PL247778B1 - Nowy peptyd penetrujący oraz jego zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy peptyd penetrujący o wzorze chemicznym C₈₀H₁₄₀N₂₀O₁₇S₂ i o sekwencji LKCKKLIPLFSKTCP, który jest zabezpieczony amidem na końcu C. Zgłoszenie obejmuje także zastosowanie tego nowego peptydu penetrującego jako nośnika leków cytotoksycznych, insuliny, izotopów stosowanych w leczeniu chorób nowotworowych lub nośników środków obrazujących.

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy peptyd penetrujący oraz zastosowanie tego nowego peptydu penetrującego.

Uważa się, że współczesny tryb życia, w tym nieprawidłowe odżywianie i brak aktywności fizycznej, jak również postępujące zanieczyszczenie środowiska doprowadziło do epidemii tak zwanych chorób cywilizacyjnych. Do najgroźniejszych z nich należą nowotwory złośliwe, choroby układu krążenia oraz cukrzyca. W Polsce choroby układu krążenia powodują prawie 50% zgonów, zaś około 20% zgonów spowodowanych jest nowotworami złośliwymi, co ujawniono w publikacji Kitajewska, W., Szeląg, W., Kopański, Z., Maslyak, Z., & Sklyarov, I. (2015). Civilisation diseases and prevention. Journal of Clinical Healthcare, 7(2014_1), 03-07. Powoduje to, że cały czas poszukiwane są zarówno nowe leki, jak i sposoby ich dostarczania do zmienionych chorobowo komórek. Jednym z kierunków intensywnie prowadzonych badań są peptydy penetrujące komórki - CPP, które są krótkimi peptydami złożonymi z co najwyżej 30 aminokwasów. Peptydy penetrujące mają zdolność przedostawania się przez błony biologiczne żywych organizmów do wnętrza komórek. Sprawia to, że mogą one pełnić rolę nośników dla innych związków chemicznych, które mają problem w pokonywaniu barier biologicznych. CPP są intensywnie badane pod kątem ich wykorzystania w diagnostyce i leczeniu chorób. W publikacji Xie, J., Bi, Y., Zhang, H., Dong, S., Teng, L., Lee, R.J., & Yang, Z. (2020). Cell-Penetrating Peptides in Diagnosis and Treatment of Human Diseases: From Precilinical Research to Clinical Application. Frontiers in Pharmacology, 11 przedstawiono badania właściwości tych peptydów, związane z przenoszeniem leków przez błony komórkowe, zwłaszcza w przypadku nowotworów, cukrzycy, schorzeń neurologicznych, otologicznych, chorób oczu czy chorób o podłożu zapalnym.

Do najbardziej znanych i najszerzej badanych peptydów CPP należą peptydy pochodzące z białka TAT wirusa HIV oraz białka Antennapedia z Drosophila melanogaster. Zarówno dla tych peptydów, jak i wielu innych udowodniono zdolność do transportowania do wnętrza komórek różnego rodzaju aktywnych biologicznie koniugatów takich jak białka, peptydy, DNA, siRNA i leki niskocząsteczkowe, co przedstawiono w publikacji Bechara, C. and Sagan, S. (2013) Cell-penetrating peptides: 20years later, where do we stand? FEBS Lett. 587, 1693-1702. Obecne strategie dostarczania do komórek makrocząsteczek obejmują w szczególności nanocząstki, co przedstawiono w publikacji Mitchell, M.J., Billingsley, M.M., Haley, R.M., Wechsler, M.E., Peppas, N.A., & Langer, R. (2021). Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery, 20: 101-124, liposomy, co przedstawiono w publikacji Liu, P., Chen, G., Zhang, J. (2022). A Review of Liposomes as a Drug Delivery System: Current Status of Approved Products, Regulatory Environments, and Future Perspectives. Molecules, 27(4): 1372, wektory wirusowe, co przedstawiono w publikacji Chung, Y.H., Cai, H., & Steinmetz, N.F. (2020). Viral nanoparticles for drug delivery, imaging, immunotherapy, and theranostic applications. Advanced drug delivery reviews, 156: 214-235, mikroiniekcję, co przedstawiono w publikacji Tiefenboeck, P., Kim, J.A., Leroux, J.-C. (2018). Intracellular delivery of colloids: Past and future contributions form microinjection. Advanced drug delivery reviews, 132: 3-15 lub elektroporację, co z kolei przedstawiono w publikacji Shi, J., Ma, Y., Zhu, J., Chen, Y., Sun, Y., Yao, Y., Yang, Z., & Xie, J. (2018). A Review on Electroporation-Based Intracellular Delivery. Molecules, 23: 3044. W publikacji Swain, S., Sahu, P., Beg, S., & Babu, S. (2016). Nanoparticles for cancer targeting: current amd future directions. Current Drug Delivery, 13(8): 1290-1302T wykazano, że te znane sposoby dostarczania do komórek makrocząsteczek, mogą skutkować wysoką toksycznością, słabą specyficznością, immunogennością, a także niską wydajnością i skutecznością transportu cząsteczek do komórek.

