek, niemożliwy do przewidzenia. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 8 i w Tabeli 12.

Przykład 7· Porównanie toksyczności ATN-RNA oraz wybranych siRNA podawanych w różnych stężeniach w kationowych kompleksach lipidowych LNP1

W celu oceny toksyczności stosowanych kompleksów RNA w nośniku LNP1 przeprowadzono analizy żywotności komórek podobnie jak w Przykładzie 3. Analizę rozpoczynano od pasażowania komórek z linii glejaka, raka piersi oraz linii jajnika na płytki hodowlane. Hodowle i transfekcję prowadzono jak opisano powyżej w (IV), dla każdego rodzaju RNA w dwóch stężeniach 0,7 pg/ml i 1,4 pg/ml, odpowiednio (0,35 i 0,7 pg RNA/dołek). Cytotoksyczność dla określonej próby na danej linii komórkowej oceniono testem aktywności metabolicznej opartym o MTT jak opisano wyżej w (V). Wartości uzyskane dla komórek traktowanych LNP z określonym RNA odniesiono do komórek nietraktowanych. Istotność statystyczną określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; * dla p < 0,05; ** dla p < 0,01; *** dla p < 0,001. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 9 i w Tabeli 12.

PL 248228 Β1

Tabela 12. Ocena cytotoksyczności dla badanych RNAw kompleksach lipidowych LNP1 - żywotność wskazana jako % kontroli; gdzie 100% - odpowiada żywotności komórek nietraktowanych [więcej=lepiej]

	Transfekowany kompleks RNA w LNP1 i stosowane stężenie RNA
0,7 pg/mL	1,4 pg/mL
Linia komórkowa	LNP-C1	LNP1ATN- RNA	LNP1- SiRNATNC	LNP1- MB-R019	LNP1MB-R091	LNP-C2	LNP1ATNRNA	LNP1- SiRNATNC	LNP1MBR-019	LNP1MBR-091
U-251 MG (glejak)	84%	30%	107%	84%	90%	88%	40%	99%	83%	72%
MDA-MB-231 (r. piersi)	105%	81%	71%	82%	81%	95%	59%	60%	80%	74%
OVCAR-3 (r. jajnika)	71%	14%	44%	73%	70%	66%	8,5%	23%	58%	61%

Kompleksy LNP1-siRNA: LNP1-siRNA-TNC, LNP1-MB-R-019, LNP1-MB-R-091 wykazują średnio powyżej 30% mniejszą toksyczność w porównaniu do kompleksów LNP1-ATN-RNA podawanych do tych samych linii komórkowych. Oznacza to, że podawanie wyselekcjonowanych siRNA obniżających poziom TNC w postaci kationowych kompleksów lipidowych LNP1 z siRNA będzie miało pozytywny wpływ na przeżywalność pacjentów, gdyż kompozycje je zawierające są mniej toksyczne. Stąd szczególnie korzystne w leczeniu nowotworów będą kompozycje zawierające LNP1-MB-R-019 i/lub LNP1-MB-R-091.

Przykład 8· Oznaczenie aktywacji genów związanych z odpowiedzią zapalną - ocena immunogenności kationowych kompleksów lipidowych LNP1 - jako nośników RNA, na poziomie komórkowym

Ocenę immunogenności poszczególnych konstruktów RNA tj. ATN-RNA i wybranych siRNA w nośniku LNP1 na linie komórkowe glejaka, raka piersi i raka jajnika określano badając ich wpływ na aktywację genów odpowiedzi zapalnej tj. syntetazy 2'-5'-oligoadenylanowej (OAS1) i genu indukowanego kwasem retinowym I (RIG1) podobniejakw Przykładzie 4. Hodowle i transfekcję prowadzono jak opisano powyżej w (IV). Transfekcję każdej linii komórkowej prowadzono z różnymi RNA: stosując ATN-RNA w stężeniu 1,4 pg/ml oraz siRNA w stężeniu 1,4 pg/ml w LNP1 (0,75 pg RNA/dołek). Następnie komórki zebrano, wyizolowano RNA i przeprowadzono analizę RT-qPCR ekspresji OAS1 i RIG1 jak opisano w (VI). Porównano wpływ ATN-RNA, badanych siRNA-ATN z obszaru ATN oraz siRNA-TNC podawanych w postaci kationowych kompleksów lipidowych LNP1 na indukcję odpowiedzi immunologicznej porównując poziom ekspresji OAS1 i RIG1 w komórkach transfekowanych określonym kompleksem LPN1 z RNA i odnoszono do komórek traktowanych samym nośnikiem LNP1 w ilości równoważnej nanocząstkom lipidowym zawartym w kompleksach z RNA. Istotność statystyczną określono analizą one-way ANOVA, rozszerzoną testem Bonferroniego; * dla p < 0,033; ** dla p < 0,002; *** dla p < 0,001. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 10 i w Tabeli 13.

Tabela 13. Ocena immunogenności dla badanych RNA w kompleksach lipidowych LNP1, wobec ekspresji genów referencyjnych RIG1 i OAS1; gdzie 100% stanowi ekspresja w komórkach traktowanych nanocząstkami LNP1 [mniej=lepiej]

	Ocena ekspresji OAS1 Transfekowany kompleks RNA	Ocena ekspresjiRIG1 Transfekowany kom ple	ks RNA
Linia komórkowa	LNP1- ATNRNA	LNP1si RN A-TNC	LNP1- MB- R019	LNP1-MB- R091	LNP1-ATNRNA	LNP1siRNA-TNC	LNP1-MB-R019	LNP1- MB- R091
U-251 MG	4800%	950%	900%	120%	5700%	690%	400%	84%
MDA-MB231	820%	680%	160%	96%	98%	85%	80%	150%
0VCAR-3	2400%	1800%	240%	140%	340%	590%	140%	140%

Nieoczekiwanie okazało się, że LNP1-ATN-RNA oraz LNP1-siRNA-TNC wykazują bardzo silny wzrost znaczników stanu zapalnego OAS1 i RIG1 w linii glejaka i raka jajnika oraz wysoki wzrost ekspresji RIG1 w raku piersi, stąd mają niższy potencjał terapeutyczny.

Wykazano również, że podawane w LPN1 wybrane siRNA-ATN (LNP1-MB-R-019 i LNP1-MB-R-091) wywołują aż do 15 razy mniejszą odpowiedź immunologiczną w porównaniu z LNP1-ATN-RNA.

PL 248228 Β1

Przykład 9· Analiza stabilności cząsteczek RNA samych i w kompleksie z LNP1

Oznaczenie stabilności ATN-RNA i określonego siRNA jak również równomolowej ilości kompleksu LNP1-ATN-RNA i określonego LNP1-siRNA-TNC prowadzono jak opisano w (III) powyżej. Wyniki densytometrycznej analizy intensywności sygnału dla poszczególnych prób przedstawiono na Fig. 11. Okazało się, że zastosowanie nośnika LNP1 chroni RNA zawarte w kompleksie przed degradacją w kontakcie z nukleazami komórkowymi (> 70% vs 0% w ciągu 72 h, odpowiednio LNP1-RNA vs niezwiązane RNA).

Przykład 10· Analiza wpływu badanych cząsteczek (ATN-RNA, siRNA-ATN, siRNA-TNC) na poziom ekspresji TNC w komórkach nowotworowych trzustki

Na podstawie dostępnych doniesień literaturowych dotyczących wpływu wyciszenia transkryptu genu TNC za pomocą techniki RNAi, na zahamowanie proliferacji komórek trzech różnych linii nowotworowych trzustki, Capan-2, PANC-1, MiaPaCa-2 [24]. Na nowotworowej linii komórkowej trzustki Panc-1 przeprowadzono badania z kompleksami LNP1 z ATN-RNA oraz z wybranymi siRNA-ATN (LNP1-MB-R- 019 i LNP1-MB-R-091) postępując jak opisano (IV), (VI) i (VII). Z otrzymanych wstępnych wyników wynika, że również dla wybranych siRNA-ATN uzyskuje się obniżenie poziomu TNC w komórkach Panc-1.