Poszukiwane są więc inne podejścia do dostarczania makrocząsteczek do komórek docelowych z wysoką wydajnością i skutecznością. W odróżnieniu od innych strategii dostarczania, CPP mogą wnikać do komórek w sposób nieinwazyjny. Nie naruszają one zwykle struktury błon plazmatycznych i są uważane za bezpieczne i wysoce wydajne. Peptydy CPP są w stanie nie tylko przenosić małe związki chemiczne, ale również takie jak na przykład kwasy nukleinowe, co wykazano w publikacji Huang, Y.-W., Lee, H.-J., Tolliver, L.M., & Aronstam, R. S. (2015). Delivery of Nucleic Acids and Nanomaterials by Cell-Penetrating Peptides: Opportunities and Challenges. BioMed Research International, 2015:

834079, inne białka, co zostało przedstawione w publikacji Kardani, K., Milani, A., Shabani, S.H., Bolhassani A. (2019). Cell penetrating peptides: The potent multi-cargo intracellular carriers. Expert Opinion on Drug Delivery, 16(11): 1227-1258, wirusy, co zostało przedstawione w publikacji Vanova, J., Hejtmankova, A., Kalbacova, M.H., Śpanielova, H. (2019). The Utilization of Cell-Penetrating Peptides in the Intracellular Delivery of Viral Nanoparticles. Materials(Basel), 12(17): 2671 lub środki do obrazowania, co przedstawiono w publikacji Stiltner, J., McCandless, K., Zahid, M. (2021). Cell-Penetrating Peptides: Applications in Tumor Diagnosis and Therapeutics. Pharmaceutics, 13(6): 890.

W ciągu ostatnich 30 lat, CPP były coraz częściej wykorzystywane w diagnostyce i terapii różnych chorób, jako jedno z najbardziej użytecznych podejść do transfekcji w różnych typach komórek. Niejednokrotnie wykazywały one zdolność do osiągania stężeń terapeutycznych nawet w komórkach i tkankach, do których dotarcie, przy wykorzystaniu innych metod transfekcji, jest wyjątkowo trudne. Sukces peptydów CPP nie jest jednak spowodowany wyłącznie ich wyjątkową zdolnością do transportu transmembranowego, ale również ich wszechstronnością, szczególnie w kontekście manipulacji nimi, jako że mogą być one w prosty sposób syntetyzowane, modyfikowane i ulepszane, co opisano w publikacji Xie, J., Bi, Y., Zhang, H., Dong, S., Teng, L., Lee, R.J., & Yang, Z. (2020). Cell-Penetrating Peptides in Diagnosis and Treatment of Human Diseases: From Precilinical Research to Clinical Application. Frontiers in Pharmacology, 11.

Jednym z problemów w leczeniu nowotworów są bariery biologiczne, zwłaszcza w mikrośrodowisku guza, które mogą blokować dostarczanie leków do komórek nowotworowych, szczególnie w przypadku glejaków mózgu oraz raka trzustki. CPP umożliwiają pokonanie semi-przepuszczalnej bariery hydrofobowej w celu realizacji efektywnego dostarczania leków do komórek i tkanek, co opisano w publikacji Cui, J., Xu, Y., Tu, H., Zhao, H., Wang, H., Di, L., & Wang, R. (2022). Gather wisdom to overcome barriers: Well-designed nano-drug delivery systems for treating gliomas. Acta Pharmaceutica Sinica B, 12(3): 1100-1125; Munir, M.U. (2022). Nanomedicine Penetration to Tumor: Challenges, and Advanced Strategies to Tackle This Issue. Cancers, 14: 2904.