Przykład 11· Ocena toksyczności LNP1 oraz cząsteczki LNP1-MB-R-19 wyciszających ludzką tenascynę-C in vivo

Ocenę toksyczności samego nośnika LNP1 oraz kompleksu LNP1-MB-R-19 in vivo przeprowadzono jak opisano powyżej w (VIII). Wyniki przedstawione w Tabeli 14 wskazują, że LNP1 było dobrze tolerowane przez zwierzęta doświadczalne przy podaniu dokomorowym (do mózgu) w dawce maksymalnie do 100 pg, co stanowi 10-krotność spodziewanej skutecznej dawki terapeutycznej (10 pg). Bardzo dobrze tolerowane były również podawane w nośniku LNP1 terapeutyczne siRNA-ATN.

Tabela 14. Ocena toksyczności lipidów tworzących otoczkę LNP1 oraz kompleksów LNP1-RNA in vivo na podstawie zaobserwowanej przeżywalności zwierząt.

Podana cząsteczka LNP	Zastosowana dawka LNP (pg/myszj	Zastosowana dawka LNP (mg/kg m.c)	Liczba żywych zwierząt [n/%]	Liczba martwych zwierząt [n/%]	Całkowita liczba zwierząt
LNP1	200	10	1/50%	1/50%	2
150	7,5	2/75%	1/25%	3
100	5	3/100%	0/0%	3
75	3,75	1/100%	0/0%	1
LNP1-MB-R-19	50 (w tym 3pg siRNA)	2,5 (wtym 0,15mg siRNA)	3/100%	0/0%	3
10 (wtym0,6gg siRNA)	0,5 (wtym 0,03 mg siRNA)	3/100%	0/0%	3

Okazało się, że terapeutyczne cząsteczki siRNA-ATN według wynalazku podawane in-vivo w nośniku LNP1 są bardzo dobrze tolerowane i bezpieczne dla myszy.

Przykład 12· Właściwości kompleksów LNP1 z siRNA wytworzonych sposobem według wynalazku

Kompleksy LNP1-siRNA-ATN oraz LNP1-siRNA-TNC otrzymano metodą mieszania mikroprzepływowego jak opisano powyżej w (II). Zastosowano stosunek molowy N/P wynoszący 8 w oparciu o dane literaturowe [Geall et al. 2012]. Celem potwierdzenia homogenności LNP zmierzono ich średnicę hydrodynamiczną, wskaźnik polidyspersyjności i zeta potencjał. Potencjał zeta to potencjał pomiędzy dyspergantem a warstwą płynu przyczepioną do powierzchni cząstki, wykorzystywany do oceny stabilności dyspersji. Oceniono również wydajność inkorporacji siRNA-TNC oraz stopień jego związania z LNP1 jak w (II). W Tabeli 15 umieszczono uzyskane dla wspomnianych parametrów wartości.

PL 248228 Β1

Tabela 15. Właściwości fizykochemiczne otrzymanych kompleksów LNP1-siRNA według wynalazku

	zav [nm]	PDI*	Potencjał zeta [mV]	Wydajność inkorporacji I%]	Stopień wiązania [%]
LNP1-SiRNA-TNC	92.3+3,4	0,093±0,007	3,5+0,8	81,5+2,5%	>99%

ZAV - (ang. Z average) - średnica hydrodynamiczna

PDI - (ang. polydispersity index) - wskaźnik polidyspersyjności *PDI<0,1 - próbka superhomogenna, PDI < 0,25 - wartość progowa