Głównym wyzwaniem w onkoterapii jest złe rokowanie, zwłaszcza w przypadku raka trzustki, glejaka i przerzutów do węzłów chłonnych. Efekt leczniczy w przypadku opornych na leczenie nowotworów nie jest znaczący, ponieważ systemy dostarczania leków nie są w stanie pokonać złożonego mikrośrodowiska guza, aby dostarczyć leki do miejsca leczenia. W publikacji Cui, J., Xu, Y., Tu, H., Zhao, H., Wang, H., Di, L., & Wang, R. (2022). Gather wisdom to overcome barriers: Well-designed nano-drug delivery systems for treating gliomas. Acta Pharmaceutica Sinica B, 12(3): 1100-1125; Munir, M.U. (2022). Nanomedicine Penetration to Tumor: Challenges, and Advanced Strategies to Tackle This Issue. Cancers, 14: 2904 przedstawiono możliwość wykorzystania CPP jako molekularnego napędu do głębokiej penetracji trudno dostępnych komórek.

Przykładem zastosowania peptydów CPP jako nośników jest koniugat z doksorubicyną, która jest lekiem często stosowanym w terapiach nowotworowych. Doksorubicyna mimo szerokiego zastosowania ma działania uboczne, takie jak na przykład kardiotoksyczność, które przedstawiono w publikacji Kalyanaraman, B. (2020). Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree? Redox Biology, 29: 101394. Badania wykazały jednak, że w określonych warunkach zastosowanie koniugatu CPP z lekiem zwiększa wychwyt komórkowy przenoszonej substancji aktywnej w testach in vitro i in vivo, poprawiając tym samym skuteczność leków przeciwnowotworowych jednocześnie ograniczając ich cytotoksyczne działanie na zdrowe komórki i tkanki, które to badania opisano w publikacji Longoria-Garcia, S., Sanchez-Dominguez, C.N., & Gallardo-Blanco, H.L. (2022). Recent applications of cell-penetrating peptide guidance of nanosystems in breast and prostate cancer. W publikacji Shoari, A., Tooyserkani, R., Tahmasebi, M., & Lowik, D.W.P.M. (2021). Delivery of Various Cargos into Cancer Cells and Tissues via Cell-Penetrating Peptides: A Review of the Last Decade. Pharmaceutics. 13(9): 1391 przedstawiono wykorzystanie CPP jako jednego ze składników całego systemu transportu, na który poza CPP i lekiem, składają się też inne elementy, takie jak zwłaszcza nanonośniki i liposomy, które pozwalają uzyskać wyższy indeks terapeutyczny i poprawić selektywność komórkową i tkankową. Przykładami peptydów skoniugowanych z doksorubicyną, które testowano w większych systemach transportowych były w szczególności: CPP PVF, co opisano w publikacji Cai, D., Gao, W., He, B., Dai, W., Zhang, H., Wang, X., Wang, J., Zhang, X., & Zhang, Q. (2014). Hydrophobie penetrating peptide PFVYLI-modified stealth liposomes for doxorubicin delivery in breast cancer therapy. Biomaterials, 35: 2283-2294, Angiopep-2 CPP, co opisano w publikacji Hu, G., Chun, X., Wang, Y., He, Q., & Gao, H. (2015). Peptide mediated active targeting and intelligent particle size reduction-mediated enhanced penetrating of fabricated nanoparticles for triple-negative breast cancer treatment. Oncotarget. 6: 41258-41 lub peptyd TAT z wirusa HIV, co opisano w publikacji Morshed, R.A., Muroski, M.E., Dai, Q., Wegscheid, M.L., Auffinger, B., Yu, D., Han, Y., Zhang, L., Wu, M., Cheng, Y., & Lesniak, M.S. (2016). Cell-penetrating peptide-modified gold nanoparticles for the delivery of doxorubicin to brain metastatic breast cancer. Molecular Pharmaceutics. 13: 1843-1854.

Znacznie mniej badań i rozwoju nanosystemów przenoszących leki przeprowadzono w odniesieniu do raka prostaty PC. Niektóre CPP były jednak testowane na PC z pewnym sukcesem i podobnie jak w przypadku raka piersi, badania wykazują, że uwzględnienie peptydów CPP do systemu transportowego leku powoduje obserwowalny wzrost specyficzności oraz wychwytu przez komórki. Przykładami CPP wykorzystywanymi w przypadku badań nad skutecznością terapii przeciwko PC są zwłaszcza Chol-Rg, ujawniony w publikacji Lang, J., Zhao X., Qi, Y., Zhang, Y., Han, X., Ding, Y., Guan, J., Ji, T., Zhao, Y., & Nie, G. (2019). Reshaping prostatę tumor microenvironment to suppress metastasis via cancer-associated fibroblast inactivation with peptide-assembly- based nanosystem. ACS nano, 13(11): 12357-12371, poliargininowy peptyd G-Rb ujawniony w publikacji Xiang, B., Dong, D.W., Shi, N.Q., Gao, W., Yang, Z.Z., Cui, Y., Cao, D.Y., & Qi, X.R. (2013). PSA-responsive and PSMA-mediated multifunctional liposomes for targeted therapy of prostate cancer. Biomaterials, 34: 6976-6991, poliargininowy peptyd R11, ujawniony w publikacji Wadajkar, A.S., Menon, J.U., Tsai, Y.S., Gore, C., Dobin, T., Gandee, L., Kangasniemi, K., Takashi, M., Manandhar, B., Ahn, J.M., Hsieh, J.-T., & Nguyen, K.T. (2013). Prostate cancer-specific thermo-responsive polymer-coated iron oxide nanoparticles. Biomaterials, 34: 3618-3625 lub chimeryczny peptyd Ste-R6L2, ujawniony w publikacji Yuan, L., Liu, C.Y., Chen, Y., Zhang, Z.H., Zhou, L., & Qu, D. (2013). Antitumor activity of tripterine via cell-penetrating peptide-coated nanostructured lipid carriers in a prostate cancer model. International Journal of Nanomedicine, 8: 4339-4350.

Do schorzeń ośrodkowego układu nerwowego zalicza się głównie udar mózgu, chorobę Parkinsona i chorobę Alzheimera. Dużym problemem w tego typu chorobach jest trudność w dostarczeniu leków w miejsce choroby, głównie poprzez występującą barierę krew-mózg BBB, która składa się ze ściśle połączonych komórek śródbłonka, co sprawia, że charakteryzuje się niską przepuszczalnością dla większości związków chemicznych, co opisano w publikacji Kristensen, M., Franzyk, H., Klausen, M.T., Iversen, A., Bahnsen, J.S., Skyggebjerg, R.B., Fodera, V., & Nielsen, H.M. (2015). Penetratin-Mediated Transepithelial Insulin Permeation: Importance of Cationic Residues and pH for Complexation and Permeation. The AAPS Journal, 17: 1200-1209. W publikacji Sharma, G., Lakkadwala, S., Modgil, A., & Singh, J. (2016). The Role of Cell-Penetrating Peptide and Transferrin on Enhanced Delivery of Drug to Brain. International Journal of Molecular Sciences, 17: 806 wykazano skuteczność CPP w transporcie środków terapeutycznych do mózgu poprzez BBB bez wywoływania efektów cytolitycznych. W badaniu opisanym w publikacji Cho, C.F., Wolfe, J.M., Fadzen, C. M., Calligaris, D., Hornburg, K., Chiocca, E. A., Agar, N.Y.R., Pentelute, B.L., & Lawler, S.E. (2017). Blood-brain-barrier spheroids as an in vitro screening platform for brain-penetrating agents. Nature Communications, 8: 15623 udowodniono natomiast, że CPP mogą omijać glikoproteinę P, aby zwiększyć akumulację leku w mózgu w celu poprawy efektu terapeutycznego.

Transdermalny system terapeutyczny jest skutecznym sposobem miejscowego dostarczania leków przeciwzapalnych realizowany najczęściej przy użyciu plastrów uwalniających substancję leczniczą. Ze względu na efektywną zdolność penetracji skóry, peptydy CPP są stosowane w tego typu systemie podawaniu leków. W publikacji Gao, S., Tian, B., Han, J., Zhang, J., Shi, Y., Lv, Q., & Li, K. (2019). Enhanced transdermal delivery of lornoxicam by nanostructured lipid carrier gels modified with polyarginine peptide for treatment of carrageenan-induced rat paw edema. International Journal of Nanomedicine , 14: 6135-6150 opisano wykorzystanie peptydu CPP - peptyd R11 do modyfikacji powierzchni nanocząstek lipidowych zawierających lornoksykam, służących do leczenia obrzęku łap szczura. Utworzony system transportujący lek znacznie poprawił wychwyt komórkowy leku w komórkach HaCaT, złagodził obrzęk łap szczura i zahamował produkcję cytokin zapalnych in vivo.