Wytworzone metodą mikroprzepływową kompleksy LNP-RNA (LNP1 lub LNP2 z określonym RNA: ATN-RNA, siRNA-ATN, siRNA-TNC) pozwoliły na uzyskanie stabilnych kompleksów o wielkości gwarantującej aktywność biologiczną (poniżej 100 nm), i niskim indeksie polidyspersyjności (< 0,1), wskazującym na bardzo wysoki stopień homogenności próbki. Zastosowanie metody mikroprzepływowej spowodowało, że otrzymane kompleksy LNP-RNA wykazywały szereg zalet w stosunku do znanej ze stanu techniki metody powolnego mieszania [US 11026894B2]: tj. charakteryzowały się mniejszym rozmiarem uzyskanych cząstek (92,3 ± 3,4 nm vs 100 ± 10 nm), wysoką wydajnością inkorporacji, wysokim stopniem wiązania RNA, powtarzalnością oraz skalowalnością metody ich wytwarzania. Jednocześnie zastosowana metoda wytwarzania kompleksów LNP-RNA według wynalazku omija konieczny w konwencjonalnych metodach produkcji LNP etap sonikacji i ekstruzji, które w negatywny sposób wpływają na stabilność kwasów nukleinowych, powodując ich degradację i utlenianie oraz często prowadzą do kontaminacji formulacji. Ponadto, w odróżnieniu od metody powolnego mieszania znanej ze stanu techniki, zastosowana metoda mikroprzepływową nie tylko daje wysokiej jakości kompleksy LNP-RNA, ale również umożliwia łatwe przeniesienie procesu syntezy ze skali laboratoryjnej do skali przemysłowej.

LITERATURA:

Akinc A et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nat. Nanotechnol. 2019; 14: 1084-1087.

Balasenthil S et al. A migration signature and plasma biomarker panel for pancreatic adenocarcinoma. Cancer Prev Res (Phila). 2011; 4:137-49.

Balasenthil S et al. A plasma biomarker panel to identify surgically resectable early-stage pancreatic cancer. J Natl Cancer Inst. 2017; 109(8): 1-10.

Behrem S et al. Distribution pattern of tenascin-C in glioblastoma: correlation with angiogenesis and tumorcell proliferation. Pathol Oncol Res. 2005; 11: 229-35.

Cai J et al.Tenascin-C modulates celi cycle progression to enhance tumour celi proliferation through akt/foxo1 signalling in pancreatic cancer. J Cancer 2018; 9: 4449-4462.

Chiquet-Ehrismann R and Chiquet M. Tenascins: regulation and putative functions during pathological stress. J Pathol 2003; 200: 488-99.

Chonn Aet al. The roleof surface charge in the activation of the classical and alternative pathways of complement by liposomes. J Immunol. 1991; 146: 4234-41.

Dammes N et al. Paving the road for RNA therapeutics. Trends Pharmacol Sci. 2020; 41: 755-775.

Esposito I et al.Tenascin C and annexin II expression in the process of pancreatic carcinogenesis. J Pathol. 2006; 208:673-85.

Fu Z et al. In vivo self-assembled smali RNAs as a new generation of RNAi therapeutics. Celi Res. 2021 ; 31:631-648.

Furusawaa Y et al. Effects of therapeutic ultrasound on the nucleus and genomie DNA. Ultrasonics Sonochemistry 2014; 21: 2061-2068

Geall AJ et al. Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2012; 109: 14604-14609.

Grabowska, M. et al. Nano-mediated delivery of double-stranded RNA for gene therapy of glioblastoma multiforme. PLoS ONE. 2019; 14(3): 1-21.

Grzelinski Mariusz et al. RNA interference-mediated gene silencing of pleiotrophin through polyethylenimine-complexed small interfering RNAs in vivo exerts antitumoral effects in glioblastoma xenografts. Human Gene Therapy. 2006; 17: 751-766.