Peptydy CPP mogą też być wykorzystane jako nośniki leków podawanych w przypadku schorzeń słuchu oraz wzroku. W publikacji Liu, C., Tai, L., Zhang, W., Wei, G., Pan, W. & Lu, W. (2014). Penetratin, a Potentially Powerful Absorption Enhancer for Noninvasive Intraocular Drug Delivery. Molecular Pharmaceutics, 11: 1218-1227 przedstawiono wyniki badania polegającego na przebadaniu kilku kationowych CPP. Badanie to zostało wykonane w celu oceny skuteczności penetracji oka, zwłaszcza przez peptyd TAT, peptyd poliargininowy R8, poliserynowy S8, protaminę i penetratynę. Badania wykazały, że penetratyna wykazywała satysfakcjonującą wydajność w kontekście przenikania do komórek w testach in vivo.

Peptydy CPP mogą być także stosowane jako nośniki insuliny podawanej doustnie. Obecnie powszechnie stosowaną metodą podawania insuliny jest ciągłe, podskórne wstrzykiwanie jej przez pacjenta. Jeśli zamiast iniekcji podskórnych, zastosowanie insuliny byłoby doustne, dolegliwości bólowe pacjenta zostałby znacznie zmniejszone. Jednak insulina jest niestabilna w jelicie cienkim, jej wychwyt w nabłonku jelitowym jest niski i charakteryzuje się niską doustną biodostępnością. W dotychczasowych badaniach pokazano, że peptyd TAT kowalencyjnie związany z insuliną, może radykalnie poprawić penetrację insuliny w modelu kultury komórkowej Caco-2. Co więcej, dostępność biologiczna insuliny związanej z CPP jest sześć do ośmiu razy większa w porównaniu z normalną insuliną, co przedstawiono w publikacji Liang, J.F., Yang, V.C. (2005). Insulin-cell penetrating peptide hybrids with improved intestinal absorption efficiency. Biochemical and Biophysical Research Communications, 335: 734-738.

Środki obrazujące są niezbędne w diagnostyce chorób i mają zdolność do śledzenia lub dostarczania w odpowiednim czasie informacji o działaniu terapeutycznym leków. Dostarczenie środków obrazowania do chorych tkanek jest nadal wielkim wyzwaniem ze względu na uniemożliwianie wychwytu wielu nienaturalnych związków przez błony komórkowe. CPP odgrywają istotnie ważną rolę w dostarczaniu środków obrazowania, ze względu na ich doskonałą przepuszczalność, wysokie powinowactwo i wysoką stabilność, co ujawniono w publikacji Xu, J., Khan, A. R., Fu, M., Wang, R., Ji, J., Zhai, G. (2019). Cell-penetrating peptide: a means of breaking through the physiological barriers of different tissues and organs. Journal of Controlled Release, 309: 106-124. Do tej pory przeprowadzono szereg badań sprawdzających możliwość wykorzystania CPP jako środków obrazowania do diagnostyki, uzyskując pewien postęp w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Wyniki badań przedstawiono w publikacjach Olson, E.S., Jiang, T., Aguilera, T.A., Nguyen, Q.T., Ellies, L.G., Scadeng, M., & Tsien, R.Y. (2010). Activatable cell penetrating peptides linked to nanoparticles as dual probes for in vivo fluorescence and MR imaging of proteases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107: 4311-4316; Miampamba, M., Liu, J., Harootunian, A., Gale, A. J., Baird, S., Chen, S. L., Nguyen, Q.T., Tsien R.Y., & Gonzalez, J.E. (2017). Sensitive in vivo Visualization of Breast Cancer Using Ratiometric Protease-activatable Fluorescent Imaging Agent, AVB-620. Theranostics, 7: 3369-3386; Unkart, J.T., Chen, S. L., Wapnir, I.L., Gonzalez, J.E., Harootunian, A., Wallace, A.M. (2017). Intraoperative Tumor Detection Using a Ratiometric Activatable Fluorescent Peptide: A First-in-Human Phase I Study. Annals of Surgical Oncology, 24: 3167-3173.

Peptydy wyznakowane radioizotopowo, ze względu na ich wysoką precyzję, mogą być wykorzystywane jako tradycyjne środki obrazowania. Niektóre radioznakowane CPP, takie jak [18F]-FPPRGD2, [18F]Galacto-RGD i 18F-RGD-K5, zostały włączone do badań klinicznych, co przedstawiono w publikacji Sun, X., Li, Y., Liu, T., Li, Z., Zhang, X., Chen, X. (2017). Peptide-based imaging agents for cancer detection. Advanced Drug Delivery Reviews, 110-111: 38-51.

Z publikacji Chiquet, C., Aptel, F., Creuzot-Garcher, C., Berrod, J.-P., Kodjikian, L., Massin, P., et al. (2017). Postoperative Ocular Inflammation: A Single Subconjunctival Injection of XG-102 Compared to Dexamethasone Drops in a Randomized Trial. American Journal of Ophthalmology, 174, 76-84 znane są peptydy, które testowane są pod kątem ich użycia w schorzeniach okulistycznych, zwłaszcza peptyd TAT. W publikacji Staecker, H., Jokovic, G., Karpishchenko, S., Kienle-Gogolok, A., Krzyżaniak, A., Lin, C.-D., Navratil, P., Tzvetkov, V., Wright, N., & Meyer, T. (2019). Efficacy and Safety of AM-111 in the Treatment of Acute Unilateral Sudden Deafness - A Double-blind, Randomized, Placebo-controlled Phase 3 Study. Otology & Neurotology, 40: 584-594 zostały przedstawione testy użycia peptydów TAT w schorzeniach otologicznych, w publikacji Capron, M., Beghin, L., Leclercq, C., Labreuche, L, Dendooven, A., Standaert, A., et al. (2019). Safety of P28GST, a Protein Derived from a Schistosome Helminth Parasite, in Patients with Crohn’s Disease: A Pilot Study (ACROHNEM). Journal of Clinical Medicine, 9: 41, badania CPP P28 w kontekście użycia ich w chorobie Leśniowskiego-Crohna, w publikacji Lulla, R.R., Goldman, S., Yamada, T., Beattie, C.W., Bressler, L., Pacini, M., et al. (2016). Phase I trial of p28 (NSC745104), a non-HDM2-mediated peptide inhibitor of p53 ubiquitination in pediatric patients with recurrent or progressive central nervous system tumors: A Pediatric Brain Tumor Consortium Study. Neuro-Oncology 18: 1319-1325 przedstawiono badania CPP P28 w leczeniu nowotworów centralnego układu nerwowego, natomiast w publikacji Coriat, R., Faivre, S., Mir, O., Dreyer, C., Ropert, S., Bouattour, M., Desjardins, R., Goldwasser, F., & Raymond, E. (2016). Pharmacokinetics and safety of DTS-108, a human oligopeptide bound to SN-38 with an esterase-sensitive cross-linker in patients with advanced malignancies: a Phase I study. International Journal of Nanomedicine, 11: 6207-6216 badania CPP DPV1047 w leczeniu innych nowotworów opornych na leczenie konwencjonalne.

Wiele chorób jest związanych z nieprawidłowym działaniem lub rozregulowaniem określonego białka, a dostarczenie nienaruszonego białka do chorej komórki jest realną alternatywą dla terapii opartych na peptydach i nukleotydach. Leki małocząsteczkowe nie mogą normalnie naśladować wysoce specyficznej i złożonej roli białek w komórkach i często powodują niepożądane skutki uboczne. Terapie białkowe są ogólnie bezpieczniejsze niż podejścia genetyczne, ponieważ nie wymagają modyfikacji genomu, co może prowadzić do wyciszenia niezbędnych genów lub indukcji nowotworzenia, co ujawniono w publikacji Patel SG, Sayers EJ, He Lin, Narayan R, Williams TL, Mills EM, Allemann RK, Luk LYP, Jones AT, Tsai YH. Cell-penetrating peptide sequence and modifcation dependent uptake and subcellular distribution of green forescent protein in different cell lines. Scientific Reports 2019 9:6298 doi.org/10.1038/s41598-019-42456-8. W przeciwieństwie do konwencjonalnych leków małocząsteczkowych większość białek jest dużych i hydrofitowych, przez co nie przechodzą one bezpośrednio przez błonę plazmatyczną, a tym samym ograniczone jest ich zastosowanie jako środków terapeutycznych. Peptydy penetrujące komórki CPP wykazują potencjał dostarczania szerokiej gamy cząsteczek, w tym dużych aktywnych białek, do wnikania do komórek poprzez endocytozę, co wykazano w publikacji Kiisholts K, Kurrikoff K, Arukuusk P, Porosk L, Peters M, Salumets A, Langel ϋ. Cell-Penetrating Peptide and siRNA-Mediated Therapeutic Effects on Endometriosis and Cancer In Vitro Models. Pharmaceutics 2021, 13, 1618 doi.org/10.3390/pharmaceutics13101618.

Celem wynalazku jest opracowanie nowego peptydu penetrującego przeznaczonego do penetracji terapeutycznej komórek ludzkich, zwłaszcza komórek prostaty oraz komórek gruczołu piersiowego.

Nowy peptyd penetrujący o wzorze chemicznym C80H140N20O17S2i o sekwencji LKCKKLIPLFSKTCP, który jest zabezpieczony amidem na końcu C.