Guttery DS et al. Association of invasion-promoting tenascin-C additional domains with breast cancers in young women. Breast Cancer Res. 2010; 12: R57.

Halder J et al. Focal adhesion kinase targeting using in vivo short interfering RNA delivery in neutral liposomes for ovarian carcinoma therapy. Clin Cancer Res. 2006; 12: 4916-24.

Hu B et al. Therapeutic siRNA: state of the art. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2020; 5:101.

Jahkola T et al. Tenascin-C expression in invasion border of early breast cancer: a predictor of local and distant recurrence. Br J Cancer. 1998; 78:1507-13.

Jahn A et al. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. J. Am. Chem. Soc. 2004; 126: 2674-2675.

Jallo Gl et al. Tenascin-C expression in the cyst wall and fluid of human brain tumors correlates with angiogenesis. Neurosurgery 1997; 5: 1052-9.

Leins A et al. Expression of tenascin-C in various human brain tumors and its relevance for survival in patients with astrocytoma. Cancer 2003; 98: 2430-9.

Li ZL et al. Autophagy deficiency promotes triple-negative breast cancer resistance to T cell-mediated cytotoxicity by blocking tenascin-C degradation. Nat Commun 2020; 11,3806.

Lieleg O et al. Selective filtering of particles by the extracellular matrix: an electrostatic bandpass. Biophysical Journal. 2009; 97: 1569-1577.

Liot S et al. Stroma involvement in pancreatic ductal adenocarcinoma: an overview focusing on extracellular matrix proteins. Front. Immunol. 2021; 12: 612271.

Ma KK et al. Triple Negative Status is a Poor Prognostic Indicator in Chinese Women with Breast Cancer: a Ten Year Review. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2012; 13: 2109-2114.

MacLachlan I. Liposomal formulations for nucleic acid delivery. Antisense Drug Technol. Princ. Strat. Appl. 2007;2:237-270.

Ming X et al. Prognostic Role of Tenascin-C for Cancer Outcome: A Meta-Analysis. Technology in Cancer Research & Treatment. 2019; 18: 1-9.

Nie S et al. Tenascin-C: A Novel Candidate Marker for Cancer Stem Cells in Glioblastoma Identified by Tissue Microarrays. J. Proteome Res. 2015; 14: 814-822.

Ortega-Berlanga B et al. Recent Advances in the Use of Lipid-Based Nanoparticles Against Glioblastoma Multiforme. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2021; 69:8.

Oskarsson Tet al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med 2011 ; 17: 867-874.

Pas J et al. Analysis of structure and function of tenascin-C. Int J Biochem Cell Biol. 2006; 38:1594-602.

Qian S et al. Exosomal Tenascin-c induces proliferation and invasion of pancreatic cancer cells by WNT signaling. OncoTargets and Therapy 2019; 12: 3197-3205.

Reardon DA et al. A pilot study: 131 l-Antitenascin monoclonal antibody 81 c6 to deliver a 44-Gy resection cavity boost. Neuro Oncology 2008; 10: 182-189.

Reardon DA et al.Phase II trial of murine (131 )l-labeled antitenascin monoclonal antibody 81C6 administered into surgically created resection cavities of patients with newly diagnosed malignant gliomas. J Clin Oncol. 2002; 20: 1389-1397.

Rolle K et al. Promising human brain tumors therapy with interference RNA intervention (iRNAi). Cancer Biology&Therapy 2010; 9:5: 396-406.

Semple SC et al. Efficient encapsulation of antisense oligonucleotides in lipid vesicles using ionizable aminolipids: Formation of novel small multilamellar vesicle structures. Biochim. Biophys. Acta (BBA) Biomembr. 2001; 1510: 152-166.

Schlich M et al. Cytosolic delivery of nucleic acids: The case of ionizable lipid nanoparticles. Bioeng Transi Med. 2021; 20: e10213.

Tang Z. et al. GEPIA: a web server for cancer and normal gene expression profiling and interactive analyses. Nucleic Acids Res. 2017; 45: 98-102.