Nowy peptyd penetrujący o wzorze chemicznym C80H140N20O17S2i o sekwencji LKCKKLIPLFSKTCP, który jest zabezpieczony amidem na końcu C do zastosowania jako nośnik leków cytotoksycznych, insuliny, izotopów do leczenia chorób nowotworowych lub nośników środków obrazujących, korzystnie jako nośnik leków cytotoksycznych lub izotopów do leczenia chorób nowotworowych prostaty lub chorób nowotworowych piersi.

Nowy peptyd penetrujący, według wynalazku, ma zdolność do penetracji komórek linii nowotworowych DU145 oraz MCF-7, zwłaszcza komórek ludzkich nowotworowych prostaty DU145 ATCC HTB-81, komórek ludzkich nowotworowych piersi MCF-7 ATCC HTB-22, jak również komórek prawidłowych BJ, PNT1A, zwłaszcza prawidłowych komórek prostaty PNT1A ECACC 95012614 oraz fibroblastów skóry BJ ATCC CRL-2522. Pozwala to na jego wykorzystanie w dostarczaniu leków przeznaczonych do leczenia chorób nowotworowych, dostarczanie insuliny lub środków obrazujących.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony w przykładzie wykonania oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia obrazy mikroskopowe, na których pokazano wnikanie nowego peptydu penetrującego do prawidłowych fibroblastów skóry BJ po jednogodzinnej inkubacji w 37°C przy 5% stężeniu CO2 oraz obraz mikroskopowy próby kontrolnej nie traktowanej nowym peptydem penetrującym komórki, przy czym obrazy mikroskopowe są w obserwacji z wykorzystaniem kontrastu fazowego oraz filtrów wzbudzających barwniki fluorescencyjne Hoechst 33342 oraz rodaminę b, fig. 2 - obrazy mikroskopowe, na których pokazano wnikanie nowego peptydu penetrującego do prawidłowych komórek prostaty PNT1A po jednogodzinnej inkubacji w 37°C przy 5% stężeniu CO2 oraz obraz mikroskopowy próby kontrolnej nie traktowanej nowym peptydem penetrującym komórki, przy czym obrazy mikroskopowe są w obserwacji z wykorzystaniem kontrastu fazowego oraz filtrów wzbudzających barwniki fluorescencyjne Hoechst 33342 oraz rodaminę b, fig. 3 - obrazy mikroskopowe, na których pokazano wnikanie nowego peptydu penetrującego do komórek nowotworowych prostaty DU145 po jednogodzinnej inkubacji w 37°C przy 5% stężeniu CO2 oraz obraz mikroskopowy próby kontrolnej nie traktowanej nowym peptydem penetrującym komórki, przy czym obrazy mikroskopowe są w obserwacji z wykorzystaniem kontrastu fazowego oraz filtrów wzbudzających barwniki fluorescencyjne Hoechst 33342 oraz rodaminę b, natomiast fig. 4 - obrazy mikroskopowe, na których pokazano wnikanie nowego peptydu penetrującego do komórek nowotworowych piersi MCF-7, po jednogodzinnej inkubacji w 37°C przy 5% stężeniu CO2 oraz obraz mikroskopowy próby kontrolnej nie traktowanej nowym peptydem penetrującym komórki, przy czym obrazy mikroskopowe są w obserwacji z wykorzystaniem kontrastu fazowego oraz filtrów wzbudzających barwniki fluorescencyjne Hoechst 33342 oraz rodaminę b.

Nowy peptyd penetrujący komórki, według wynalazku, ma sekwencję LKCKKLIPLFSKTCP i wzór chemiczny C80H140N20O17S2, a ponadto zabezpieczony jest amidem na końcu C. Masa molowa tego nowego peptydu wynosi 1718,32 Da. Peptyd wykazuje hydrofobowość rzędu 47% a jego ładunek netto wynosi +4.

Inne parametry nowego peptydu penetrującego:

- uśredniona hydropatia peptydu GRAVY - the Grand Average hydropathy value of the peptide = 0, 22666666666667;

- hydrofobowość peptydu wg. Wimleya-White’a - The Wimley-White whole-residue hydrophobicity of the peptide = 1,53;

- Indeks Bomana, współczynnik oddziaływań białko-białko - Protein-binding Potential - Boman index = 0,19 kcal/mol.