Tas F et al. Clinical significance of serum protease-activated receptor-1 levels in gastric cancer patients. Biomed Rep. 2016; 4: 489-492.

Wawrzyniak D et al. Down-regulation of tenascin-C inhibits breast cancer cells development by cell growth, migration, and adhesion impairment. PLoS ONE 2020; 15(8): 1-25.

Wilson KE et al. Expression of the extracellular matrix protein tenascin in malignant and benign ovarian tumours. Br J Cancer 1996; 74: 999-1004.

Wilson KE et al. Expression of the extracellular matrix protein tenascin in malignant and benign ovarian tumours. Br J Cancer. 1996; 74:999-1004.

Wilson KE et al.Regulation and function of the extracellular matrix protein tenascin-C in ovarian cancer cell lines. Br J Cancer. 1999; 80: 685-692.

Yang et al. Tenascin C is a prognostic determinant and potential cancer-associated fibroblasts marker for breast ductal carcinoma. Experimental and Molecular Pathology 2017; 102: 262-267. Yoshida J et al. Human gene therapy for malignant gliomas (glioblastoma multiforme and anaplastic astrocytoma) by in vivo transduction with human interferon b gene using cationic liposomes. Human Gene Therapy 2004; 15: 77-86.

Zukiel R et al. Suppression of human brain tumor with interference RNA specific for tenascin-C. Cancer Biol Ther. 2006; 5: 1002-7.

PL 248228 Β1

LISTA SEKWENCJI

Sekwencje Seq ID No: 15-24 przedstawione w wersji elektronicznej (oraz w Przykładach, Materiały i metody (IV)) Seq ID No: 25 przedstawiona w wersji elektronicznej oraz dostępna pod nr.NM_002160.4) <110> Medicofarma Biotech <120> siRNA przeciw tenascyna-C <130> PPL/1328/AGR <160> 24 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 163 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1

caagcgacag	agugggguga	acgccacccu	gccagaagag	aaccagccag	□gguguuuaa	60
ccacguuuac	aacaucaagc	ugccaguggg	aucccagugu	ucgguggauc	uggagucagc	120
caguggggag <210> 2 <211> 163 <212> RNA <213> homc <400> 2	aaagaccugg > sapiens	caccgccuuc	agagcccagc	gaa		163
uucgcugggc	ucugaaggcg	gugccagguc	uuucucccca	cuggcugacu	ccagauccac	60
cgaacacugg	gaucccacug	gcagcuugau	guuguaaacg	ugguuaaaca	ccacuggcug	120
guucucuucu	ggcagggugg	cguucacccc	acucugucgc	uug		163

<210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> artificial <220>

<223> synthetic ssRNA <400> 3 ucuucuggca ggguggcguu c 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> artificial <220>

<223> synthetic ssRNA <400> 4 gaacgccacc cugccagaag a 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> artificial <220>

<223> synthetic ssRNA <400> 5 aacgugguua aacaccacug g 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> artificial <220>

<223> synthetic ssRNA <400> 6 ccaguggugu uuaaccacgu u 21 <210> 7 <211> 21 < 212> RNA < 213> artificial <220>

< 223> synthetic ssRNA

PL 248228 Β1 <400> 7 cacuggcagc uugauguugu a

<210>	8
<211>	21
<212>	RNA
<213>	artificial
<220>
<223>	synthetic ssRNA
<400>	8

uacaacauca agcugccagu g <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> artificial <220>

<223> synthetic ssRNA <400> 9 agauccaccg aacacuggga u

<210>	10
<211>	21
<212>	RNA
<213>	artificial
<220>
<223>	synthetic ssRNA
<400>	10

aucccagugu ucgguggauc u

<210>	11
<211>	21
<212>	RNA
<213>	synthetic ssRNA
<400>	11

cucugaaggc ggugccaggu c <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> artificial <220>

<223> synthetic ssRNA <400> 12 gaccuggcac cgccuucaga g <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> artificial <220>

<223> synthetic ssRNA <400> 13 uuaaguuucc aauuucaggu u <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> artificial <220>

<223> synthetic ssRNA <400> 14 aaccugaaau uggaaacuua a

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Cząsteczka siRNA wobec sekwencji transkryptu ludzkiej tenascyny-C (TNC), ujawnionej w bazie NCBI jako NM 002160.4, Seq ID No: 25, znamienna tym, że cząsteczką siRNA jest cząsteczka MB-R-019 stanowiąca dupleks sekwencji efektorowej o Seq ID No: 3 z sekwencją pasażerską o Seq ID No: 4.
2. 2. Cząsteczka siRNA według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka siRNA zawiera co najmniej jeden modyfikowany chemicznie nukleotyd i/lub co najmniej jedną modyfikację wybraną z modyfikacji 2'-o-Me, wiązań typu PTO, modyfikacji 2'-Fluoro RNA, modyfikacji 5'-E winylofosfonianem 2'-metoksyurydyny, modyfikacji cholesterolem, modyfikacji przez przyłączenie deoksynukleotydów [dTdT], korzystnie zawiera przyłączone deoksynukleotydy [dTdT] na 3’ końcu nici efektorowej.
3. 3. Nanocząstka lipidowa LNP, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedną cząsteczkę siRNA, jak określono w którymkolwiek z zastrz. 1 albo 2.
4. 4. Nanocząstka lipidowa LNP według zastrz. 3, znamienna tym, że jest kationowym lipidowym kompleksem.
5. 5. Nanocząstka lipidowa LNP według zastrz. 4, znamienna tym, że kationowy lipidowy kompleks zawiera:

   DSPC (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina) : DOTAP (chlorek N-[1-(2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy) : cholesterol : DSPE-PEG2000 (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000), w stosunku wagowym 10:40:48:2 ± 10% każdego z lipidów.
6. 6. Nanocząstka lipidowa LNP według któregokolwiek z zastrz. 3-5, znamienna tym, że jest wytworzona metodą mieszania mikroprzepływowego.
7. 7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozczynnik lub zaróbkę, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę siRNA, jak określono w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 albo 2 i/lub zawiera co najmniej jedną nanocząstkę lipidową LNP, jak określono w którymkolwiek z zastrz. 3-6.
8. 8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że nanocząstka lipidowa LNP stanowi kationowy lipidowy kompleks, zawierający:

   DSPC (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina) : DOTAP (chlorek N-[1-(2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy) : cholesterol : DSPE-PEG2000 (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000), w stosunku wagowym 10:40:48:2 ± 10% każdego z lipidów.
9. 9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7 albo 8, znamienna tym, że nanocząstka lipidowa LNP jest wytworzona metodą mieszania mikroprzepływowego.
10. 10. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 7-9, znamienna tym, że cząsteczka siRNA zawiera co najmniej jedną modyfikację wybraną z modyfikacji 2'-O-Me, wiązań typu PTO, modyfikacji 2'-Fluoro RNA, modyfikacji 5'-E winylofosfonianem 2'-metoksyurydyny, modyfikacji cholesterolem, modyfikacji przez przyłączenie deoksynukleotydów [dTdT], korzystnie zawiera przyłączone deoksynukleotydy [dTdT] na 3’ końcu nici efektorowej.
11. 11. Cząsteczka siRNA, jak określono w którymkolwiek z zastrzeżeń 1-2 albo nanocząstka lipidowa LNP, jak określono w którymkolwiek z zastrzeżeń 3-6, albo kompozycja farmaceutyczna, jak określono w którymkolwiek z zastrzeżeń 7-10 do zastosowania w terapii i/lub zapobieganiu rozwojowi nowotworu glejaka, poprzez hamowanie ekspresji ludzkiej tenascyny-C (TNC).