Nowy peptyd penetrujący zawiera aminokwasy w następujących ilościach:

- Aminokwasy hydrofobowe: I: 1 V: 0 L: 3 F: 1 C: 2 M: 0 A: 0 W: 0

- Glicyna i Prolina: G: 0 P: 2

- Ujemnie naładowane aminokwasy: E: OD: 0

- Dodatnio naładowane aminokwasy: K: 4 R: 0 H: 0

- Inne aminokwasy: T: 1 S: 1 Y: 0 Q: 0 N: 0

Udział procentowy poszczególnych aminokwasów w nowym peptydzie penetrującym jest następujący: C = 13,33% F = 6,67% I = 6,67% K = 26,67% L = 20% P = 13,33% S = 6,67% T = 6,67%.

Zastosowanie nowego peptydu penetrującego, który ma sekwencję LKCKKLIPLFSKTCP i wzór chemiczny C80H140N20O17S2, a ponadto zabezpieczony jest amidem na końcu C, jako nośnika leków cytotoksycznych stosowanych w leczeniu chorób nowotworowych, zwłaszcza choroby nowotworowej prostaty lub choroby nowotworowej piersi i innych, zwłaszcza schorzeniach układu nerwowego, jako nośników insuliny stosowanych w doustnym leczeniu cukrzycy, jako nośników izotopów stosowanych, zwłaszcza w leczeniu chorób nowotworowych prostaty lub piersi lub nośników środków obrazujących stosowanych w diagnostyce obrazowej.

Linie komórkowe fibroblastów skóry BJ, komórek nowotworowych prostaty DU145, komórek nowotworowych piersi MCF-7 oraz prawidłowych komórek prostaty PNT1A hodowano, odpowiednio w pożywkach Eagle’s minimal essential medium EMEM ATCC 30-2003 oraz Roswell Park Memorial Institute RPMI - ATCC 30-2001, uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą FBS oraz roztworem antybiotyków zawierającym 100 lU/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny. Hodowlę prowadzono w 37°C i przy 5% stężeniu CO2. Po uzyskaniu 80-90% konfluencji dokonywano pasażu hodowli oraz dostosowania ich gęstości do wartości 5 x 104 kom/mL, po czym przenoszono na płytkę 12-dołkową po 1 mL tak przygotowanych hodowli. Płytki inkubowano w 37°C i 5% stężeniu CO2 przez 24-godziny. Do każdego dołka dodawano po 111,11 μL 100 μΜ nowego peptydu penetrującego, uzyskując końcowe stężenie 10 μM i poddano 1-godzinej inkubacji w 37°C i przy 5% stężeniu CO2. Następnie po 3-krotnym przepłukaniu każdego dołka 1000 μL PBS, dodano 10,10 μL 100 μL barwnika fluorescencyjnego Hoechst 33342 oraz inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez dostępu światła. Następnie dokonano analizy uzyskanych wyników poprzez obserwację z wykorzystaniem kontrastu fazowego oraz filtrów wzbudzających barwniki fluorescencyjne: Hoechst 33342 o λwzbudzenia = 350 nm, λemisji = 460 nm oraz rodamina b o λwzbudzenia 553 nm, λemisji = 627 nm, przy zastosowaniu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Uzyskane obrazy mikroskopowe analizowano porównując obecność lub brak sygnału fluorescencyjnego w badanej próbie obejmującej komórki danej linii komórkowej inkubowane w obecności nowego peptydu penetrującego komórki, znakowanego rodaminą b w porównaniu do próby kontrolnej, która nie została poddana inkubacji z badanym peptydem. Uzyskane wyniki w postaci zdjęć mikroskopowych przedstawiono na Fig. 1-4.

Claims (3)

1. Nowy peptyd penetrujący o wzorze chemicznym C80H140N20O17S2 i o sekwencji LKCKKLIPLFSKTCP, który jest zabezpieczony amidem na końcu C.

2. Nowy peptyd penetrujący o wzorze chemicznym C80H140N20O17S2 i o sekwencji LKCKKLIPLFSKTCP, który jest zabezpieczony amidem na końcu C do zastosowania jako nośnik leków cytotoksycznych, insuliny, izotopów do leczenia chorób nowotworowych lub nośników środków obrazujących.

3. Nowy peptyd penetrujący o wzorze chemicznym C80H140N20O17S2 i o sekwencji LKCKKLIPLFSKTCP, który jest zabezpieczony amidem na końcu C, według zastrz. 2, do zastosowania jako nośnik leków cytotoksycznych lub izotopów do leczenia chorób nowotworowych prostaty lub chorób nowotworowych piersi.